CN116593690A - 一种碳青霉烯酶多联检测试纸及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种碳青霉烯酶多联检测试纸及制备方法。试纸支撑底板上依次固定有样品垫、金标蛋白垫、层析检测膜和吸水垫；金标蛋白垫上固定有胶体金标记的金标多抗PcAb，所述金标多抗PcAb为胶体金标记的分别抗NDM、IMP、KPC、OXA23、OXA48及VIM型碳青霉烯酶的单克隆抗体的混合物；层析检测膜上设有六条检测线及一条质控线，六条检测线上分别包被有抗NDM、IMP、KPC、OXA23、OXA48及VIM型碳青霉烯酶的单克隆抗体；质控线上固定有兔抗鼠IgG。该多联检测试纸可一次性检测NDM、IMP、KPC、OXA23、OXA48及VIM型六种碳青霉烯酶，该方法操作简便、高效、灵敏且检测成本低，可用于碳青霉烯酶耐药菌株的早期分型、指导用药，以及辅助临床感染控制和治疗。
Description
技术领域
本发明涉及一种碳青霉烯酶多联检测试纸及制备方法，属于生物技术领域。
背景技术
耐碳青霉烯类抗生素耐药的肠杆菌科细菌(carbapenems resistantenterobacter，CRE)造成的感染呈现逐年上升的趋势。产碳青霉烯酶是耐碳青霉烯类肠杆菌最常见的耐药机制，碳青霉烯酶可以直接水解灭活大多数β-内酰胺类(包括碳青霉烯酶类)和多种非β-内酰胺类抗菌药物，产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌具有快速传播的潜力，相比非产酶的耐碳青霉烯类肠杆菌更易引起院内感染，且病死率更高。碳青霉烯酶的编码基因位于染色体或质粒上，通过克隆传播或基因水平转移使细菌对美罗培南、亚胺培南等β-内酰胺类抗菌药物产生抗性。根据氨基酸序列同源性以及分子结构特点，可将碳青霉烯酶分为A、B、D三类，其中A类为丝氨酸蛋白酶，主要为质粒介导的肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶即KPC酶(Klebsiella pneumoniae carbapenemase)、阴沟肠杆菌(IMI酶、NMC-A酶)、黏质沙雷菌中由染色体介导的SME酶等；B类为金属酶，包括NDM型(New Delhi metallo-βlactamase)、VIM型(Verona integron-encoded metallo-β-lactamase)及IMP型(imipenemasemetallo-β-lactamase)金属β－内酰胺酶；D类为OXA酶(oxacillinase)，主要为OXA-48、OXA-23酶。其中KPC、NDM、OXA-48碳青霉烯酶是肠杆菌科细菌对碳青霉烯类耐药最主要的耐药机制。
目前，常用的检测碳青霉烯酶的方法主要分表型检测法和基因检测法。表型检测方法主要有改良霍奇试验(modified Hodge test，MHT)、基于比色的Carba NP实验、基于质谱的美罗培南溶解试验(MHA)、碳青霉烯灭活试验(carbapenem enzyme inactivationmethod，CIM)、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)鉴定等，这些检测方法所需时间长。此外，生化方法耗时短且敏感性及特异性均较高，但不能区分亚型。基因检测法(聚合酶链式反应，Polymerase Chain Reaction，PCR)是碳青霉烯酶检测的“金标准”，但人力及成本很高。例如，专利CN202110733877.1公开了一种检测六种主要碳青霉烯酶基因引物和探针、试剂盒及方法，其采用实时荧光定量PCR可以用于快速灵敏地检测样品中KPC、VIM、CTX、GES、NDM和IMP共6种碳青霉烯酶基因。
快速检测产碳青霉烯酶多重耐药和泛耐药菌株可以针对性进行及时有效治疗。目前，已有基于胶体金免疫层析法的试剂应用，但是仍然存在各种问题。专利申请号为CN202111630811公开了一种用于检测细菌内碳青霉烯酶的免疫层析试纸条及检测方法，该发明专利选用性质稳定的美罗培南作为底物，以金标青霉素结合蛋白PBP 4’作为受体，通过检测底物消耗情况间接检测样品中碳青霉烯酶的有无。该专利申请选用美罗培南作为底物，以金标青霉素结合蛋白PBP 4’作为受体，通过检测底物消耗情况间接检测样品中碳青霉烯酶的有无，这种方法并不是直接检测碳青霉烯酶，不能准确确定碳青霉烯酶的具体类型。
