CN113461822A

CN113461822A - Scl-70抗体或其结合片段、其筛选方法及包含其的检测试剂盒

Info

Publication number: CN113461822A
Application number: CN202110581108.4A
Authority: CN
Inventors: 任印玲; 何海华; 周莹莹; 陈清浦; 杜凯; 李婷华
Original assignee: Shenzhen New Industries Biomedical Engineering Co Ltd
Current assignee: Shenzhen New Industries Biomedical Engineering Co Ltd
Priority date: 2021-05-21
Filing date: 2021-05-26
Publication date: 2021-10-01
Anticipated expiration: 2041-05-26
Also published as: CN113461822B

Abstract

本发明提供了一种Scl‑70抗体或其结合片段、其筛选方法及包含其的检测试剂盒，属于体外诊断试剂技术领域。所述抗体或结合片段包含选自2D6或2E6的互补决定区CDR氨基酸序列。相比于现有技术，具有高效价、高准确性及稳定性好的特点，所述Scl‑70抗体或其结合片段可作为Scl‑70抗体检测试剂盒的定标品/阳性对照品/质控品的原料来源。

Description

Scl-70抗体或其结合片段、其筛选方法及包含其的检测试剂盒

技术领域

本发明涉及Scl-70抗体检测领域，具体而言，涉及一种Scl-70抗体或其结合片段、其筛选方法及包含其的检测试剂盒。

背景技术

Scl-70，即人DNA拓扑异构酶I的C末端片段的70kD分子量蛋白，因为其抗原分子量为70KD而得名，存在两种DNA拓扑异构酶，I型和II型，I型切割单链DNA，而II型切割双链DNA。Scl-70抗体识别的抗原是DNA拓扑异构酶I，主要为IgG，IgM，IgA较少见。Scl-70抗体见于多种自身免疫病，是系统性硬化症（Systemic sclerosis，SSc）相对特异性的抗体，其阳性常与弥漫性皮肤病变、近端皮肤累及、心脏受累、并发肿瘤及肺间质纤维化密切相关，被认为是预后不良的指标。检测Scl-70抗体可提高SSc的诊断率，有利于SSc的鉴别诊断和治疗效果的提高。

Scl-70抗体检测方法主要有定性检测法及定量检测法，在定性检测法中，需要用到阳性对照品对检测结果进行阴/阳性的判定。在定量检测法中，则需要用到一系列不同浓度的Scl-70抗体作为定标品对检测结果进行定量赋值。

目前，商品化的Scl-70抗体检测定标品来源较少，各厂家自制的定标品主要为病人血清。病人血清存在来源不固定，产量有限，特异性不高，各批次性能不稳定的问题。因此，急需开发出一种来源广，效价高，稳定性好的Scl-70抗体用于Scl-70抗体的检测。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种Scl-70抗体或其结合片段、其制备方法及包含其的检测试剂盒，以解决现有技术中的Scl-70抗体来源少，效价低及稳定性不佳的问题。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种Scl-70抗体或其结合片段，包含轻链可变区VL和/或重链可变区VH，所述VL包含一具有式FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4的氨基酸序列，其中，CDRL1由SEQ ID NO:8组成，CDRL2由SEQ ID NO:10或29组成，CDRL3由SEQ ID NO:12组成；所述VH包含一具有式FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4的氨基酸序列，其中CDRH1由SEQ ID NO:15组成，CDRH2由SEQ ID NO:17或36组成，CDRH3由SEQ ID NO:19或38组成。

进一步地，所述Scl-70抗体或其结合片段，所述CDRL2、CDRH2及CDRH3选自以下组别1-5中任一组所示的氨基酸序列：

1）CDRL2选自SEQ ID NO:10，CDRH2选自SEQ ID NO:17，CDRH3选自SEQ ID NO:19；

2）CDRL2选自SEQ ID NO:29，CDRH2选自SEQ ID NO:36，CDRH3选自SEQ ID NO:38；

3）CDRL2选自SEQ ID NO:10，CDRH2选自SEQ ID NO:36，CDRH3选自SEQ ID NO:38；

4）CDRL2选自SEQ ID NO:29，CDRH2选自SEQ ID NO:17，CDRH3选自SEQ ID NO:19；

5）CDRL2选自SEQ ID NO:10，CDRH2选自SEQ ID NO:17，CDRH3选自SEQ ID NO:38。

进一步地，所述FRL1由SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:26组成，FRL2由SEQ ID NO:9组成，FRL3由SEQ ID NO:11组成，FRL4由SEQ ID NO:13或32组成；所述FRH1由SEQ ID NO:14或33组成，FRH2由SEQ ID NO:16或35组成，FRH3由SEQ ID NO:18或37组成，FRH4由SEQ ID NO:20或39组成。

根据本发明的另一方面，提供了一种Scl-70抗体或其结合片段，包含轻链可变区VL和/或重链可变区VH，所述VL包含选自SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:23所示的VL氨基酸序列；所述VH包含选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:41所示的VH氨基酸序列。

优选地，所述抗体或结合片段包含VL和VH，所述VL和VH包含选自以下6-10任一组所示的氨基酸序列：

6）VL选自SEQ ID NO:3，VH选自SEQ ID NO:5；

7）VL选自SEQ ID NO:23，VH选自SEQ ID NO:25；

8）VL选自SEQ ID NO:3，VH选自SEQ ID NO:25；

9）VL选自SEQ ID NO:23，VH选自SEQ ID NO:5；

10）VL选自SEQ ID NO:3，VH选自SEQ ID NO:41。

进一步地，所述的抗体或结合片段，还包括轻链恒定区CL和/或重链恒定区CH；优选地，所述CL包含选自人种系IgG抗体CL的保守性氨基酸序列；所述CH包含选自人种系IgG抗体CH的保守性氨基酸序列。

进一步地，所述CL包含选自SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；所述CH包含选自SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。

根据本发明的另一方面，提供了一种Scl-70抗体或其结合片段，包含轻链L链和/或重链H链，所述L链包含选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:21所示的轻链L链氨基酸序列；所述H链包含选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:40任一项所示的H链氨基酸序列；

优选地，所述抗体或结合片段包含L链和H链，所述L链和H链包含选自以下11-15任一组所示的氨基酸序列：

11）L链选自SEQ ID NO:1，H链选自SEQ ID NO:2；

12）L链选自SEQ ID NO:21，H链选自SEQ ID NO:22；

13）L链选自SEQ ID NO:1，H链选自SEQ ID NO:22；

14）L链选自SEQ ID NO:21，H链选自SEQ ID NO:2；

15）L链选自SEQ ID NO:1，H链选自SEQ ID NO:40。

根据本发明的另一方面，提供了一种核酸序列，其特征在于，所述核酸序列编码表达包含上述的Scl-70抗体或其结合片段。

根据本发明的另一方面，提供了一种Scl-70抗体或其结合片段的筛选方法，所述方法包括：

a)从待测样本中提取mRNA，并反转录为cDNA；

b)以cDNA为模板，应用特异性引物组i）扩增轻链可变区基因；应用特异性引物组ii）扩增出重链可变区基因；

c)将轻链可变区基因与重链可变区基因与同一噬菌体载体连接，构建噬菌体抗体库；

d)经过Scl-70抗原亲和吸附-洗脱-扩增，最终筛选出上述的Scl-70抗体或其结合片段。

根据本发明的另一方面，提供了一种检测试剂盒，包含一种检测剂，所述检测剂包含上述的抗体或结合片段。

优选地，所述检测剂还包含保存液，所述保存液包括：氯化钠，10g/L；ProClin300，0.5g/L；100mM7.8Tris。

优选地，所述保存液包括：氯化钠，10g/L；ProClin300，0.5g/L；100mM7.8Tris；0.5w/v%BSA；2 w/v%海藻糖。

优选地，所述检测剂为所述检测试剂盒的定标品、阳性对照品或质控品。

应用本发明的技术方案，可以制备得到高效价、高准确性及稳定性好的Scl-70抗体或其结合片段，解决了目前Scl-70抗体来源少，效价低及稳定性不佳的问题。其为Scl-70抗体检测试剂盒的定标品/阳性对照品/质控品制备提供了一种性能优良的原料来源。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1为抗血清与实施例12、实施例14及实施例15提供的各个抗体之间检测效价/准确性的线性相关示意图；

