CN106771144A - 一种检测c‑反应蛋白斑点免疫金渗滤试剂盒及定量检测方法 - Google Patents

一种检测c‑反应蛋白斑点免疫金渗滤试剂盒及定量检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种检测C‑反应蛋白斑点金渗滤试剂盒及定量检测方法，包括pH值为6.6的样本稀释液、pH值为6.4的洗涤液、C‑反应蛋白抗体胶体金、C‑反应蛋白层析器、定标卡；其中，所述样本稀释液包括Triton‑100和磷酸盐缓冲液溶液；所述洗涤液包括牛血清白蛋白和磷酸盐缓冲液溶液。本发明采用硝酸纤维素膜为固相载体，以抗体标记胶体金作为探针和指示剂，其中胶体金颗粒的表面带负电荷与C‑反应蛋白抗体蛋白分子的正电荷基团因静电作用形成牢固的结合，当被金颗粒标记的抗体与相应的抗原配体结合，金颗粒在抗体配体位点大量聚集时，便形成肉眼可见的红色斑点。本发明具有检测结果准确，检测灵敏度高，使用方便，可以广泛应用于临床。

Description

一种检测C-反应蛋白斑点免疫金渗滤试剂盒及定量检测方法
技术领域
本发明属于医学检验领域，尤其涉及一种检测C-反应蛋白(CRP)斑点免疫金渗滤试剂盒及定量检测方法。
背景技术
C-反应蛋白(C-reactive protein，CRP)是环状五球体蛋白，属于Oligomeric钙结合蛋白，相对分子质量约120000，由5个相同的单体以非共价键构成，是炎性淋巴因子白介素-6、白介素-1，肿瘤坏死因子刺激肝脏上皮细胞合成的。由于C-反应蛋白在感染发生后6～8h即开始升高，24～48h达到高峰，高峰值可达正常的数百倍，在感染消除后其含量急骤下降，一周内可恢复正常。C-反应蛋白被公认为是最有价值的急性时相反应蛋白，它的升高可以提示许多炎症事件的发生，因此，很久以来被广泛应用于临床感染性疾病的检测。近年来有研究者发现，炎症在动脉粥样硬化的起始、形成、发展过程中扮演了重要的角色，所以C-反应蛋白这个极其灵敏的炎症指标在各种类型心血管疾病中得到了广泛的研究。
常规C-反应蛋白检验方法可在感染或组织损伤时检测出C-反应蛋白＞10mg/L，但是，不能很好地检测出低水平(0.1～10mg/L)的C-反应蛋白变化。该水平的C-反应蛋白与心血管疾病的发生有着密切的关系，所以日益受到研究者的关注。随着一些高灵敏度检测方法的出现，低水平的C-反应蛋白也可以被检测出来，由于应用的检测方法具有较高的灵敏度，因此，这个水平的C反应蛋白又被称为较高的超敏C反应蛋白(high sensitivity C-reactive protein，hs-C-反应蛋白)。研究显示，在无明显症状的健康男性中，C-反应蛋白的升高程度与初次发生冠心病的危险性呈正相关，hs-C-反应蛋白浓度处于高值的那部分人群未来发生中风、心肌梗死、周围血管疾病的危险分别是低值的2倍(RR＝1.9，95％CI1.1～3.3)、3倍(RR＝2.9，95％)CI 1.8～6.0)和4倍(RR＝4.1，95％CI 1.2～6.0)，并且证实不受吸烟因素的影响而独立于冠心病的其他危险因子之外。Hs-C-反应蛋白对于女性也是一个强有力的未来心血管发病的预测因子(RR＝4.4，95％CI 2.2～8.9)。hs-C-反应蛋白对于急性冠脉综合征的诊断也有十分重要的作用。不稳定性心绞痛或非ST段抬高的心肌梗死患者有hs-C-反应蛋白升高、则示来可能会发生各种不利事件，如心绞痛的再发、ST段抬高的心肌梗死或冠心病引起的死亡。
临床实验室C-反应蛋白检测一直采用透射免疫和散射免疫方法，这些方法的参考值范围变动很大，从3mg/L到超过200mg/L。随着人们对于低水平C-反应蛋白与心血管疾病关系的认识，这些测定方法的灵敏度远远不能满足要求，而且目前的检测方法即使使用昂贵的仪器设备和试剂，也不能同时兼顾高值和低值的检测要求。因此，建立一种检测时间短，并且检测除了能在实验室进行外，还要求能够进行床旁检测，同时对高值和低值C-反应蛋白都适用的检测方法，从而为临床提供准确的诊断依据，是十分必要的。