因此，亟需提供一种操作简单、高效、灵敏的免疫层析法多联检测碳青霉烯酶的方法。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种碳青霉烯酶多联检测试纸及制备方法。该多联检测试纸可一次性检测NDM、IMP、KPC、OXA23、OXA48及VIM型六种碳青霉烯酶，该方法操作简便、高效、灵敏且检测成本低，可用于碳青霉烯酶耐药菌株的早期分型、指导用药，以及辅助临床感染控制和治疗。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种碳青霉烯酶多联检测试纸，所述试纸包括支撑底板，在支撑底板上依次固定有样品垫、金标蛋白垫、层析检测膜和吸水垫；其中，金标蛋白垫上固定有胶体金标记的金标多抗PcAb，所述金标多抗PcAb为胶体金标记的分别抗NDM、IMP、KPC、OXA23、OXA48及VIM型碳青霉烯酶的单克隆抗体的混合物；层析检测膜上设有六条检测线及一条质控线，六条检测线上分别包被有抗NDM、IMP、KPC、OXA23、OXA48及VIM型碳青霉烯酶的单克隆抗体；质控线上固定有兔抗鼠IgG。
所述抗NDM、IMP、KPC、OXA23、OXA48及VIM型碳青霉烯酶的单克隆抗体的混合物为单克隆抗体4F11、3D7、6H3、3A3、7E12、1B5的混合物；
所述包被的抗NDM、IMP、KPC、OXA23、OXA48及VIM型碳青霉烯酶的单克隆抗体分别为单克隆抗体6H9、5G5、4H9、4E3、3F9、1E1。
碳青霉烯酶的单克隆抗体的制备方法为：其中，X为NDM、IMP、KPC、OXA23、OXA48或VIM；
(1)免疫原的制备：
1)构建重组表达载体：按照大肠杆菌表达系统密码子偏爱性，分别对NDM、IMP、KPC、OXA23、OXA48及VIM型碳青霉烯酶的基因序列进行优化合成；优化后合成的基因序列如SEQ ID NO.1-6所示，相应的氨基酸序列如SEQ ID NO.7-12所示；
以合成的基因为模板，经PCR扩增获得目的片段，并将其克隆至表达载体pET-28a，得重组表达载体pET-28a-X；其中，X为NDM、IMP、KPC、OXA23、OXA48或VIM；
2)将重组表达载体pET-28a-X用CaCl2法转入感受态细胞E.coli BL21(DE3)中，获得阳性重组大肠杆菌BL21(DE3)菌株；
3)将阳性重组大肠杆菌BL21(DE3)接种于LB培养基，诱导表达过夜，收集样品进行超声破碎及纯化，分别得到NDM、IMP、KPC、OXA23、OXA48及VIM重组蛋白；
(2)单克隆抗体的制备：
以纯化的NDM、IMP、KPC、OXA23、OXA48或VIM重组蛋白为免疫原，免疫6-8周龄雌性Balb/c小鼠，进行抗体制备。
所述的碳青霉烯酶多联检测试纸的制备方法，包括以下步骤：
(1)抗碳青霉烯酶NDM、IMP、KPC、OXA23、OXA48及VIM型单克隆抗体的制备；
(2)胶体金标记的抗体混合溶液的制备；
(3)金标蛋白垫的制备；
(4)层析检测膜的制备；
(5)吸水垫及支撑底板的制备；
(6)组装试纸。
胶体金标记的抗体混合溶液为胶体金标记的单克隆抗体4F11、3D7、6H3、3A3、7E12、1B5的混合物；胶体金标记的抗体混合溶液中单克隆抗体4F11、3D7、6H3、3A3、7E12、1B5的质量比为1：1：1：1：1：1，终浓度均为0.3mg/mL。
层析检测膜的制备方法为：
1)检测线包被液制备：用0.01mol/L、pH 7.0-7.6的磷酸盐缓冲液，将单克隆抗体6H9、5G5、4H9、4E3、3F9、1E1分别配制成1mg/mL的溶液，备用；
2)质控线包被液制备：用0.1mol/L Tris-HCl缓冲液，将兔抗鼠IgG抗体配制成1mg/mL的溶液，备用；
3)将硝酸纤维素膜切成2.5×30cm的长条，备用；
4)制备印迹：以0.9μL/cm的量，分别将检测线包被液和质控线包被液，喷涂于硝酸纤维素膜上，得到T1、T2、T3、T4、T5、T6六条检测线和一条质控线印迹；检测线与质控线相距0.2cm，于42℃干燥4h，干燥密闭保存。
所述的碳青霉烯酶多联检测试纸在NDM、IMP、KPC、OXA23、OXA48及VIM六种碳青霉烯酶的检测中的应用。
所述的碳青霉烯酶多联检测试纸在碳青霉烯酶耐药菌株的早期分型中的应用。
本发明有益效果：
1.本发明制备的试纸条是基于双抗夹心ELISA检测法的原理，其是针对NDM、IMP、KPC、OXA23、OXA48或VIM抗原的检测，首先根据大肠杆菌的密码子偏好性优化并合成了NDM、IMP、KPC、OXA23、OXA48及VIM蛋白的编码区基因序列(SEQ ID NO.1-6)，通过原核表达系统制备NDM、IMP、KPC、OXA23、OXA48和VIM蛋白，经免疫本发明制备的试纸条能同时检测NDM、IMP、KPC、OXA23、OXA48或VIM六种碳青霉烯酶，快速、简便、特异性好，实现了准确、快速检测的目的。
2.本发明提供了六种碳青霉烯酶抗体，所述的NDM、IMP、KPC、OXA23、OXA48或VIM型碳青霉烯酶抗体与相应的碳青霉烯酶具有较好的亲和力，可制备成检测试剂盒用于碳青霉烯酶耐药菌株的早期分型。
3.本发明实现了一步多检，操作简单快速，结果清晰易辨，具有较好的检测灵敏度和准确性，可用于碳青霉烯酶耐药菌株的早期分型，指导用药，从而辅助临床感染控制和治疗。
附图说明
