CN109331173A - 胃泌素-二氧化硅微球及其用途 - Google Patents

胃泌素-二氧化硅微球及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及胃泌素‑二氧化硅微球及其用途。本发明研究表明，胃泌素能够具有抑制肠道钠离子吸收的作用，从而能够用于防治盐敏感性高血压。为了避免胃泌素对机体功能的不利影响，本发明将胃泌素多肽连到不能被机体吸收的微球上，因此，胃泌素多肽也不能被吸收进入血液循环系统，仅是通过作用于肠道粘膜的胃泌素受体发挥作用，并随粪便被完全排除体外。因此，该微球无明显的毒副作用。而本发明提供的微球能够降低肠道钠交换通道NHE3及其复合物蛋白的表达、抑制钠离子的吸收，从而具有防治高血压的作用。

Description

胃泌素-二氧化硅微球及其用途
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及胃泌素-二氧化硅微球及其用途。
背景技术
高血压是遗传因素、环境因素和行为因素相互作用导致的一种慢性疾病。盐敏感性高血压可定义为相对高盐摄入所引起的血压升高。盐摄入的多少是高血压的一个重要环境因素，但是在健康人群个体之间对盐负荷或减少盐的摄入存在不同的血压反应，即存在盐敏感性问题。在1978年和1979年，Kawasaki和Luft根据高血压患者和正常人对高盐饮食后血压的变化提出了“血压的盐敏感性”的概念。将具有这个特点的高血压称为盐敏感性高血压。约有50％～60％的原发性高血压患者为盐敏感性高血压，高盐的摄入除了可以升高血压，还能引起血管和肾脏等器官的炎症反应，加重胰岛素抵抗，甚至能够诱发脑卒中等严重并发症。
由于盐敏感性高血压的发病机制不明，临床上尚无根治方法。盐敏感性高血压的治疗包括非药物治疗和药物治疗两方面。非药物治疗主要是减少钠盐摄入。药物治疗主要是应用利尿剂、钙拮抗剂、血管紧张素转换酶抑制剂等。但是，仍存在一些病人血压不能得到很好的控制。主要原因有两方面：一方面为目前的降压药物只针对症状治疗，能够降低血压但未找到盐敏感性高血压发生的根本原因，这些病人依然具有高盐摄入导致的靶器官损伤的风险。第二方面为虽然对高血压患者提倡减少钠盐摄入，但是由于无法控制患者的生活习惯，因此切实做到降低高血压患者的钠盐摄入非常困难。
目前，降低血压类药物分为五大类，(1)利尿降压药，通过肾脏排钠排水，减少血容量并降低外周阻力，达到降压效果。(2)β受体阻滞剂，使β受体阻滞，提高血管平滑肌对血管介质的敏感性，抑制肾素的分泌，达到降压的目的。(3)血管紧张素转换酶抑制剂，通过抑制血管紧张素酶的作用，减少血管紧张素Ⅱ的产生，从而降低体循环阻力，达到降压的目的。(4)钙拮抗剂，抑制钙离子通过心肌与血管平滑肌细胞膜，使平滑肌松弛，周围阻力降低，起到降压作用。(5)血管扩张剂，具有对抗周围血管阻力，而达到降压作用。常用的药物有肼苯哒嗪，长压啶等。利尿剂降压的机制主要是通过对钠的排除的作用。最初利尿剂是通过减少血容量和心排出量来降压的，此时外周阻力还可能有所升高。由于这五类降压药均未从摄取的角度解决钠离子的吸收问题，因而无法降低血管炎症反应的发生，更无法从根本上抑制高血压并发症的发生和对机体的影响。因此抑制机体钠摄入从而降低盐敏感性高血压病人的血压是本领域的研究热点：
钠氢交换体3(Na+/H-Exchanger 3,NHE3)：钠氢交换体3(Na+/H+exchanger 3,NHE3)是钠氢交换体家族成员之一，它介导管腔中的钠离子与细胞质中的氢离子等价交换，是机体钠离子转运蛋白之一。NHE3分子结构和其他亚型相似，由831个氨基酸残基组成，大致可以分为两个结构域：N端由454个氨基酸组成12个跨膜区介导离子交换，C端为细胞内活性调节区通过连接信号分子和细胞骨架实现对NHE3活性的调节。透射电子显微技术发现，NHE3不仅分布于细胞膜，还大量存在于循环胞浆内的胞内体中，NHE3特殊组织分布决定了其独特的生理作用。肠道抑制剂药物tenapanor，它是一种被最低限度吸收的小分子NHE3抑制剂，Tenapanor通过口服给药后，在临床实验中显示可以降低饮食钠与磷的肠吸收。Tenapanor作为盐敏感性高血压的治疗药物，动物实验达到很好的疗效，但是人体的临床研究发现，该药物存在腹泻等明显的副作用。因此，该药物的研发宣告失败。
