CN112826924A - 肠靶向性胃泌素-二氧化硅复合物的用途 - Google Patents

肠靶向性胃泌素-二氧化硅复合物的用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及肠靶向性胃泌素‑二氧化硅复合物的用途。本发明通过实验证明，肠靶向性胃泌素能够降低BBM上的SGLT1由高糖引起的异常增加，降低BBM在高糖环境中对葡萄糖的吸收，从而达到主动降糖的目的；同时还能够通过增加血清中GLP‑1的分泌，在促进胰岛素分泌的同时，减少胰岛b细胞的凋亡，即在主动降低血糖的同时还能够在一定程度上恢复胰岛细胞的功能，进而实现降糖效果。

Description

肠靶向性胃泌素-二氧化硅复合物的用途
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及肠靶向性胃泌素-二氧化硅复合物的用途。
背景技术
糖尿病(Diabetes mellitus，DM)是一种常见的由遗传和环境因素相互作用所致的终身性代谢性疾病，其发病率在世界范围内迅速增加。国际糖尿病联盟(IFD)的数据显示，仅在2017年，全球范围内糖尿病的患病人数就已经高达4.51亿，预计到2045年患病人数将增加到6.93亿。糖尿病主要可分为一型糖尿病、二型糖尿病、妊娠期糖尿病等，其中一型糖尿病(T1DM)主要由于自身免疫系统攻击自身的胰岛细胞，导致胰岛素分泌缺乏，二型糖尿病(T2DM)主要是由于胰岛素抵抗导致糖代谢紊乱。现代医学认为，糖尿病不仅表现为血糖升高，机体免疫力下降，而且容易并发其他疾病(如糖尿病神经病变、视网膜病变、糖尿病足等)，严重降低患者的生活质量。众多临床结果也表明，即便是接受降糖治疗，患者的血糖达标率也仅在49.2％，并且糖尿病引发的多种并发症一旦发生，药物治疗也很难逆转，给社会经济和人民生活带来了极大的负担，因此如何尽早有效的预防和控制糖尿病，提高患者的生活质量已经成为当代医学重要挑战和亟待解决的问题。
传统的抗糖尿病药物的关注点主要在于促进胰岛素的分泌以及增加胰岛素敏感性等两个方面，临床上常见的药物主要可分为以下几类：(1)胰岛素以及胰岛素类似物，多用于TIDM以及口服降糖药物无效的T2DM患者。主要采用肌肉注射、皮下注射以及静脉注射等非胃肠道给药途径，给患者尤其是病程较长的患者带来了一定程度上的痛苦。(2)促胰岛素分泌药物，主要作用于胰岛b细胞，如磺酰脲类药物等，但这类药物易引起低血糖等不良反应。(3)胰岛素增敏剂，如双胍类降糖药以及噻唑烷二酮类药物等。这类药物主要通过抑制肠壁细胞对糖的吸收以及增加外周组织及细胞对葡萄糖的利用，从而缓解胰岛素抵抗。但长期服用此类药物易对肝脏产生一定的损害作用。(4)肠促胰岛素类降糖药物，例如胰高血糖素样肽-1受体激动剂(GLP-1RA)，二肽基肽酶4抑制剂(DPP-4抑制剂)等，主要通过增加内源性GLP-1水平和活性促进胰岛素分泌，在控制血糖的同时改善患者胰岛不断恶化的情况，目前只在部分国家上市，安全性及有效性有待进一步确定。
综上我们发现，现有的抗糖药物并不能从根本上解决患者血糖升高的情况，只是在血糖依然升高的情况下进行被动的降糖干预，而且绝大多数抗糖尿病药物主要作用于胰腺、肝脏、骨骼肌、脂肪组织、以及肾脏等器官。而小肠作为血糖吸收的前沿屏障，是血糖控制潜在的重要器官，但目前针对这方面的药物研究还比较缺乏。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供肠靶向性胃泌素-二氧化硅复合物的用途。研究表明，胃泌素抑制小肠糖转运蛋白的表达，促进降糖激素的分泌。
本发明提供了胃泌素在制备小肠刷状缘膜中葡萄糖载体表达抑制剂中的应用。
本发明中，所述葡萄糖载体为SGLT1和GLUT2。
本发明还提供了胃泌素在制备促进肠内分泌细胞增殖的制剂中的应用。
本发明还提供了胃泌素在制备促进肠内分泌细胞中肠降糖激素分泌的制剂中的应用。
本发明中，所述肠降糖激素激素为GLP-1/2和GIP
本发明还提供了胃泌素在制备防治1型糖尿病的药物中的应用。
本发明中，所述防治包括：改善胰岛功能、改善糖耐量和、减少糖吸收和降低1型糖尿病的发病率。