图1为纯化的NDM、IMP、KPC、OXA23、OXA48或VIM六种碳青霉烯酶的SDS-PAGE电泳鉴定图；
图中，A.NDM蛋白，M为Marker，1、2分别为纯化前后的NDM蛋白；B.OXA-48蛋白，M为Marker，1为纯化后的OXA-48蛋白；
C.KPC蛋白，M为Marker，1为纯化后的KPC蛋白；
D.IMP蛋白，M为Marker，1、2分别为纯化前后的IMP蛋白；
E.OXA-23蛋白，M为Marker，1为纯化后的OXA-23蛋白；
F.VIM蛋白，M为Marker，1为纯化后的VIM蛋白；
图2为美罗培南和头孢硝噻吩鉴定重组蛋白的酶活性；
图中，A.NDM蛋白；B.OXA-48蛋白；C.KPC蛋白；D.IMP蛋白；E.OXA-23蛋白；F.VIM蛋白；
图3为ELISA测定NDM、IMP、KPC、OXA23、OXA48及VIM重组蛋白免疫小鼠血清效价；
图中，A.NDM蛋白免疫小鼠；B.OXA-48蛋白免疫小鼠；C.KPC蛋白免疫小鼠；D.IMP蛋白免疫小鼠；E.OXA-23蛋白免疫小鼠；F.VIM蛋白免疫小鼠；
图4为金标用单克隆抗体的纯化及鉴定；
图中，A.抗NDM蛋白单克隆抗体纯化前后的SDS-PAGE鉴定；其中M为Marker，1、2分别为纯化前后的单克隆抗体；
B.OXA-48蛋白单克隆抗体纯化前后的SDS-PAGE鉴定；其中M为Marker，1、2分别为纯化前后的单克隆抗体；
C.KPC蛋白单克隆抗体纯化前后的SDS-PAGE鉴定；其中M为Marker，1、2分别为纯化前后的单克隆抗体；
D.IMP蛋白单克隆抗体纯化前后的SDS-PAGE鉴定；其中M为Marker，1、2分别为纯化前后的单克隆抗体；
E.OXA-23蛋白单克隆抗体纯化前后的SDS-PAGE鉴定；其中M为Marker，1、2分别为纯化前后的单克隆抗体；
F.VIM蛋白单克隆抗体纯化前后的SDS-PAGE鉴定；其中M为Marker，1、2分别为纯化前后的单克隆抗体；
图5为试纸条的结构示意图；
其中，1为支撑底板，2为层析检测膜，3为样品垫，4为金标蛋白垫，5为吸水垫，6-11分别为检测线T1、T2、T3、T4、T5、T6，12为质控线C；
图6为试纸条结果判定示意图。
具体实施方式
下面结合实施例来说明本发明的具体实施方式，以下实施例是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。
如无特别说明，在以下实施例中所涉及的仪器设备，均为常规仪器设备；所使用试剂为市售常规试剂；所涉及的试验方法均为常规方法。
实施例一：免疫原的选择及制备
1.免疫原的选择
当前，细菌耐药已成为全球公共健康领域的重大挑战，其中尤以碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌(CRE)引起的感染形势最为严峻。随着碳青霉烯类抗菌药物在临床的广泛应用，肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗菌药物的耐药率呈逐年快速上升趋势。CHINET中国细菌耐药监测网历年监测结果显示，我国临床分离肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗菌药物的耐药率从2005年的3％快速攀升至2019年的25％以上，上升幅度高达8倍。2018年全国细菌耐药监测网(CARSS)数据显示，全国1429所医院临床分离的肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗菌药物的平均耐药率为10.1％，部分省市甚至超过20％。产生碳青霉烯酶是肠杆菌目细菌对碳青霉烯类药物耐药最主要的机制。由于不同种类的抗菌药物对产生不同碳青霉烯酶菌株的体外抗菌活性不同，如何准确、快速地对CRE产生的碳青霉烯酶进行检测并分型，对于临床抗感染治疗的精准用药和医院感染预防控制具有重要的价值。KPC型阳性：表明菌株产A类碳青霉烯酶，其活性可被阿维巴坦抑制，产酶菌株通常仅对替加环素、黏菌素、头孢他啶-阿维巴坦敏感。NDM、VIM和IMP型阳性：表明菌株产B类金属β内酰胺酶，其活性不能被阿维巴坦抑制，产酶菌株通常仅对替加环素和多黏菌素敏感，少数菌株对氨曲南敏感。OXA-23和OXA-48型阳性：表明菌株产D类碳青霉烯酶，其活性可被阿维巴坦抑制，产酶菌株通常仅对替加环素、多黏菌素或头孢他啶-阿维巴坦敏感。
基于以上原因，本发明研究筛选NDM、IMP、KPC、OXA23、OXA48或VIM型碳青霉烯酶成为检测碳青霉烯酶的首选靶标蛋白。
2.免疫原的制备
(1)重组表达载体的构建：NDM、IMP、KPC、OXA23、OXA48及VIM型碳青霉烯酶的基因序列按照大肠杆菌表达系统密码子偏爱性进行优化合成，优化后的合成基因的序列如SEQID NO.1-6所示，其中，序列中最后一个三联体密码子taa是终止子，SEQ ID NO.2-6类似。相应的氨基酸序列如SEQ ID NO.7-12所示。