图2为抗血清与实施例11、实施例113及实施例16提供的各个抗体之间检测效价/准确性的线性相关示意图。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。

抗体（antibody），又称免疫球蛋白（immunoglobulin，简称Ig）是由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)多肽链组成的多域蛋白，通过二硫键连接在一起。重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸序列变化很大，其他部分氨基酸序列相对恒定。因此，将Ig轻链和重链中靠近N端氨基酸序列变化较大的区域称为可变区(variable region，V)，分别占重链和轻链的1/4和1/2；将靠近C端的氨基酸序列相对稳定的区域，称为恒定区(constantregion，C)，分别占重链和轻链的3/4和1/2。

重链和轻链的V区分别称为VH和VL。VH和VL中各含有三个氨基酸组成和排列顺序高度可变的区域，称为互补决定区(complementarity determining region，CDR)，每个VL的三个CDR分别称为CDRL1、CDRL2及CDRL3，每个VH的三个CDR分别称为CDRH1、CDRH2及CDRH3。VH的3个高变区分别位于29～31、49～58和95～102位氨基酸，而VL的3个高变区分别位于28～35、49～56和91～98位氨基酸。VH和VL的3个CDR共同组成Ig的抗原结合部位，决定抗体的特异性，是抗体识别及结合抗原的部位。在V区中，CDR之外区域的氨基酸组成和排列顺序相对保守，称为骨架区(framework region，FR)。VH或VL各有四个FR，每个VL的四个FR分别称为FRL1、FRL2、FRL3及FRL4，每个VH的四个FR分别称为FRH1、FRH2、FRH3及FRH4。即VL从N端至C端的区段排布为-[FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4]-，VH从N端至C端的区段排布为-[FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4]-，即间隔分布的3个CDR区段和间隔分布的4个FR区段构成一条链的完整的可变区。

重链和轻链的C区分别称为CH和CL。C区不参与配体结合并且表现出更有限的变化，恒定区是物种特异性的，可以根据CH的差异分为各种类别和亚类，包括大小，电荷，氨基酸组成，糖基化和生物学功能。

由本申请的背景技术中可知，Scl-70抗体是SSc相对特异性的抗体，对Scl-70抗体进行临床检测，有利于SSc的鉴别诊断和治疗效果的提高。鉴于目前商品化的Scl-70抗体来源较少及已知抗体性能的缺陷，本发明人对Scl-70抗体进行了大量的研究，筛选到了2D6及2E6两株抗体。其中，2D6具有良好的Scl-70反应效价、准确性及热稳定性，2E6具有更高的Scl-70反应效价，但热稳定性稍差。本发明人进一步对自然筛选到的这两株抗体进行优化，最终得到了具有高效价、高准确性及稳定性好的Scl-70抗体。

基于上述研究结果，申请人提出了本申请的技术方案。在本申请一种典型的实施方式中，提供了一种Scl-70抗体或其结合片段，包含轻链可变区VL和/或重链可变区VH，所述VL包含一具有式FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4的氨基酸序列，其中，CDRL1由SEQ ID NO:8组成，CDRL2由SEQ ID NO:10或29组成，CDRL3由SEQ ID NO:12组成；所述VH包含一具有式FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4的氨基酸序列，其中CDRH1由SEQID NO:15组成，CDRH2由SEQ ID NO:17或36组成，CDRH3由SEQ ID NO:19或38组成。

本申请所述Scl-70抗原包括已知的数据库，例如Genbank数据库中已公开的Scl-70抗原氨基酸序列，包括但不限于包含SEQ ID NO:42所示氨基酸序列的Scl-70。

本申请的Scl-70抗体或其结合片段可变区选自2D6及2E6的CDR区氨基酸序列，所述CDR区是通过筛选出效价高的克隆，送测序得到抗体可变区完整序列，然后再通过软件（abysis）分析得到。

抗体轻链或重链的CDR区构成配体的结合口袋，是配体结合的关键序列，因此，对CDR区进行重新组合，可以得到一系列的Scl-70抗体或其结合片段，含有上述的选自2D6或2E6的CDRL和/或CDRH的Scl-70抗体或其结合片段对Scl-70具有良好的反应效价、准确性及稳定性。

进一步地，本申请发明人通过研究发现，不同的CDR组合方式得到的抗体或结合片段对Scl-70的反应效价及热稳定性不同。选自天然抗体V区的三个连续的CDR1-3倾向于作为一个完整的结构单位发挥功能。因此，在本申请一种优选的实施例中，所述Scl-70抗体或其结合片段包含轻链可变区VL和重链可变区VH，所述CDRL2、CDRH2及CDRH3选自以下组别1-5中任一组所示的氨基酸序列：

选自包含所述1-5组别的任一组的CDRL1-3和CDRH1-3氨基酸序列的抗体或结合片段均具备良好的反应效价、准确性及稳定性。

优选地，包含所述组别3的CDR区的抗体或结合片段，其含有天然抗体2D6的三个完整的CDRL1-3及天然抗体2E6的三个完整的CDRH1-3，使得天然的CDRL1-3或CDRH1-3之间的相互作用力得以保存。同时，CDRL与CDRH之间不但不相互拮抗，反而在效价、准确性及稳定性能上相互协同。

在本申请一种优选的实施例中，所述FRL1由SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:26组成，FRL2由SEQ ID NO:9组成，FRL3由SEQ ID NO:11组成，FRL4由SEQ ID NO:13或32组成；所述FRH1由SEQ ID NO:14或33组成，FRH2由SEQ ID NO:16或35组成，FRH3由SEQ ID NO:18或37组成，FRH4由SEQ ID NO:20或39组成。

优选地，所述组别1、3及5对应组别A所示的FRL1-4氨基酸序列，所述组别2及4对应组别B所示的FRL1-4氨基酸序列，所述组别1及4对应组别C所示的FRH1-4氨基酸序列，所述组别2、3及5对应组别D所示的FRH1-4氨基酸序列。

组别	FRL1或FRH1	FRL2或FRH2	FRL3或FRH3	FRL4或FRH4
					A	SEQ ID NO:7	SEQ ID NO:9	SEQ ID NO:11	SEQ ID NO:13
B	SEQ ID NO:26	SEQ ID NO: 9	SEQ ID NO:11	SEQ ID NO:32
					C	SEQ ID NO:14	SEQ ID NO:16	SEQ ID NO:18	SEQ ID NO:20
D	SEQ ID NO:33	SEQ ID NO:35	SEQ ID NO:37	SEQ ID NO:39

所述FR区是通过筛选出效价高的克隆，送测序得到抗体可变区完整序列，然后再通过软件（abysis）分析得到。每个CDR区段之间间隔分布的FR区段氨基酸序列变化较小，在识别抗体时，四个FR主要功能是使抗体分子卷曲，进而使得三个CDR区段相互靠近。

在本申请第二种典型的实施方式中，提供了一种Scl-70抗体或其结合片段，包含轻链可变区VL和/或重链可变区VH，所述VL包含选自SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:23所示的VL氨基酸序列；所述VH包含选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:41所示的VH氨基酸序列。

本申请发明人通过研究发现，将天然抗体2D6或2E6的轻链或重链V区重组，得到的重组抗体具备良好的反应效价、准确性及稳定性，且不同的组合方式之间表现出性能之间的差别。

6）VL选自SEQ ID NO:3，VH选自SEQ ID NO:5；

7）VL选自SEQ ID NO:23，VH选自SEQ ID NO:25；

8）VL选自SEQ ID NO:3，VH选自SEQ ID NO:25；

9）VL选自SEQ ID NO:23，VH选自SEQ ID NO:5；

10）VL选自SEQ ID NO:3，VH选自SEQ ID NO:41。

在本申请一种优选的实施例中，还包括轻链恒定区CL和/或重链恒定区CH；优选地，所述CL包含选自人种系IgG抗体CL的保守性氨基酸序列；所述CH包含选自人种系IgG抗体CH的保守性氨基酸序列。

