CN115400116A - 木犀草素及其衍生物在调节尿酸分泌蛋白及肾损伤因子表达水平的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了木犀草素及其衍生物在调节尿酸分泌蛋白及肾损伤因子表达水平的药物中的应用。本发明研究确定了木犀草素及其衍生物能够上调尿酸分泌蛋白的表达水平，并逆转肾损伤因子的表达升高，从而起到促进尿酸排泄、缓解肾脏损伤的作用，不仅为木犀草素及其衍生物提供了新的用途，也为高尿酸血症及高尿酸导致的肾损伤的预防、治疗、改善提供了新的药物选择。且木犀草素及其衍生物的成分无明显毒副作用，疗效确切，安全可控，价廉易得。

Description

木犀草素及其衍生物在调节尿酸分泌蛋白及肾损伤因子表达 水平的药物中的应用

本申请是申请日为2020年5月25日、申请号为202010446988.X、发明名称为“木犀草素及其衍生物在预防、治疗高尿酸血症及改善高尿酸导致的肾损伤药物中的应用”的发明专利的分案申请。

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及木犀草素及其衍生物在调节尿酸分泌蛋白及肾损伤因子表达水平的药物中的应用。

背景技术

据报道，我国高尿酸血症(Hyperuricemia，HUA)患者约有1.2亿(约占总人口的10％)，其中男性占19.4％，女性占7.9％。该病已成为继高血压、高血糖、高血脂这“三高”之后的第“四高”。尿酸是体内嘌呤代谢的终产物，也是高尿酸血症和痛风发作的物质基础。人体内尿酸的产生主要有2种途径：一是通过摄入富含嘌呤类食物分解代谢产生(外源性)，占人体内尿酸总量的20％；二是通过体内核蛋白分解产生(内源性)，占总量的80％。内源或外源性嘌呤类物质在黄嘌呤氧化酶的作用下生成次黄嘌呤，进一步生成尿酸，98％以钠盐形式存在。与其他哺乳动物相比，由于在进化过程中基因突变导致人类尿酸氧化酶缺失，无法将尿酸分解为可溶性化合物尿囊素，从而导致血中尿酸水平升高。生理条件下血浆尿酸盐溶解的最大极限约417μmol/L(7mg/dL)(绝经期前的女性约为360μmol/L)，并以此作为理化指标来判断高尿酸血症。肝脏代谢尿酸生成增多、排泄减少均可导致高尿酸血症。临床研究显示，90％的原发性高尿酸血症属于排泄不良型。

肾脏是尿酸排泄的主要器官，机体合成的尿酸2/3从肾脏排泄，1/3从肠道排泄。目前已发现多种转运蛋白参与了肾脏近曲小管对尿酸盐的转运过程，分为重吸收蛋白和分泌蛋白两大类，分布于近端肾小管上皮细胞顶膜和基底膜。尿酸重吸收蛋白包括：尿酸盐阴离子转运体1(URAT1)；葡萄糖转运蛋白9(GLUT9)；有机阴离子转运体(OAT)家族蛋白中的OAT4、OAT10。尿酸分泌蛋白包括：位于基底外侧膜的OAT1、OAT2和OAT3。尿液尿酸经肾小管的尿酸重吸收蛋白重吸收入血，由分泌蛋白重新分泌入尿，最终排出体外。若尿酸重吸收增加或排泄减少，就会导致高尿酸血症及其他相关的全身疾病。目前，临床上高尿酸血症的治疗药物主要有苯溴马隆，别嘌呤醇，非布司他等，研究报道苯溴马隆具有严重的肝、肾毒性，其他药物也有不同程度的不良反应。因此寻找不良反应小、安全有效的治疗高尿酸血症的药物已成为该领域亟待解决的热点问题。

