CN114984060A - 一种具有降低血清中尿酸的组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发涉及于微生物领域及医药技术领域，尤其涉及一种具有降低血清中尿酸的组合物及其应用。组合物为组分A和组分B，组分A为含格氏乳杆菌Lactobacillus gasseri BKR‑007，组分B为含木犀草素；组合物中格氏乳杆菌BKR‑007含量为0.6×108～1.8×1010CFU/kg(B.W.)，组合物中木犀草素含量为1～40mg/kg(B.W.)。实验表明，菌株BKR‑007可以促进机体对木犀草素的吸收并维持较高血药浓度。与单组分菌株BKR‑007、木犀草素或菊花提取物相比，使用较低剂量的复方组合物即可对高尿酸血症及其因高尿酸血症所诱发的机体慢性亚炎症状态、肝肾功能损伤等产生良好的改善作用。

Description

一种具有降低血清中尿酸的组合物及其应用
技术领域
本发涉及于微生物领域及医药技术领域，尤其涉及一种具有降低血清中尿酸的组合物及其应用。
背景技术
痛风是一种由于机体长期处于嘌呤代谢紊乱导致尿酸排泄减少从而血尿酸水平的增高导致尿酸盐晶体在关节、软骨和肾脏等沉积特征性的代谢性疾病[1]。高尿酸血症是引起痛风的重要生化基础以及最危险的因素[2]，其临床诊断指标为男性血尿酸含量大于420μmol/L，女性大于357μmol/L[1]。
研究表明，在长期处于高尿酸血症的胁迫下，机体亦可诱发慢性低度炎症，并对肝脏及肾脏功能造成损伤。造成肝脏损伤的一个重要机制为：肝脏中黄嘌呤氧化酶(XOD)在将底物氧化为尿酸的过程中伴随限制性氧胁迫(ROS)现象，产生过量自由基包括O2 -及H2O2进而造成肝功受损及慢性低度炎症[5-6]。造成肾脏损伤的重要机制为：一方面引起尿酸结晶成沉积，间接导致肾小动脉和慢性炎症，引起肾脏损伤加重。另一方面，流行病调查研究显示尿酸可以引发肾小球小动脉病变，直接导致慢性肾脏疾病[7]。除此，高尿酸血症亦可诱发高血压[8]、糖尿病[8]、冠状动脉粥样硬化性心脏病[9]及肥胖[10]等一系列慢性疾病。故控制血清中尿酸的水平，对降低痛风及其它代谢性疾病的诱发风险具有重要意义。
人体血清中的尿酸来源主要有两种途径，一种为外源性的，由食物中所富含的嘌呤类化合物经人体肠道吸收，进入血液，进而在肝脏中转化为黄嘌呤，黄嘌呤进一步经黄嘌呤氧化酶(XOD)转化为尿酸，故对于高尿酸血症的患者，需要尽量减少高嘌呤食物的摄取，进而减少尿酸的生成；一种为内源性的，由人体自身合成或由嘌呤核苷酸合成与分解代谢形成，故单纯的降低食物中嘌呤的摄取不能从根本上降低高尿酸血症患者体内尿酸的水平。
故在临床实践中则往往使用黄嘌呤氧化酶(XOD)抑制剂，如别嘌醇等，控制血清中尿酸的水平。而常见的药物如别嘌醇、非布司他或溴苯马龙等则往往具有较多的不良反应及副作用，为长期使用控制血清中的尿酸水平造成隐患。
益生菌对食物中外源性嘌呤化合物在肠道中的降解具有重要作用，已报到的具有此类功能的菌株有：发酵乳杆菌MEP181504(Lactobacillus fermentum)、短乳杆菌EMP181507(Lactobacillus brevis)、口乳杆菌NITE P-223(Lactobacillus oris)、格氏乳杆菌JCM8787(Lactobacillus gasseri)(特開2013-48636(P2013-48636A)、酵乳杆菌MEP181504(L.fermentum)及短乳杆菌MEP 181507(L.brevis)等(特開2013-48636(P2013-48636A)。这些菌株主要对黄嘌呤、鸟嘌呤、鸟嘌呤核苷酸、肌苷及腺苷等具有良好的降解作用。
近年，以木犀草素为代表的黄酮类化合物因具有抑制嘌呤氧化酶 (XOD)能力而被用于治疗高尿酸血症的研究[11]，木犀草素来源广泛，存在于多种植物中，尤其广泛存在于水果和蔬菜中。如药用植物全叶青兰、裸花紫珠、金银花、马齿苋、锦灯笼、鹿茸草、北刘寄奴等；唇形科药材荆芥、黄芩、半枝莲、白毛夏枯草、紫苏、独一味等；菊科药材墨旱莲、野菊花、菊花、蒲公英、洋甘菊等；蔬果中辣椒、胡萝卜、洋蓟、芹菜、甜椒、油橄榄等；农作物中的花生壳、玉米须等[12-20]。以菊花为代表的富含木犀草素的天然药物亦被证实具有降低血清中尿酸水平的作用[21]。
由于木犀草素水溶性较差[22-23]，限制了其临床应用，故有研究报道利用磺丁基醚-β-环糊精(SBE-β-CD)对其进行包埋制成包合物。动物实验表明，木犀草素在大鼠体内消除符合二室消除模型，与木犀草素相比，木犀草素/SBE-β-CD包合物达峰时间提前，药-时曲线下面积增大，生物利用度提高[24]。
但由于SBE-β-CD不属于食品原料，故无法应用于普通食品中，这就大大的限制了该包埋方式的应用范围。并且富含木犀草素的天然提取物，因其它天然产物组成复杂且木犀草素含量有限，故亦不适合采用此种包埋方式提高机体对木犀草素的生物利用度，所以提高机体对此类天然产物中木犀草素的吸收是目前所要解决的问题。