常用的金标免疫检测包括侧向免疫金层析法(Bilateral immune-chromatographic assay)和斑点金免疫渗滤法(Dot immune-gold filtration assay)。侧向免疫金层析法是受测样本和胶体金标记探针在一种微孔膜(例如：硝酸纤维素膜)上受虹吸作用做侧向运动，与预先包被在膜另一端的捕获探针相遇而聚集，呈现肉眼可见的红色线条。由于受测样本和标记探针是在混合状态下做同步运动，这种方法在检测抗体时会因为待测样本中的非特异性抗体存在而消耗标记探针，从而降低检测的灵敏度。同时该检测方法检测时间较长易受环境湿度影响，在环境干燥的情况下样本易于蒸发导致层析不完全和反应体系的改变，从而导致测量结果的准确性受到较大的影响。竞争法则以不显色为阳性结果，在很多情况下给结果判定带来不便。所以，目前该技术的临床应用受到局限。
发明内容
现有的金标免疫检测在定性检测应用较为广泛，本发明提供一种检测C-反应蛋白(CRP)斑点免疫金渗滤试剂盒定量检测方法，斑点免疫金渗滤法是让待测样本垂直渗滤过微孔膜(例如：硝酸纤维素膜)，被膜上包被的捕获探针捕获，再以同样方式让胶体金标探针渗滤过微孔膜，与被捕获的配体结合后聚集形成肉眼可见的红色斑点。本发明具有检测时间短、精密度好的特点。
一种检测C-反应蛋白(CRP)斑点免疫金渗滤试剂盒，包括pH值为6.6的样本稀释液、pH值为6.4的洗涤液、胶体金标记C-反应蛋白抗体、C-反应蛋白层析器和定标卡；所述样本稀释液包括Triton-100和磷酸盐缓冲液溶液；所述洗涤液包括牛血清白蛋白和磷酸盐缓冲液溶液。
优选的，所述样本稀释液中Triton-100的浓度为0.1～0.9％，所述磷酸盐缓冲液溶液的浓度为0.05～0.9mol/L；所述洗涤液中牛血清白蛋白的浓度为0.1～0.9％，所述磷酸盐缓冲液溶液的浓度为0.05～0.9mol/L。
优选的，所述磷酸盐缓冲液溶液由以下原料配制：Na2HPO40.2-0.3重量份、KH2PO42.0-1.0重量份、NaCl 6重量份、KCl 0.2重量份、蒸馏水1000重量份、牛血清白蛋白7重量份。
优选的，所述胶体金标记C-反应蛋白抗体按以下步骤制备而成：
先将质量份数为1％的氯金酸与双蒸水按体积1∶79配成A液，将质量份数为1％的柠檬酸三钠、质量份数为1％的鞣酸、25mMK2CO3与双蒸水按体积比4∶0.035～0.080∶0.035～0.080∶15.84～15.93配成B液；再将A液和B液在水浴内同时加热到59～61℃，搅拌A液，快速加入B液，继续搅拌1分钟，在10～13分钟内加热至沸腾，得到胶体金液；
利用0.25MK2CO3调整所述胶体金液pH值为6.71～6.90；
将C-反应蛋白抗体原液在4℃下以6000～13000r/min速度离心60分钟，吸取上清液；将该抗体装入透析袋，用双蒸水透析去除盐分后，装瓶冷冻，得到C-反应蛋白抗体；
将所述C-反应蛋白抗体缓慢加入胶体金液中进行标记，所述C-反应蛋白抗体和胶体金液的质量体积比为0.27～0.30mg：100ml，搅拌15分钟后，依次加入10～19％的迭氮钠和0.5～0.9％的牛血清白蛋白，所述迭氮钠、牛血清白蛋白与胶体金液的体积比为500μl：100μl：100ml，搅匀后在3.0～4.0℃，以6000r/min速度离心30分钟，去除上清液，沉淀物即为胶体金标记的C-反应蛋白抗体。
优选的，所述B液中柠檬酸三钠、鞣酸、K2CO3与双蒸水的体积比为4∶0.08∶0.08∶15.84，所形成的胶体金液中胶体金颗粒的直径为10＜D＜11nm。
优选的，所述C-反应蛋白层析器内设置有直径为3cm的反应盒，
所述反应盒包括盒底和盒盖，所述盒盖顶面中央设置有一个上表面直径为0.6cm，下表面直径为0.3cm的小圆孔；所述反应盒内垫满吸水材料；在所述小圆孔下方和所述吸水材料上方之间放置一张1.3×1.3cm的包被C-反应蛋白抗体的硝酸纤维素膜。
优选的，所述包被C-反应蛋白抗体的硝酸纤维素膜按照以下步骤制备：