木犀草素(luteolin)是一种天然黄酮类化合物，多以糖苷的形式存在于多种植物中，其中以全叶青兰、野菊花、金银花、紫苏中含量较高。木犀草素和木犀草苷均具有显著抗炎，抗氧化活性，且木犀草素的抗炎活性在一定程度上优于木犀草苷。研究表明木犀草素具有抗炎、抗肿瘤、抗纤维化、抗氧化、抗微生物、抗糖尿病、神经保护和抗过敏等多种作用。木犀草素对黄嘌呤氧化酶活性有抑制作用，并且可明显降低高尿酸血症模型小鼠的血清尿酸水平。但是木犀草素能否通过调节尿酸转运蛋白降尿酸改善肾损伤作用的研究目前尚未见报道。

发明内容

为克服现有技术的不足，本发明提供木犀草素及其衍生物在预防、治疗高尿酸血症及改善高尿酸导致的肾损伤药物中的应用，建立高尿酸血症肾损伤小鼠模型，确定木犀草素对高尿酸血症及高尿酸导致的肾损伤的保护作用。

本发明的技术方案之一：木犀草素及其衍生物在预防、治疗或改善高尿酸血症药物中的应用。

进一步地，所述木犀草素及其衍生物通过抑制黄嘌呤氧化酶活性，降低血清尿酸水平，预防、治疗或改善高尿酸血症。

进一步地，所述木犀草素及其衍生物通过调节尿酸转运蛋白表达水平，预防、治疗或改善高尿酸血症。

进一步地，所述木犀草素及其衍生物通过调节尿酸转运蛋白ABCG2，OCT1，OCT2，OAT3，OAT1的表达水平，降低血清尿酸水平，预防、治疗或改善高尿酸血症。

进一步地，所述木犀草素及其衍生物可制备成片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、口服液、悬浮剂、注射液，各种剂型中木犀草素的质量占药物总质量的30％-60％。

本发明的技术方案之二：木犀草素及其衍生物在预防、治疗或改善高尿酸导致的肾损伤药物中的应用。

进一步地，所述木犀草素及其衍生物通过抑制黄嘌呤氧化酶活性，降低血清尿酸水平，预防、治疗或改善高尿酸导致的肾损伤。

进一步地，所述木犀草素及其衍生物通过调节尿酸转运蛋白表达水平，预防、治疗或改善高尿酸导致的肾损伤。

进一步地，所述木犀草素及其衍生物通过调节尿酸转运蛋白ABCG2，OCT1，OCT2，OAT3，OAT1的表达水平，预防、治疗或改善高尿酸导致的肾损伤。

进一步地，所述木犀草素及其衍生物可制备成片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、口服液、悬浮剂、注射液，各种剂型中木犀草素的质量占药物总质量的30％-60％。

本发明的有益效果是：

1.本发明确定了木犀草素及其衍生物可通过逆转氧嗪酸钾引起的黄嘌呤氧化酶活性升高，引起尿酸合成受阻从而降低血清及肝脏中的尿酸、血尿素氮水平和血清肌酐。

2.本发明首次确定了木犀草素及其衍生物可通过调节高尿酸小鼠尿酸转运相关蛋白的表达，促进尿酸排泄，减少尿酸重吸收，发挥降尿酸作用。

3.本发明还确定了木犀草素及其衍生物能减轻高尿酸引起的肾脏肿胀，逆转高尿酸引起的肾脏损害，逆转高尿酸引起的肾损伤因子KIM-1蛋白表达升高，有肾脏保护功能，且对肝脏没有损伤，无明显毒副作用，疗效确切，安全可控，价格低廉，可用于制备治疗或改善高尿酸血症、高尿酸导致的肾损伤药物，根据需要按药剂学的常规制备方法制成各类剂型，服用方便。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为实施例1中木犀草素对高尿酸血症模型小鼠肾脏外观的影响图，其中，1-7分别代表溶剂对照组，模型组，苯溴马隆组，非布司他组，木犀草素低剂量组，木犀草素中剂量组，木犀草素高剂量组；