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发明内容
本发明目的在于提供一种具有降低血清中尿酸的组合物及其应用。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种具有降低血清中尿酸的组合物，组合物为组分A和组分B，组分 A为含格氏乳杆菌Lactobacillus gasseri BKR-007，组分B为含木犀草素；组合物中格氏乳杆菌BKR-007含量为0.6×108～1.8×1010CFU/kg(B.W.)，优选使用量为0.6～1.8×109CFU/kg(B.W.)，组合物中木犀草素含量为 1～40mg/kg(B.W.)，优选使用量为2.5～22.5mg/kg(B.W.)。
所述含格氏乳杆菌Lactobacillus gasseri BKR-007的组分A为格氏乳杆菌BKR-007的培养物、菌悬液、冻干粉或其它含格氏乳杆菌BKR-007的制剂。
所述含木犀草素的组分B为木犀草素单质或天然提取获得的含木犀草素的提取物，其中，天然提取获得的提取物为经植物提取获得。
所述的植物为芦丁、青兰、裸花紫珠、金银花、马齿苋、锦灯笼、鹿茸草、北刘寄奴、荆芥、黄芩、半枝莲、白毛夏枯草、紫苏、独一味、墨旱莲、野菊花、菊花、蒲公英、洋甘菊、辣椒、胡萝卜、洋蓟、芹菜、甜椒、油橄榄、花生壳、玉米须中的一种或几种。优选为菊花作为木犀草素的天然来源。
所述组合物中格氏乳杆菌BKR-007含量为0.6～1.8×109CFU/kg (B.W.)，组合物中木犀草素含量为2.5～22.5mg/kg(B.W.)。
一种具有降低血清中尿酸的组合物的应用，所述组合物在治疗或改善高尿酸血症及其所诱发的慢性炎症及肝肾损伤中的应用。
所述组合物在制备治疗或改善高尿酸血症及其所诱发的慢性炎症及肝肾损伤的药物、日化品、化妆品、食品添加剂、保健食品及其在其它食品中的应用。
所述组合物中两组分相互协调、促进(格氏乳杆菌使机体增加对木犀草素吸收率)，提高血药浓度，延长其半衰期在制备治疗或改善高尿酸血症及其所诱发的慢性炎症及肝肾损伤的药物、日化品、化妆品、食品添加剂、保健食品及其在其它食品中的应用。
上述组合物中，所述菌株BKR-007、木犀草素及优选的菊花提取物，经动物实验，除具有可降低血清中尿酸水平，亦具有调节免疫因子、增强肝脏代谢能力及抗氧化水平、提高肾脏对代谢产物的清除作用。
所述菌株BKR-007经动物实验，亦具有可以促进机体对木犀草素的吸收水平，提高血药浓度，延长半衰期的功能。
由此可见组合物具有显著的协同作用，在满足或提高生理活性的同时，可以显著降低各组分使用剂量。
所述的具有协同作用，其所体现的组合物生理活性增强体现为：
降低高尿酸血症者血清中的尿酸水平；
降低因高尿酸血症所诱发的慢性炎症状态，包括：肿瘤坏死因子-α (THF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、脂多糖(LPS)及一氧化氮(NO)。
改善肝脏代谢及抗氧化能力，包括：提高超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)及谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的活力，降低代谢中间产物丙二醛(MDA)积累量。
改善肾脏代谢能力，包括降低血清中肌苷(Scr)及尿素氮(BUN)含量。
与现有技术相比，本发明的技术优势体现为：
本发明首次将具有降解尿酸前体的益生菌与含具有嘌呤氧化酶抑制能力的木犀草素结合，通过二者的协同作用，利用多途径降低血清中尿酸水平。进一步的，本发明首次发现菌株BKR-007具有增强机体对木犀草素的吸收，延长木犀草素在血清中半衰期的作用，同时，菌株BKR-007减少机体对尿酸前体的吸收,木犀草素抑制尿酸前体转化为尿酸，从而增强抑制血清中尿酸水平；相互协调从而进一步增强抑制血清中尿酸水平的作用。故与单组分菌株BKR-007、木犀草素物质或由菊花提取的木犀草素相比，使用较低剂量的复方组合物对高尿酸血症及其因高尿酸血症所诱发的亚炎症状态及其肝肾功能的损伤即具有较好的改善作用；进而可以大幅度的减少单方使用剂量，降低使用成本。
附图说明
图1为本发明实施例提供的不同添加量的菌株BKR-007、木犀草素及其组合物对大鼠血清中尿酸的抑制水平效果图(n＝8，SD)。
图2为本发明实施例提供的菌株BKR-007、菊花提取物及其组合物对大鼠血清中尿酸的抑制水平.(n＝8，SD)。
图3为本发明实施例提供的大鼠灌胃后血清中木犀草素平均药时曲线. (n＝6，SD)。
图4为本发明实施例提供的菌株BKR-007、木犀草素、菊花提取物及其组合物对大鼠血清中嘌呤氧化酶活性的抑制作用.(n＝8，SD)。
图5为本发明实施例提供的25周持续高嘌呤饮食作用下大鼠血清中与炎症相关因子的活性水平.(n＝8,SD)。
图6为本发明实施例提供的20周持续高嘌呤饮食作用下本发明组合物对小鼠肝脏的保护.(n＝8,SD)。
图7为本发明实施例提供的20周持续高嘌呤饮食作用下本发明组合物对小鼠肾脏的保护.(n＝8,SD)。