将C-反应蛋白抗体原液在6℃下以8000～10000r/min速度离心60分钟，吸取上清液；将所述抗体装入透析袋，用双蒸水透析去除盐分，超滤浓缩后装瓶冷冻，得到C-反应蛋白抗体；
用磷酸盐缓冲液稀释所述C-反应蛋白抗体，得到0.8mg/ml的包被液；
将所述包被液滴加至裁切好的硝酸纤维素膜上，每张膜片0.02ml，将膜片置于烘箱中干燥后得到包被C-反应蛋白抗体的硝酸纤维素膜。
优选的，所述定标卡为C-反应蛋白梯度质量浓度溶液所检测颜色相对应的检测信号值。根据检测试纸显示的信号值，与定标卡信号值比对，即可定量判定其质量浓度。
优选地，所述梯度浓度分别为1、5、10、20、30、40、50mg/L，并且该梯度质量浓度检测的信号与定标卡相对应。
一种检测C-反应蛋白斑点免疫金渗滤试剂盒的定量检测方法，按以下步骤操作：
真空采集血样，室温放置15min-2h，以3000r/min速度离心30min，吸取上清液混匀，冷冻，将待测样本转移至样本稀释液中，混匀15secs即为待检测样本；用移液器准确吸取待检测样本，点在反应盒圆孔内硝酸纤维素膜面上；待检测样本渗入后，再往反应盒膜面滴加胶体金标记C-反应蛋白抗体，所述胶体金标记C-反应蛋白抗体与所述检测样本的体积比为1：1；待胶体金标记C-反应蛋白抗体渗入后，再往反应盒膜面上滴加洗涤液，所述洗涤液与所述检测样本的体积比为1：1；观察反应盒膜面，待洗涤液完全渗入膜面后，检测C-反应蛋白层析器信号值，通过仪器结合定标卡信息计算检测样本C-反应蛋白浓度，即可定量判定其质量浓度。
本发明斑点金标免疫渗滤法以亲和层析原理为基础，采用硝酸纤维素膜为固相载体，以吸附在硝酸纤维素上的抗体为固相，以人血中抗原以及抗体标记胶体金为液相，并同时以抗体标记胶体金作为探针和指示剂，而建立起来的一种新型的免疫检测方法。其中胶体金颗粒的表面带负电荷与C-反应蛋白抗体蛋白分子的正电荷基团因静电作用形成牢固的结合，同时金颗粒又有高电子密度的特性，当被金颗粒标记的抗体与相应的抗原配体结合，金颗粒在抗体配体位点大量聚集时，便形成肉眼可见的红色斑点。本发明提供的一种检测C-反应蛋白(CRP)斑点金渗滤试剂盒及定量检测方法，具有检测结果准确，检测灵敏度高，使用方便，可以广泛应用于临床。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
本发明公开了一种检测C-反应蛋白(CRP)斑点免疫金渗滤试剂盒，包括pH值6.6的样本稀释液、pH值6.4的洗涤液、C-反应蛋白抗体标记胶体金、C-反应蛋白层析器和定标卡；其中，所述样本稀释液含有浓度为0.1～0.9％的Triton-100和浓度为0.05～0.9mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)溶液，所述洗涤液含有浓度为0.1～0.9％的牛血清白蛋白(BSA)和浓度为0.05～0.9mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)溶液。
作为优选方案，所述磷酸盐缓冲液(PBS)溶液由Na2HPO4 0.2-0.3重量份、KH2PO42.0-1.0重量份、NaCl 6重量份、KCl 0.2重量份、蒸馏水1000重量份、牛血清白蛋白7重量份。
作为优选方案，所述定标卡为C-反应蛋白梯度质量浓度溶液所检测信号值相对应。根据检测试纸显示的信号值，与定标卡信号值比对，即可定量判定其质量浓度。
作为优选方案，所述梯度浓度分别为1、5、10、20、30、40、50mg/L，并且该梯度质量浓度检测的信号与定标卡相对应。
作为优选方案，所述C-反应蛋白层析器设置有反应盒，其长3cm×宽2.5cm×高0.6cm的塑料小盒，分盒底和盒盖两部分，盒盖顶面中央有一个直径为0.8cm的小圆孔，盒内垫满吸水材料，在小圆孔下方和吸水材料上方之间放置一张1.3×1.3cm的硝酸纤维素膜，合紧盒盖即组成反应盒。可避免大部分待测样本和标记探针从斑点以外的非相关区域流失，影响检测灵敏度，可以使得该技术在临床检验中广泛使用。