图2为实施例1中木犀草素对高尿酸血症模型小鼠肾脏指数的影响图，其中，1-7分别代表溶剂对照组，模型组，苯溴马隆组，非布司他组，木犀草素低剂量组，木犀草素中剂量组，木犀草素高剂量组；

图3为实施例2中木犀草素对高尿酸血症模型小鼠血尿酸的影响图，其中，1-7分别代表溶剂对照组，模型组，苯溴马隆组，非布司他组，木犀草素低剂量组，木犀草素中剂量组，木犀草素高剂量组；

图4为实施例2中木犀草素对高尿酸血症模型小鼠血尿素氮的影响图，其中，1-7分别代表溶剂对照组，模型组，苯溴马隆组，非布司他组，木犀草素低剂量组，木犀草素中剂量组，木犀草素高剂量组；

图5为实施例2中木犀草素对高尿酸血症模型小鼠血肌酐的影响图，其中，1-7分别代表溶剂对照组，模型组，苯溴马隆组，非布司他组，木犀草素低剂量组，木犀草素中剂量组，木犀草素高剂量组；

图6为实施例3中木犀草素对高尿酸血症模型小鼠肾脏组织病理学的影响图；

图7为实施例3中木犀草素对高尿酸血症模型小鼠肝脏组织病理学的影响图；

图8为实施例4中木犀草素对高尿酸血症模型小鼠肝脏黄嘌呤氧化酶活性的影响图，其中，1-7分别代表溶剂对照组，模型组，苯溴马隆组，非布司他组，木犀草素低剂量组，木犀草素中剂量组，木犀草素高剂量组；

图9为实施例4中木犀草素对高尿酸血症模型小鼠血清黄嘌呤氧化酶活性的影响图，其中，1-7分别代表溶剂对照组，模型组，苯溴马隆组，非布司他组，木犀草素低剂量组，木犀草素中剂量组，木犀草素高剂量组；

图10为实施例5中木犀草素对高尿酸血症模型小鼠肾脏尿酸转运蛋白表达水平的影响图，其中，1-7分别代表溶剂对照组，模型组，苯溴马隆组，非布司他组，木犀草素低剂量组，木犀草素中剂量组，木犀草素高剂量组；

图11为实施例5中木犀草素对高尿酸血症模型小鼠肾脏损伤因子蛋白表达水平的影响图，其中，1-7分别代表溶剂对照组，模型组，苯溴马隆组，非布司他组，木犀草素低剂量组，木犀草素中剂量组，木犀草素高剂量组；

图12为实施例6中木犀草素对高尿酸血症模型小鼠24h尿液排泄量的影响图，其中，1-7分别代表溶剂对照组，模型组，苯溴马隆组，非布司他组，木犀草素低剂量组，木犀草素中剂量组，木犀草素高剂量组；

图13为实施例6中木犀草素对高尿酸血症模型小鼠24h尿总蛋白排泄量的影响图，其中，1-7分别代表溶剂对照组，模型组，苯溴马隆组，非布司他组，木犀草素低剂量组，木犀草素中剂量组，木犀草素高剂量组；

图14为实施例6中木犀草素对高尿酸血症模型小鼠24h尿微量白蛋白排泄量的影响图，其中，1-7分别代表溶剂对照组，模型组，苯溴马隆组，非布司他组，木犀草素低剂量组，木犀草素中剂量组，木犀草素高剂量组。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。

另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

以下实施例中通过收集小鼠尿液，检测排尿量，试剂盒检测血清尿酸、尿素氮、肌酐水平、尿总蛋白水平、尿微量白蛋白(MUA)水平；通过蛋白免疫印迹、免疫组化检测尿酸转运蛋白、氧化应激相关蛋白、肾脏损伤因子水平；HE染色、免疫组化方法观察肝、肾病理学变化，检测木犀草素能否改善高尿酸血症小鼠的肾损伤；通过试剂盒检测高尿酸血症小鼠的肾功能指标、肾损伤指标；通过Western blot检测高尿酸血症小鼠肾脏尿酸转运蛋白URAT1，GLUT9，ABCG2，OCT1，OCT2，OAT3，OAT1及肾损伤分子KIM-1的表达水平。