可通过本领域公知的序列比对的方法得到人IgG抗体CL或CH的保守性氨基酸序列。所述IgG抗体包括IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体或IgG4抗体，或所述IgG抗体的CH1、CH2及或CH3结构域。

在本申请一种优选的实施例中，所述CL包含选自SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；所述CH包含选自SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。

在本申请第三种典型的实施方式中，提供了一种Scl-70抗体或其结合片段，包含轻链L链和/或重链H链，所述L链包含选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:21所示的轻链L链氨基酸序列；所述H链包含选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:40任一项所示的H链氨基酸序列。

本申请发明人通过研究发现，将天然抗体2D6或2E6的L链或H链重组，得到的重组抗体具备良好的反应效价、准确性及稳定性，且不同的组合方式之间又表现出性能之间的差别。

11）L链选自SEQ ID NO:1，H链选自SEQ ID NO:2；

12）L链选自SEQ ID NO:21，H链选自SEQ ID NO:22；

13）L链选自SEQ ID NO:1，H链选自SEQ ID NO:22；

14）L链选自SEQ ID NO:21，H链选自SEQ ID NO:2；

15）L链选自SEQ ID NO:1，H链选自SEQ ID NO:40。

优选地，所述L链选自SEQ ID NO:1，H链选自SEQ ID NO:22的抗体，其含有天然抗体2D6的L链及天然抗体2E6的H链，所述L链及H链之间不但不相互拮抗，反而在效价、准确性及热稳定性能上相互协同。

在本申请第四种典型的实施方式中，提供了一种核酸序列，其特征在于，所述核酸序列编码表达包含上述的Scl-70抗体或其结合片段。本发明的核酸分子可以RNA形式存在，例如mRNA、hnRNA、tRNA或任何其他形式，或以DNA形式存在，包括但不限于通过克隆或合成产生获得的cDNA和基因组DNA或任何它们的组合。DNA可以是三链、双链或单链的，或它们的任何组合。DNA或RNA至少一条链的任何部分可以是编码链，也称为正义链，或其可以是非编码链，也称为反义链。

编码特定氨基酸的密码子是本领域已知的，由于遗传密码的简并性而仍编码所述抗体的核酸序列也是已知的，并且这样的核酸变体也包含于本发明中。

通过上述核酸序列编码表达的Scl-70抗体或其结合片段，具备良好的Scl-70反应效价、准确性及稳定性。

在本申请第五种典型的实施方式中，提供了一种Scl-70抗体或其结合片段的筛选方法，所述方法包括：

a)从待测样本中提取mRNA，并反转录为cDNA；

d)经过Scl-70抗原亲和吸附-洗脱-扩增，最终筛选出Scl-70抗体或其结合片段。

优选地，所述待测样本为系统性硬化症病人外周血清淋巴细胞样本。

优选地，所述b)步骤扩增轻链可变区基因的引物组i）为：

上游引物为：

VL1: 5’-CTAGCTAGC gmcatccrgwtgacccagtctcc-3’

VL2: 5’-CTAGCTAGC gatrttgtgatgacycagwctcc-3’

VL3: 5’-CTAGCTAGC gaaatwgtgwtgacrcagtctcc-3’

VL4: 5’-CTAGCTAGC gawrttgtgmtgacwcagtctcc-3’

VL5: 5’-CTAGCTAGC cagtctgtgctgactcagccacc-3’

VL6: 5’-CTAGCTAGC cagtctgtgytgacgcagccgcc-3’

下游引物为:

VLR1: 5’-TTGGCGCGCC acactctcccctgttgaagctctt-3’

VLR2: 5’-TTGGCGCGCC tgaacattctgtaggggccactg-3’

扩增重链可变区基因的引物组ii）为：

上游引物为：

VH1: 5’-CATGCCATGGgtcctcgcaccatggcccaggtbcagctggtgcagtctgg-3’

VH2: 5’-CATGCCATGG gtcctcgcaccatggcccarrtscagctggtrcartctgg-3’

VH3: 5’-CATGCCATGG cccagrtcaccttgaaggagtctgg-3’

VH4: 5’-CATGCCATGG ccatggccsargtgcagctggtggagtctgg-3’

VH5: 5’-CATGCCATGG ccgaggtgcagctgktggagwcysg-3’

VH6: 5’-CATGCCATGG cccaggtgcarctgcaggagtcggg-3’

下游引物为：

VHR1: 5’-CCCAAGCTT tggggcggatgcact-3’

VHR2: 5’-CCCAAGCTT aagggttggggcggatgcact-3’

通过上述的引物组可以灵敏而特异性地扩增目的抗体可变区区段。通过上述方法筛选得到的Scl-70抗体或其结合片段，具备良好的Scl-70反应效价、及稳定性，且操作简便，效率高。

在本申请第六种典型的实施方式中，提供了一种检测试剂盒，包含一种检测剂，所述检测剂包含上述的抗体或结合片段。

优选地，所述检测剂还包含保存液，所述保存液包括：氯化钠，10g/L；ProClin300，0.5g/L；100mM 7.8Tris。优选地，所述保存液包括：氯化钠，10g/L；ProClin300，0.5g/L；100mM 7.8Tris；0.5w/v%BSA；2w/v%海藻糖。

优选地，所述检测试剂盒为Scl-70抗体检测试剂盒。

将上述的Scl-70抗体或其结合片段保存于上述保存液中，经4℃恒温振荡处理12个月，定标品/阳性对照品中的抗体分子的稳定性相对偏差在±15％范围内；在保存液中添加0.5w/v%BSA；2w/v%海藻糖等组分后，其稳定性相对偏差保持在±6％范围内。

试剂盒通常包括一种或多种检测剂，其中含有被测量的特异性抗体，它们可作为定标品和/或阳性对照和/或质控品。定标品用于建立用于抗体浓度赋值的定标曲线，或者可以在正/负截止值附近使用单个阳性对照品。优选地，用待测的特异性抗体或与其化学相似的材料制备定标品或阳性对照品。理想地，将定标品或对照品制造为以类似于测试分析物（特异性抗体）的方式与其他测定组分相互作用。通常会包括多个定标品，这些定标品包含不同浓度的特异性抗体，这些抗体的浓度跨越了待测物的浓度范围。当所述检测剂作为Scl-70抗体检测用的定标品、阳性对照品或质控品时，所述Scl-70抗体在所述检测剂中的浓度是被标明也即是明确的，且其浓度可以根据检测的需要进行调整。

当然，所述试剂盒还包括用于检测Scl-70抗体的其他必要的检测剂组分，如化学发光免疫分析法相关试剂组分，具体的如Scl-70抗原包被的固相载体组分和标记的抗体试剂组分等。其中，优选地，固相载体为磁性微球，标记的抗体组分是ABEI标记的抗人IgG抗体。

下面将结合具体的实施例来进一步说明本申请的有益效果。需要说明的是，以下实施例及对比例中，如无特殊说明，所用试剂及耗材均为市售产品，比如DNA提取试剂盒，具体DNA的初步提取的步骤可以按照试剂盒的说明进行操作。其中mM表示mmol/L。

1.噬菌体库构建及Fab抗体筛选实施例

1.1用于噬菌体展示Fab抗体的噬菌体库的构建

采用基因合成的方法，体外合成（合成公司）重链CH1恒定区基因，同时合成k和λ轻链恒定区基因。重链CH1恒定区基因以限制性内切酶进行酶切，纯化后重链CH1与噬菌体MC（购自优宝生物）连接，转化大肠杆菌中，构建了MC-CH1载体。将轻链k和λ恒定区基因分别用内切酶进行酶切，纯化后分别将k和λ恒定区基因与MC-CH1载体连接，转化大肠杆菌中，构建MC-CH1-k载体和MC-CH1-λ载体，将这两种载体命名为MCK-1和MCK-2。

1.2人外周血淋巴细胞的分离及总RNA的提取

分别收集10份年龄分别为30-50岁之间的系统系硬化症病人外周血各2mL，分别采用淋巴细胞分离液分离获得外周血淋巴细胞，每份淋巴细胞的量约为5×106。采用Trizol法从淋巴细胞中提取总RNA。