图8为本发明实施例提供的各组健康志愿者治疗前后血清中尿酸减少量的比较.(n＝12，SD)。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明组合物中一种物质为前期已经分离出的一株具有广泛降解尿酸前体(降解黄嘌呤、鸟嘌呤、鸟嘌呤核苷酸、肌苷及腺苷外亦具有降解次黄嘌呤及鸟嘌呤的能力)的菌株格氏乳杆菌BKR-007，其可以良好的降低机体对外源性尿酸前体的吸收。进一步的，将该菌株与木犀草素或富含木犀草素的天然产物(菊花提取物)联合使用，两者具有协同作用，可以增强机体对木犀草素的吸收，提高血药浓度，延长保留时间，通过进一步抑制嘌呤氧化酶(XOD)活性从而增强抑制血清中的尿酸水平，故可以减少木犀草素或菊花提取物的使用量从而达到使用效果。
同时，复方组合物除具有直接降低血清中尿酸的水平，对改善高尿酸血症及因高尿酸血症所诱发的亚炎症状态及其肝肾功能损伤的改善，亦可显著改善机体的慢性炎症状态及肝肾功能损伤。
下述实施例中记载的菌株BKR-007已在申请号为2022104408921，发明名称为一株格氏乳杆菌及其在降低血尿酸中的应用的专利文献中记载并提供了相应的保藏证明。
实施例1不同投喂量下的菌株BKR-007、木犀草素及其组合物对大鼠血清中尿酸水平的影响
菌株BKR-007的制备方法为：将保存于甘油管的菌株BKR-007接种于 MRS培养基，37℃培养至OD600为1.2，培养后的发酵液装于离心管，4000rpm 离心10min，弃上清液回收菌体。利用生理盐水将菌体重悬至 1.0×1010CFU/ml备用。
木犀草素，纯度>97％，陕西惠科植物开发有限公司。
高尿酸大鼠模型采用给大鼠腹腔注射氧嗪酸钾(300mg/kg/Day)并辅以高嘌呤饮食(酵母浸粉5.5g/只/Day、腺嘌呤36mg/只/Day)建立。实验动物采用雄性SD大鼠，在室温下饲养，自由饮食采食，经1周适应性饲养后，随机将其平均分成18组，每组8只，每组实验条件如表1.所示：
表1.各组大鼠的实验条件.
Figure RE-GDA0003786450490000061
如表1.所述，大鼠全天进食高嘌呤食物，每天上午对大鼠进行氧嗪酸钾注射，进行高尿酸血症建模，各组每天晚间分别灌胃菌株BKR-007、木犀草素及其混合物，持续20天。
采血方式为鼠尾采血，将采集的血液经3000rad/min离心10min后，制得血清，利用尿酸检测试剂盒(BioVision Inc.,Milpitas,CA,USA)测定各组大鼠血清中尿酸的水平。
实验结果数据的统计学分析：采用(x±s)表示，用SPSS 17.0统计软件进行分析，多组间均数比较采用单因素方差分析(ANOVA)，两组间均数比较采用独立t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
20天实验结束后，各组大鼠血清中尿酸水平如图1.所示：
由图1.可知，注射氧嗪酸钾并结合高嘌呤饮食后，大鼠血清中尿酸水平由58.80±7.47umol/L(NC)提高至202.03±13.66umol/L(Control)，利用别嘌醇处理后，可将大鼠血清中尿酸降至92.44±6.58umol/L(PC)，证明造模成功。
单独使用木犀草素及菌种BKR-007后，均具有降低大鼠血清中尿酸效果，但当木犀草素给药浓度降至2.5mg/kg时(LL)，则与Control组未见显著差异(P>0.05)。并且随着菌株BKR-007使用量的降低，其降低大鼠血清中尿酸的能力亦随之降低。
但是当不同浓度的木犀草素及菌株BKR-007组合后发现，高浓度的木犀草素与高浓度的菌株BKR-007组合后(LH-BH)，与其单独使用相比，并未进一步降低大鼠血清中尿酸的水平，但有趣的是，中低浓度的木犀草素与菌株BKR-007组合(LM-BH、LM-BM、LL-BH、LL-BM)后，与单独使用中低浓度的木犀草素(LM及LL)相比，则显著的将大鼠血清中尿酸水平降至与高浓度组合组(LH-BH)相一致，尤为明显的是，当低浓度木犀草素(2.5mg/kg)与中浓度菌株BKR-007(0.6×109CFU/kg)组合使用时，该组(LL-BM)大鼠平均血清中尿酸水平为120.83±12.01umol/L，与 LH组(123.23±13.35umol/L)、BH组(125.33±9.71umol/L)及LH-BH组 (119.69±7.64umol/L)未见显著性差异。
故将木犀草素及菌株BKR-007的组合物，其优选的推荐用量为LL-BM 组使用剂量，即为木犀草素为2.5mg/kg，菌株BKR-007为0.6×109CFU/kg。
实施例2菌株BKR-007与不同浓度含木犀草素的菊花提取物对大鼠血清中尿酸水平的影响
含木犀草素的菊花提取物为食品级菊花提取物，其为选取木犀草素含量为10％的杭白菊(Chrysanthemum morifolium)提取物，该提取物购自 ORYZA OIL&FAT CHEMICALCO.,LTD.(菊の花エキス-P)。
菌株的制备：(参见实施例1.)
