CN100359021C - 一种通用引物联合标记法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种通用引物联合标记法，该方法设计了一种与病毒、细菌和人类基因同源性较低的通用引物U和随机通用引物UNN，通过优化的两轮扩增可以同时对各种微量的单链或双链DNA样品进行大量扩增标记并用于临床检测型芯片的杂交，从而能检测多种微量的临床样品。与常用的样品标记方法比较，本发明是一种高效、灵敏的荧光标记方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种对病原微生物进行扩增的荧光标记方法。
背景技术
基因芯片具有高度集成化和平行化等特点，在疾病的基因诊断或病原体诊断中，它可以同时检测多个基因或多种病原体。然而通常情况下用于作疾病诊断的组织和病原体的量非常少，需要将其大量扩增之后才能用于芯片检测。而要对多种临床样品进行扩增标记，目前尚缺乏有效的方法。
常用的样品标记方法包括：随机逆转录方法、随机引物延伸法、RNA的线性扩增及PCR扩增法标记方法。其中随机逆转录方法和随机引物延伸法虽能对多种样品进行标记，但是无法使微量的样品得到扩增，无法用于病原体的芯片检测；RNA的线性扩增标记法进行标记的底物是RNA，它不能用于临床DNA样品的检测，另外其扩增效率也只有数千倍，仍然无法满足临床微量样品的检测；PCR扩增标记虽然能使微量样品得到大量扩增，但是针对多种病原微生物往往得设计多对引物进行多重PCR扩增，在扩增过程由于引物的热力学条件不一致而影响样品的扩增效率，通常情况下多重PCR的引物对数不超过5对。因而需要建立一种高效、灵敏的能对多种病原微生物进行扩增的荧光标记方法。
发明内容
本发明目的是提供一种高效、灵敏的通用引物联合标记法，该方法可以用于各种微量的RNA或DNA样品的荧光扩增标记。
本发明提供的一种通用引物联合标记法，包括以下步骤：
1)用oligo6.0设计通用引物U和随机通用引物UNN，其中
所述通用引物U为CTATACTGAGTCGTTGATC；
所述随机通用引物UNN为CTATACTGAGTCGTTGATCNN，N代表G、A、T或C；
所述cy3-U为cy3标记的通用引物U；
所述cy5-U为cy5标记的通用引物U；
2)对于RNA样品，先用随机通用引物UNN在逆转录酶的作用下逆转录合成cDNA第一链，然后再用于下面的两轮扩增标记；对于DNA单链或双链样品，直接用于下面的两轮扩增标记；
3)样品的第一轮扩增：用随机通用引物UNN对DNA单链或双链样品在Taq酶的作用下进行两个循环的扩增，产生两端带有通用引物U的互补序列的DNA片段；
4)样品的第二轮扩增：第一轮扩增样品通过下述两种荧光标记方法进行第二轮扩增标记：a)用cy3-U或cy5-U扩增标记第一轮的扩增产物，得到用于杂交的荧光标记样品；或b)用通用引物U对第一轮扩增产物进行扩增的过程中掺入荧光标记的dUTP或dCTP，得到用于杂交的荧光标记样品。
上述步骤4)中第一轮扩增样品可以直接进行第二轮扩增标记，在标记的DNA样品量低于100ng时，需将第一轮扩增样品用通用引物U扩增后再进行第二轮扩增标记。
本发明设计了一种与病毒、细菌和人类基因同源性较低的通用引物U和随机通用引物UNN，通过优化的两轮扩增可以同时对各种微量的单链或双链DNA样品进行大量扩增标记并用于临床检测型芯片的杂交，从而能检测多种微量的临床样品。与常用的样品标记方法比较，本发明是一种高效、灵敏的荧光标记方法。
附图说明
图1为本发明通用引物联合标记法示意图；
图2为GFP+H3N2的荧光标记混合物与芯片杂交图；
图3为GFP+H1N1的荧光标记混合物与芯片杂交图；
图4为GFP+B的荧光标记混合物与芯片杂交图；
