CN1329523C - 一种限制性荧光标记方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种限制性荧光标记方法，该方法依次包括以下步骤：(1)以限制性核酸内切酶消化由样品核酸提取纯化后反转录获得的cDNA或者以多对针对多种靶基因而设计的引物进行多重PCR扩增获得的扩增产物，产生许多大小较为一致的限制性基因片段；(2)设计接头，与上述限制性酶切片段连接；(3)根据上述限制性内切酶位点与接头序列设计PCR通用引物，并在上述引物的5′端标记上荧光分子；(4)以荧光标记的通用引物进行PCR扩增样品，该扩增样品经纯化后与DNA芯片杂交。本发明可显著增强杂交信号，并同时显著减少荧光物用量，大大提高芯片检测的灵敏度，尤其适合临床病原体基因的检测芯片。
Description
技术领域
本发明涉及一种荧光标记方法，特别是涉及一种限制性荧光标记方法，可用于同时扩增并标记样品中的多种靶基因。
背景技术
根据DNA芯片上固化探针的性质，DNA芯片可以分为以下类型：寡核苷酸芯片、cDNA芯片或基因芯片。DNA芯片技术的方法主要包括以下四个方面：芯片的制备、样品的准备、分子杂交与检测分析。其中样品的准备包括样品核酸的分离纯化、扩增和标记等过程。由于目前芯片检测仪器的灵敏度有限，分离纯化的核酸需要进行扩增，并在扩增过程中进行标记以便对杂交结果进行检测。目前样品的标记主要采用荧光标记法，也可用生物素、放射性同位素等标记，样品的标记在其PCR扩增、反转录等过程中进行。反应中DNA聚合酶、反转录酶等可选择荧光标记的dNTP作为底物，在拷贝延伸的过程中，将其掺入到新合成的DNA片段中。常用的荧光分子包括Cy3、Cy5、FITC和TRITC(罗丹明)、Alexa546、Alexa 690、Biodipy 630/650或生物素等。
常用的标记方法包括反转录标记法、随机引物延伸法、PCR扩增法等。在表达谱芯片的检测中常采用反转录标记或随机引物延伸法进行标记，以反映各种基因表达丰度的差异；而病原体的检测中为提高检测的灵敏度常采用PCR标记的方法。在标记反应中加入Cy3、Cy5标记的dUTP或dCTP，这些荧光标记物在PCR扩增过程中被随机掺入到新合成的DNA分子中。上述这些方法存在如下局限性：①所述的荧光核苷酸非任何聚合酶的天然底物，与核苷酸相连的荧光部分通常比较大，所以聚合酶掺入核苷酸的效率会比掺入其天然底物的效率低得多，因此可能会影响反转录及PCR产物的形成。②所述的荧光核苷酸是以一种随机的方式被掺入到新链中，因此，样品中各种核酸的荧光掺入量存在一定的差异，以这种方法比较基因的表达量时就会出现偏差。③所述的荧光核苷酸类似物相当昂贵，在反转录或PCR中需要量较大。因此，需要采用替代的标记方法，以增加终产物的荧光强度，同时降低成本。
发明内容
本发明的目的是提供一种可显著增强杂交信号、并同时显著减少荧光物用量的限制性荧光标记方法。
为了达到上述目的，本发明所述的限制性荧光标记方法依次包括以下步骤：
(1)以限制性核酸内切酶消化由样品核酸提取纯化后反转录获得的cDNA或者以多对针对多种靶基因而设计的引物进行多重PCR扩增获得的扩增产物，产生许多大小较为一致的限制性基因片段；
(2)设计接头，与上述限制性酶切片段连接；
(3)根据上述限制性内切酶位点与接头序列设计PCR通用引物，并在上述引物的5′端标记上荧光分子；
(4)以荧光标记的通用引物进行PCR扩增样品，该扩增样品经纯化后与DNA芯片杂交。
上述步骤的流程示意图如图1所示，图中的U代表通用引物。
所述的步骤(3)中，在PCR通用引物的5′端标记上的荧光分子可以是Cy3、Cy5或生物素等。