以合成基因为模板，经PCR扩增获得目的片段；引物序列如表1所示，PCR扩增体系如表2所示；将其克隆至表达载体pET-28a，得重组表达载体pET-28a-X，(X为NDM、IMP、KPC、OXA23、OXA48或VIM)。
PCR程序：95℃30s，60℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min；使用TianGen公司DNA纯化试剂盒回收PCR产物，PCR产物及载体质粒分别经BamHI和XhoI双酶切(表3)37℃，4小时之后回收酶切片段，按表4加入目的基因双酶切回收产物、载体质粒双酶切回收产物进行16℃过夜连接。连接产物用CaCl2法转入感受态细胞DH5α，经PCR及测序鉴定最终获得阳性重组大肠杆菌DH5α菌株pET-28a-X，提取质粒备用。
表1引物序列表
| 引物名称 | 酶切位点 | 碱基序列 |
| VIM-F | BamH I | 5'-CGCGGATCCATGGTTGATAGCAGCGGCGAATACC-3'(SEQ ID NO.13) |
| VIM-R | Xho I | 5'-CCGCTCGAGTTATTCAACAACGCTACGGTTGG-3'(SEQ ID NO.14) |
| NDM-F | BamH I | 5'-CGCGGATCCATGGGTGAAATCCGTCCGACC-3'(SEQ ID NO.15) |
| NDM-R | HindIIII | 5'-CCCAAGCTTTTAACGCAGTTTATCCGCCATA-3'(SEQ ID NO.16) |
| IMP-F | BamH I | 5'-CGCGGATCCATGGCGGAATCTCTGCCGGATCTG-3'(SEQ ID NO.17) |
| IMP-R | Xho I | 5'-CCGCTCGAGTTAGTTGCTCGGTTTGCTCGGTTT-3'(SEQ ID NO.18) |
| KPC-F | BamH I | 5'-CGCGGATCCATGCTGACCAACCTGGTTGCGGAACC-3'(SEQ ID NO.19) |
| KPC-R | Xho I | 5'-CCGCTCGAGTTACTGGCCGTTAACACCCAGGC-3'(SEQ ID NO.20) |
| OXA 23-F | BamH I | 5'-CGCGGATCCATGTGCACCGTTCAGCACAACC-3'(SEQ ID NO.21) |
| OXA23-R | Xho I | 5'-CCGCTCGAGTTAGATGATGTTCAGCTGTTTCAG-3'(SEQ ID NO.22) |
| OXA48-F | BamH I | 5'-CGCGGATCCATGAAAGAATGGCAGGAAAACAAAAG-3'(SEQ ID NO.23) |
| OXA48-R | Xho I | 5'-CCGCTCGAGTTACGGGATGATTTTTTCCTGTT-3'(SEQ ID NO.24) |
表2 PCR扩增体系
| 样品 | 体积(μL) |
| 目的基因 | 1 |
| HS酶 | 0.5 |
| dNTP | 4 |
| 5ⅹPrime STAR Buffer | 10 |
| 上游引物F | 1 |
| 下游引物R | 1 |
| 灭菌水 | 32.5 |
表3目的基因双酶切反应体系
| 样品 | 体积(μL) |
| BamHI | 1 |
| XhoI或HindII | 1 |
| PCR回收产物或空载体质粒 | 22 |
| 10×buffer | 5 |
| 灭菌水 | 21 |
表4目的基因和载体连接体系
| 样品 | 体积(μL) |
| 目的基因双酶切回收产物 | 9 |
| 载体质粒双酶切回收产物 | 7 |
| T4 DNA连接酶 | 2 |
| 10×T4 buffer | 2 |
(2)将重组表达载体pET-28a-X质粒用CaCl2法转入感受态细胞E.coli BL21(DE3)中，转化步骤如下：
1)向100μL感受态细胞中加入1μL pET-28a-X质粒(20ng)，混匀后置于冰水浴静置30min；2)冰水浴静置后，迅速置于42℃水浴中，静置90s，接着转移至冰水浴中静置3min；3)向离心管中加入900μL无抗性LB液体培养基，37℃，220rpm/min震荡培50min；4)将上述离心管4000rpm/min离心5min,留100μL左右重悬菌体；5)将上述100μL已转换的感受态的重悬菌体，涂布到LB-Kana的固体培养基上，37℃过夜培养获得阳性重组大肠杆菌BL21(DE3)菌株。用枪头挑取饱满的单菌落，接种到含kana抗性的LB液体培养基内(kana与培养基的体积比为1：1000)，220r/min震荡培养3h。菌液PCR筛选阳性菌落，经测序确认序列正确后，即为阳性重组pET-28a-X-E.coli BL21(DE3)，用于后续蛋白表达纯化。