本发明中，所述胃泌素的剂型为胃泌素-二氧化硅微球。
一些实施例中所述胃泌素-二氧化硅微球的制备方法包括：将氨基化的二氧化硅微球与胃泌素在EDC/NHS溶液中反应，获得胃泌素-二氧化硅微球。
所述氨基化的二氧化硅微球与胃泌素的质量比为(1～5):1；
所述EDC/NHS溶液中EDC浓度为200mmol/L；NHS浓度为500mmol/L。
本发明通过实验证明，肠靶向性胃泌素能够降低BBM上的SGLT1由高糖引起的异常增加，降低BBM在高糖环境中对葡萄糖的吸收，从而达到主动降糖的目的；同时还能够通过增加血清中GLP-1的分泌，在促进胰岛素分泌的同时，减少胰岛b细胞的凋亡，即在主动降低血糖的同时还能够在一定程度上恢复胰岛细胞的功能，进而实现降糖效果。
附图说明
图1示小肠CCKBR特异性敲除对小鼠糖耐量影响；
图2示小肠CCKBR特意性敲除对小鼠空腹血糖的影响；
图3示小肠CCKBR特异性敲除后小鼠肠道SGLT1表达提高；
图4示小肠CCKBR特异性敲除后小鼠肠道GLUT2表达提高；
图5示小肠CCKBR特异性敲除后小鼠血清GLP-1水平降低；
图6示小肠CCKBR特异性敲除后小鼠血清GLP-2水平降低；
图7示胃泌素-二氧化硅微球经灌胃处理后，靶向输送至小鼠小肠部位；
图8示质谱法检测胃泌素处理组中胃泌素的含量；
图9示胃泌素能够降低1型糖尿病小鼠(NOD)的发病率；
图10示胃泌素对NOD小鼠糖耐量影响；
图11示胃泌素对NOD小鼠空腹血糖影响；
图12示胃泌素处理对NOD小鼠肠道SGLT1表达的影响；
图13示胃泌素处理对NOD小鼠肠道GLUT2表达的影响；
图14示胃泌素处理对NOD小鼠血清GLP-1水平的影响；
图15示胃泌素处理对NIOD小鼠血清GLP-2水平的影响；
图16示胃泌素能够通过PKC信号通路抑制HIEC由高糖引起的SGLT1的表达升高；
图17示胃泌素能够促进L细胞增殖促进GLP-1的分泌。
具体实施方式
本发明提供了肠靶向性胃泌素-二氧化硅复合物的用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
根据现有的研究我们可以知道，小肠主要从两个方面参与血糖稳态的调节：一个是通过调节葡萄糖转运蛋白(如钠葡萄糖共转运体SGLT1，葡萄糖转运体GLUT2)的表达，进而调节糖的吸收。有研究指出，在糖尿病患者的十二指肠中，SGLT1的蛋白和mRNA水平较正常人升高3-4倍。因此通过抑制SGLT1的表达减少其介导葡萄糖的吸收，对于血糖的控制将具有重要意义；其次，小肠中的一些肠内分泌细胞通过分泌一些肠降糖激素，参与血糖的调节，小肠L细胞分泌的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)和K细胞分泌的葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP)均能够增加葡萄糖依赖的胰岛素的分泌，在胰腺细胞胰岛素释放中起重要作用。因此通过研究小肠SGLT1介导的葡萄糖吸收以及肠降糖激素的分泌调节来探索肠道在调控血糖中的作用机制，对于血糖控制来说具有非常重要的临床意义。
我们实验室通过多年的研究发现，胃泌素除了已知的促进胃酸分泌的功能以外，还能够参与小肠所介导血糖稳态的调节。首先，我们发现胃泌素受体(CCKBR)在小肠中有着较为丰富的表达，为了研究Gastrin/CCKBR在血糖调控中的作用，我们随即构建了CCKBR肠道特异性敲除鼠，并发现该基因敲除鼠出现糖耐量异常、空腹血糖升高等现象，初步证实了Gastrin/CCKBR在血糖调控中的积极作用。为了进一步进行验证，我们利用二氧化硅的自身重量以及不被吸收的的特性，将二氧化硅微球与胃泌素多肽相连形成稳定的多肽微球复合物(SiO2-Gastrin)，使该复合物将胃泌素靶向输送到小肠中而不被吸收入血。随后，我们使用该复合物对糖尿病小鼠进行灌胃处理，发现胃泌素与其肠道上的受体CCKBR结合之后，一方面能够通过PKC信号通路，降低1型糖尿病小鼠(NOD)近端小肠刷状缘膜(BBM)上SGLT1的表达，从而降低葡萄糖的吸收，同时未被吸收的葡萄糖经过小肠远端部位刺激肠内分泌细胞(K细胞、L细胞)大量分泌肠降糖激素(GLP-1、GLP-2、GIP)，另一方面，胃泌素还能够与肠内分泌细胞中的CCKBR受体结合，进而促进L细胞的增殖，增加GLP-1的分泌，进而从而在主动减少葡萄糖吸收入血的同时，改善NOD小鼠胰岛功能不断恶化的情况。