实施例1

动物建模与分组给药，具体步骤如下：

1.实验动物

SPF级ICR雄性小鼠70只，随机分为7组，每组10只，体重22±2g，购自湖北医药学院实验动物中心，合格证号：NO.42000900000308。小鼠分笼饲养，自由饮水、饮食，室温(25±2)℃，相对湿度50％-70％。

2.药物与试剂

氧嗪酸钾盐(Sigma)；次黄嘌呤(Sigma)；苯溴马隆(宜昌长江药业有限公司)；非布司他(华中海威)；木犀草素(宝鸡辰光)。

3.实验方法

3.1高尿酸血症动物模型的建立、给药与取材方法

SPF级ICR雄性小鼠70只，分为7组，每组10只，分别为溶剂对照组，模型组，阳性药对照组：苯溴马隆组(20mg/kg)、非布司他组(10mg/kg)，木犀草素低、中、高剂量组(10，30，90mg/kg)。第1-7天每天18:00灌胃给药，溶剂对照组、模型组、阳性药对照组灌胃给予生理盐水，木犀草素低、中、高剂量组灌胃给药；从第8天开始，每天12:00，溶剂对照组腹腔注射给予生理盐水，模型组、苯溴马隆组、非布司他组、木犀草素低、中、高剂量组均腹腔注射给予上述氧嗪酸钾与次黄嘌呤混合溶液(其中氧嗪酸钾与次黄嘌呤各300mg/kg)；同时，每天18:00溶剂对照组和模型组灌胃给予生理盐水，其他各组分别灌胃相应药物，连续7天；在收集尿液前将小鼠放入代谢笼中提前适应48h，收集末次小鼠灌胃给药前24h的小鼠尿液。在末次小鼠灌胃给药前12h禁食，自由饮水，在末次灌胃给药2h后，摘眼球取血，4000rpm，4℃离心10min，取上清液用于检测血清尿酸、肌酐、尿素氮水平及黄嘌呤氧化酶活性。采血后颈部脱臼处死小鼠，用预冷的生理盐水进行心脏灌流，将肝脏肾脏中的血液排除干净。冰上取两小块肝脏，一块迅速置于EP管中冰浴，用于制备肝组织匀浆液。另一块肝脏固定于4％多聚甲醛溶液，用于观察肝脏病理学变化。取下两肾，拍照并称重，计算肾脏指数。肾脏指数计算公式如下：

肾脏指数(％)＝双肾重量(g)*100/体重(g)

其中一肾剥外膜，纵切成两份，置4％多聚甲醛中固定，用于组织病理学检查。另外一肾纵切成两份，分别置2mL已标记的EP管中，一份置-80℃冰箱保存，一份投入液氮中保存。所有操作均在冰上进行。上述各组灌胃、腹腔注射生理盐水及给药均按照0.4mL/20g进行。

4.实验结果

图1中，1-7分别是溶剂对照组，模型组，苯溴马隆组，非布司他组，木犀草素低剂量组，木犀草素中剂量组，木犀草素高剂量组的小鼠肾脏外观图。由图中可以看出，模型组、苯溴马隆组和非布司他组小鼠肾脏明显肿胀，随着木犀草素剂量增加小鼠肾脏肿胀减轻，肾脏颜色也逐渐恢复。

图2为溶剂对照组，模型组，苯溴马隆组，非布司他组，木犀草素低剂量组，木犀草素中剂量组，木犀草素高剂量组的小鼠肾脏指数图，由图中可以看出，模型组和苯溴马隆组小鼠肾脏指数明显增高，随着木犀草素剂量增加小鼠肾脏指数明显降低、趋于正常。