高尿酸大鼠的造模：(参见实施例1.)
血清中尿酸水平的测定：(参见实施例1.)
实验结果数据的统计学分析：(参见实施例1.)
将大鼠平均分为10组，每组8只，每组实验条件如表2.所示：
表2.各组大鼠的实验条件.
Figure RE-GDA0003786450490000071
Figure RE-GDA0003786450490000081
如表2.所述，大鼠全天进食高嘌呤食物，每天上午对大鼠进行氧嗪酸钾注射，进行高尿酸血症建模，各组每天晚间分别灌胃菌株BKR-007、菊花提取物及其混合物，持续20天。
20天实验结束后，各组大鼠血清中尿酸水平如图2.所示：
由图2.可知，注射氧嗪酸钾并结合高嘌呤饮食后，大鼠血清中尿酸水平由67.35±3.11umol/L(NC)提高至202.47±11.54umol/L(Control)，利用别嘌醇处理后，可将大鼠血清中尿酸降至100.72±7.73umol/L(PC)，证明造模成功。
当单独使用菊花提取物后，可见具有降低大鼠血清中尿酸效果，但当菊花提取物给药浓度降至25mg/kg时(CL)，则与Control组未见显著差异 (P>0.05)。
而当不同浓度的菊花提取物与菌株BKR-007(1.2×109CFU/kg)同时喂养后，则可发现两者具有协同作用，CH-BM组(118.59±15.44umol/L)、 CM-BM组(120.03±13.77umol/L)及CL-BM组(130.64±7.71umol/L)大鼠血清中的尿酸水平均低于CH组(140.82±6.65umol/L)和BM组 (143.12±9.25umol/L)，可见即便是较低浓度的菊花提取物，在与菌株 BKR-007复配后，亦可达到理想的降低血清中尿酸的效果。
故本发明菊花提取物及菌株BKR-007的组合物，其优选的推荐用量为 CL-BM组使用剂量，即为菊花提取物为25mg/kg，菌株BKR-007为 0.6×109CFU/kg。
实施例3菌株BKR-007对大鼠体内木犀草素及菊花提取物吸收作用的影响
菌株的制备：(参见实施例1.)
木犀草素：(参见实施例1.)
菊花提取物：(参见实施例2.)
实验动物：雄性SD大鼠，普通鼠粮适应性喂养1周后实验。
血浆样品的处理及测定：精密吸取血浆200μl，加入内标溶液和乙腈各 100μl，旋涡振荡30s，加入乙腈400μl，旋涡振荡30s，离心(12000rad/min) 10min，取上清液600μl，氮气吹干，以100μl流动相溶解，精密吸取20μl 进样分析，用以测定大鼠血浆中木犀草素的含量。
血清中木犀草素的检测：利用高效液相色谱法(HPLC)分别对各组大鼠血清进行检测，条件为：色谱柱：Agilent TC-C18色谱柱(4.6mm×150mm， 5μm)；流动相：乙腈-0.5mol/L；磷酸二氢钾(40:60)；流速：1.0ml/min；检测波长：280nm；柱温：室温(22℃)；进样量：20μl。
菌株BKR-007在不同剂量下对木犀草素吸收的促进作用：
实验共分为8组，每组6只。
第1组为空白对照组，不喂食菌株BKR-007；
第2组每天灌胃活菌株BKR-007的剂量为0.3×108CFU/kg(B.W.)；
第3组每天灌胃活菌株BKR-007的剂量为0.6×108CFU/kg(B.W.)；
第4组每天灌胃活菌株BKR-007的剂量为1.8×108CFU/kg(B.W.)；
第5组每天灌胃活菌株BKR-007的剂量为0.6×109CFU/kg(B.W.)；
第6组每天灌胃活菌株BKR-007的剂量为1.8×109CFU/kg(B.W.)；
第7组每天灌胃活菌株BKR-007的剂量为0.6×1010CFU/kg(B.W.)；
第8组每天灌胃活菌株BKR-007的剂量为1.8×1010CFU/kg(B.W.)。
各组持续灌胃一周后，大鼠禁食(自由饮水)12h后给予30mg/kg(B.W.) 的木犀草素。1h后断尾采血0.5ml，4000rad/min离心15min，分离血浆， -20℃保存后测量大鼠血清中的木犀草素含量，结果如表3所示。
表3.各组大鼠灌胃后血清中木犀草素的含量.(n＝6,SD)
Figure RE-GDA0003786450490000091
由表3.可知，当每天菌株BKR-007使用量为提升至0.6×108CFU/kg (B.W.)时，可见菌株对木犀草素的吸收具有促进作用，当每天菌株 BKR-007使用量为提升至0.6×109CFU/kg(B.W.)时则对木犀草素吸收的促进作用达到最强，至菌株进一步提升至1.8×1010CFU/kg(B.W.)时亦未发现其对木犀草素的吸收作用进一步增强。故认为0.6×109CFU/kg(B.W.) 为菌株BKR-007最适使用浓度，用以实现对木犀草素的最佳吸收效果。
菌株BKR-007对木犀草素血浆中代谢动力的影响：