因此，本发明解决了三个问题：1)精准研究肠道胃泌素并证实其能够改善机体高血糖症状；2)从源头上控制了机体对糖的的吸收，在降低血糖的同时改善一型糖尿病小鼠胰岛功能；3)避免了机体对胃泌素的吸收，从而避免了机体胃泌素增加导致的相关毒副作用。因此，该发明可以作为安全药物，用于糖尿病的预防和治疗。
首次通过构建CCKBRflox/flox；villin CRE小鼠，探究了肠道胃泌素对血糖调控的积极作用，即该小鼠小肠上皮细胞内的CCKBR受体被敲除，而体内其它器官或组织的CCKBR受体表达和功能正常，精准探究胃泌素/CCKBR在小肠中糖代谢中的重要作用。
通过创新制备Gastrin-SiO2复合物，我们设计把胃泌素多肽链接到不能被机体吸收的二氧化硅颗粒上，该颗粒在胃部不被胃酸等破坏，也不能被吸收。因此，该微粒被灌胃后不被吸收进入机体循环，仅作用于肠道上皮细胞后随粪便被排出体外。从而探究了胃泌素在治疗糖尿病中的重要作用，为临床抗糖治疗提供新的靶点。
首次发现肠道胃泌素能通过PKC信号通路抑制BBM上SGLT1的表达，以及通过促进肠内分泌细胞的增殖，促进GLP-1/2以及GIP的分泌，在降低一型糖尿病小鼠的同时改善胰岛功能
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例
首先，选用CCKBR肠道特异性敲除鼠，初步验证Gastrin/CCKBR在血糖调控中作用。其次，利用二氧化硅的自身重量以及不被吸收的特性，将二氧化硅与胃泌素多肽相连形成稳定的多肽微球复合物(SiO2-Gastrin)，使该复合物将胃泌素靶向输送到小肠中而不被吸收入血。随后，我们使用该复合物对糖尿病小鼠进行灌胃处理，同时使用人肠上皮细胞(HIEC)以及人肠内分泌细胞(NCL-H716)开展相关的细胞实验，检测该药物的作用及其机理，以及可能的毒副作用。具体的操作步骤及研究结果如下：
一、特异性阻断胃泌素的肠道生物学效应
通过CRISPR-Cas9基因编辑技术构建CCKBRflox/flox；villin CRE小鼠，即该小鼠小肠上皮细胞内的胃泌素受体CCKBR被敲除，而体内其它器官或组织的CCKBR表达和功能正常，精准探究胃泌素/CCKBR在小肠中糖代谢中的重要作用。
实验动物：四月龄WT及CCKBRflox/floxvillin CRE鼠30只，分为WT组和KO组
检测指标：进糖耐量、胰岛素耐量、空腹血糖、随机血糖、尿蛋白、尿糖检测。小肠BBM葡萄糖转运蛋白SGLT1以及GLUT2的表达，血清胰岛素、胃泌素、GLP-1、GIP
仪器：血糖仪、Real-time PCR仪、电泳仪、酶自动生化分析法检测仪、ELISA试剂盒
实验方法：选取4月龄基因敲除鼠和野生型鼠各15只，进行糖耐量、胰岛素耐量、空腹血糖、随机血糖、尿蛋白、尿糖检测。随后牺牲小鼠刮取小肠BBM，检测葡萄糖转运蛋白SGLT1以及GLUT2的表达，取血离心得血清检测胰岛素、胃泌素、GLP-1、GIP等的表达水平。
实验结果：
(1)通过检测我们发现，CCKBR肠道特异性敲除鼠出现了一系列糖尿病倾向性表型，如糖耐量受损、空腹血糖升高等(图1～2)
(2)除此之外，我们还发现CCKBR敲除之后，肠道BBM上的SGLT1以及GLUT2的mRNA的表达也显著升高(图3～4)
(3)随后我们对血清中的肠降糖激素的分泌进行检测，发现GLP-1、GLP-2的分泌显著减少(图5～6)
通过上述结果，我们初步证实了胃泌素在肠道介导的血糖稳态的调节中发挥着重要的正向调控作用
二、胃泌素-二氧化硅复合物的合成
1、胃泌素多肽的合成
胃泌素的序列：Glp-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-Gly-Lys(由公司合成)