结论：木犀草素能减轻高尿酸血症引起的肾脏肿胀。

实施例2

对实施例1取到的血清进行血清尿酸、肌酐、尿素氮水平检测

1.药物与试剂

尿酸、肌酐、尿素氮检测试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所，货号分别为C012-2、C011-1、C013-2。

2.实验方法

将上述离心取得的血清置于冰上，分别按照南京建成试剂盒说明书检测小鼠血清尿酸、血清肌酐、血清尿素氮水平。

3.实验结果

3.1木犀草素能明显降低HUA小鼠的血清尿酸水平

图3为木犀草素对高尿酸血症模型小鼠血尿酸的影响，由图中可以看出，与溶剂对照组比较，模型组小鼠血清尿酸水平具有显著的统计学意义，提示造模成功。与模型组比较，苯溴马隆组能降低HUA小鼠血清尿酸水平；非布司他组能显著降低HUA小鼠血清尿酸水平，且他们的降尿酸效果与木犀草素比较无统计学意义；低、中、高剂量木犀草素组均能显著降低血清尿酸水平，且呈剂量依赖性。

3.2木犀草素能明显降低HUA小鼠血清肌酐和尿素氮水平

由图4和图5可以看出，与溶剂对照组比较，模型组血尿素氮水平和血清肌酐显著升高。与模型组比较，苯溴马隆组、非布司他组和低、中、高剂量木犀草素组均能显著降低HUA小鼠的血尿素氮水平和血清肌酐。

结论：木犀草素能降低高尿酸血症小鼠尿酸水平，血尿素氮水平和血清肌酐，减轻高尿酸血症及高尿酸引起的肾脏损伤。

实施例3对实施例1取到的肾脏和肝脏进行组织病理学检查

1.药物与试剂

苏木素-伊红(HE)染色试剂盒，购自碧云天生物技术有限公司，货号为C0105。

2.实验方法

小鼠的肾脏和肝脏组织放入4％多聚甲醛固定液固定24h后，于组织包埋机中进行脱水、透明、浸蜡及石蜡包埋。采用轮转式切片机连续切片(3-4μm厚度)，HE染色，经脱蜡、水洗、分化、返蓝、伊红染色、脱水、透明和封片之后，在显微镜下观察肾脏和肝脏组织的病理学变化。

3.实验结果

3.1木犀草素能逆转高尿酸引起的肾脏损害

如图6所示，小鼠肾脏HE染色结果显示：模型对照组、苯溴马隆组、非布司他组均出现肾小管扩张和肾小管上皮萎缩(图中黑色箭头代表肾小管扩张，红色箭头代表肾小管上皮萎缩)，而木犀草素中、高剂量组与溶剂对照组比较无显著性差异。

结论：木犀草素能逆转高尿酸引起的肾脏损害。

3.2木犀草素对肝脏基本无影响

如图7所示，模型对照组肝细胞形态与溶剂对照组相近。与模型对照组比较，苯溴马隆组出现明显的肝细胞高度水肿，肝窦消失及部分细胞坏死，这与文献中报道的苯溴马隆存在严重的肝毒性的结论相一致。非布司他和木犀草素各组均未出现明显肝脏损伤。

实施例4对实施例1取到的血清和肝脏进行黄嘌呤氧化酶活性检测

1.药物与试剂

黄嘌呤氧化酶试剂盒购自碧云天生物技术有限公司，货号为A002-1-1。

2.实验方法

采用黄嘌呤氧化酶检测试剂盒，按其使用说明书操作步骤进行测定。取小鼠肝组织约0.1g，根据黄嘌呤氧化酶检测试剂盒要求加入0.9mL的生理盐水，在冰浴中以眼科剪刀迅速剪碎、匀浆，匀浆机开至第6档，匀浆3次，每次停10s。16000g，4℃离心10min，取上清液用于检测肝脏黄嘌呤氧化酶活性。血清中黄嘌呤氧化酶活性亦根据上述黄嘌呤氧化酶检测试剂盒要求进行检测。

