CN113476607B - Slc12a5及其抑制剂的应用 - Google Patents

Slc12a5及其抑制剂的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医药工程技术领域，公开了SLC12A5及其抑制剂的应用。本发明发现SLC12A5基因在人肝纤维化组织中表达升高。通过特异性抑制剂抑制SLC12A5的生物学功能，与对照相比，VU0240551在体内能够减轻肝纤维化的程度；在体外能够显著降低肝星状细胞的增殖能力以及促进肝星状细胞的凋亡，从而提示了以SLC12A5为靶点可以提供一种制备治疗或改善肝纤维化的药物和治疗肝纤维化的新途径。

Description

SLC12A5及其抑制剂的应用
技术领域
本发明涉及生物医药工程技术领域，具体涉及SLC12A5及其抑制剂的应用。
背景技术
肝纤维化(Liver fibrosis)是正常肝脏在多种病因引起的损伤刺激下会产生病理修复反应，在持续长久的损伤修复过程中，出现以细胞外基质的增多以及过度沉积并导致肝脏正常结构破坏以及肝功能异常为特征的病理过程。若不及时治疗，严重的发生肝小叶重构，假小叶形成，成为肝硬化，并最终导致肝衰竭或者肝癌，危及生命。根据GBD项目(the Global Burden of Disease project)的调查，在2010年，超过200万人由于肝癌肝硬化等肝脏疾病死亡，大约占了全球死亡人数的4％。在中国，60岁之前，肝癌是最常见的诊断癌症，也是男性癌症死亡的主要原因。就2015年国际癌症研究机构(International Agencyfor Research on Cancer)的报告，中国的肝癌发病率全球第七，仅次于蒙古、老挝、冈比亚、埃及、越南、韩国和泰国，但就我国人口规模(14亿， 2019年)而言，中国无疑面临着世界上最多的肝癌患者。因此，减少肝癌、肝硬化的发病率，只能在肝病可逆的病理过程中，即肝纤维化阶段，寻找有效的治疗靶点，逆转肝脏的病变。
目前公认的肝纤维化发生发展的机制的核心环节是肝星状细胞的活化。肝脏组织的细胞主要分为实质细胞和非实质细胞，实质细胞指肝细胞，正常肝脏中约占肝内所有细胞的90％；非实质细胞包括肝星状细胞、Kupffer细胞、内皮细胞等。正常情况下，肝星状细胞处于静止状态，位于Disse间隙，此时肝细胞外基质的合成和降解处于动态平衡。当肝受损时，肝细胞、Kupffer细胞、窦内皮细胞等分泌血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子β(TGF β)、IL-1等细胞因子，通过多种信号转导途径作用于肝星状细胞并活化。活化的肝星状细胞通过自分泌和旁分泌，促进自身的增殖分化，α-SMA的表达，以及合成大量的细胞外基质并在肝内沉积，最终导致肝纤维化。
溶质转运蛋白(Solute Carrier,SLC)超家族是一类重要的细胞膜蛋白家族，介导细胞与外界以及细胞内各类溶质的跨膜运输，参与了细胞间的能量传递、营养代谢、信号传导等重要的生理病理过程。SLC12A5是溶质转运蛋白家族的成员，是Na+/K+、Cl-在细胞膜上的共转运蛋白，在健康的人体中多表达于大脑组织。SLC12A5存在两种亚型，由不同的启动子启动产生，研究发现，缺乏这两种亚型的小鼠会在出生后不久因为呼吸衰竭以及运动缺陷而死亡。SLC12A5在中枢神经系统神经元中高表达。很多神经系统疾病的研究表明，SLC12A5的异常表达与癫痫发作有关，也与应激障碍、慢性疼痛以及精神问题相关。近年来也有研究发现SLC12A5在膀胱移行细胞癌、结直肠癌和肺腺癌等肿瘤疾病中高表达。该基因能显著增强细胞增殖和促进G1－S期转化，抑制肿瘤细胞凋亡，但是其在其他癌症中的作用仍未有相关研究和报道。