奥利司他(orlistat,Roche Company)是一种通过减少肠道中脂肪吸收而发挥作用的减肥药。于1999年获得美国FDA批准，在欧洲和美国上市销售。它是一种胃肠道脂肪酶抑制剂，它可以减少人体对食物中脂肪的吸收，达到减轻体重的目的。该药用于体重指数(BMI)大于或等于30kg/m2的肥胖症患者或者体重大于28kg/m2并伴有相关危险因素的超重患者的体重控制。推荐剂量为每次120mg，每日3次，与含脂肪主餐同服或餐后1小时内服用。该剂量服用12-18个月后，患者相比安慰剂组体重减轻2.6％～2.9％。此外，奥利司他还可以调节肥胖患者的血脂平衡和糖代谢，并能降低高血压。服用奥利司他期间若进食高脂肪饮食会导致肠胃产气、大便油腻、排便急迫以及腹痛等不良反应，约有8％的受试患者由于胃肠道不良反应而退出临床试验。加拿大的某数据库研究分析表明，在一年后只有不到10％的病人还在继续服用该药物。
胃泌素是胃窦部G细胞分泌的一种多肽，能够调节多种胃肠道功能和中枢神经系统的功能。缩胆囊素和胃泌素具有共同的受体，CCKA和CCKB受体，这两种受体都属于G蛋白偶联受体家族。硫化的CCK与CCKA受体的亲和力高于硫化的胃泌素和非硫化的CCK与CCKA受体的亲和力500～1000倍，而CCKB受体与CCK和胃泌素的亲和力相同，不受硫化的影响。由于在血浆中，胃泌素的含量远高于CCK的含量，因此我们将CCKB受体称为胃泌素受体。近年来，我们研究发现，胃泌素作为体内一种重要的胃肠激素，除了具有调节胃肠道的分泌功能外，还可以参与调节机体的钠水代谢。但利用胃泌素来实现对盐敏感性高血压的治疗目前尚未见相关报道。
胃泌素作为一种多肽，应用于口服须克服两大障碍：一是抑制胃肠道各种酶对其降解，二是选用合适的制剂形式及载体材料使药物不被机体吸收而仅作用于肠道。粒径范围处于1～1000nm的毫微粒制剂是目前研究最多的口服多肽制剂，但毫微粒的表面带电荷情况及聚合物疏水性能均影响多肽在小肠部位的吸收。近年来的研究主要在对毫微粒表面进行修饰，如在毫微粒表面连接各种生物粘附材料，如脱乙酰壳多糖、等。Kawashima等研究者采用乳化溶剂扩散法在降钙素的PLGA毫微粒表面覆盖一层粘附材料脱乙酰壳多糖后，与原PLGA毫微粒相比，虽然药物扩散形式没有显著改变，但能明显降低血钙水平，且能维持48小时。Lubben等报道，脱乙酰壳多糖及其衍生物能有效提高亲水性大分子物质的吸收，因其能增加细胞间的紧密连接的开放而有利于药物的细胞旁转运。介孔材料由于其独特的优异性能成为了研究开发的热点，在催化、吸附分离、药物释放等领域的应用前景更使其备受关注。1992年，Kresge等，首次在Nature杂志上报道了一类以硅铝酸盐为基的新颖的介孔氧化硅材料，M41S，其中以命名为MCM-41的材料最引人注目其特点是孔道大小均匀、六方有序排列、孔径在1.5～10nm范围可以连续调节，具有高的比表面积和较好的热稳定及水热稳定性，从而将分子筛的规则孔径从微孔范围拓展到介孔领域这对于在沸石分子筛中难以完成的大分子催化、吸附与分离等过程，无疑展示了广阔的应用前景。介孔SiO2纳米粒子(mesoporous silica nanoparticles，MSN)具有在2～50nm范围内可连续调节的均一介孔孔径、规则的孔道、稳定的骨架结构、易于修饰的内外表面和无生理毒性等特点，非常适合用作药物分子的载体。同时，MSN具有巨大的比表面积(＞900m2/g)和比孔容(＞0.9cm3/g)，可以在孔道内负载各种药物，并可对药物起到缓释作用，提高药效的持久性。因此，近年来MSN在可控药物传输系统方面的应用日益得到重视。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供胃泌素-二氧化硅微球及其用途，该微球仅在肠道被利用，而对其他器官没有影响。该微球具有良好的降血压作用。