3.实验结果

3.1木犀草素能逆转高尿酸引起的黄嘌呤氧化酶活性升高

如图8所示，与模型对照组比较，非布司他和木犀草素各组的肝脏黄嘌呤氧化酶活性具有统计学意义，检测结果显示非布司他组的该酶活性与溶剂对照组无明显差异，这与非布司他降尿酸的作用原理相一致，即非布司他作为一种黄嘌呤氧化酶抑制剂，它可使该酶活性丧失引起尿酸合成受阻从而消除高尿酸血症。木犀草素各组的该酶活性与模型组相比，也均有所降低，且呈剂量依赖性。同时，我们对血清中的黄嘌呤氧化酶活性进行了检测，结果如图9所示，图中显示血清中黄嘌呤氧化酶活性变化趋势与肝脏中基本一致。

结论：木犀草素能逆转氧嗪酸钾引起的黄嘌呤氧化酶活性升高。

实施例5对实施例1取到的肾脏进行肾脏尿酸转运蛋白URAT1，GLUT9，ABCG2，OCT1，OCT2，OAT3，OAT1的表达水平、肾损伤因子KIM-1表达水平的检测

1.药物与试剂

RIPABuffer(Cell Signaling Technology，9806S)；Cocktail(AMRESCO，3235C020)；BCA试剂盒(Thermo Scientific，PL212739)；预染蛋白Marker(普利莱基因技术有限公司，P1103)；β-actin(cell Signaling，#4970)；URAT1(ABBIOTEC，250521)；GLUT9(Thermo Fisher Scientific，PA5-22966)；ABCG2，OAT3，OCT1(BiosynthesisBiotechnology,bs-0662R,bs-0609R,bs-20814R)及OAT1，OCT2(Abcam,ab135924,ab170871)；Goat Anti-Rabbit IgG H&amp；L(HRP)(Abcam，ab97051)；SuperECL plus(普利莱基因技术有限公司，P1010)

2.实验方法

按照每100mg组织加入1000μL裂解液(10μl cocktail和990μl RIPA)。冰上眼科剪将组织迅速剪碎、匀浆3次，每次停10s，之后超声10下，冰浴中放置30min。12000g，4℃离心20min，取上清至新的EP管中，即得到组织总蛋白产物。10倍稀释蛋白样品，BCA法进行蛋白浓度测定。蒸馏水调平各组蛋白浓度，加入2×loading buffer(含2％β-巯基乙醇)混匀，封口膜密封，沸水中煮10min，之后冰浴5min。根据蛋白浓度和每次电泳需要的蛋白量进行分装，-80℃储存。取等量的蛋白样品(约30μg)经SDS-PAGE电泳分开后，按照免疫印迹的方法将蛋白转移至PVDF膜上。用含5％脱脂奶粉的封闭液将膜在室温，摇床上封闭2h。用TBST清洗封闭液，然后孵育一抗，一抗稀释比例为URAT1(1:800)，GLUT9(1:2000)，ABCG2(1:2000)，OAT1(1:2000)，OAT3(1:500)，OCT1(1:500)，OCT2(1:2000)，KIM-1(1:2000)和内参β-actin(1:2000)，在室温下摇床孵育2h，TBST缓冲液洗膜三次，每次10min，换为对应的辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗标记(1:10000)进行孵育，室温孵育1.5h，TBST缓冲液洗膜三次，每次10min。然后取化学发光底物试剂盒中的A、B两种试剂各300μL，混匀后迅速盖上PVDF膜，膜上发光，显影，最后用ImageQuant LAS4000凝胶成像仪进行光密度值分析。