目前国内外关于SLC12A5在神经系统之外的研究很少，特别是在肝脏中的研究寥寥无几。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供SLC12A5(Solute Carrier Family 12 Member5)作为治疗或改善肝纤维化的靶点中的应用，即任何形式的对其抑制、沉默、敲除、降低表达的方式或物质都可以应用于治疗或改善肝纤维化或其相关药物制备中；
本发明的另外一个目的在于提供SLC12A5抑制剂在制备治疗或改善肝纤维化的药物中的应用。
本发明应用SLC12A5的小分子特异性抑制剂VU0240551进行SLC12A5 的抑制，并验证相关实验效果；VU0240551的CAS号：893990-34-6，分子式：C16H14N4OS2，分子量：342.44，是SLC12A5通道的抑制剂，结构式如下：
Figure BDA0003196326480000031
在对肝纤维化组织样本的免疫组化实验中，相对于正常组织，肝纤维化组织中的SLC12A5高表达，这提示了SLC12A5在肝纤维化中可能作为潜在影响靶点；为此，本发明进一步在动物模型体内使用SLC12A5抑制剂 VU0240551干预，结果显示能够显著降低肝脏的损伤水平；此外，MTT实验也证明了VU0240551在体外能够显著降低肝星状细胞的增殖能力；最后本发明采用流式细胞术验证了VU0240551在体外能够显著促进肝星状细胞的凋亡。
根据上述研究结果，本发明发现SLC12A5基因在人肝纤维化组织中表达升高。应用SLC12A5的特异性抑制剂VU0240551在体内能够减轻肝纤维化的程度；在体外能够显著降低肝星状细胞的增殖能力以及促进肝星状细胞的凋亡。这能够提示SLC12A5可以作为治疗肝纤维化的一个新靶点。
作为优选，所述SLC12A5抑制剂包括抑制SLC12A5的化学药物、多肽/ 蛋白类药物和基因药物中的一种或多种。其中，所述基因药物选自：能降低 SLC12A5表达量的siRNA、dsRNA、shRNA、miRNA、SLC12A5反义核苷酸或它们任意的组合；或者能表达或形成所述siRNA、dsRNA、shRNA、miRNA、 SLC12A5反义核苷酸的构建物或它们任意的组合。其中，所述多肽/蛋白类药物中多肽是α-氨基酸以肽链连接在一起而形成的化合物，是蛋白质水解的中间产物，不具备空间结构(即蛋白质的一级结构)；蛋白质是N条多肽链按一定的空间结构缠绕构成的高分子物质，具有一定空间结构(即蛋白质的二级、三级、四级结构)；所述构建物指基因工程领域中能够承载并表达核苷酸的载体，包括但不限于细菌质粒、噬菌体、重组病毒载体和真核重组表达载体中的至少一种。
在本发明具体实施方式中，所述化学药物为SLC12A5特异性抑制剂 VU0240551。
此外，所述药物中还包括药学上可接受的载体，包括但不限于溶剂、聚合物、脂质体、重组病毒载体和真核重组表达载体中的至少一种。
作为优选，所述药物为口服药物或注射药物，剂型包括片剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、丸剂或溶液剂。
由以上技术方案可知，本发明发现SLC12A5基因在人肝纤维化组织中表达升高。通过特异性抑制剂抑制SLC12A5的生物学功能，与对照相比， VU0240551在体内能够减轻肝纤维化的程度；在体外能够显著降低肝星状细胞的增殖能力以及促进肝星状细胞的凋亡，从而提示了以SLC12A5为靶点可以提供一种制备治疗或改善肝纤维化的药物和治疗肝纤维化的新途径。
附图说明
图1所示人肝脏标本免疫组化结果；相对于正常组织，肝纤维化组织中的SLC12A5高表达；
图2所示在体内使用SLC12A5抑制剂VU0240551干预后动物血清结果；