作为优选方案，所述包被C-反应蛋白抗体的硝酸纤维素膜按照以下步骤制备：
将C-反应蛋白抗体原液在6℃下以8000～10000r/min速度离心60分钟，吸取上清液；将所述抗体装入透析袋，用双蒸水透析去除盐分，超滤浓缩后装瓶冷冻，得到C-反应蛋白抗体；用磷酸盐缓冲液稀释所述C-反应蛋白抗体，得到0.8mg/ml的包被液；将所述包被液滴加至裁切好的硝酸纤维素膜上，每张膜片0.02ml，将膜片置于烘箱中干燥后得到包被C-反应蛋白抗体的硝酸纤维素膜。
作为优选方案，所述C-反应蛋白抗体标记胶体金按以下步骤制备而成：
(1)胶体金的制备以质量份数分别为1％氯金酸、1％柠檬酸三钠、1％鞣酸、25mMK2CO3及双蒸水为原料，先将1％氯金酸与双蒸水按体积1∶79配成A液；将1％柠檬酸三钠、1％鞣酸、25mMK2CO3与双蒸水按体积4∶0.035～0.080∶0.035～0.080∶15.84～15.93配成B液；再将A液、B液在水浴内同时加热到59～61℃，搅拌A液，快速加入B液，继续搅拌1分钟，在10～13分钟内加热至沸腾，制成颗粒直径8～12nm的胶体金，该胶体金液颜色由黑→蓝→紫→红色时即成；
(2)将步骤(1)胶体金液用0.25M K2CO3调整pH值为6.71～6.90后备用；
(3)C-反应蛋白抗体的制备与透析，将C-反应蛋白抗体在6℃下以8000～10000r/min速度离心60分钟，吸取上清液；将该抗体装入透析袋，用双蒸水透析去除盐分后，装瓶冷冻，备用；
(4)C-反应蛋白抗体标记胶体金，将步骤(3)C-反应蛋白抗原0.27～0.30mg，缓慢加入步骤(2)制备的100ml胶体金液中进行包被，搅拌15分钟后，依次加入10～19％的迭氮钠500μL、0.5～0.9％的牛血清白蛋白100μl，搅匀后在3.0～4.0℃，6000r/min条件下离心30分钟，去除上清液，即成胶体金标记C-反应蛋白抗体。
作为优选方案，配制胶体金A液配方同上，所述配制胶体金B液的组分与质量体积比为1％柠檬酸三钠4.0ml、1％鞣酸0.08ml、25mM K2C030.08ml与双蒸水15.84ml；制成的胶体金颗粒直径为10＜D＜11nm；胶体金液pH值调为7.1；胶体金液与C-反应蛋白抗原的体积重量比为100ml∶0.30mg。
一种检测C-反应蛋白(CRP)斑点免疫金渗滤试剂盒的定量检测方法，按以下步骤操作：
(1)待检人血清/血浆或全血的采集：用毛细管或真空采血管采集血样，混匀即为全血样本；或采人血3～5ml于干净的真空采血管中，置室温放置15min-2h，3000r/min离心30min，吸取上清液即为人血清/血浆，冷冻备用；
(2)检测样本的制备：将全血、血清或血浆用毛细管或移液器采集5μl转移至样本稀释液中，混匀15secs即为待检测样本；
(3)检测样本加样：用移液器准确吸取25μL检测样本，点在反应盒圆孔内硝酸纤维素膜面上；
(4)滴加C-反应蛋白抗体标记胶体金：待检测样本渗入后，再往反应盒膜面滴加25μL C-反应蛋白抗体标记胶体金；
(5)待C-反应蛋白抗体标记胶体金渗入后，再往反应盒膜面上滴加25μL洗涤液；
(6)检测并记录结果：观察反应盒膜面，待洗涤液完全渗入膜面后，检测C-反应蛋白层析器信号值，通过仪器结合定标卡信息计算检测样本C-反应蛋白浓度，即可定量判定其质量浓度。
实施例1
一种检测C-反应蛋白(CRP)斑点免疫金渗滤试剂盒，包括pH值为6.6的样本稀释液、pH值为6.4的洗涤液、C-反应蛋白抗体标记胶体金、C-反应蛋白层析器和定标卡；其中，所述样本稀释液含有浓度为0.5％的Triton-100和浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)溶液，所述洗涤液含有浓度为0.5％的牛血清白蛋白(BSA)和浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)溶液；所述磷酸盐缓冲液(PBS)溶液由Na2HPO4 0.263重量份、KH2PO4 1.65重量份、NaCl 6重量份、KCl 0.2重量份、蒸馏水1000重量份、牛血清白蛋白7重量份。所述C-反应蛋白层析器内设置有直径为3cm的反应盒，所述反应盒包括盒底和盒盖，所述盒盖顶面中央设置有一个上表面直径为0.6cm，下表面直径为0.3cm的小圆孔；所述反应盒内垫满吸水材料；在所述小圆孔下方和所述吸水材料上方之间放置一张1.3×1.3cm的包被C-反应蛋白抗体的硝酸纤维素膜。