本发明提供了胃泌素在制备防治高血压的药物中的应用。
研究表明，胃泌素基因敲除小鼠的血压显著升高。人群调查发现正常人和高血压人群空腹状态下血清胃泌素水平没有显著的差异，但是饮食后高血压人群血清胃泌素水平显著升高。以上证据说明了胃泌素可能与血压的调节有关。而本发明研究表明，胃泌素具有显著的降低肠道钠吸收的作用，从而减少机体对钠的摄入，从而降低血压，具体的是抵抗盐敏感高血压的发生。
本发明所述胃泌素的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。具体序列为：p-Glu-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2。
本发明所述高血压为盐敏感性高血压。
本发明还提供了胃泌素-二氧化硅微球，胃泌素连接于氨基化二氧化硅微球表面。
本发明所述微球胃泌素-二氧化硅微球的载药量为3wt％(质量比，即100mg微球连接物中含有3mg的胃泌素)，平均粒径为70μm。由于制备原料中的二氧化硅微球颗粒较大，机体不能吸收。经验证，灌胃给予本发明制备的微球后，大鼠血清中并未发现有胃泌素，这说明通过口服给与的胃泌素二氧化硅微球并没有进入体内，只在肠道发挥作用，对其他器官没有影响。
所述胃泌素-二氧化硅微球的制备方法，包括：将氨基化的二氧化硅微球与胃泌素在EDC/NHS溶液中反应，获得胃泌素-二氧化硅微球。
一些实施例中，所述氨基化的二氧化硅微球与胃泌素的质量为(10～50):1。具体的，所述氨基化的二氧化硅微球与胃泌素的质量为30:1。
一些实施例中，所述EDC/NHS溶液中EDC浓度为200mmol/L；NHS浓度为500mmol/L。所述EDC/NHS溶液以MES缓冲溶液配置。所述MES缓冲液的浓度为100mmol/L，pH值为6.8，使用4mmol/L NaOH溶液进行pH调节)。
所述氨基化的二氧化硅微球与胃泌素反应的条件为为室温(18～30℃)搅拌反应1～3h。优选反应2h。所述反应结束后，还包括离心分离微球和清洗微球的步骤。所述清洗微球采用PBST缓冲液、乙醇或去离子水。清洗后，干燥微球。所述干燥采用冷冻干燥的方式。
一些实施例中，所述氨基化的二氧化硅微球的制备方法包括：将二氧化硅微球与三乙胺反应制得氨基化的二氧化硅微球；所述二氧化硅微球与三乙胺的质量体积比为1g：0.5mL。所述反应的条件为室温(18～30℃)搅拌反应10～14h。优选反应12h。
本发明所述的微球在制备抑制肠道NHE3或其复合物蛋白表达的制剂中的应用。所述NHE3复合物蛋白为NHERF1、NHERF2、NHERF3、ezrin和/或IRBIT。
本发明研究表明，高盐组大鼠小肠刷状缘膜上NHE3及其复合物蛋白(NHERF1、NHERF2、NHERF3、ezrin和IRBIT)的表达相比于对照组明显升高，胃泌素-二氧化硅微球组大鼠小肠刷状缘膜上NHE3及其复合物蛋白的表达相比于高盐组具有显著的降低。这说明胃泌素-二氧化硅微球具有显著的降低肠道钠交换通道NHE3及其复合物蛋白的表达作用。
本发明所述的微球在制备抑制肠道钠吸收的制剂中的应用。
本发明研究表明，高盐组大鼠尿钠水平相比于对照组明显升高，胃泌素-二氧化硅微球组的尿钠水平相比于高盐组具有显著的降低。这说明胃泌素二氧化硅微球具有显著的降低肠道钠吸收的作用。
本发明所述的微球在制备防治高血压的药物中的应用。
本发明研究表明，高盐组大鼠血压相比于对照组明显升高，胃泌素二氧化硅微球组的血压相比于高盐组具有显著的降低。这说明胃泌素二氧化硅微球具有显著的降低高盐引起的血压升高作用。一些实施例中，本发明所述的微球在用于防治的高血压为盐敏感性高血压。
本发明还提供了一种防治高血压药物，含有本发明所述的微球。
本发明所述的药物还包含其他治疗剂，所述其他治疗剂选自其他用于治疗高血压的药物。