图3所示在体内使用SLC12A5抑制剂VU0240551干预后动物组织染色结果；
图4所示体外使用SLC12A5抑制剂VU0240551抑制肝星细胞的MTT实验结果；
图5所示VU0240551在体外促进肝星状细胞凋亡的流式检测结果。
具体实施方式
本发明公开了SLC12A5及其抑制剂的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述应用盒已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明所涉及的实验的材料和方法参照如下：
1、实验动物和细胞
本研究使用的小鼠为雄性野生型C57BL/6小鼠，饲养于本院实验动物研究中心，每笼5只小鼠，每天12h光照，自由饮食饮水，独立供气系统，环境温度恒定在22℃-26℃。购得小鼠在适应环境一周后开始实验。所有动物实验均获中南大学实验动物伦理委员会批准，并严格遵守管理规范条例。
本实验使用的人肝星状细胞系LX2细胞购自中南大学湘雅医学院细胞库。细胞使用含有0.5％的青霉素和链霉素、5％胎牛血清的高糖DMEM完全培养基培养，每隔2-3天用含Tris-EDTA的胰酶干预消化并传代。细胞培养在 37℃、5％CO2细胞培养箱中。
2、组织样本
本研究选取了2018年1月至2019年12月之间在中南大学湘雅二医院肝移植科行肝移植手术的40例患者的肝脏标本，这些患者均为晚期肝硬化患者。术后肝硬化病变的肝脏组织由本院病理科行甲醛固定及石蜡包埋，患者术后肝脏标本均由病理科诊断为肝硬化。本研究同时选取了2019年1月至2019 年12月之间在本院肝胆外科行血管瘤切除术的10例患者的肝脏组织标本，在距血管瘤边缘2cm处取正常肝脏组织标本，由本院病理科行甲醛固定及石蜡包埋，患者术后肝脏标本均由病理科诊断为肝血管瘤，距血管瘤边缘2cm 处肝脏组织为正常肝脏，无肝硬化等其他病变。本实验经中南大学伦理委员会审批，严格遵照管理规范条例进行。
3、实验试剂
表1
Figure BDA0003196326480000051
Figure BDA0003196326480000061
4、实验仪器
表2
Figure BDA0003196326480000062
5、实验方法
5.1、人肝脏标本免疫组化
采用选取的肝脏组织蜡块切片并对靶标SLC12A5染色：
(1)65℃温度烤片1小时，烤片完成后迅速将切片置于二甲苯Ⅰ中脱蜡 10分钟，而后放入二甲苯Ⅱ中继续脱蜡10分钟；
(2)将切片依次放入无水乙醇、95％乙醇、75％乙醇中，各5分钟；
(3)以0.01M磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)漂洗3次，每次5分钟；
(4)滴加3％H2O2孵育10分钟，使内源性过氧化物酶失活(常温避光)；
(5)以0.01MPBS缓冲液漂洗3次，每次5分钟；
(6)以柠檬酸钠抗原修复液修复抗原：将配置好的0.01M柠檬酸钠溶液倒入高压锅中，加热至沸腾时将切片置于其中煮沸约10分钟，然后待抗原修复液自然冷却至室温，取出切片，以0.01MPBS缓冲液漂洗3次，每次5 分钟；
(7)滴加抗原封闭液于切片，室温封闭1小时；
(8)去除组织周围多余液体，滴加稀释的SLC12A5抗体溶液(1：200) 于切片，充分覆盖组织，抗体孵育盒底面加入适量双蒸水保持孵育盒内湿润状态，将孵育盒置于4℃冰室避光孵育过夜；
(9)将过夜后的切片取出，于室温中复温45分钟，0.01MPBS漂洗3次，每次5分钟；
(10)室温下滴加二抗试剂盒中的试剂1，孵育20分钟；0.01MPBS缓冲液漂3次，每次5分钟；
(11)室温下滴加二抗试剂盒中的试剂2，孵育20分钟；0.01MPBS缓冲液漂洗3次，每次5分钟；