(3)将阳性重组pET-28a-X-E.coli BL21(DE3)接种于含Kana+抗生素的LB培养基中，直至菌液OD600值在0.6-0.8之间，加入诱导剂IPTG(终浓度0.5mM)，16℃诱导表达过夜后，菌液过夜诱导表达后，8000rpm，5min离心收集沉淀。向沉淀中加入HEPES缓冲液重悬菌体进行超声破碎，经SDS-PAGE鉴定后取超声破碎上清进行Ni柱亲和层析纯化，咪唑梯度洗脱法纯化分别得到NDM、IMP、KPC、OXA23、OXA48及VIM重组蛋白。
(4)将纯化后的重组蛋白进行SDS-PAGE电泳和Western blot检测；
结果如图1所示，鉴定结果显示，获得的NDM、IMP、KPC、OXA23、OXA48及VIM重组蛋白纯度较高，均在90％以上；其中，图1中，A.NDM蛋白；B.OXA-48蛋白；C.KPC蛋白；D.IMP蛋白；E.OXA-23蛋白；F.VIM蛋白。
(5)将纯化后的重组蛋白分别用美罗培南和头孢硝噻吩进行活性鉴定；
结果如图2所示，鉴定结果显示，美罗培南检测重组蛋白酶活性结果显示，连续检测10min内，美罗培南随着时间地推移逐渐被分解，298nm处的吸光值逐渐降低。以上结果证明，原核表达的重组蛋白NDM、IMP、KPC、OXA23、OXA48及VIM具有碳青霉烯酶活性。
实施例二：抗NDM、IMP、KPC、OXA23、OXA48或VIM单克隆抗体的制备及鉴定
1.小鼠免疫
将重组蛋白NDM、IMP、KPC、OXA23、OXA48和VIM分别免疫6-8周龄雌性Balb/c小鼠，进行抗体制备。重组蛋白免疫剂量分别为20μg/只。首次免疫，将重组蛋白与弗氏完全佐剂按体积比1：1混合乳化均匀后，皮下多点注射。第14d和第28d，将重组蛋白与弗氏不完全佐剂按体积比1：1混合乳化均匀后，皮下多点注射，进行第二次、第三次免疫。三免后2周用ELISA测免疫血清效价，取效价最高小鼠，将重组蛋白溶于PBS按照50μg/只进行腹腔注射加强免疫。
ELISA方法测定血清效价的具体操作如下：
1)包被：用碳酸盐缓冲液(CBS，0.05mol/L，pH 9.6)将包被原NDM、IMP、KPC、OXA23、OXA48或VIM(免疫血清)的浓度调整为最佳包被浓度(2μg/mL)，加入96孔板中，100μL/孔，37℃孵育2h，用洗涤缓冲液PBST(PBS(0.01mol/L，pH 7.4)+0.05％(v/v)Tween-20)洗3次，拍干。
2)封闭：在96孔板中加入5％(m/v)脱脂奶，300μL/孔，4℃过夜，PBST洗3次，拍干后4℃保存备用。
3)加免疫血清：第一孔直接加入100μL1：100的免疫血清，第二孔开始用PBS将免疫血清进行倍比稀释。同时设置NC(阴性对照)和BC(空白对照)组，放于37℃孵育1h，PBST洗5次，拍干。
4)加HRP-羊抗鼠酶标二抗：用5％(m/v)脱脂奶按1:5000的比例将Goat-IgG-HRP进行稀释，之后加入96孔板，100μL/孔，37℃孵育30min，PBST洗板5次。
5)显色：加入TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)底物显色液，100μL/孔，室温下进行反应5-7min。
6)终止：按照100μL/孔将2mol/L的H2SO4加入各待测96孔板上，混匀，终止反应。
7)读数：用酶标仪测定OD450nm吸光度值。
8)结果判定：待测孔OD450nm/阴性孔OD450nm≥2.1，则为阳性孔，阳性孔血清的最大稀释度为待测样品的效价。
结果如图3所示，ELISA测定NDM、IMP、KPC、OXA23、OXA48及VIM重组蛋白免疫小鼠血清效价最高在2.56×104-2.048×105之间；根据试验结果选取每组中效价最高的小鼠进行加强免疫。
2.细胞融合及杂交瘤阳性克隆细胞筛选
加强免疫后3-5d提取小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞按计数比1:10混合。混合后加入RPMI 1640培养基至50mL，1500r/min离心5min，去上清。将细胞沉淀置于37℃条件下融合，加入1mL预热的融合剂(45％ PEG4000)，静置2min后，缓慢加入2mL预热的HAT培养基。混匀后，1500r/min离心5min，去上清。将融合后的细胞液铺入已加有饲养细胞的细胞板中，37℃、5％CO2培养箱中培养。在细胞融合后的7-10天用ELISA对96孔板中的杂交瘤细胞培养上清进行筛选，再通过3-5次亚克隆制备阳性单克隆杂交瘤细胞株。
ELISA操作类似ELISA测定血清效价的方法，将加免疫血清改为每孔加100微升1:50稀释的杂交瘤培养上清即可。结果见表5显示：针对重组蛋白NDM、IMP、KPC、OXA23、OXA48和VIM共获得12株单克隆杂交瘤细胞，其上清效价在1.24×103-2.48×103之间。
表5 12株单克隆杂交瘤细胞株上清效价
3.单克隆抗体的制备及鉴定
3.1单克隆抗体的效价测定