2、胃泌素多肽与二氧化硅微球的稳定链接口服制剂的制备
(1)二氧化硅微球氨基化
实验器材：圆底烧瓶，搅拌仪，离心管
实验试剂：去离子水，乙醇，KH550(APTES)溶液，三乙胺溶液，二氧化硅微球
实验步骤：
a.在烧瓶中加入90ml乙醇和10ml去离子水以及0.5ml KH550溶液，搅拌30min
b.称取1g二氧化硅微球加入烧瓶中，继续常温搅拌6h
c.加入0.5ml三乙胺溶液，常温搅拌12h
d.静置沉降一段时间，倒出上清液，将二氧化硅微球转移至离心管中
e.用乙醇洗涤微球三次，放入烘箱中加热干燥(或冷冻后干燥处理)
(2)二氧化硅微球表面连接多肽
实验器材：圆底烧瓶，搅拌仪，离心机，离心管
实验试剂：去离子水，MES缓冲溶液，PBST缓冲溶液，EDC，NHS，胃泌素，氨基化二氧化硅微球
实验步骤：
a.配制MES缓冲溶液(0.1M，pH＝6.8)
b.(MES缓冲液配置：实际实验中所配置为，50ml浓度为100mmol/L,pH＝6.8(最终结果pH＝6.9)，使用4mmol/LNaOH溶液进行pH调节)(实际操作中前四次为使用实验室已配置溶液，最近一次为新配置缓冲液)
c.取10mLMES缓冲溶液，配制EDC/NHS溶液，其中EDC浓度为200mmol/L，NHS浓度为500mmol/L(实际操作中为使用实验室已配置溶液)
d.在上述10mL EDC/NHS溶液中加入10mg胃泌素(Glp-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-Gly-Lys)和300mg SiO2-NH2，常温搅拌2小时
e.离心分离SiO2微球，PBST缓冲溶液清洗两次(实际操作为乙醇，去离子水反复洗涤)，除去未反应多肽
f.冷冻干燥
g.取2～10mg左右样品进行热重测试
3、胃泌素多肽与二氧化硅微球的稳定链接口服制剂的肠靶向性检测
(1)胃泌素-二氧化硅复合物肠靶向性检测
实验动物：C57小鼠
材料：二氧化硅-胃泌素复合物连接FITC荧光
仪器：小动物荧光活体成像仪
实验方法：C57小鼠禁食48小时，使用二氧化硅-胃泌素复合物连接FITC荧光材料进行20mg/kg/d灌胃处理，6小时后使用小动物活体成像仪观察胃泌素在胃肠道的走向
实验结果：胃泌素灌胃处理6小时后，可观察到C57小鼠小肠部位有大量胃泌素聚集。胃部由于不完全排空会有部分自发荧光(图7)。
(2)胃泌素未被吸收进入外周血循环检测
我们使用质谱法检测了胃泌素处理组中胃泌素的含量，图A-F代表了不同浓度的胃泌素标准品的信号响应图，从图中可以看出，当胃泌素浓度低于1ng/ul使没有信号相应，我们在对照组和胃泌素处理组中也未发现有信号相应，说明，连接在二氧化硅微球上的胃泌素没有进入体内。在大鼠血清中并未发现有胃泌素，这说明通过口服给与的胃泌素二氧化硅微球并没有进入体内，只在肠道发挥作用，对其他器官没有影响(图8)。
三、胃泌素-二氧化硅复合物处理一型糖尿病小鼠
实验动物：一型糖尿病小鼠(NOD)30只
检测指标：进糖耐量、胰岛素耐量、空腹血糖、随机血糖、尿蛋白、尿糖检测。小肠BBM葡萄糖转运蛋白SGLT1以及GLUT2的表达，血清胰岛素、胃泌素、GLP-1、GIP
仪器：血糖仪、Real-time PCR仪、电泳仪、酶自动生化分析法检测仪、ELISA试剂盒等
实验方法：选取一型糖尿病小鼠(NOD)以及二型糖尿病小鼠(ob/ob)小鼠，分别分为对照组和Gastrin-SiO2灌胃组(20mg/kg/d)，灌胃12周，期间检测空腹血糖、随机血糖、OGTT、ITT等，灌胃结束后分别统计一型和二型小鼠的发病率，同时检测小肠BBM葡萄糖转运蛋白SGLT1以及GLUT2的表达，血清胰岛素、胃泌素、GLP-1、GIP等指标。
实验结果：
(1)胃泌素能够降低1型糖尿病小鼠(NOD)的发病率
4周龄NOD小鼠进行灌胃处理至12周，期间统计的发病率，根据统计结果我们发现，胃泌素能够大大降低NOD小鼠的发病率(图9)(NOD：NOD+Gas＝92％:15％P＝0.000021)
(2)胃泌素能够改善NOD小鼠的糖耐量异常