实验共分为4组，每组6只。普通鼠粮适应性喂养1周后，第2组(L-BM) 及第4组(C-BM)每天灌胃活菌株BKR-007(0.6×109CFU/kg)持续灌胃1 周，第1组(L)及第3组(C)每天灌胃同样体积的生理盐水。
各组灌胃一周后，大鼠禁食(自由饮水)12h后，尾静脉采血0.5ml，然后1组(L)及2组(L-BM)灌胃30mg/kg木犀草素，3组(C)4组(C-BM) 灌胃300mg/kg菊花提取物。分别于给药后0.15h、0.5h、0.75h、1h、1.5h、 2h、4h、6h、8h及10h断尾采血0.5ml，4000rad/min离心15min，分离血浆，-20℃保存备用。
各组大鼠血浆平均药物浓度-时间曲线见图3.。使用3P97药动学处理软件，药动学参数对平均药时曲线进行拟合，以理论血药浓度与实测血药浓度相关系数最大与AUC值最小为原则并结合F检验计算，得到主要动力学参数如表4.。
表4.各组大鼠灌胃后血清中木犀草素主要动力学参数.(n＝6,SD)
Figure RE-GDA0003786450490000101
由图3A.可以的看出，在对大鼠进行灌胃菌株BKR-007的作用下，其对木犀草素的吸收能力明显增强，血浆中木犀草素在0.75h达到峰值，达到 0.772±0.091mg/ml(L-BM)，高于单独灌胃组(L)的0.653±0.091mg/ml；
由图3B.可以的看出，在对大鼠进行灌胃菌株BKR-007的作用下，其对菊花提取物中木犀草素的吸收能力亦明显增强，血浆中木犀草素在1h达到峰值，达到0.728±0.029mg/ml(C-BM)，高于单独灌胃组(C)的 0.612±0.046mg/ml。
由表4.可知，大鼠经菌株BKR-007灌胃处理后，其对标准品木犀草素及菊花提取物中木犀草素的消除半衰期亦有明显提高，其对标准品木犀草素的消除半衰期为6.154±0.723h(L-BM)，高于L组的4.876±0.602h；其对菊花提取物中木犀草素的消除半衰期为5.53±0.301h(C-BM)，高于C组的 3.333±0.264h。
除此，由表4.亦可知，在菌株BKR-007灌胃后，标准品木犀草素及菊花提取物中木犀草素其达峰面积及总峰面(L-BM组及C-BM组)积亦明显高于菌株BKR-007未灌胃组(L组及C组)。
由此本发明认为，菌株BKR-007与木犀草素及菊花提取物组合，所具有的协同作用其重要的原因为，菌株BKR-007可以显著的促进机体对木犀草素的吸收水平，进而增强机体抑制尿酸的产生水平。
实施例4复方制剂对高尿酸血症大鼠嘌呤氧化酶的抑制
菊花提取物：(参见实施例2.)
木犀草素：(参见实施例1.)
菌株的制备：(参见实施例1.)
高尿酸大鼠的造模：(参见实施例1.)
实验结果数据的统计学分析：(参见实施例1.)
血清中嘌呤氧化酶活性的测定：利用Xanthine Oxidase Activity Assay Kit(Sigma-Aldrich Co,St.Louis,MO,USA)。
将大鼠平均分为8组，每组8只，每组实验条件如表5.所示：
表5.各组大鼠喂养及给药情况.
Figure RE-GDA0003786450490000111
如表5.所述，大鼠全天进食高嘌呤食物，每天上午对大鼠进行氧嗪酸钾注射，进行高尿酸血症建模，各组每天晚间分别灌胃菌株BKR-007、木犀草素、菊花提取物及其混合物，持续20天。
20天实验结束后，各组大鼠血清中嘌呤氧化酶(XOD)活性如图4.所示：
由图4.可以看出，虽然高剂量木犀草素、菌株BKR-007及菊花提取物其对血清中的降低效果相似(见图1.及图2.)，但是对大鼠血清中嘌呤氧化酶(XOD)活性的抑制作用各不相同。
LH组木犀草素可以显著的降低大鼠血清中嘌呤氧化酶(XOD)的活性，提示其降低大鼠血清中尿酸水平的关键因素为对XOD活性的抑制。BH组菌株BKR-007虽然使用了较高剂量(1.8×109CFU/kg)，但是并未对嘌呤氧化酶(XOD)活性产生明显的抑制作用，提示菌株BKR-007对大鼠血清中尿酸的产生的抑制不是对XOD活性的抑制结果。而CH组菊花提取物具有一定降低XOD的能力但较LH组为低，提示该提取物可能亦存在其它组分产生用以降低血清中的尿酸水平。
当用菌株BKR-007与较低浓度木犀草素及菊花提取物混合灌胃大鼠后，发现其血清中XOD活性均较单独使用高浓度木犀草素组 (40.41±2.00U/L)为低，其中LL-BM组大鼠血清XOD酶活为 34.41±2.93U/L，CL-BM组大鼠血清XOD酶活为30.74±2.87U/L，提示菌株BKR-007在与木犀草素及菊花提取物复配后，可通过协同作用抑制XOD活性，进而抑制尿酸的产生。
实施例5复方制剂对高尿酸血症大鼠炎症相关因子的活性水平的影响
菊花提取物：(参见实施例2.)
木犀草素：(参见实施例1.)
菌株的制备：(参见实施例1.)
高尿酸大鼠的造模：(参见实施例1.)
实验结果数据的统计学分析：(参见实施例1.)