将阳性单克隆杂交瘤细胞株进行复苏和扩大培养，取10周龄左右的雌性Balb/c小鼠，按照1mL/只的剂量腹腔注射不完全弗氏佐剂，3d后按照5×105个细胞/只的剂量腹腔注射培养至对数生长期的杂交瘤细胞，体内诱生腹水，约7-14d，观察小鼠腹部，待小鼠腹部隆起后抽取腹水，ELISA操作类似ELISA测定血清效价的方法，将加免疫血清改为每孔加100微升倍比稀释的腹水即可。结果见表6显示：针对重组蛋白NDM、IMP、KPC、OXA23、OXA48和VIM共获得12株单克隆抗体杂交瘤细胞(4F11、3D7、6H3、3A3、7E12、1B5、6H9、5G5、4H9、4E3、3F9、1E1)，其腹水效价在5.12×105-2.048×106之间。
3.2单克隆抗体的亲和力测定
采用ELISA法检测抗体与相应重组蛋白的结合能力，以IMP为例。具体实验过程如下：取IMP蛋白稀释成1μg/mL、2μg/mL浓度，按100μL/孔加入96孔板中，4℃过夜。96孔板用PBST洗三遍，加入含有5％脱脂奶的PBS溶液，放置于37℃1h。分别取IMP抗体(4H9和6H3)进行浓度梯度稀释后分别加入96孔板中，37℃孵育30min。PBST洗三遍，加入羊抗鼠二抗，置于37℃孵育30min。PBST洗三遍后，加入TMB显色液10min，终止显色，测定各个孔OD值，计算出解离常数Kd。经检测，本发明制备的12株单克隆抗体与相应的重组蛋白具有很好的结合能力，其亲和力常数介于1.087×109L/mol到6.29×109L/mol之间(表6)。
表6 12株单克隆抗体腹水效价测定
3.3单克隆抗体的特异性测定
采用ELISA法检测抗体与相应重组蛋白的特异性。具体实验过程如下：取VIM蛋白、OXA23蛋白、NDM蛋白、KPC蛋白、OXA23蛋白、OXA48蛋白稀释成1μg/mL浓度，按100μL/孔加入96孔板中，4℃过夜。96孔板用PBST洗三遍，加入含有5％脱脂奶的PBS溶液，放置于37℃1h。分别取12株单克隆抗体腹水1:2000稀释后分别加入96孔板中，37℃孵育30min。PBST洗三遍，加入羊抗鼠二抗，置于37℃孵育30min。PBST洗三遍后，加入TMB显色液10min，终止显色，测定各个孔OD值，结果如表7所示：经检测，本发明制备的12株单克隆抗体与相应的重组蛋白具有很好的特异性，与其余5种重组蛋白均无交叉反应。
表7 12株单克隆抗体的特异性测定
注：“+”表示OD450值大于1.0，结果为阳性；“-”表示OD450值小于0.2，结果为阴性。
以protein A agarose亲和层析分离纯化单克隆抗体，对纯化前后的单克隆抗体进行SDS-PAGE鉴定，结果如图4所示。鉴定结果显示，获得的NDM、IMP、KPC、OXA23、OXA48及VIM单克隆抗体纯度较高，均在95％以上。
实施例三：兔抗小鼠IgG多克隆抗体的制备
以protein A agarose亲和层析分离纯化获得小鼠血清IgG作为免疫原，与弗氏佐剂混匀乳化后免疫健康新西兰兔，首次免疫以弗氏完全佐剂乳化抗原，以200μg/只的剂量皮下多点注射；每次加强免疫间隔3周，以弗氏不完全佐剂乳化抗原进行注射；最后一次加强免疫2周后，将小鼠血清IgG以2μg/mL的浓度，每孔50μL的用量包被酶联免疫吸附板，用ELISA方法测定免疫血清效价；效价达到预期值(1:102400)及以上值时，采集高免兔全血，37℃放置2h后，以4000rpm的速度离心5min，收取上清。
辛酸硫酸铵法提取兔血淸IgG，得到兔抗鼠IgG多克隆抗体，用ELISA试验方法测定多克隆抗体IgG的效价为1:204800，用于质控线的制备。
实施例四：碳青霉烯酶多联检测试纸的制备方法
本发明使用双抗体夹心胶体金免疫层析法制备碳青霉烯酶检测试纸。本发明所述的试纸中，将胶体金标记的抗NDM、IMP、KPC、OXA23、OXA48及VIM型碳青霉烯酶的单克隆抗体IgG：4F11、3D7、6H3、3A3、7E12、1B5的混合物，简称为金标多抗PcAb；抗体6H9、5G5、4H9、4E3、3F9、1E1分别作为包被抗体用于制备检测印记；兔抗鼠IgG抗体作为质控线。
1.胶体金溶液的制备
取100mL超纯水于500mL洁净的烧杯中，加入1mL 10g/L氯金酸煮沸；在加热搅拌状态下迅速加入新鲜配制的1.6mL 10g/L柠檬酸三钠溶液，变为紫红色后，继续煮沸15min，待溶液冷却至室温，用超纯水定容至100mL，4℃避光保存。
2.抗体IgG混合物的胶体金标记
以1mL胶体金溶液为例，向1mL胶体金溶液中加入2μL 0.2mol/L K2CO3，加入100μL单克隆抗体：4F11、3D7、6H3、3A3、7E12、1B5的混合物溶液，得到金标多抗PcAb；其中，每毫升金标多抗PcAb溶液中包含4F11、3D7、6H3、3A3、7E12、1B5各0.3mg；
室温反应15min，加入3％酪蛋白溶液100μL，室温封闭10min，12000r/min离心10min，弃上清，加入100μL的含1.2wt％BSA、0.05wt％叠氮钠的PBS缓冲液重悬，获得胶体金标记的抗体混合溶液。