本发明与现有技术相比具有以下优点：①由于荧光分子不是标记在核苷酸上，所以不会影响聚合酶掺入核苷酸的效率以及反转录、PCR产物的形成，大大提高荧光分子的掺入率，可高达100％，因此杂交信号显著增强。②通过采用限制性酶切后扩增的方法，将样品核酸的靶基因酶切成许多个大小约为250bp的片段并都标记上等量的荧光，多段靶基因均可与芯片的探针杂交，扩大了杂交的范围，提高了检测的效率。③由于采用PCR扩增的方法，且荧光分子的掺入率高，所以荧光物的用量可显著减少。④每个新合成的DNA分子都带有同等量的荧光分子，便于比较样品中多种基因的表达量。标记过程中可根据模板量来调节PCR扩增的循环数而有效地应用于基因表达谱芯片的基因差异表达分析。⑤以一个引物即可实现对样品中的多种靶基因同时进行扩增，尤其适用于多种病原体混合感染时基因的检测。⑥本发明所述的标记方法适合各种类型的芯片，如寡核苷酸芯片、cDNA芯片等，尤其适合以限制性扩增方法制备的cDNA探针或基因探针来制作的芯片，因为以限制性PCR标记片段的大小与探针较一致，有利于这两者之间的杂交，使杂交信号进一步增强，提高检测效率。而在随机引物延伸的标记反应中，由于随机引物与DNA模板的结合是随机的，所以标记的片段与探针大小的匹配程度低，杂交的信号相对较弱。因此，以一套引物进行限制性扩增方法制备探针，以另一套引物进行限制性PCR标记样品，这种芯片的设计可使芯片的制作与杂交的过程得到优化。
综上所述，本发明采用荧光分子标记的通用引物进行限制性PCR标记待测样品，可大大提高芯片检测的灵敏度，尤其适合临床病原体基因的检测芯片。
下面将结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
附图说明
图1是本发明所述的限制性荧光标记的流程示意图。
图2是本发明的实施例中的杂交图谱。
具体实施方式
实施例
本实施例中所涉及的DNA芯片制备：
将HIV1U26942 DNA以Sau3A I酶切后连接到BamH I酶切的pUC18载体上，转化大肠杆菌感受态细胞，挑取白色菌落并进行鉴定。然后提取质粒，以引物SO100、SO101扩增靶基因片段作探针。应用基因芯片点样仪，将探针有序地打印在玻片上形成16×18的阵列。打印后玻片以紫外交联仪照射、80℃干烤，置于阴暗、干燥处室温保存，待杂交。
本实施例的限制性荧光标记方法依次包括如下步骤：
(1)以限制性内切酶Sau3A I酶切HIV1U26942 DNA样品，产生具有“GATC”粘性末端的限制性片段。酶切反应可参考以下方法：取约1μg HIV1U26942 DNA，加入2μl 10×内切酶缓冲液，1μl Sau3A I，加双蒸水(ddH2O)至20μl，37℃反应1～2小时。
(2)设计接头，与上述限制性酶切片段连接：
以Oligo 6.0软件设计两条寡核苷酸链S1P(5′-pGATCm CAC ACCAGC CAAACC CA-3′)与S1R(5′-GGTTTGGCTGGTGTG-3′)，合成后溶于双蒸水中。在微量管中将两者等量(等摩尔数)混合，加热至90℃，5分钟。然后，置于PCR仪上，90℃ 3分钟36秒，80℃ 3分钟36秒，70℃ 3分钟36秒，60℃ 3分钟36秒，50℃ 3分钟36秒，40℃ 3分钟36秒，30℃ 3分钟36秒，20℃ 3分钟36秒，4℃保持，形成的接头(S1P/S1R)如下：
GATCCACACCAGCCAAACCCA
|||||||||||||||||||
GTGTGGTCGGTTTGG
以T4 DNA连接酶将上述限制性片段与接头连接。连接反应可参考以下方法：在微量管中加入22μl去离子水，10×连接酶缓冲液3μl，形成的接头2μl，酶切产物2μl，T4 DNA连接酶1μl，16℃反应2～3小时，作为PCR反应的模板。