(12)滴加现配的DAB显色工作液，显微镜下根据显色效果来决定终止显色时间，蒸馏水漂洗；
(13)苏木素染色5秒，显微镜下观察，待胞核染成蓝色时马上终止染色，分化液分化，返蓝；
(14)将切片分别放于75％乙醇、95％乙醇以及无水乙醇中，各5分钟；接着分别放入二甲苯Ⅱ和二甲苯Ⅰ中，各10分钟；
(15)将切片置于通风厨中自然风干，中性树胶封片，显微镜观察并拍照，结果见图1，差异有统计学意义(*代表P<0.05)。
5.2、动物模型实验
选取5周龄的C57BL/6小鼠，饲养一周适应环境，6周龄时称量体重，清除腹部毛发，用75％酒精消毒小鼠右下腹部，取1ml注射器，吸取CCl4/ 橄榄油混合溶液(体积比1：4)，肝纤组(n＝20)按照5ml/kg的剂量向小鼠腹腔注射CCl4/橄榄油混合溶液，每周2次，一共6周：对照组(n＝10)按照相同剂量注射橄榄油。在最后两周，肝纤组1/2(n＝10)同时注射药物VU0240551，用DMSO溶解干粉为液态试剂，剂量为0.02mg/kg，1次/天； 1/2(n＝10)同时注射等体积的药物溶质DMSO。
标本收集：最后一次注射后48小时收集标本：通过眼缘静脉收集小鼠血液标本，取血后颈椎脱臼处死小鼠。开腹解剖肝脏，生理盐水冲洗去除肝脏表面血渍，将左外叶肝脏置于4％多聚甲醛溶液中固定。血液做肝功能，肝功能结果见图2，差异有统计学意义(*代表P<0.05，**代表P＜0.001)。多聚甲醛固定的肝脏送石蜡包埋切片。
蜡块切片后分别做Col1α1染色、Masson染色、天狼星红染色：
Col1α1免疫组化染色方法同上，Col1α1一抗稀释比例为1：200，结果见图3。
Masson染色:
(1)石蜡切片脱蜡水化：
①二甲苯I中脱蜡5min。
②新鲜的二甲苯Ⅱ，再脱蜡5min。
③无水乙醇5min。
④95％乙醇2min。
⑤80％乙醇2min
⑥70％乙醇2min。
⑦蒸馏水2min。
(2)配置好的Weigert铁苏木素染液染色5min。
(3)酸性乙醇分化液分化15s,水洗。
(4)Masson蓝化液返蓝5min，水洗。
(5)蒸馏水1min。
(6)丽春红品红染色液染色5min。
(7)在上述操作过程中按蒸馏水：弱酸溶液＝2:1比例配置弱酸工作液，用弱酸工作液洗1min。
(8)磷钼酸溶液洗1min。
(9)用配置好的弱酸工作液洗1min。
(10)直接放入苯胺蓝染色液中染色2min。
(11)用配置好的弱酸工作液洗1min。
(12)95％乙醇快速脱水。
(13)无水乙醇脱水3次，每次10s。
(14)二甲苯透明3次，每次2min。
(15)中性树胶封固。镜下观察，结果见图3。
天狼星红染色：
(1)石蜡切片脱蜡水化：
①二甲苯I中脱蜡5min。
②换用新鲜的二甲苯Ⅱ，再脱蜡5min。
③无水乙醇5min。
④95％乙醇2min。
⑤80％乙醇2min
⑥70％乙醇2min。
⑦蒸馏水2min。
(2)Weigert铁苏木素染液染色10min。
(3)酸性分化液分化5s。
(4)自来水10min，蒸馏水洗1次。
(5)天狼星红染液滴染1h。
(6)流水稍微冲洗，去除表面染液。
(7)95％乙醇快速脱水。
(8)无水乙醇脱水3次，每次10s。
(9)二甲苯透明3次，每次2min。
(10)中性树胶封固。镜下观察，结果见图3。
5.3、MTT实验
人肝星状细胞LX2以2×103细胞/孔种板于96孔板,用不同浓度的 VU0240551干预0、24、48、72、96h。接下来,20μLMTT(5mg/ml)溶液添加到每个孔,继续孵育4h后置换成150μLDMSO，振荡10分钟。以490nm波长进行吸光度测量。如图4所示，分别以5μM、20μM、50μM干预肝星状细胞LX2，肝星状细胞细胞的增殖能力与对照组比较明显降低，差异有统计学意义(**代表P＜0.001)。