1.3抗体重链和轻链可变区基因的扩增

采用Omniscript RT kit（购自Qiagen有限公司）进行RT-PCR反应，将淋巴细胞总RNA反转录成cDNA。以cDNA为模板，应用一组几乎覆盖人IgG抗体全部轻链或重链可变区编码序列的特异性引物（发明内容部分有详述）进行PCR反应，扩增轻链和重链可变区基因。。PCR产物经1.5%的凝胶电泳鉴定，显示重链可变区基因长度为390bp左右。轻链可变区基因长度为350bp左右。

1.4Fab噬菌体抗体库的构建

将获得的轻链可变区基因分别用限制性内切酶酶切，纯化后分别与MCK-1和MCK-2连接；将MCK-1部分连接产物纯化后溶于100ul无菌水中，分三次电击转化感受态细胞后将转化菌均匀涂布于含抗性的平板中；收集所有克隆质粒的DNA即为k链轻链抗体库；用相同的方法获得λ链轻链抗体库；

将获得的重链可变区基因用限制性内切酶进行双酶切，纯化后与噬菌体载体连接（所述噬菌体载体不限一种载体）；将重链连接产物纯化后溶于100ul无菌水中，电转入感受态细胞后将转化菌均匀涂布于含抗性的平板中；收集所有克隆质粒的DNA即为重链抗体库；

用合适的内切酶进行双酶切，将重链可变区从重链抗体库DNA中切出，分别与轻链k库和λ库DNA连接；电转化感受态细胞后将转化菌均匀涂布于含抗性的平板中；收集所有克隆质粒的DNA即为抗体库DNA；同时将转化菌梯度稀释，涂板后计算菌落个数。获得k链Fab抗体库容量为2.79×108，λ链Fab抗体库容量为2.83×108。

1.5噬菌体抗体库的富集筛选

(a)用10mg/L的人源Scl-70抗原和0.05mo1/L的碳酸氢钠缓冲液，制备人源Scl-70抗原包被的6孔酶标板，并且用小牛血清蛋白4℃封闭过夜。

(b)加1m1/孔Fab噬菌体抗体文库，37℃孵育2小时，用PBST(lg/LTween-20)洗一次。(第一轮洗1次，第二轮洗5次，第三、四、五轮洗10次)。

(c)每孔加入1mL0.lmo1/LHC1(用甘氨酸调pH值至2.2，含1g/LBSA)以洗脱噬菌体，室温静置10min，稍吹打后加入2mol/LTris中和。

(d)用孔中的洗脱液感染2m1新制备的大肠杆菌XL1-b1ue，37℃摇动培养2小时，加入1012pfu辅助噬菌体VCSM13（空载噬菌体，辅助噬菌体），继续摇动培养1小时，加卡那霉素至终浓度70mg/L，30℃摇动培养过夜。离心，收集上清。

(e)从(a)-(d)步为一轮，一共进行5轮，得到高浓度的特异性噬菌体和Scl-70抗体融合蛋白。

1.6 单克隆菌落检测

将第五轮洗脱下来的噬菌体感染TG1细胞，涂2YTAG平板获得单菌落。挑取80个单菌落培养在96孔板中，加入辅助噬菌体进行噬菌体扩增。吸取扩增后的噬菌体上清进行化学发光检测。以Scl-70抗原包被磁性微球，将每个单菌落培养上清分别经行1:10,1:100，1:1000稀释，ABEI标记anti-M13 monoclonal抗体，进行检测。得到两株效果较好的抗体克隆，进行测序。两株抗体命名为2D6-Fab及2E6-Fab。

对2D6-Fab及2E6-Fab进行测序及测序后CDR区分析。分析后，2D6轻链如SEQ IDNO:1所示，轻链可变区如SEQ ID NO:3所示，轻链恒定区如SEQ ID NO:4所示，重链可变区如SEQ ID NO:5所示。FRL1、CDRL1、FRL2、CDRL2、FRL3、CDRL3、FRL4分别如SEQ ID NOs:7-13所示，FRH1、CDRH1、FRH2、CDRH2、FRH3、CDRH3、FRH4分别如SEQ ID NOs:14-20所示。

2E6轻链如SEQ ID NO:21所示，轻链可变区如SEQ ID NO:23所示，轻链恒定区如SEQ ID NO:24所示，重链可变区如SEQ ID NO:25所示。FRL1、CDRL1、FRL2、CDRL2、FRL3、CDRL3、FRL4分别如SEQ ID NO:26、SEQ ID NOs:8-9、SEQ ID NO:29、SEQ ID NOs:11-12、SEQID NO:32所示，FRH1、CDRH1、FRH2、CDRH2、FRH3、CDRH3、FRH4分别如SEQ ID NO:33、SEQ IDNO:15、SEQ ID NOs:35-39所示。

2.Scl-70抗体制备实施例

2.1实施例11-实施例16和对比例11

本实施例11-16分别提供了一种包含L链和H链的Scl-70抗体。L链从N端至C端氨基酸的组成为-FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4-CL-；H链从N端至C端氨基酸的组成为-FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4-CH-。各实施例抗体分别命名为抗体1、抗体2、抗体3、抗体4、抗体5、抗体6。

各抗体的CDRL1均为SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列、FRL2均为SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列、FRL3均为SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，CDRL3均为SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，CDRH1均为SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，CH均为SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。各抗体的其余片段氨基酸序列分别如下表1所示：

表1：

抗体1

抗体2

抗体3

抗体4

抗体5

抗体6

FRL1

SEQ ID NO: 6

SEQ ID NO:26

SEQ ID NO:7

SEQ ID NO:26

SEQ ID NO:7

CDRL2

SEQ ID NO:7

SEQ ID NO:29

SEQ ID NO:10

SEQ ID NO:29

SEQ ID NO:10

FRL4

SEQ ID NO:8

SEQ ID NO:32

SEQ ID NO:13

SEQ ID NO:32

SEQ ID NO:13

FRH1

SEQ ID NO:9

SEQ ID NO:33

SEQ ID NO:14

SEQ ID NO:33

FRH2

SEQ ID NO:10

SEQ ID NO:35

SEQ ID NO:16

SEQ ID NO:35

CDRH2

SEQ ID NO:11

SEQ ID NO:36

SEQ ID NO:17

FRH3

SEQ ID NO:12

SEQ ID NO:37

SEQ ID NO:18

SEQ ID NO:37

CDRH3

SEQ ID NO:13

SEQ ID NO:38

SEQ ID NO:19

SEQ ID NO:38

FRH4

SEQ ID NO:14

SEQ ID NO:39

SEQ ID NO:20

SEQ ID NO:39

CL

SEQ ID NO:4

SEQ ID NO:24

SEQ ID NO:4

2.2抗体重链和轻链基因的合成

根据上述实施例11-16提供的抗体序列构建基因序列，增加信号肽（IL2信号肽MYRMQLLSCIALSLALVTNS），优化密码子后，交由合成公司（金斯瑞）分别合成抗体1、抗体2、抗体3、抗体4、抗体5及抗体6的轻链和重链基因。各抗体的轻链和重链基因序列分别如下表2所示：

表2：

序列

抗体1

抗体2

抗体3

抗体4

抗体5

抗体6

L链

SEQ ID NO:60

SEQ ID NO:62

SEQ ID NO:60

SEQ ID NO:62

SEQ ID NO:60

H链

SEQ ID NO:61

SEQ ID NO:63

SEQ ID NO:61

SEQ ID NO:64

2.3构建哺乳动物表达载体

将体外合成的轻链基因及载体pCHO1.0（购自优宝生物）均用AvrII和BstZ171进行酶切，纯化后连接。连接产物转化大肠杆菌JM109，将转化菌均匀涂布于含抗性的平板中，37℃过夜培养，PCR验证阳性菌。得到阳性质粒L-pCHO1.0。