THF-α检测：肿瘤坏死因子-α试剂盒(南京建成生物工程研究所)
IL-1β检测：白细胞介素-1β试剂盒(南京建成生物工程研究所)
LPS检测：脂多糖试剂盒(南京建成生物工程研究所)
NO检测：一氧化氮试剂盒(南京建成生物工程研究所)
将大鼠平均分为8组，每组8只，第1组喂食普通鼠粮，第2～8组每天喂食高嘌呤鼠粮，并于每天上午对其进行氧嗪酸钾注射，进行高尿酸血症建模，持续喂养24周。
24周喂养结束后，对各组大鼠进行治疗，各组治疗及给药方案如表5. 所示：
大鼠的喂养及给药情况如表5.所述。所述治疗持续时间为2周。
2周实验结束后，各组大鼠血清中与炎症相关因子的活性水平如图5. 所示：
由图5可知，在大鼠长期高嘌呤饮食作用下，Contorl组体内肿瘤坏死因子-α(THF-α)、白细胞介素-1β(IL-β)、脂多糖(LPS)均较NC组有明显的增高，而一氧化氮(NO)组则较NC组有明显的降低，证明在高尿酸血症的长期作用下，大鼠体内的炎症状况发生了明显的改变。
由图5A及B.所示，治疗期间，Contorl组大鼠血清中THF-α及IL-1β的平均水平分别为194.80±9.51ng/L及1236.39±54.94pg/L，而用别嘌醇治疗的PC组其血清中的THF-α(190.10±7.51ng/L)及IL-1β(1243.13±38.19pg/L) 水平则并未发现明显降低。
而高剂量木犀草素组(LH)、高剂量菌株BKR-007组(BH)则可以明显的降低上述两种炎症因子的水平，高剂量菊花提取物组(CH)则只对 THF-α具有显著的抑制作用，其中菌株BKR-007相对于木犀草素及菊花提取物具有最好的改善效果。
当低剂量木樨草素及菊花提取物与中等剂量菌BKR-007复方后，则体现出明显的协同作用，其中LL-BM组及CL-BM组大鼠血清THF-α因子的水平分别为134.45±6.26ng/L及136.00±5.41ng/L，显著低于单方使用高剂量菌株BKR-007(BH组)的水平(144.93±9.63ng/L)；而LL-BM组及CL-BM 组大鼠血清IL-1β因子的水平分别为1089.59±55.01pg/L及 976.76±36.97pg/L，值得注意的是，单方使用高剂量菊花提取物(CH)组并未显示出明显的降低IL-1β的能力，但是其在较低剂量下与菌株BKR-007 复配(CL-BM组)则对IL-1β的抑制作用(976.76±36.97pg/L)明显高于单方使用菌株BKR-007的BH组(1035.91±20.66pg/L)。
由图5.C可知，大鼠在高尿酸血症的长期持续作用下，血清中一氧化氮(NO)水平出现了明显的下调(Control组为27.12±0.89umol/L；NC组为34.59±2.15umol/L)，其中给药别嘌醇组(PC，27.73±1.71umol/L)及菌株BKR-007组(BH，26.02±2.42umol/L)未发生明显变化，而木犀草素组 (LH，29.97±1.30umol/L)及菊花提取物组(CH，32.30±0.97umol/L)组对 NO的下调起到了明显的抑制作用。当这两种组分降低浓度后分别与菌株BKR-007复配后，NO的浓度上升明显，其中LL-BM组为31.65±2.45umol/L， CL-BM组为33.96±2.54umol/L，接近于NC组(34.59±2.15umol/L)的水平。
由图5.D可知，三组高剂量单方组分，均可在不同程度上降低血清中脂多糖(LPS)的丰度，与Control组(313.87±16.82EU/L)相比，其对脂多糖的降低效果分别为:289.73±11.09EU/L(LH)、257.39±17.13EU/L(BH) 及287.21±15.15EU/L(CH)，其中BH组最为明显。与BH组相比较，当菌株BKR-007与木犀草素及菊花提取物分别复配后，其对脂多糖(LPS)的抑制效果进一步增强，其中LL-BM组为230.99±10.94EU/L，CL-BM组为 226.54±8.36EU/L，该结论进一步体现了菌株BKR-007与木犀草素及菊花提取物之间存在协同效应，用以改善在长期高尿酸血症胁迫下，机体内与炎症相关因子的水平。
实施例6复方制剂对高尿酸血症所诱发的肝损伤的保护作用
菊花提取物：(参见实施例2.)
木犀草素：(参见实施例1.)
菌株的制备：(参见实施例1.)
实验结果数据的统计学分析：(参见实施例1.)
高尿酸小鼠模型采用腹腔注射氧嗪酸钾(270mg/kg/Day)并辅以高嘌呤饮食(酵母浸粉0.5g/只/Day、腺嘌呤5mg/只/Day)建立。实验动物采用雄性6周龄C57 BL6小鼠，在室温下饲养，自由饮食采食，经1周适应性饲养后，随机将其平均分成8组，每组8只，每组实验条件如表6.所示：
表6.各组小鼠喂养及给药情况.