3.实验结果

3.1木犀草素能显著上调HUA小鼠肾脏OAT3、OCT2和ABCG2的蛋白表达，并且能够逆转高尿酸引起的肾损伤因子KIM-1蛋白表达升高

如图10所示，与溶剂对照组相比，模型组尿酸分泌蛋白表达量明显降低。模型组尿酸排泄障碍导致高尿酸血症，与血尿酸检测结果一致。与模型组相比，木犀草素组ABCG2，OCT2，OAT3尿酸分泌蛋白表达量明显升高，并具有剂量依耐性，而对OCT1，OAT1表达量有微弱的上调。苯溴马隆组能上调ABCG2，OCT1，OCT2，OAT1和OAT3蛋白表达水平。非布司他能明显上调OAT3蛋白表达水平。而木犀草素组对URAT1和GLUT9尿酸重吸收蛋白表达水平影响不明显。

结论：木犀草素能显著上调HUA小鼠肾脏OAT3、OCT2和ABCG2的促尿酸分泌转运蛋白表达水平，促进尿酸排泄。

如图11所示，与溶剂对照组相比，模型组肾损伤因子KIM-1蛋白表达量明显升高。而木犀草素组能够逆转高尿酸引起的肾损伤因子KIM-1蛋白表达升高。

结论：木犀草素能够逆转高尿酸引起的肾损伤因子KIM-1蛋白表达升高，缓解高尿酸引起的小鼠肾脏损伤。

实施例6对实施例1取到的尿液进行尿总蛋白和尿微量白蛋白的检测

1.药物与试剂

小鼠微量白蛋白尿(Microalbuminuria,MAU)ELISA试剂盒(武汉新启迪生物科技有限公司，PL212739)；BCA试剂盒(Thermo Scientific，PL212739)

2.实验方法

对实施例1收集到的尿液，16000g，4℃离心10min，取上清，根据上述小鼠尿微量白蛋白(MAU)ELISA试剂盒要求进行检测小鼠尿微量白蛋白。根据上述BCA试剂盒要求进行检测小鼠尿总蛋白浓度。再根据24h尿液排泄量计算出24总蛋白和微量白蛋白排泄量。

3.实验结果

3.1高尿酸血症小鼠24h尿液、总蛋白、微量白蛋白排泄量明显增加，木犀草素能显著减少HUA小鼠24h尿液、总蛋白和微量白蛋白排泄量。

如图12，13，14所示，与溶剂对照组相比，模型组24h尿液、总蛋白、微量白蛋白排泄量明显增多。而木犀草素组能够逆转高尿酸引起的24h尿液、总蛋白、微量白蛋白排泄量明显增多。

结论：木犀草素能缓解高尿酸引起的小鼠肾脏损伤。

本发明以次黄嘌呤和氧嗪酸钾的混合溶液对小鼠进行腹腔注射，建立小鼠高尿酸血症模型，氧嗪酸钾是一种尿酸酶抑制剂，通过抑制尿酸酶从而抑制尿酸在体内的分解诱发高尿酸血症。次黄嘌呤经黄嘌呤氧化酶催化可最终转化尿酸。阳性对照药物苯溴马隆通过阻断近曲肾小管对尿酸的重吸收，从而促进尿酸的排泄；非布司他是一种口服的非嘌呤选择性黄嘌呤氧化酶抑制剂,通过抑制黄嘌呤氧化酶活性，使尿酸生成减少，具有良好的降低血清尿酸作用。

肾脏是尿酸排泄的主要器官，HUA是尿酸排泄减少所引起的细胞外液尿酸盐超饱和状态。尿酸排泄需多种表达于肾小管上皮细胞的尿酸重吸收蛋白和分泌蛋白共同协调完成，这些转运蛋白是肾脏调节和保持体内尿酸水平稳定的关键，也是多种内源性和外源性降尿酸物质的作用靶点。本发明通过以尿酸转运相关蛋白为靶点探索木犀草素降尿酸作用机制，结果发现，木犀草素具有显著的、抑制黄嘌呤氧化酶活性减少尿酸生成、促进尿酸排泄，且可以通过调节尿酸转运蛋白ABCG2，OCT1，OCT2，OAT3，OAT1的表达水平，预防、治疗或改善高尿酸血症及高尿酸导致的肾损伤。并且木犀草素为纯植物提取活性成分，具有毒副作用小，疗效确切，安全可控，价格低廉等优点，可将木犀草素开发为新的降尿酸并改善高尿酸肾损伤的药物及健康产品，具有好的应用前景。