将体外合成的重链基因及载体pCHO1.0（购自优宝生物）均用EcoRV和PacI进行酶切，纯化后连接。连接产物转化大肠杆菌JM109，将转化菌均匀涂布于含抗性的平板中，37℃过夜培养，PCR验证阳性菌。得到阳性质粒L-H-pCHO1.0。

2.4表达重组蛋白

将生长状态良好的CHO-K1细胞按1.5×106个/mL接种至500ml摇瓶，细胞体积共100ml，放37度，5% CO2摇床，100rpm培养4小时。转染：按照DNA:转染试剂=1:3的比例配制好转染复合物，逐滴加入上述准备的细胞中，边加边轻轻摇动细胞以使复合物充分散开。滴加完毕后旋紧瓶盖，将细胞放在37℃、5%CO2、100rpm条件下培养。转染当天记为第0天。第二天（即转染后培养48h）添加5%培养基体积的补料，并转移至32℃、5%CO2、100rpm条件下培养。在第四、六天各添加5%培养基体积的补料，培养条件维持不变。根据时间安排与细胞活率情况，可以在第八天或第九天收样。

3.抗体效价/准确性检测

3.1检测方法：

Scl-70抗原包被的磁性微球，其中磁性微球的浓度：20mg/mL，Scl-70的浓度为2mg/mL（ArotecM30705011:20T4171108），包被比例为1mg:8ug；

ABEI标记的抗人IgG抗体，其中ABEI浓度：4mg/mL，抗人IgG抗体的浓度：2mg/mL，标记比例为0.5mg:25ug。

1）取一定量的对比例11提供的对比样本，将其按一定比例梯度稀释得到6个浓度的样本，分别用含有上述组分的测定试剂盒(化学发光法)进行检测，测得并记录其RLU；

2）取同样量的实施例11-16提供的待测样本，将其按1）中的特定比例梯度稀释得到7个浓度的样本，分别用含有上述组分的测定试剂盒(化学发光法)进行检测，测得并记录其RLU。

检测方法如下：将40uL样本，20uL磁性微球加到反应杯中37℃温育10min，外加磁场沉淀，去掉上清液，用洗液清洗沉淀复合物3次，加入200uLABEI，37℃温育10min，外加磁场沉淀，去掉上清液，用洗液清洗沉淀复合物3次，直接进入样品测量室，自动监测其RLU。

3）将1）中测定得到的6个不同浓度（原液、稀释3、5、10、15与20倍）的对比例样本的RLU与2）中测定得到的6个对应浓度（稀释10、30、50、100、150与200倍）的样本的RLU，用最小二乘法进行直线拟合，并计算线性相关系数(r)，当R2≥0.95，即线性相关系数(r)≥0.9900，则说明抗体的准确性符合要求，否则不符合。如无特殊说明，每个样本均测定三次，取平均值得到。

待测样本：实施例11-16所述哺乳动物细胞表达的Scl-70抗体（细胞表达上清）。

对比样本：阳性血清样本，阳性样本来源于Bio-Rad、Meridian、ImmunoVision、SeraCare等厂家）

测试机型：Maglumi2000PlusSN:230200251600014。

3.2抗体效价/准确性验证数据和结果：

（1）由表3可知，自然筛选到的2E6抗体（实施例12）效价高于2D6抗体（实施例11），重组抗体(实施例13-16)的效价均高于对比例，其中重组抗体14的效价最高。

（2）由图1及图2可知，实施例11-16的R2≥0.95，其准确性均符合要求。

表3：

样本来源	原液RLU	稀释10倍RLU	稀释30倍RLU	稀释50倍RLU	稀释100倍RLU	稀释150倍RLU	稀释200倍RLU
								实施例11	1635814	1008952	355261	220146	139674	73148	55375
实施例12	2305050	1525412	534645	331346	157678	104964	78577
								实施例13	2189606	1448919	508884	314827	157990	88083	52686
实施例14	2458577	1743672	609213	379232	170846	123885	85651
								实施例15	2002638	1314585	421418	239003	129369	89280	59217
实施例16	1081794	801329	329448	177066	86415	57626	43480
								样本来源	/	原液RLU	稀释3倍RLU	稀释5倍RLU	稀释10倍RLU	稀释15倍RLU	稀释20倍RLU
对比例11	/	80112	26858	16138	8234	5632	4321

4.稳定性验证

4.1验证方法：

实施例21-26(试验组)和对比例21(对照组)提供了一种用于检测Scl-70抗体的定标品/阳性对照品，分别对应包含实施例11-16所提供的经稀释的Scl-70抗体及保存液（氯化钠，10g/L；ProClin300，0.5g/L；100mM7.8Tris）。实施例27提供了另一种定标品/阳性对照品，其与实施例22所述检测剂的差别仅在于：定标品/质控品的保存液为：氯化钠，10g/L；ProClin300，0.5g/L；100mM7.8Tris；0.5w/v%BSA；2 w/v%海藻糖。

测试条件：试验组和对照组的定标品/阳性对照品分别于4℃及40℃，180r/min恒温振荡；

测试时间：4℃连续跟踪12个月，40℃连续跟踪7天；

其他说明：

1）恒温振荡，模拟产品在运输过程中，定标品/阳性对照品中的抗体分子的稳定性，根据下列公式分别计算相对偏差1和偏差2，并得出稳定性的效果；

定标品/阳性对照品的接受标准为4℃环境中处理12个月后，RLU相对偏差(偏差1)在±15％范围内；40℃环境中处理7天后，RLU相对偏差(偏差2)在±15％范围内；

2）经测试50例阳性和100例阴性血清，结合上述线性曲线的线性范围，定标品的高点RLU设为80万，低点RLU设为4千可以满足试剂盒定标曲线的要求。

4.2定标品/阳性对照品稳定保存方法的效果验证数据和结果：

用于检测Scl-70抗体的定标品/阳性对照品稳定保存方法的效果验证数据如表4所示。对比表4中的实验数据可知，

（1）天然筛选的2D6抗体（实施例21）的保存稳定性显著优于2E6抗体（实施例22），2D6抗体7天40℃保存稳定性优约13%。

（2）将实施例27及实施例22进行对比可知，对保存液组分进行优化后，抗体的保存稳定性大大提高。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

表4：

第5天	57984	-11.5	3102	-11.91	582007	-9.87	3032	-10.31
									第6天	50130	-13.55	2671	-13.87	516521	-11.25	2679	-11.64
第7天	42315	-15.59	2248	-15.84	451285	-12.63	2331	-12.98

序列表

<110> 深圳市新产业生物医学工程股份有限公司

<120> Scl-70抗体或其结合片段、其筛选方法及包含其的检测试剂盒

<130> 2021-4-19

<150> 202110557053.3

<151> 2021-05-21

<160> 64

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 220

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Val Val Ser Ala Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln

85 90 95

Tyr Ile Tyr Leu Trp Ser Phe Gly Gly Gly Ser Lys Leu Glu Ile Glu

100 105 110

Arg Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

115 120 125

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

130 135 140

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

145 150 155 160

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

165 170 175

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

180 185 190

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

195 200 205

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220

<210> 2

<211> 446

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 2

Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Val Val Arg Thr Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asn Ile Asn Pro Gly Asp Gly Arg Thr Asn Tyr Asp Glu Asn Phe

50 55 60

Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Pro Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Asp Gly Asn Tyr Gly Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr

100 105 110

Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 3

<211> 113

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 3

Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Val Val Ser Ala Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln

85 90 95

Tyr Ile Tyr Leu Trp Ser Phe Gly Gly Gly Ser Lys Leu Glu Ile Glu

100 105 110

Arg

<210> 4

<211> 107

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 4

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 5

<211> 118

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 5

Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Val Val Arg Thr Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asn Ile Asn Pro Gly Asp Gly Arg Thr Asn Tyr Asp Glu Asn Phe

50 55 60

Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Pro Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Asp Gly Asn Tyr Gly Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr

100 105 110

Ser Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 6

<211> 328

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 6

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Gly Leu Tyr Ser Leu

50 55 60

Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr

65 70 75 80

Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Val

85 90 95

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

100 105 110

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

115 120 125

Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

130 135 140

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

145 150 155 160

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

165 170 175

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

180 185 190

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

195 200 205

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

210 215 220

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr

225 230 235 240

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

245 250 255

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

260 265 270

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

275 280 285

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

290 295 300

Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

305 310 315 320

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325

<210> 7

<211> 23

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 7

Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Val Val Ser Ala Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Leu Ser Cys

20

<210> 8

<211> 17

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 8

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 9

<211> 15

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 9

Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 10

<211> 7

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 10

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser

1 5

<210> 11

<211> 32

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 11

Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr

1 5 10 15

Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 12

<211> 8

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 12

His Gln Tyr Ile Tyr Leu Trp Ser

1 5

<210> 13

<211> 11

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 13

Phe Gly Gly Gly Ser Lys Leu Glu Ile Glu Arg

1 5 10

<210> 14

<211> 30

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 14

Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Val Val Arg Thr Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Arg Phe Thr

20 25 30

<210> 15

<211> 5

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 15

Ser Tyr Trp Met His

1 5

<210> 16

<211> 14

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 16

Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly

1 5 10

<210> 17

<211> 17

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 17

Asn Ile Asn Pro Gly Asp Gly Arg Thr Asn Tyr Asp Glu Asn Phe Lys

1 5 10 15

Asn

<210> 18

<211> 32

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 18

Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Pro Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met Gln

1 5 10 15

Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg

20 25 30

<210> 19

<211> 9

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 19

Asp Gly Asn Tyr Gly Ile Phe Asp Tyr

1 5

<210> 20

<211> 11

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 20

Trp Gly Arg Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 21

<211> 219

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 21

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Val Val Ser Ala Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Gly Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln

85 90 95

Tyr Ile Tyr Leu Trp Ser Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Gly Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser

115 120 125

Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser

130 135 140

Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser

145 150 155 160

Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn

165 170 175

Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp

180 185 190

Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr

195 200 205

Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 22

<211> 450

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 22

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Ile Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Glu Asn Thr Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Ala Ala Tyr Gly Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp

100 105 110

Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile

245 250 255

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260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

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290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

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340 345 350

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355 360 365

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370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 23

<211> 113

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 23

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Val Val Ser Ala Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Gly Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

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Tyr Ile Tyr Leu Trp Ser Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

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<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 24

Gly Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser

1 5 10 15

Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp

20 25 30

Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro

35 40 45

Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn

50 55 60

Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys

65 70 75 80

Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val

85 90 95

Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

100 105

<210> 25

<211> 122

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 25

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Ile Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Glu Asn Thr Leu Phe

65 70 75 80

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85 90 95

Ala Arg Arg Ala Ala Tyr Gly Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp

100 105 110

Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

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<210> 26

<211> 23

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 26

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Val Val Ser Ala Gly

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Glu Lys Val Thr Leu Ser Cys

20

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<211> 17

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 27

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 28

<211> 15

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 28

Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 29

Trp Ala Ser Thr Arg Gly Ser

1 5

<210> 30

<211> 32

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 30

Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr

1 5 10 15

Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 31

<211> 8

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 31

His Gln Tyr Ile Tyr Leu Trp Ser

1 5

<210> 32

<211> 11

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 32

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

1 5 10

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<211> 30

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 33

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

20 25 30

<210> 34

<211> 5

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 34

Ser Tyr Trp Met His

1 5

<210> 35

<211> 14

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 35

Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala

1 5 10

<210> 36

<211> 17

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 36

Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Ile Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 37

<211> 32

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 37

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Glu Asn Thr Leu Phe Leu Gln

1 5 10 15

Met Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg

20 25 30

<210> 38

<211> 13

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 38

Arg Ala Ala Tyr Gly Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Val

1 5 10

<210> 39

<211> 11

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 39

Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 40

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val

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50 55 60

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65 70 75 80

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100 105 110

Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

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Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

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Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

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Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile

245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

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340 345 350

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355 360 365

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370 375 380

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420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 41

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

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Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val

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<210> 42

<211> 163

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

Ile Lys Gly Glu Lys Asp Trp Gln Lys Tyr Glu Thr Ala Arg Arg Leu

1 5 10 15

Lys Lys Cys Val Asp Lys Ile Arg Asn Gln Tyr Arg Glu Asp Trp Lys

20 25 30

Ser Lys Glu Met Lys Val Arg Gln Arg Ala Val Ala Leu Tyr Phe Ile

35 40 45

Asp Lys Leu Ala Leu Arg Ala Gly Asn Glu Lys Glu Glu Gly Glu Thr

50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

Gly Lys Asp Ser Ile Arg Tyr Tyr Asn Lys Val Pro Val Glu Lys Arg

100 105 110

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115 120 125

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Ser Ile Thr

<210> 43

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<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 43

Met Ser Gly Asp His Leu His Asn Asp Ser Gln Ile Glu Ala Asp Phe

1 5 10 15

Arg Leu Asn Asp Ser His Lys His Lys Asp Lys His Lys Asp Arg Glu

20 25 30

His Arg His Lys Glu His Lys Lys Glu Lys Asp Arg Glu Lys Ser Lys

35 40 45

His Ser Asn Ser Glu His Lys Asp Ser Glu Lys Lys His Lys Glu Lys

50 55 60

Glu Lys Thr Lys His Lys Asp Gly Ser Ser Glu Lys His Lys Asp Lys

65 70 75 80

His Lys Asp Arg Asp Lys Glu Lys Arg Lys Glu Glu Lys Val Arg Ala

85 90 95

Ser Gly Asp Ala Lys Ile Lys Lys Glu Lys Glu Asn Gly Phe Ser Ser

100 105 110

Pro Pro Gln Ile Lys Asp Glu Pro Glu Asp Asp Gly Tyr Phe Val Pro

115 120 125

Pro Lys Glu Asp Ile Lys Pro Leu Lys Arg Pro Arg Asp Glu Asp Asp

130 135 140

Ala Asp Tyr Lys Pro Lys Lys Ile Lys Thr Glu Asp Thr Lys Lys Glu

145 150 155 160

Lys Lys Arg Lys Leu Glu Glu Glu Glu Asp Gly Lys Leu Lys Lys Pro

165 170 175

Lys Asn Lys Asp Lys Asp Lys Lys Val Pro Glu Pro Asp Asn Lys Lys

180 185 190

Lys Lys Pro Lys Lys Glu Glu Glu Gln Lys Trp Lys Trp Trp Glu Glu

195 200 205

Glu Arg Tyr Pro Glu Gly Ile Lys Trp Lys Phe Leu Glu His Lys Gly

210 215 220

Pro Val Phe Ala Pro Pro Tyr Glu Pro Leu Pro Glu Asn Val Lys Phe

225 230 235 240

Tyr Tyr Asp Gly Lys Val Met Lys Leu Ser Ala Lys Met Leu Asp His

245 250 255

Glu Tyr Thr Thr Lys Glu Ile Phe Arg Lys Asn Phe Phe Lys Asp Trp

260 265 270

Arg Lys Glu Met Thr Asn Glu Glu Lys Asn Ile Ile Thr Asn Leu Ser

275 280 285

Lys Cys Asp Phe Thr Gln Met Ser Gln Tyr Phe Lys Ala Gln Thr Glu

290 295 300

Ala Arg Lys Gln Met Ser Lys Glu Glu Lys Leu Lys Ile Lys Glu Glu

305 310 315 320

Asn Glu Lys Leu Leu Lys Glu Tyr Gly Phe Cys Ile Met Asp Asn His

325 330 335

Lys Glu Arg Ile Ala Asn Phe Lys Ile Glu Pro Pro Gly Leu Phe Arg

340 345 350

Gly Arg Gly Asn His Pro Lys Met Gly Met Leu Lys Arg Arg Ile Met

355 360 365

Pro Glu Asp Ile Ile Ile Asn Cys Ser Lys Asp Ala Lys Val Pro Ser

370 375 380

Pro Pro Pro Gly His Lys Trp Lys Glu Val Arg His Asp Asn Lys Val

385 390 395 400

Thr Trp Leu Val Ser Trp Thr Glu Asn Ile Gln Gly Ser Ile Lys Tyr

405 410 415

Ile Met Leu Asn Pro Ser Ser Arg Ile Lys Gly Glu Lys Asp Trp Gln

420 425 430

Lys Tyr Glu Thr Ala Arg Arg Leu Lys Lys Cys Val Asp Lys Ile Arg

435 440 445

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Arg Ala Val Ala Leu Tyr Phe Ile Asp Lys Leu Ala Leu Arg Ala Gly