灌胃期间检测糖耐量以及空腹血糖等指标，发现，与对照组相比，胃泌素灌胃组糖耐量恢复正常，并且空腹血糖异常升高的现象也得到了抑制(图10、图11)。
(3)胃泌素够显著降低NOD小鼠BBM上SGLT1以及GLUT2的表达
分别刮取对照组及实验组的BBM，并检测其中SGLT1和GLUT2的mRNA的表达，我们发现，胃灌胃处理的NOD小鼠SGLT1和GLUT2的mRNA的表达显著升高(图12～13)。
(4)胃泌素能够促进NOD小鼠肠降糖激素GLP-1/2的分泌
我们检测了血清降糖激素(GLP-1/2)的表达，发现未经处理的NOD小鼠，随着自然自发糖尿病后，GLP-1以及GLP2的分泌显著降低，而经过胃泌素干预后，GLP-1以及GLP2的分泌较对照组显著升高(图14～15)。
四、胃泌素体外刺激肠上皮细胞以及肠内分泌细胞
细胞：人肠上皮细胞、人肠内分泌细胞
检测指标：SGLT1、GLUT2、CCKBR的mRNA的表达，细胞上清中GLP-1/2、GIP的分泌
实验方法：
(1)体外培养HIEC细胞，检测CCKBR表达，同时设置正常组、高糖组、高糖加胃泌素组、高糖加PKC抑制剂加胃泌素组，检测SGLT1以及GLUT2的表达
(2)体外培养NCL-H716细胞，检测CCKBR表达，同时设置正常组、高糖组、高糖加胃泌素组，检测细胞HOXB9，pyy、Gcg、Gip的基因表达水平，以及上清GLP-1、GIP等的分泌。
实验结果：
(1)胃泌素能够通过PKC信号通路抑制HIEC由高糖引起的SGLT1的表达升高
通过体外试验我们发现高糖(50mM)处理HIEC之后，SGLT1的mRNA的表达显著升高(P＝0.0017)，而给予高糖的同时给予胃泌素(10mM)处理之后，我们发现胃泌素够显著降低HIEC由高糖引起的SGLT1表达的升高(P＝0.0008)，随后我们采用了不同的抑制剂对HIEC进行预处理后，在进行高糖和胃泌素同时干预，我们发现只有PKC抑制剂处理之后，胃泌素对高糖引起的SGLT1的表达升高的抑制作用得以解除，说明胃泌素是通过PKC信号通路发挥抑制作用的(图16)。
(2)胃泌素能够促进L细胞增殖促进GLP-1的分泌
通过对NCL-H716细胞进行体外处理，我们发现(图17)，高糖处理时编码L细胞的基因gcgs的表达显著降低(P<0.05)，而胃泌素单独处理时gcg的表达显著升高(P<0.01),胃泌素和高糖同时处理时，gcg的表达较高糖组显著回升(P<0.05)
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.胃泌素在制备小肠刷状缘膜中葡萄糖载体表达抑制剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述葡萄糖载体为SGLT1和GLUT2。
3.胃泌素在制备促进肠内分泌细胞增殖的制剂中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述内分泌细胞为L细胞或K细胞。
5.胃泌素在制备促进肠内分泌细胞中肠降糖激素分泌制剂中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述肠降糖激素激素为GLP-1/2和GIP。
7.胃泌素在制备防治1型糖尿病的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述防治包括：改善胰岛功能、改善糖耐量、减少小肠糖吸收和降低1型糖尿病的发病率。
9.根据权利要求1～8任一项所述的应用，其特征在于，所述胃泌素的剂型为胃泌素-二氧化硅微球。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述胃泌素-二氧化硅微球的制备方法包括：将氨基化的二氧化硅微球与胃泌素在EDC/NHS溶液中反应，获得胃泌素-二氧化硅微球；
所述氨基化的二氧化硅微球与胃泌素的质量比为(1～5):1；
所述EDC/NHS溶液中EDC浓度为200mmol/L；NHS浓度为500mmol/L。
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