所述药物的剂型包括颗粒剂、丸剂、散剂、片剂、胶囊剂、口服液或糖浆剂。
本发明还提供了一种防治高血压的方法，其为给予本发明所述的药物。具体为防止盐敏感性高血压。所述给予的方式为口服，所述给予的剂量为0.2mg/kg。
本发明研究表明，胃泌素能够具有抑制肠道钠离子吸收的作用，从而能够用于防治盐敏感性高血压。为了避免胃泌素对机体功能的不利影响，本发明将胃泌素多肽连到不能被机体吸收的微球上，因此，胃泌素多肽也不能被吸收进入血液循环系统，仅是通过作用于肠道粘膜的胃泌素受体发挥作用，并随粪便被完全排除体外。因此，该微球无明显的毒副作用。而本发明提供的微球能够降低肠道钠交换通道NHE3及其复合物蛋白的表达、抑制钠离子的吸收，从而具有防治高血压的作用。
附图说明
图1示对各种处理的Caco-2细胞(人直结肠癌细胞)进行高盐刺激以及给与胃泌素微球处理后，NHE3及其复合物蛋白的表达；
图2示胃泌素-二氧化硅微球具有显著的降低高盐引起的血压升高作用；
图3示胃泌素-二氧化硅微球具有显著的降低肠道钠吸收的作用；
图4示胃泌素-二氧化硅微球具有显著的降低肠道钠交换通道NHE3及其复合物蛋白的表达作用；
图5示胃泌素-二氧化硅微球并没有进入体内，只在肠道发挥作用，对其他器官没有影响。
具体实施方式
本发明提供了胃泌素-二氧化硅微球及其用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
1、胃泌素多肽的合成
胃泌素的序列：pGlu-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2。采用人工合成的方式制备胃泌素。
2、胃泌素多肽与二氧化硅微球的稳定链接口服制剂的制备
1)二氧化硅微球氨基化
实验器材：圆底烧瓶，搅拌仪，离心管
实验试剂：去离子水，乙醇，KH550(APTES)溶液，三乙胺，二氧化硅微球
实验步骤：
a.在烧瓶中加入90ml乙醇和10ml去离子水以及0.5ml KH550溶液，搅拌30min
b.称取1g二氧化硅微球加入烧瓶中，继续常温搅拌6h
c.加入0.5ml三乙胺，常温搅拌12h
d.静置沉降一段时间，倒出上清液，将微球转移至离心管中
e.用乙醇洗涤微球三次，放入烘箱中加热干燥(或冷冻后干燥处理)，获得氨基化二氧化硅微球(SiO2-NH2)。
2)二氧化硅微球表面连接多肽
实验器材：圆底烧瓶，搅拌仪，离心机，离心管
实验试剂：去离子水，MES缓冲溶液，PBST缓冲溶液，EDC，NHS，胃泌素，氨基化二氧化硅微球(SiO2-NH2)
实验步骤：
a.配制MES缓冲溶液(0.1M，pH＝6.8)
b.(MES缓冲液配置：实际实验中所配置为，50ml浓度为100mmol/L,pH＝6.8(最终结果pH＝6.9)，使用4mmol/L NaOH溶液进行pH调节)。
c.取10mL MES缓冲溶液，配制EDC/NHS溶液，其中EDC浓度为200mmol/L，NHS浓度为500mmol/L。
d.在上述10mL EDC/NHS溶液中加入10mg胃泌素和300mg SiO2-NH2，常温搅拌2小时。
e.离心分离SiO2微球，PBST缓冲溶液清洗两次(实际操作为乙醇，去离子水反复洗涤)，除去未反应多肽。
f.冷冻干燥。
g.取2～10mg左右样品进行热重测试，结果表明，微球连接胃泌素的质量分数为3％。
效果验证
1、细胞实验
1.1实验方法：
我们对Caco-2细胞(人直结肠癌细胞)进行了高盐刺激。结果表明，给予Caco-2细胞刺激之后，NHE3的表达显著增加。而给予胃泌素预处理之后的Caco-2细胞再给予高盐刺激，我们发现NHE3表达并没有增加，NHE3相关的调节蛋白表达也显著降低(图1)。
2、动物实验：
1.1动物：12周龄的雄性Dahl盐敏感性大鼠30只。
1.2实验动物饲料：1.正常盐饲料，含盐量为0.4％；2.高盐饲料，含盐量为8％
1.3药物：胃泌素二氧化硅微球制剂
1.4仪器和试剂：BP2000无创血压测量仪，Visitech Systems.