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Asn Glu Lys Glu Glu Gly Glu Thr Ala Asp Thr Val Gly Cys Cys Ser

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660 665 670

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675 680 685

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<210> 44

<211> 32

<212> DNA

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<211> 32

<212> DNA

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<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ctagctagcg aaatwgtgwt gacrcagtct cc 32

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<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

ctagctagcg awrttgtgmt gacwcagtct cc 32

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<211> 32

<212> DNA

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ctagctagcc agtctgtgct gactcagcca cc 32

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<211> 32

<212> DNA

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<400> 49

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<211> 34

<212> DNA

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<212> DNA

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<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<211> 50

<212> DNA

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catgccatgg gtcctcgcac catggcccar rtscagctgg trcartctgg 50

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<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 54

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<210> 55

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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catgccatgg ccatggccsa rgtgcagctg gtggagtctg g 41

<210> 56

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 56

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<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 57

catgccatgg cccaggtgca rctgcaggag tcggg 35

<210> 58

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 58

cccaagcttt ggggcggatg cact 24

<210> 59

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 59

cccaagctta agggttgggg cggatgcact 30

<210> 60

<211> 720

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 60

atgtacagga tgcagctcct gtcctgtatt gctctgtctc tcgcacttgt gaccaactct 60

aatatagtga tgacacaatc cccttcaagc ctggtggttt ctgctgggga gaaggtgact 120

ctgtcttgta agagtagcca gtctctcctg tatagcagca atcagaagaa ctacctggcc 180

tggttccagc agaagcctgg tcagagtcca aagctgctca tctattgggc ctccaccaga 240

gagtccggcg tccctgatcg ctttaccgga tcaggcagtc ggacagactt caccctcaca 300

atctcatccg tgcaggccga agacatggct gtgtattact gtcaccagta tatctatttg 360

tggtccttcg gaggaggtag caagttggag attgagcgac gaaccgtcgc agctccctca 420

gtgttcatat tcccccccag cgacgagcag ctgaaatcag gtacagcaag cgtggtgtgc 480

ctgttgaata acttttaccc tagagaggca aaggtgcagt ggaaggtcga caacgcactc 540

cagagcggca actcccagga gagtgtgacc gaacaagata gtaaggactc aacttactca 600

ctctcttcta cccttaccct ctctaaagct gattatgaga aacacaaggt gtacgcttgt 660

gaagtcaccc accaggggct gagttctccc gtgacaaaaa gtttcaatag gggcgagtgt 720

<210> 61

<211> 1398

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 61

atgtaccgaa tgcagctcct ctcatgtatt gccctgagcc tggctttggt gactaacagc 60

gagatccagc tcgtacagag cggcagtgaa gtagtgcgga ccggcacctc tgtgaaactg 120

agctgcaagg caagtggtta tagatttaca agctattgga tgcattgggt taagcagagg 180

cctggacagg ggctggaatg gatcggcaac atcaatcctg gcgacggccg gactaactat 240

gacgagaact ttaaaaacaa ggccactctg acagttgatc cttcctcaaa cactgcctac 300

atgcaactga acagcttgac atctgaagat agtgctgtgt actattgcac acgggacggc 360

aactatggaa tcttcgacta ttggggccgg gggaccagcg ttaccgttag ttccgcaagc 420

acaaaaggac cttccgtgtt cccacttgca cctagctcta aatcaacaag tggaggcacc 480

gctgccttgg gttgtttggt gaaggattat tttcccgagc cagtgaccgt gagctggaat 540

tctggagccc ttacctccgg agtccacact tttcccgctg tcctccagtc aggattgtat 600

tcactctcca gcgttgtcac cgtaccctct agctcccttg gcacccagac ttacatttgt 660

aatgtgaacc ataaacctag caacaccaaa gttgacaagg tggagcctaa aagctgtgac 720

aaaacccata cttgtcctcc atgtcccgcc cctgaacttc ttggcggtcc tagtgtattc 780

ctgttccccc caaagccaaa ggaccagctc atgatcagcc gcactcccga agtgacttgc 840

gtggtggttg acgtgagcca tgaggaccct gaggtgaaat ttaattggta tgtggatggt 900

gtagaagtgc ataatgccaa gaccaaaccc agggaggaac aatataattc cacatatagg 960

gtcgtgtctg tgctgaccgt gttgcaccag gactggctga acggtaagga atataagtgt 1020

aaggtgtcaa ataaggctct tcctgctccc atcgagaaga ccatcagtaa ggccaaaggc 1080

caaccaaggg agccacaggt gtataccctg ccacctagtc gggaggagat gaccaaaaat 1140

caggtttccc tgacctgtct ggtcaaggga ttctatccat ctgacatcgc cgtggaatgg 1200

gaatctaacg ggcagccaga gaataactac aagacaaccc cacccgtgct ggattcagac 1260

ggaagtttct ttctgtattc taagcttaca gtggacaaat ctaggtggca gcagggaaac 1320

gtgttttcct gctctgtcct gcatgaggcc ctgcataacc actacacaca gaaaagcctc 1380

tccctttccc caggaaag 1398

<210> 62

<211> 717

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 62

atgtacagga tgcagctcct gtcttgtatt gccctgtctc tggccctcgt taccaatagc 60

gacatcgagc ttacacaatc tcctagtagc cttgtggtca gcgcaggcga aaaggtcaca 120

ctgagttgta agtctagtca aagtctgctg tacagttcca atcagaagaa ttatctcgcc 180

tggtttcaac agaagcctgg acagtctcca aaattgctga tttactgggc tagtaccaga 240

ggtagcggcg tgcccgaccg gttcaccggt tcagggtcca ggacagactt tactcttaca 300

atatctagtg ttcaggctga ggacatggct gtgtactatt gccaccaata catatacttg 360

tggtccttcg gggggggcac caaactggag attaagagag gccagccaaa ggccaatcca 420

actgtgacct tgtttcctcc tagttccgag gagctgcagg ctaataaggc taccctggtg 480

tgtctgatct ccgatttcta tccaggcgca gttaccgtgg cctggaaagc tgatggctca 540

cctgttaaag caggcgtaga aactaccaag ccctccaaac agtctaacaa taagtacgca 600

gcctcctctt atttgtcttt gacacccgaa cagtggaaga gccacaggtc ttatagctgc 660