(3)根据上述限制性内切酶位点与接头序列设计PCR通用引物，并在上述引物的5′端标记上荧光分子：
引物的设计：
引物U GTITGGCTGGTGTGGATC
GGTITGGCTGGTGTG________GATCCACACCAGCCAAACCCA
||||||||||||||||
ACCCAAACCGACCACACCTAG________||||||||||||||||
GTGTGGTCGGTTTGG
CATGGTGTGGTCGGTTTG 引物U
其中，横线代表限制性酶切片段；两端部分为接头；其上方和下方的序列为设计的通用引物U：5′-GTTTGG CTG GTG TGGATC-3′。并在通用引物的5′端加上荧光分子Cy3，即Cy3-U：5′Cy3-GTT TGG CTG GTGTGG ATC-3′。
(4)以荧光标记的通用引物进行PCR扩增样品：
为了便于比较，本实施例采用A和B两个反应管进行试验，其中，B为本实施例的试验，A为对比试验。
在A、B两个PCR反应管中分别加入10μl 10×PCR缓冲液(500mmol/LKCl，100mmol/L Tris-HCl pH 8.3，15mmol/L MgCl2)，10μl dNTPs(各2mmol/L)，1μl PCR反应的模板。然后在A管中加入5μl Cy3-dCTP(1mmol/L)，2μl通用引物U(100μmol/L)；在B管中加入2μl Cy3-U(100μmol/L)。再加H2O至99μl。最后分别加入1μl Taq DNA聚合酶(5U/μl)，轻轻混匀。于PCR仪(Perkin-Elmer 2400)上，95℃变性2分钟后进入30循环的PCR扩增(95℃ 30秒钟，68℃ 30秒钟，72℃ 1分钟)，72℃延伸5分钟，使荧光分子被掺入扩增的DNA片段中。采用QIAquick离心柱(QIAGEN)纯化PCR产物，并离心干燥。将干燥的产物溶于50μl ddH2O，置于-20℃保存备用。
取上述A和B的终产物等量与上述制备好的芯片进行杂交。杂交后清洗玻片并干燥，扫描芯片并分析杂交结果，其杂交图谱如图2所示，其中，A区为对比试验的杂交图谱，B区为本实施例的杂交图谱，由图中可知，本实施例以Cy3-U进行限制性PCR反应的杂交信号显著高于对比试验中以Cy3-dCTP标记的反应(P＜0.001)。
Claims (4)
1.一种限制性荧光标记方法，依次包括以下步骤：
(1)以识别序列为GATC的限制性核酸内切酶Sau3AI消化cDNA或者PCR扩增产物；
(2)设计接头，与上述限制性酶切片段连接，其中所述接头由两条寡核苷酸链S1P(5′-pGATCm CAC ACC AGC CAA ACC CA-3′)与S1R(5′-GGTTTGGCTGGTGTG-3′)混合连接而成；
(3)根据上述限制性内切酶位点与接头序列设计PCR通用引物，该引物的序列为：5′-GTT TGG CTG GTG TGG ATC-3′，并在上述引物的5′端标记上荧光分子，所述的荧光分子选自Cy3、Cy5或生物素；
(4)以荧光标记的通用引物进行PCR扩增样品，该扩增样品经纯化后与DNA芯片杂交。
2.根据权利要求1所述的限制性荧光标记方法，其特征是：所述的步骤(3)中，在PCR通用引物的5′端标记上的荧光分子是Cy3。
3.根据权利要求1所述的限制性荧光标记方法，其特征是：所述的步骤(3)中，在PCR通用引物的5′端标记上的荧光分子是Cy5。
4.根据权利要求1所述的限制性荧光标记方法，其特征是：所述的步骤(3)中，在PCR通用引物的5′端标记上的荧光分子是生物素。
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