Figure RE-GDA0003786450490000131
如表6.所述，除NC组外，小鼠全天进食高嘌呤食物，每天上午对小鼠进行氧嗪酸钾注射，进行高尿酸血症建模，各组每天晚间分别灌胃菌株 BKR-007、木犀草素、菊花提取物及其混合物，持续20周。
饲养完成后，处死小鼠，剖取小鼠肝脏，利用CelLytic MT lysis reagent(Sigma)处理小鼠肝脏，利用超氧化物歧化酶试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定肝脏中SOD活力；利用过氧化氢酶试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定肝脏中CAT活力；利用谷胱甘肽过氧化物酶试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定肝脏中GPx活力；利用丙二醛试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定肝脏中MDA含量。
实验结果如图6.所示：
由图6.可知，在持续20周高嘌呤饮食作用下，小鼠肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)及谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性均有较明显的降低，而丙二醛(MDA)积累量则有明显上升，故认为小鼠肝脏功能受到了一定程度的损伤，对肝脏内自由基的清除及对丙二醛的代谢能力有所下降。
而在高剂量木犀草素(LH)、菌株BKR-007(BH)及菊花提取物(CH) 的作用下，其对小鼠肝脏的抗氧化能力及对丙二醛的代谢你能力均有所增强(如图6.A～D)。
当降低菌株喂食量并与低剂量木犀草素及菊花提取物复配后，可以发现SOD活力、CAT活力及GPx活力均较单组分高用量的木犀草素、菌株 BKR-007及菊花提取物有明显提高，并显著的降低了MDA在肝脏中的积累。
与单组分高剂量菌株BKR-007(BH，40.50±2.60％)相比，LL-BM组与CL-BM组SOD的活性分别为44.01±3.92％及46.86±3.72％；
与单组分高剂量菌株BKR-007(BH，48.57±2.79U/ug)相比，LL-BM 组与CL-BM组CAT的活性分别为55.21±2.42U/ug及51.93±3.92U/ug；
与单组分高剂量菌株BKR-007(BH，32.11±1.47U/ug)相比，LL-BM 组与CL-BM组GPx的活性分别为34.30±1.50U/ug及34.59±2.85U/ug；
与单组分高剂量菌株BKR-007(BH，1.51±0.043nmol/mg)相比，LL-BM 组与CL-BM组MDA的活性分别为1.30±0.053nmol/mg及 1.29±0.056nmol/mg。
该结果进一步提示，菌株BKR-007在与木犀草素及菊花提取物复配后，可以协同提高肝脏中SOD、CAT及GPx的活力，降低代谢物MDA的积累，从而增强肝脏的抗氧化能力，提高肝脏代谢能力的作用，并且在较低剂量下即可产生积极的效果。
实施例7复方制剂对高尿酸血症所诱发的肾功能损伤的保护作用
菊花提取物：(参见实施例2.)
木犀草素：(参见实施例1.)
菌株的制备：(参见实施例1.)
高尿酸小鼠的造模、分组、培养时间及给药方式：(参见实施例6.)
实验结果数据的统计学分析：(参见实施例1.)
饲养完成后，取血液样本，3500rad/min离心取上清液，用肌氨酸法测定肌酐(Scr)，脲酶法测定尿素氮(BUN)。
实验结果如图7.所示：
由图7.可知，在持续20周高嘌呤饮食作用下，小鼠血清中肌苷(Scr) 及尿素氮(BUN)含量均有较明显的升高，故认为小鼠小鼠肾脏功能受到了一定程度的损伤，对血清中Scr及BUN的代谢能力有所下降。
而在高剂量木犀草素(LH)、菌株BKR-007(BH)及菊花提取物(CH) 的作用下，小鼠血清中Scr及BUN的含量均有明显下降，故认为这三种活性成分均在不同程度上具有提高小鼠肾功能的能力。
当降低菌株BKR-007喂食量并与低剂量木犀草素(LL-BM)及菊花提取物(CL-BM)复配后，亦可以发现小鼠血清中Scr及BUN的含量较单组分高用量的木犀草素、菌株BKR-007及菊花提取物有明显提高。
与单组分高剂量菌株BKR-007(BH，62.98±4.83umol/L)相比，LL-BM 组与CL-BM组Scr的活性分别为58.96±4.87umol/L及59.34±3.81umol/L；
与单组分高剂量菌株BKR-007(BH，10.14±0.45mmol/L)相比，LL-BM 组与CL-BM组BUN的活性分别为9.16±0.59mmol/L及9.28±0.40mmol/L；
该结果进一步提示，菌株BKR-007在与木犀草素及菊花提取物复配后，可以协同提高血清中代谢产物的降解能力，降低血清中代谢物Scr及BUN 的积累，从而起到在较低剂量下，保护肾功能，增强肾脏代谢能力的效果。
实施例8.本发明组合物对健康人群血清中尿酸水平的影响
菊花提取物：(参见实施例2.)
菌株的制备：(参见实施例1.)