Synchron EL-ISE Electrolyte电解质检测仪，酶自动生化分析法检测仪
1.5实验方法：
将Dahl盐敏感性大鼠随机分为三组，包括对照组(n＝10)、高盐组(n＝10)和胃泌素二氧化硅微球组(n＝10)。对照组给与正常盐饲料喂养，高盐组和胃泌素二氧化硅微球组给与8％高盐饲料喂养，同时胃泌素二氧化硅微球组给与胃泌素二氧化硅微球灌胃处理，药物剂量为0.2mg/kg。连续喂养6周，每周检测大鼠的血压，尿钠。6周后，取大鼠的小肠，分析小肠刷状缘膜上NHE3及其复合物蛋白表达。
1.6给药方法：
对照组：按照体重，使用灌胃针给与相应体积的水。
高盐组：按照体重，使用灌胃针给与相应体积的水。
胃泌素二氧化硅微球组：按照体重，使用灌胃针给与相应剂量的二氧化硅微球。
1.7结果分析：
高盐组大鼠血压相比于对照组明显升高，胃泌素二氧化硅微球组的血压相比于高盐组具有显著的降低。这说明胃泌素二氧化硅微球具有显著的降低高盐引起的血压升高作用(图1)。
高盐组大鼠尿钠水平相比于对照组明显升高，胃泌素二氧化硅微球组的尿钠水平相比于高盐组具有显著的降低。这说明胃泌素二氧化硅微球具有显著的降低肠道钠吸收的作用(图2)。
高盐组大鼠小肠刷状缘膜上NHE3及其复合物蛋白(NHERF1、NHERF2、NHERF3、ezrin和IRBIT)的表达相比于对照组明显升高，胃泌素二氧化硅微球组大鼠小肠刷状缘膜上NHE3及其复合物蛋白的表达相比于高盐组具有显著的降低。这说明胃泌素二氧化硅微球具有显著的降低肠道钠交换通道NHE3及其复合物蛋白的表达作用(图3)。
胃泌素二氧化硅微球吸收检测：质谱法检测了胃泌素处理组中胃泌素的含量，图4(A-F)代表了不同浓度的胃泌素标准品的信号响应图，从图中可以看出，当胃泌素浓度低于1ng/ul使没有信号相应，我们在对照组和胃泌素处理组中也未发现有信号相应，这说明，连接在二氧化硅微球上的胃泌素没有进入体内。在大鼠血清中并未发现有胃泌素，这说明通过口服给与的胃泌素二氧化硅微球并没有进入体内，只在肠道发挥作用，对其他器官没有影响。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.胃泌素在制备防治高血压的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述高血压为盐敏感性高血压。
3.胃泌素-二氧化硅微球，其中胃泌素连接于氨基化二氧化硅微球表面。
4.权利要求3所述胃泌素-二氧化硅微球的制备方法，包括：将氨基化的二氧化硅微球与胃泌素在EDC/NHS溶液中反应，获得胃泌素-二氧化硅微球。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述氨基化的二氧化硅微球与胃泌素的质量为(1～5):1。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述EDC/NHS溶液中EDC浓度为200mmol/L；NHS浓度为500mmol/L。
7.权利要求3所述的微球，或权利要求4～6任一项所述方法制得的微球在制备抑制肠道NHE3或其复合物蛋白表达的制剂中的应用。
8.权利要求3所述的微球，或权利要求4～6任一项所述方法制得的微球在制备抑制肠道钠吸收的制剂中的应用。
9.权利要求3所述的微球，或权利要求4～6任一项所述方法制得的微球在制备防治高血压的药物中的应用。
10.一种防治高血压药物，其特征在于，含有权利要求4所述的微球，或权利要求5～7任一项所述方法制得的微球。
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