所述包被C-反应蛋白抗体的硝酸纤维素膜按照以下步骤制备：
将C-反应蛋白抗体原液在6℃下以9000r/min速度离心60分钟，吸取上清液；将所述抗体装入透析袋，用双蒸水透析去除盐分，超滤浓缩后装瓶冷冻，得到C-反应蛋白抗体；用磷酸盐缓冲液稀释所述C-反应蛋白抗体，得到0.8mg/ml的包被液；将所述包被液滴加至裁切好的硝酸纤维素膜上，每张膜片0.02ml，将膜片置于烘箱中干燥后得到包被C-反应蛋白抗体的硝酸纤维素膜。
所述胶体金标记C-反应蛋白抗体按以下步骤制备而成：
(1)胶体金的制备以质量分数分别为1％氯金酸、1％柠檬酸三钠、1％鞣酸、25mMK2CO3及双蒸水为原料，先将1％氯金酸与双蒸水按体积1∶79配成A液；将1％柠檬酸三钠、1％鞣酸、25mMK2CO3与双蒸水按体积4∶0.035～0.080∶0.035～0.080∶15.84～15.93配成B液；再将A液、B液在水浴内同时加热到60℃，搅拌A液，快速加入B液，继续搅拌1分钟，在12分钟内加热至沸腾，制成颗粒直径10nm的胶体金，该胶体金液颜色由黑→蓝→紫→红色时即成；
(2)胶体金pH值的调整将步骤(1)胶体金液用0.25M K2CO3调整pH值为6.8后备用；
(3)C-反应蛋白抗体的制备与透析，将抗体在6℃下9000r/min离心60分钟，吸取上清液即为C-反应蛋白抗体；将该抗体装入透析袋，用双蒸水透析去除盐分后，装瓶冷冻，备用；
(4)C-反应蛋白抗体标记包被胶体金，将步骤(3)C-反应蛋白抗体0.29mg，缓慢加入步骤(2)制备的100ml胶体金液中进行包被，搅拌15分钟后，依次加入10％迭氮钠500μl、0.8％牛血清白蛋白100μl，搅匀后在3.5℃，6000r/min条件下离心30分钟，去除上清液，即成C-反应蛋白胶体金。
一种检测C-反应蛋白(CRP)斑点免疫金渗滤试剂盒的定量检测方法，
(1)用毛细管或真空采血管采集血样，混匀即为全血样本；或采人血4ml于干净的真空采血管中，置室温放置1h，3000r/min离心30min，吸取上清液即为人血清/血浆，冷冻备用；
(2)将全血、血清或血浆用毛细管或移液器采集5μl转移至样本稀释液中，混匀15secs即为待检测样本；
(3)用移液器准确吸取25μL检测样本，点在反应盒圆孔内硝酸纤维素膜面上；
(4)待检测样本渗入后，再往反应盒膜面滴加25μL C-反应蛋白抗体标记胶体金；
(5)待C-反应蛋白抗体标记胶体金渗入后，再往反应盒膜面上滴加25μL洗涤液；
(6)观察反应盒膜面，待洗涤液完全渗入膜面后，检测C-反应蛋白层析器信号值，通过仪器结合定标卡信息计算检测样本C-反应蛋白浓度，即可定量判定其质量浓度。
实施例2
一种检测C-反应蛋白(CRP)斑点免疫金渗滤试剂盒，包括pH值为6.6的样本稀释液、pH值为6.4的洗涤液、C-反应蛋白抗体标记胶体金、C-反应蛋白层析器和定标卡；其中，所述样本稀释液含有浓度为0.1％的Triton-100和浓度为0.05mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)溶液，所述洗涤液含有浓度为0.1％的牛血清白蛋白(BSA)和浓度为0.05mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)溶液；所述磷酸盐缓冲液(PBS)溶液由Na2HPO4 0.2重量份、KH2PO4 1.0重量份所述C-反应蛋白层析器内设置有直径为3cm的反应盒，所述反应盒包括盒底和盒盖，所述盒盖顶面中央设置有一个上表面直径为0.6cm，下表面直径为0.3cm的小圆孔；所述反应盒内垫满吸水材料；在所述小圆孔下方和所述吸水材料上方之间放置一张1.3×1.3cm的包被C-反应蛋白抗体的硝酸纤维素膜。