3.层析检测膜的制备
(1)检测线包被液制备：用0.01M pH7.0-7.6磷酸盐缓冲液，将上述抗体6H9、5G5、4H9、4E3、3F9、1E1分别配制成1mg/mL待用。
(2)对照线包被液配制：使用0.1mol/LTris-HCl缓冲液将兔抗鼠IgG抗体配制成1mg/mL待用。
(3)将硝酸纤维素膜(NC膜)切成2.5×30cm的长条，备用。
(4)制备印迹：取上述制备的检测线包被液和对照线包被液分别装入喷膜机中，在硝酸纤维素膜上置于XYZ3000喷点仪平台上，并以压条固定；利用Biojet Quanti 3000喷头以0.9μL/cm的量喷涂于硝酸纤维素膜，制成检测线T和对照线C印迹；NC膜上设置有T1、T2、T3、T4、T5、T6六条检测线及质控线(C)；六条检测线T1、T2、T3、T4、T5、T6分别对应抗体6H9、5G5、4H9、4E3、3F9、1E1；检测线与质控线相距0.2cm；于42℃干燥4h；将检测膜置于自封袋中，加干燥剂密闭保存。
4.样品垫的制备
将玻璃棉切成1.8×30cm的长条，使用含有BSA 10g/L、Tween-20 5g/L、NaN33g/L的0.1mol/L PBS溶液的样品垫处理液浸泡玻璃棉条；置45℃干燥箱干燥30min；将样品垫置塑料袋，加干燥剂室温密闭保存备用。
5.金标蛋白垫的制备
将金标蛋白，即步骤2制备的胶体金标记的抗体混合溶液按照5μL/cm的量喷涂于金标垫，于45℃干燥1h，封装：在干燥室内(湿度＜20％)，将已干燥好的硝酸纤维素膜装入事先装有干燥剂的铝箔袋内，抽真空密封保存备用。
6.吸水垫的制备
将吸水纸切2.5×30cm的长条，加干燥剂室温密闭保存备用。
7.支撑底板的制备
将双面胶贴于PVC支撑底板，切成7.5×30cm的长板，制备支撑底板。
8.试纸的组装
在支撑底板上按顺序依次有样品垫、金标蛋白垫、层析检测膜、吸水垫。先将检测膜粘贴于支撑底板中央，然后自上而下将吸水纸粘贴于靠近质控线的检测膜端，将金标蛋白垫和样品垫依次粘贴于靠近检测膜的检测线端，各层间重叠2mm。试纸条的结构如图5所示。利用CM4000切割仪将装配好的试纸板切成宽度为0.25cm的试纸条，干燥密封保存。
9.结果判定
本发明的胶体金多联试纸条检测结果判定方法：
将待检测的样品加载样品垫上过滤后，若待测物中含有NDM、IMP、KPC、OXA23、OXA48或VIM型碳青霉烯酶抗原，则与试纸条上胶体金标记的抗NDM、IMP、KPC、OXA23、OXA48及VIM型碳青霉烯酶的单克隆抗体形成相应复合物，上行被包被在硝酸纤维膜上的抗NDM、IMP、KPC、OXA23、OXA48及VIM型碳青霉烯酶单克隆抗体拦截形成复合物，即在T1、T2、T3、T4、T5或T6处形成红色条带；无论是否含有NDM、IMP、KPC、OXA23、OXA48或VIM型碳青霉烯酶抗原，胶体金标记的抗体都将向上层析被包被在NC膜上的兔抗鼠IgG拦截，在C处质控线上形成红色条带。此条带是质控线，若此线不出现，说明胶体金试纸条失效。
如图6所示，观察结果阳性则出现至少两条结合线，T1显色说明样品中有NDM；T2显色说明样品中有IMP，T3显色说明样品中有KPC；T4显色说明样品中有OXA23，T5显色说明样品中有OXA48；T6显色说明样品中有VIM，判定结果阴性仅出现一条质控线C，若C条带不显色则试剂条无效。
10.试纸条的性能检测
测定本发明方法试纸条的特异性和敏感性。
特异性：选用NDM、IMP、KPC、OXA23、OXA48及VIM型碳青霉烯酶分别测定该胶体金试纸条的特异性。按照5μL样品+95μL样品稀释液的比例，充分混匀后滴加至加样孔中，5min后观察试验结果。特异性试验结果显示，该方法检测结果T线对应位置除了与自身抗原显色外，与其他5种碳青霉烯酶无交叉反应，表明该方法特异性好。
敏感性：分别用PBS把重组蛋白(NDM、KPC、VIM、IMP、OXA48、OXA23)溶液稀释成以下浓度：400ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.125ng/mL。分别用试纸条进行检测，每个样品重复测定3次，10min内读取结果，观察能使T1-T6线消失的最小浓度，即为试纸的检测限，即灵敏度。结果显示多联试纸对重组蛋白NDM、KPC、VIM、IMP、OXA48、OXA23的检测限分别为12.5ng/mL、3.125ng/mL、6.25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、6.25ng/mL，灵敏度较高。
重复性：使用同一批试纸条分别检测高、中、低三个浓度的重组蛋白，评价试纸条的批内重复性，在检测同一个浓度时，同一批试纸条所呈现出来的显色强度基本一致，证明该试纸条具有较好的批内重复性。使用3批试纸条分别检测高、中、低三个浓度的重组蛋白，评价试纸条的批间重复性。在检测同一个浓度时，三个不同批次的试纸条所呈现出来的显色强度也基本一致，证明该试纸条具有较好的批间重复性。