将上述菌株作为活性成分，并匹配辅料，主要辅料为：海藻糖(10％ w/w)、脱脂乳粉(8％w/w)、麦芽糊精(5％w/w)、维生素C(0.5％w/w) 及蔗糖(2％.w/w)制备冻干粉菌剂。
将按上述比例将各辅料混合溶解于无菌水后115℃灭菌30min，冷却后与所收集的菌体以质量比为2：1混合冻干，冻干后的菌粉经稀释涂布测出活菌数。
48名健康志愿者的招募来自于中国辽宁省沈阳市，选取年龄为20～55 岁，清晨空腹血清尿酸值为208～428umol/L，无高尿酸血症病史，无其它严重疾病史(如糖尿病、高血压及其它心脑血管疾病)，无乳清蛋白过敏史。
作为实验期间的限制，从实验的开始日至结束日均禁止使用或摄入可能会影响本实验的营养辅助品、健康食品、医药品或医药外品等(例如，苯溴马隆，阿洛普林，丙磺舒和非布索坦药物，利尿剂，阿司匹林和其他通用药物)。在实验期间，按照指示摄入每日规定量的实验食物。
本实验严格按照国际药理学临床伦理审查委员会的要求，受试者基于《赫尔辛基宣言》的伦理原则，遵守流行病学研究的伦理准则，充分知晓了目的、内容，方法等后，签署了书面同意。
48名健康志愿者基于相似的年龄及血尿酸水平，平均分为4组。分别为对照组(NC)、菊花提取物组(C)、益生菌组(B)及复方组(C-B)，其中：
NC组为每日早晚各补充一袋样品(4g/袋，麦芽糊精)；
C组为每日早晚各补充一袋样品(4g/袋，含2250mg/袋菊花提取物，辅料为麦芽糊精)；
B组为每日早晚各补充一袋样品(4g/袋，含3×1010CFU菌株BKR-007, 辅料为麦芽糊精)；
C-B组为每日早晚各补充一袋样品(4g/袋，含1.5×1010CFU菌株 BKR-007,750mg/袋菊花提取物，辅料为麦芽糊精)。
连续进行4周实验，实验结果见表7.。
表7. 48名健康志愿者28天实验前后血清中尿酸变化情况.
Figure RE-GDA0003786450490000161
如表7所示，各组12名健康志愿者彼此间血清中尿酸水平差异较大，故将每名志愿者初始血清尿酸水平与实验完成后血清中尿酸水平相减，计算出每名健康志愿者血清中的尿酸下降量，用以比较不同组分对健康志愿者血清中尿酸含量的降低程度，结果如图8所示。
由图8.可知，对照组(NC)平均尿酸降低量为-7.48±12.09umol/L，菊花提取物组(C)平均尿酸降低量为5.17±11.67umol/L，菌株BKR-007组(B) 平均尿酸降低量为13.40±12.56umol/L，菊花提取物及菌株BKR-006所构成的组合物组(C-B)平均尿酸降低量为26.02±10.68umol/L。
经过T检验可知，对照组(NC)与菊花提取物组(C)、与菌株BKR-007 组(B)及组合物组(C-B)均具有显著性差异，并且差异性逐级增大，P 值分别为：0.016、0.0004及<0.0001。说明菊花提取物、菌株BKR-007及其组合物均对健康人群血清中的尿酸水平具有降低作用。
同时，组合物组(C-B)与菌株BKR-007组(B)相比，亦具有显著性差异，P＝0.0146，该结果进一步证明，菌株BKR-007与菊花提取物对人体血清中的尿酸水平的降低具有协同性，使用较低剂量的菌株BKR-007与菊花提取物，其对血清中尿酸的降低能力即可优于较高剂量的单组分对尿酸的降低能力。

Claims (8)

1.一种具有降低血清中尿酸的组合物，其特征在于：组合物为组分A和组分B，组分A为含格氏乳杆菌Lactobacillus gasseri BKR-007，组分B为含木犀草素；组合物中格氏乳杆菌BKR-007含量为0.6×108～1.8×1010CFU/kg(B.W.)，组合物中木犀草素含量为1～40mg/kg(B.W.)。
2.按权利要求1所述的具有降低血清中尿酸的组合物，其特征在于：所述含格氏乳杆菌Lactobacillus gasseri BKR-007的组分A为格氏乳杆菌BKR-007的培养物、菌悬液、冻干粉或其它含格氏乳杆菌BKR-007的制剂。
3.按权利要求1所述的具有降低血清中尿酸的组合物，其特征在于：所述含木犀草素的组分B为木犀草素单质或天然提取获得的含木犀草素的提取物，其中，天然提取获得的提取物为经植物提取获得。
4.按权利要求3所述的具有降低血清中尿酸的组合物，其特征在于：所述的植物为芦丁、青兰、裸花紫珠、金银花、马齿苋、锦灯笼、鹿茸草、北刘寄奴、荆芥、黄芩、半枝莲、白毛夏枯草、紫苏、独一味、墨旱莲、野菊花、菊花、蒲公英、洋甘菊、辣椒、胡萝卜、洋蓟、芹菜、甜椒、油橄榄、花生壳、玉米须中的一种或几种。
5.按权利要求1-4任意一项所述的具有降低血清中尿酸的组合物，其特征在于：所述组合物中格氏乳杆菌BKR-007含量为0.6～1.8×109CFU/kg(B.W.)，组合物中木犀草素含量为2.5～22.5mg/kg(B.W.)。
6.一种权利要求1所述的具有降低血清中尿酸的组合物的应用，其特征在于：所述组合物在治疗或改善高尿酸血症及其所诱发的慢性炎症及肝肾损伤中的应用。
7.按权利要求6所述的具有降低血清中尿酸的组合物的应用，其特征在于：所述组合物在制备治疗或改善高尿酸血症及其所诱发的慢性炎症及肝肾损伤的药物、日化品、化妆品、食品添加剂、保健食品及其在其它食品中的应用。
8.按权利要求6所述的具有降低血清中尿酸的组合物的应用，其特征在于：所述组合物中两组分相互协调、促进，提高血药浓度，延长其半衰期在制备治疗或改善高尿酸血症及其所诱发的慢性炎症及肝肾损伤的药物、日化品、化妆品、食品添加剂、保健食品及其在其它食品中的应用。
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