所述包被C-反应蛋白抗体的硝酸纤维素膜按照以下步骤制备：
将C-反应蛋白抗体原液在6℃下以8000r/min速度离心60分钟，吸取上清液；将所述抗体装入透析袋，用双蒸水透析去除盐分，超滤浓缩后装瓶冷冻，得到C-反应蛋白抗体；用磷酸盐缓冲液稀释所述C-反应蛋白抗体，得到0.8mg/ml的包被液；将所述包被液滴加至裁切好的硝酸纤维素膜上，每张膜片0.02ml，将膜片置于烘箱中干燥后得到包被C-反应蛋白抗体的硝酸纤维素膜。
所述胶体金标记C-反应蛋白抗体按以下步骤制备而成：
(1)胶体金的制备以质量分数分别为1％氯金酸、1％柠檬酸三钠、1％鞣酸、25mMK2CO3及双蒸水为原料，先将1％氯金酸与双蒸水按体积1∶79配成A液；将1％柠檬酸三钠、1％鞣酸、25mMK2CO3与双蒸水按体积4∶0.035～0.080∶0.035～0.080∶15.84～15.93配成B液；再将A液、B液在水浴内同时加热到60℃，搅拌A液，快速加入B液，继续搅拌1分钟，在12分钟内加热至沸腾，制成颗粒直径8nm的胶体金，该胶体金液颜色由黑→蓝→紫→红色时即成；
(2)胶体金pH值的调整，将步骤(1)胶体金液用0.25M K2CO3调整pH值为6.71后备用；
(3)C-反应蛋白抗体的制备与透析，将抗体在6℃下8000r/min离心60分钟，吸取上清液即为C-反应蛋白抗体；将该抗体装入透析袋，用双蒸水透析去除盐分后，装瓶冷冻，备用；
(4)C-反应蛋白抗体标记包被胶体金，将步骤(3)C-反应蛋白抗体0.29mg，缓慢加入步骤(2)制备的100ml胶体金液中进行包被，搅拌15分钟后，依次加入10％迭氮钠500μl、0.5％牛血清白蛋白100μl，搅匀后在3.0℃，8000r/min条件下离心30分钟，去除上清液，即成C-反应蛋白胶体金。
一种检测C-反应蛋白(CRP)斑点免疫金渗滤试剂盒的定量检测方法，
(1)用毛细管或真空采血管采集血样，混匀即为全血样本；或采人血3ml于干净的真空采血管中，置室温放置15min，3000r/min离心30min，吸取上清液即为人血清/血浆，冷冻备用；
(2)将全血、血清或血浆用毛细管或移液器采集5μl转移至样本稀释液中，混匀15secs即为待检测样本；
(3)用移液器准确吸取25μL检测样本，点在反应盒圆孔内硝酸纤维素膜面上；
(4)待检测样本渗入后，再往反应盒膜面滴加25μL C-反应蛋白抗体标记胶体金；
(5)待C-反应蛋白抗体标记胶体金渗入后，再往反应盒膜面上滴加25μL洗涤液；
(6)观察反应盒膜面，待洗涤液完全渗入膜面后，检测C-反应蛋白层析器信号值，通过仪器结合定标卡信息计算检测样本C-反应蛋白浓度，即可定量判定其质量浓度。
实施例3
一种检测C-反应蛋白(CRP)斑点免疫金渗滤试剂盒，包括pH值为6.6的样本稀释液、pH值为6.4的洗涤液、C-反应蛋白抗体标记胶体金、C-反应蛋白层析器和定标卡；其中，所述样本稀释液含有浓度为0.9％的Triton-100和浓度为0.9mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)溶液，所述洗涤液含有浓度为0.9％的牛血清白蛋白(BSA)和浓度为0.9mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)溶液；所述磷酸盐缓冲液(PBS)溶液由Na2HPO40.3重量份、KH2PO42.0重量份所述C-反应蛋白层析器内设置有直径为3cm的反应盒，所述反应盒包括盒底和盒盖，所述盒盖顶面中央设置有一个上表面直径为0.6cm，下表面直径为0.3cm的小圆孔；所述反应盒内垫满吸水材料；在所述小圆孔下方和所述吸水材料上方之间放置一张1.3×1.3cm的包被C-反应蛋白抗体的硝酸纤维素膜。
所述包被C-反应蛋白抗体的硝酸纤维素膜按照以下步骤制备：