上面结合实施例对本发明作了详细说明，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数变化，形成多个具体的实施例，这些均为本发明的常见变化，在此不再详述。
Claims (8)
1.一种碳青霉烯酶多联检测试纸，其特征在于，所述试纸包括支撑底板，在支撑底板上依次固定有样品垫、金标蛋白垫、层析检测膜和吸水垫；其中，金标蛋白垫上固定有胶体金标记的金标多抗PcAb，所述金标多抗PcAb为胶体金标记的分别抗NDM、IMP、KPC、OXA23、OXA48及VIM型碳青霉烯酶的单克隆抗体的混合物；层析检测膜上设有六条检测线及一条质控线，六条检测线上分别包被有抗NDM、IMP、KPC、OXA23、OXA48及VIM型碳青霉烯酶的单克隆抗体；质控线上固定有兔抗鼠IgG。
2.如权利要求1所述的碳青霉烯酶多联检测试纸，其特征在于，
所述抗NDM、IMP、KPC、OXA23、OXA48及VIM型碳青霉烯酶的单克隆抗体的混合物为单克隆抗体4F11、3D7、6H3、3A3、7E12、1B5的混合物；
所述包被的抗NDM、IMP、KPC、OXA23、OXA48及VIM型碳青霉烯酶的单克隆抗体分别为6H9、5G5、4H9、4E3、3F9、1E1。
3.如权利要求2所述的碳青霉烯酶多联检测试纸，其特征在于，碳青霉烯酶的单克隆抗体的制备方法为：其中，X为NDM、IMP、KPC、OXA23、OXA48或VIM；
(1)免疫原的制备：
1)构建重组表达载体：按照大肠杆菌表达系统密码子偏爱性，分别对NDM、IMP、KPC、OXA23、OXA48及VIM型碳青霉烯酶的基因序列进行优化合成；优化后合成的基因序列如SEQID NO.1-6所示，相应的氨基酸序列如SEQ ID NO.7-12所示；
以合成的基因为模板，经PCR扩增获得目的片段，并将其克隆至表达载体pET-28a，得重组表达载体pET-28a-X；其中，X为NDM、IMP、KPC、OXA23、OXA48或VIM；
2)将重组表达载体pET-28a-X用CaCl2法转入感受态细胞E.coli BL21(DE3)中，获得阳性重组大肠杆菌BL21(DE3)菌株；
3)将阳性重组大肠杆菌BL21(DE3)接种于LB培养基，诱导表达过夜，收集样品进行超声破碎及纯化，分别得到NDM、IMP、KPC、OXA23、OXA48及VIM重组蛋白；
(2)单克隆抗体的制备：
以纯化的NDM、IMP、KPC、OXA23、OXA48或VIM重组蛋白为免疫原，免疫6-8周龄雌性Balb/c小鼠，进行抗体制备。
4.如权利要求3所述的碳青霉烯酶多联检测试纸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)抗碳青霉烯酶NDM、IMP、KPC、OXA23、OXA48及VIM型单克隆抗体的制备；
(2)胶体金标记的抗体混合溶液的制备；
(3)金标蛋白垫的制备；
(4)层析检测膜的制备；
(5)吸水垫及支撑底板的制备；
(6)组装试纸。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，胶体金标记的抗体混合溶液为胶体金标记的单克隆抗体4F11、3D7、6H3、3A3、7E12、1B5的混合物；胶体金标记的抗体混合溶液中单克隆抗体4F11、3D7、6H3、3A3、7E12、1B5的质量比为1：1：1：1：1：1，终浓度均为0.3mg/mL。
6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，层析检测膜的制备方法为：
1)检测线包被液制备：用0.01mol/L、pH 7.0-7.6的磷酸盐缓冲液，将单克隆抗体6H9、5G5、4H9、4E3、3F9、1E1分别配制成1mg/mL的溶液，备用；
2)质控线包被液制备：用0.1mol/L Tris-HCl缓冲液，将兔抗鼠IgG抗体配制成1mg/mL的溶液，备用；
3)将硝酸纤维素膜切成2.5×30cm的长条，备用；
4)制备印迹：以0.9μL/cm的量，分别将检测线包被液和质控线包被液，喷涂于硝酸纤维素膜上，得到T1、T2、T3、T4、T5、T6六条检测线和一条质控线印迹；检测线与质控线相距0.2cm，于42℃干燥4h，干燥密闭保存。
7.如权利要求1-6任一项所述的碳青霉烯酶多联检测试纸在NDM、IMP、KPC、OXA23、OXA48及VIM六种碳青霉烯酶的检测中的应用。
8.如权利要求1-6任一项所述的碳青霉烯酶多联检测试纸在碳青霉烯酶耐药菌株的早期分型中的应用。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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