caggtgaccc atgagggctc cacagtggaa aagactgtgg cccccaccga gtgttcc 717

<210> 63

<211> 1410

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 63

atgtatcgca tgcagttgtt gagttgcatc gccctcagcc tcgctctggt aaccaattcc 60

gaggtgaagt tggtggaatc cggtggagga ttggtccagc ccggaggatc tagaaagttg 120

tcatgtgccg cttcaggatt tacttttagc agctattgga tgcactgggt gagacaggcc 180

ccagaaaagg ggctggaatg ggtcgcttat atttcctccg gcggtataac tatctactat 240

gcagacacag tgaaggggcg attcacaatc agcagagata accctgagaa tacactcttt 300

ctgcaaatga ccagcctcac aagtgaagac actgccatct attactgtgc ccgacgcgct 360

gcatatggca attatgattg gtattttgat gtctggggcg caggaactac tgtaaccgtg 420

tctagtgctt ccaccaaagg cccatcagtc ttcccattgg ctccctcttc taagtcaact 480

agtggaggca ccgctgctct tggttgtctg gtgaaggatt actttcccga gcctgtgacc 540

gtaagctgga atagcggcgc acttactagc ggcgtgcaca ccttcccagc tgtcttgcag 600

agtggactgt actctctttc tagcgttgtc acagtgccta gtagctcctt gggtacccaa 660

acctacatct gtaatgtgaa tcataaacca agcaacacca aggtcgataa ggtggagcct 720

aaaagttgcg acaagaccca tacctgccca ccatgtcccg ctcctgaact tttgggtggt 780

ccctctgtat tcctttttcc tcctaagcct aaagatcagc tgatgatcag ccgaacccct 840

gaggttacct gcgtggtggt ggatgtgagc catgaggacc cagaagtgaa gttcaattgg 900

tacgtggacg gcgtggaggt gcataacgct aagactaagc cccgtgagga gcagtataat 960

agcacttacc gtgtggtctc cgtgctgact gtgctgcacc aggattggct gaatgggaag 1020

gaatataagt gtaaggtgtc caataaggct ttgccagccc caattgagaa aaccatttcc 1080

aaggccaaag ggcagccaag ggaaccacag gtgtacaccc tgcctccttc ccgagaagaa 1140

atgaccaaaa atcaggtgag tctgacatgc ctggtgaaag gattctatcc atccgacatc 1200

gccgtggagt gggagagtaa cggacagcct gagaataact ataagacaac cccccctgtt 1260

cttgattctg acggctcatt cttcttgtac tctaagctga cagtggacaa gtcaaggtgg 1320

caacaaggca acgttttctc ttgttccgtc ctgcatgagg ctctccataa tcactataca 1380

caaaagagcc ttagcttgtc ccctggcaag 1410

<210> 64

<211> 1410

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 64

atgtacagaa tgcagcttct cagttgcata gccctgtctt tggccctggt cacaaatagc 60

gaggtgaagc ttgttgaaag cggtggaggc cttgtgcagc ctggtggttc tcgaaagctg 120

agctgtgctg cttccggctt caccttctct agctattgga tgcactgggt gagacaggcc 180

ccagagaaag gtttggaatg ggtcgctaac atcaatcccg gcgacgggcg aactaactac 240

gatgagaact ttaagaacag atttacaatc agccgtgaca atcccgagaa caccttgttt 300

ctccagatga cttctcttac cagcgaggat accgcaattt actattgcgc tcgacgggcc 360

gcctacggga actatgactg gtactttgat gtctggggag ctgggaccac agtgaccgtc 420

tcctccgcat ctaccaaggg ccccagcgtg tttccattgg ctccttccag caagtctaca 480

agtggaggta ccgctgctct cggttgtctc gtcaaggact acttcccaga accagtaact 540

gtgagctgga actcaggggc ccttacctcc ggggtgcata catttcccgc tgtgctgcag 600

agcgggctgt attccctgtc tagcgttgtg accgttccat cctcctcact cggcacacag 660

acctacattt gtaacgttaa tcacaagccc tctaacacca aggttgacaa agtggaaccc 720

aagagctgtg acaagacaca cacttgtcca ccatgtcccg ccccagaact gttgggaggt 780

ccatctgtgt tcctgtttcc cccaaaacca aaggatcagc tgatgatcag taggactccc 840

gaggtaacct gcgtcgtggt ggatgtgtca catgaagatc cagaggtcaa gttcaactgg 900

tatgttgatg gagtggaggt gcataatgcc aaaaccaagc ctcgtgagga acagtacaac 960

tctacctaca gagtggtgag cgtgctgaca gtgctccacc aagactggct caatggaaag 1020

gagtacaagt gcaaagtgag taataaagca ttgcctgccc caatcgaaaa aaccatctct 1080

aaggctaagg gccaaccccg cgaaccacag gtctacacac tgccacccag cagagaagag 1140

atgacaaaaa atcaggtatc actcacctgc ctcgttaaag gcttctatcc ttcagacatc 1200

gccgtcgagt gggagagcaa cggccaacca gagaataatt acaaaacaac cccacctgtg 1260

ttggattccg acggctcctt cttcctgtat tctaagttga ctgttgataa gagccggtgg 1320

cagcagggca acgttttctc ttgcagcgta cttcatgagg cactgcacaa ccactatact 1380

caaaagtccc tgtccctgtc ccccggcaag 1410

Claims

1.一种Scl-70抗体或其结合片段，包含轻链可变区VL和/或重链可变区VH，所述VL包含一具有式FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4的氨基酸序列，其中，CDRL1由SEQ IDNO:8组成，CDRL2由SEQ ID NO:10或29组成，CDRL3由SEQ ID NO:12组成；所述VH包含一具有式FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4的氨基酸序列，其中CDRH1由SEQ ID NO:15组成，CDRH2由SEQ ID NO:17或36组成，CDRH3由SEQ ID NO:19或38组成。

2.根据权利要求1所述的抗体或结合片段，所述CDRL2、CDRH2及CDRH3选自以下组别1-5中任一组所示的氨基酸序列：

3.根据权利要求1所述的抗体或结合片段，所述FRL1由SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:26组成，FRL2由SEQ ID NO:9组成，FRL3由SEQ ID NO:11组成，FRL4由SEQ ID NO:13或32组成；所述FRH1由SEQ ID NO:14或33组成，FRH2由SEQ ID NO:16或35组成，FRH3由SEQ ID NO:18或37组成，FRH4由SEQ ID NO:20或39组成。

4.一种Scl-70抗体或其结合片段，包含轻链可变区VL和/或重链可变区VH，所述VL包含选自SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:23所示的VL氨基酸序列；所述VH包含选自SEQ ID NO:5、SEQID NO:25或SEQ ID NO:41所示的VH氨基酸序列；

6）VL选自SEQ ID NO:3，VH选自SEQ ID NO:5；

7）VL选自SEQ ID NO:23，VH选自SEQ ID NO:25；

8）VL选自SEQ ID NO:3，VH选自SEQ ID NO:25；

9）VL选自SEQ ID NO:23，VH选自SEQ ID NO:5；

10）VL选自SEQ ID NO:3，VH选自SEQ ID NO:41。

5.根据权利要求1或4所述的抗体或结合片段，还包括轻链恒定区CL和/或重链恒定区CH；优选地，所述CL包含选自人种系IgG抗体CL的保守性氨基酸序列；所述CH包含选自人种系IgG抗体CH的保守性氨基酸序列。

6.根据权利要求5所述的抗体或结合片段，所述CL包含选自SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；所述CH包含选自SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。

7.一种Scl-70抗体或其结合片段，包含轻链L链和/或重链H链，所述L链包含选自SEQID NO:1或SEQ ID NO:21所示的轻链L链氨基酸序列；所述H链包含选自SEQ ID NO:2、SEQID NO:22或SEQ ID NO:40任一项所示的H链氨基酸序列；

11）L链选自SEQ ID NO:1，H链选自SEQ ID NO:2；

12）L链选自SEQ ID NO:21，H链选自SEQ ID NO:22；

13）L链选自SEQ ID NO:1，H链选自SEQ ID NO:22；

14）L链选自SEQ ID NO:21，H链选自SEQ ID NO:2；

15）L链选自SEQ ID NO:1，H链选自SEQ ID NO:40。

8.一种核酸序列，其特征在于，所述核酸序列编码表达包含权利要求1至7任一项所述的Scl-70抗体或其结合片段。

9.一种Scl-70抗体或其结合片段的筛选方法，所述方法包括：

a）从待测样本中提取mRNA，并反转录为cDNA；

b）以cDNA为模板，应用特异性引物组i）扩增轻链可变区基因；应用特异性引物组ii）扩增出重链可变区基因；

c）将轻链可变区基因与重链可变区基因与同一噬菌体载体连接，构建噬菌体抗体库；

d）经过Scl-70抗原亲和吸附-洗脱-扩增，最终筛选出权利要求1至7任一项所述的抗体或结合片段Scl-70抗体或其结合片段。

10.一种检测试剂盒，包含一种检测剂，所述检测剂包含权利要求1至7任一项所述的抗体或结合片段；优选地，所述检测剂还包含保存液，所述保存液包括：氯化钠，10g/L；ProClin300，0.5g/L；100Mm 7.8Tris；优选地，所述保存液包括：氯化钠，10g/L；ProClin300，0.5g/L；100mM 7.8Tris；0.5w/v%BSA；2w/v%海藻糖；优选地，所述检测剂为所述检测试剂盒的定标品、阳性对照品或质控品。