将C-反应蛋白抗体原液在6℃下以10000r/min速度离心60分钟，吸取上清液；将所述抗体装入透析袋，用双蒸水透析去除盐分，超滤浓缩后装瓶冷冻，得到C-反应蛋白抗体；用磷酸盐缓冲液稀释所述C-反应蛋白抗体，得到0.8mg/ml的包被液；将所述包被液滴加至裁切好的硝酸纤维素膜上，每张膜片0.02ml，将膜片置于烘箱中干燥后得到包被C-反应蛋白抗体的硝酸纤维素膜。
所述胶体金标记C-反应蛋白抗体按以下步骤制备而成：
(1)胶体金的制备以质量分数分别为1％氯金酸、1％柠檬酸三钠、1％鞣酸、25mMK2CO3及双蒸水为原料，先将1％氯金酸与双蒸水按体积1∶79配成A液；将1％柠檬酸三钠、1％鞣酸、25mMK2CO3与双蒸水按体积4∶0.035～0.080∶0.035～0.080∶15.84～15.93配成B液；再将A液、B液在水浴内同时加热到60℃，搅拌A液，快速加入B液，继续搅拌1分钟，在12分钟内加热至沸腾，制成颗粒直径12nm的胶体金，该胶体金液颜色由黑→蓝→紫→红色时即成；
(2)胶体金pH值的调整，将步骤(1)胶体金液用0.25M K2CO3调整pH值为6.90后备用；
(3)C-反应蛋白抗体的制备与透析，将抗体在6℃下10000r/min离心60分钟，吸取上清液即为C-反应蛋白抗体；将该抗体装入透析袋，用双蒸水透析去除盐分后，装瓶冷冻，备用；
(4)C-反应蛋白抗体标记包被胶体金，将步骤(3)C-反应蛋白抗体0.3mg，缓慢加入步骤(2)制备的100ml胶体金液中进行包被，搅拌15分钟后，依次加入19％迭氮钠500μl、0.9％牛血清白蛋白100μl，搅匀后在4.0℃，10000r/min条件下离心30分钟，去除上清液，即成C-反应蛋白胶体金。
一种检测C-反应蛋白(CRP)斑点免疫金渗滤试剂盒的定量检测方法，
(1)用毛细管或真空采血管采集血样，混匀即为全血样本；或采人血5ml于干净的真空采血管中，置室温放置2h，3000r/min离心30min，吸取上清液即为人血清/血浆，冷冻备用；
(2)将全血、血清或血浆用毛细管或移液器采集5μl转移至样本稀释液中，混匀15secs即为待检测样本；
(3)用移液器准确吸取25μL检测样本，点在反应盒圆孔内硝酸纤维素膜面上；
(4)待检测样本渗入后，再往反应盒膜面滴加25μL C-反应蛋白抗体标记胶体金；
(5)待C-反应蛋白抗体标记胶体金渗入后，再往反应盒膜面上滴加25μL洗涤液；
(6)观察反应盒膜面，待洗涤液完全渗入膜面后，检测C-反应蛋白层析器信号值，通过仪器结合定标卡信息计算检测样本C-反应蛋白浓度，即可定量判定其质量浓度。
实施例4
实施例4与实施例1、2和3的区别在于，在制备胶体金标记C-反应蛋白抗体的步骤中配制胶体金A液配方同上，所述配制胶体金B液的组分与含量为1％柠檬酸三钠4.0ml、1％鞣酸0.08ml、25mM K2C030.08ml与双蒸水15.84ml；制成的胶体金颗粒直径为10＜D＜11nm；胶体金液pH值调为7.1；胶体金液与C-反应蛋白抗体的体积重量比为100ml∶0.30mg。
以上实施方式和实施例均需根据具体情况适度调节温度和蒸馏水的使用量，本说明只是有助于理解本发明的核心原理，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种检测C-反应蛋白斑点免疫金渗滤试剂盒，其特征在于，包括：
pH值为6.6的样本稀释液、pH值为6.4的洗涤液、胶体金标记C-反应蛋白抗体、C-反应蛋白层析器和定标卡；
所述样本稀释液包括Triton-100和磷酸盐缓冲液溶液；
所述洗涤液包括牛血清白蛋白和磷酸盐缓冲液溶液。
2.根据权利要求1所述斑点免疫金渗滤试剂盒，其特征在于，所述样本稀释液中Triton-100的浓度为0.1～0.9％，所述磷酸盐缓冲液溶液的浓度为0.05～0.9mol/L；所述洗涤液中牛血清白蛋白的浓度为0.1～0.9％，所述磷酸盐缓冲液溶液的浓度为0.05～0.9mol/L。