5.4流式细胞术
(1)将人肝星状细胞LX-2接种于六孔板中，当细胞密度达到70％-80％时，按实验分组及要求LX-2细胞进行药物干预，实验组加VU0240551至终浓度为50μM，对照组加入等体积的DMSO；
(2)收集细胞：72小时后弃去培养基，每孔加入0.5ml不含EDTA的胰酶消化细胞，镜下观察细胞形态变化，当细胞逐渐变圆时终止消化，收集细胞至离心管，800rpm离心5分钟，去除上清，用PBS缓冲液继续洗涤细胞2 次，800rpm离心5分钟，去除PBS缓冲液，收集细胞；
(3)取500μl Binding Buffer加入离心管，充分混匀细胞；
(4)取5μl Annexin V-FITC加入离心管，混匀后继续加入5μl Propidium Iodide，充分混匀后于室温下反应15分钟，注意避光操作；
(5)1小时内上机进行流式细胞仪检测，结果见图5，差异有统计学意义(*代表P<0.05)。
5.5、统计学分析
用SPSS26.0软件分析所得数据，实验结果以Mean±SD表示。用Student-t 检验评估两组之间的差异。P<0.05表示差异有统计学意义。
实验中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下就本发明所提供的SLC12A5及其抑制剂的应用做进一步说明。
实施例1：SLC12A5抑制剂VU0240551对肝纤维化的作用验证
1、人肝脏标本免疫组化结果
为了了解SLC12A5在肝纤维化进程中的作用，本发明采集了正常肝脏组织标本以及肝纤维化组织标本并进行免疫组化染色，结果显示：相对于正常组织，肝纤维化组织中的SLC12A5高表达(图1)。
2、动物模型结果
(1)动物血清学结果
在肝纤维化小鼠模型体内使用SLC12A5抑制剂VU0240551干预，小鼠血液标本中AST、ALT以及ALP水平相对于对照组DMSO有明显差异，与正常组无明显差异(图2)；
(2)动物组织染色结果
对肝纤维化小鼠模型的肝脏组织蜡块切片后分别做Col1α1染色、Masson 染色、天狼星红染色，三种染色结果均显示，使用VU0240551干预后，实验组小鼠肝脏汇管区周围的胶原沉积相对于对照组DMSO明显减少，与正常组无明显差异(图3)。
3、MTT实验
人肝星状细胞LX2采用不同浓度的VU0240551干预后，其体外增殖能力受到明显的抑制，且随剂量增加而愈加显著(图4)。
4、流式细胞仪检测人肝星状细胞LX2凋亡
相对于DMSO的NC组，使用VU0240551干预后，人肝星状细胞LX2 出现明显的凋亡，证明SLC12A5抑制剂可以促进人肝星状细胞的凋亡，从而抑制其自身的增殖分化和α-SMA的表达，避免细胞外基质在肝内沉积从而导致肝纤维化(图5)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.VU0240551在制备治疗或改善肝纤维化的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述药物中还包括药学上可接受的载体。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述药学上可接受的载体包括溶剂、聚合物、脂质体、重组病毒载体和真核重组表达载体中的至少一种。
4.根据权利要求1～3任一项所述应用，其特征在于，所述药物为口服药物或注射药物，剂型包括片剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、丸剂或溶液剂。
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