实施例7将木犀草素制备成片剂

取木犀草素，加入淀粉等片剂常规辅料，研磨混合过筛，干法制粒，整粒，压制成片剂，其中木犀草素质量占药物总质量的30％。

实施例8将木犀草素制备成胶囊剂

取木犀草素，加入淀粉、乳糖等胶囊剂常规辅料，混匀，过筛，灌装制备成胶囊剂，其中木犀草素质量占药物总质量的60％。

实施例9将木犀草素衍生物：木犀草素苷，制备成颗粒剂

取木犀草素苷，加入淀粉、糖粉、硬脂酸镁等颗粒剂常规辅料，混匀，过筛，干法制粒，整粒制备成颗粒剂，其中木犀草素衍生物质量占药物总质量的50％。

实施例10将木犀草素制备成注射剂

取木犀草素，加入甘露醇、注射用水等制备注射剂的常规辅料，按照常规注射剂的生产方法制备得到注射液，其中木犀草素质量占药物总质量的40％。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.木犀草素及其衍生物在调节尿酸分泌蛋白及肾损伤因子表达水平的药物中的应用，其特征在于：所述木犀草素及其衍生物用于上调所述尿酸分泌蛋白的表达水平，并逆转所述肾损伤因子的表达升高。

2.根据权利要求1所述的木犀草素及其衍生物在调节尿酸分泌蛋白及肾损伤因子表达水平的药物中的应用，其特征在于：所述尿酸分泌蛋白包括ABCG2、OCT1、OCT2、OAT3、OAT1。

3.根据权利要求2所述的木犀草素及其衍生物在调节尿酸分泌蛋白及肾损伤因子表达水平的药物中的应用，其特征在于：所述肾损伤因子为KIM-1。

4.根据权利要求2所述的木犀草素及其衍生物在调节尿酸分泌蛋白及肾损伤因子表达水平的药物中的应用，其特征在于：所述木犀草素及其衍生物对ABCG2、OCT2、OAT3的蛋白表达水平的上调程度大于对OCT1、OAT1的蛋白表达水平的上调程度。

5.根据权利要求4所述的木犀草素及其衍生物在调节尿酸分泌蛋白及肾损伤因子表达水平的药物中的应用，其特征在于：所述木犀草素及其衍生物对ABCG2、OCT2、OAT3的蛋白表达水平的上调具有剂量依赖性。

6.根据权利要求5所述的木犀草素及其衍生物在调节尿酸分泌蛋白及肾损伤因子表达水平的药物中的应用，其特征在于：所述木犀草素及其衍生物的使用剂量为10～90mg/kg。

7.根据权利要求2所述的木犀草素及其衍生物在调节尿酸分泌蛋白及肾损伤因子表达水平的药物中的应用，其特征在于：所述木犀草素及其衍生物通过上调所述尿酸分泌蛋白的表达水平，能够促进尿酸排泄，预防、治疗或改善高尿酸血症。

8.根据权利要求3所述的木犀草素及其衍生物在调节尿酸分泌蛋白及肾损伤因子表达水平的药物中的应用，其特征在于：所述木犀草素及其衍生物通过逆转所述肾损伤因子的表达升高，能够缓解肾脏损伤。

9.根据权利要求1所述的木犀草素及其衍生物在调节尿酸分泌蛋白及肾损伤因子表达水平的药物中的应用，其特征在于：所述木犀草素及其衍生物的质量占所述药物总质量的30％～60％。

10.根据权利要求1所述的木犀草素及其衍生物在调节尿酸分泌蛋白及肾损伤因子表达水平的药物中的应用，其特征在于：所述药物为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、口服液、悬浮剂、注射液中的一种。

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