3.根据权利要求1所述斑点免疫金渗滤试剂盒，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液溶液由以下原料配制：Na2HPO4 0.2-0.3重量份、KH2PO4 2.0-1.0重量份、NaCl 6重量份、KCl 0.2重量份、蒸馏水1000重量份、牛血清白蛋白7重量份。
4.根据权利要求1所述斑点免疫金渗滤试剂盒，其特征在于，所述胶体金标记C-反应蛋白抗体按以下步骤制备而成：
先将质量份数为1％的氯金酸与双蒸水按体积1∶79配成A液，将质量份数为1％的柠檬酸三钠、质量份数为1％的鞣酸、25mMK2CO3与双蒸水按体积比4∶0.035～0.080∶0.035～0.080∶15.84～15.93配成B液；再将A液和B液在水浴内同时加热到59～61℃，搅拌A液，快速加入B液，继续搅拌1.5分钟，在10～13分钟内加热至沸腾，得到胶体金液；
利用0.25MK2CO3调整所述胶体金液pH值为6.71～6.90；
将C-反应蛋白抗体原液在6℃下以8000～10000r/min速度离心60分钟，吸取上清液；将该抗体装入透析袋，用双蒸水透析去除盐分后，装瓶冷冻，得到C-反应蛋白抗体；
将所述C-反应蛋白抗体缓慢加入胶体金液中进行标记，所述C-反应蛋白抗体和胶体金液的质量体积比为0.27～0.30mg：100ml，搅拌15分钟后，依次加入10～19％的迭氮钠和0.5～0.9％的牛血清白蛋白，所述迭氮钠、牛血清白蛋白与胶体金液的体积比为500μl：100μl：100ml，搅匀后在3.0～4.0℃，6000r/min条件下离心30分钟，去除上清液，沉淀物即为胶体金标记的C-反应蛋白抗体。
5.根据权利要求4所述斑点免疫金渗滤试剂盒，其特征在于，所述B液中柠檬酸三钠、鞣酸、K2CO3与双蒸水的体积比为4∶0.08∶0.08∶15.84，所形成的胶体金液中胶体金颗粒的直径为10＜D＜11nm。
6.根据权利要求4所述斑点免疫金渗滤试剂盒，其特征在于，所述C-反应蛋白层析器内设置有直径为3cm的反应盒，
所述反应盒包括盒底和盒盖，所述盒盖顶面中央设置有一个上表面直径为0.6cm，下表面直径为0.3cm的小圆孔；
所述反应盒内垫满吸水材料；
在所述小圆孔下方和所述吸水材料上方之间放置一张1.3×1.3cm的包被C-反应蛋白抗体的硝酸纤维素膜。
7.根据权利要求6所述斑点免疫金渗滤试剂盒，其特征在于，所述包被C-反应蛋白抗体的硝酸纤维素膜按照以下步骤制备：
将C-反应蛋白抗体原液在6℃下以8000～10000r/min速度离心60分钟，吸取上清液；将所述抗体装入透析袋，用双蒸水透析去除盐分，超滤浓缩后装瓶冷冻，得到C-反应蛋白抗体；
用磷酸盐缓冲液稀释所述C-反应蛋白抗体，得到0.8mg/ml的包被液；
将所述包被液滴加至裁切好的硝酸纤维素膜上，每张膜片0.02ml，将膜片置于烘箱中干燥后得到包被C-反应蛋白抗体的硝酸纤维素膜。
8.根据权利要求1所述斑点免疫金渗滤试剂盒，其特征在于，所述定标卡为C-反应蛋白梯度质量浓度溶液所检测颜色相对应的检测信号值。
9.根据权利要求8所述斑点免疫金渗滤试剂盒，其特征在于，所述梯度质量浓度分别为1、5、10、20、30、40、50mg/L。
10.一种检测C-反应蛋白斑点免疫金渗滤试剂盒的定量检测方法，按以下步骤操作：
真空采集血样，室温放置15min-2h，以3000r/min速度离心30min，吸取上清液混匀，冷冻，将待测样本转移至样本稀释液中，混匀15secs即为待检测样本；
用移液器准确吸取待检测样本，点在反应盒圆孔内硝酸纤维素膜面上；
待检测样本渗入后，再往反应盒膜面滴加胶体金标记C-反应蛋白抗体，所述胶体金标记C-反应蛋白抗体与所述检测样本的体积比为1：1；
待胶体金标记C-反应蛋白抗体渗入后，再往反应盒膜面上滴加洗涤液，所述洗涤液与所述检测样本的体积比为1：1；
观察反应盒膜面，待洗涤液完全渗入膜面后，检测C-反应蛋白层析器信号值，通过仪器结合定标卡信息计算检测样本C-反应蛋白浓度，即可定量判定其质量浓度。
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