图5为1000np的GFP双链DNA样品经通用引物联合标记后的杂交结果图；
图6为100np的GFP双链DNA样品经通用引物联合标记后的杂交结果图；
图7为10np的GFP双链DNA样品经通用引物联合标记后的杂交结果图；
图8为1np的GFP双链DNA样品经通用引物联合标记后的杂交结果图；
图9为K562细胞的基因表达谱的双色标记杂交结果图；
图10为K562细胞的基因表达谱的cy3-U标记杂交结果图；
图11为K562细胞的基因表达谱的cy5-U标记杂交结果图。
下面分别以流感病毒和K562细胞为例，介绍本发明的具体实施方式。
具体实施方式
实施例1流感病毒的检测
本实施例中的基因来源：
流感病毒株H1N1(A/GD/376/01)、H3N2(A/GD/448/01)、B(B/GD/704/04)取自广东省CDC，用QIAGEN试剂盒抽提出病毒核酸后，随机引物逆转录合成cDNA第一链。用作阳性对照样品的GFP来源于人工克隆pMD-T18载体，以引物SO100(5`GTAAAACGACGACGGCCAGT 3`)、SO101(5`CAGGAAACAGCTATGAC 3`)扩增载体上的GFP靶基因获得。
基因芯片的来源：
从GeneBank中获得流感病毒代表株的基因序列，用Oligo 6.0按照寡核苷酸探针设计的一般原则设计出长度为60mer的流感病毒寡核苷酸探针27条，GFP寡核苷酸探针4条，将其打印在UltraGAPSTM玻片上，600mJ/cm2的能量强度进行紫外交联。
本实施例中逆转录合成的单链cDNA样品的通用引物联合标记步骤如下：
1)用Oligo 6.0设计通用引物U及UNN，并交由Tri-link公司合成。
2)样品的第一轮扩增：以3种流感病毒的cDNA一链产物5μl及总量分别为1000ng、100ng、10ng、1ng GFP双链DNA作为模板，加入UNN 40pmol，rTaq 10μl(TaKaRa公司)，加双蒸水调整体积为20μl，95℃变性5min后，按照下列条件扩增2个循环：95℃ 30s，5℃ 20min，10℃ 10min，13℃ 10min，16℃ 10min，20℃ 10min，23℃ 8min，26℃ 8min，30℃ 5min，34℃ 5min，38℃ 5min，40℃ 5min，44℃ 5min，48℃ 5min，52℃ 3min，58℃ 1min，72℃ 1min。最后72℃延伸5min后，4℃保存。
3)通用引物U扩增：取第一轮扩增产物5μl，加入通用引物U 80pmol，rTaq50μl(TaKaRa公司)，双蒸水调整总体积为100μl。95℃变性5min，然后94℃ 30s，40℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 2min扩增30个循环，最后72℃延伸5min，4℃保存。
4)样品的第二轮扩增标记：取通用引物U扩增产物10μl，加入cy3标记的通用引物U 100pmol，rTaq 50μl(TaKaRa公司)，双蒸水调整总体积为100μl。按步骤2)中PCR循环条件进行扩增。
5)将上述荧光标记产物用3S PCR纯化试剂盒除去产物中的酶、cy3-U和dNTP，将纯化产物抽干-20℃保存。
在将样品与芯片杂交中，将抽干的荧光标记物溶于杂交缓冲液，与芯片进行杂交清洗后扫描分析杂交结果。
流感病毒H1N1(A/GD/376/01)、H3N2(A/GD/448/01)、B(B/GD/704/04)与芯片的杂交结果如图2～4所示。
不同浓度的GFP双链DNA样品经通用引物联合标记后的杂交结果如图5～8所示，结果显示用通用引物联合标记可以检测到1ng的DNA样品。
实施例2K562细胞的基因表达谱检测
本实施例中的K562细胞有本室培养并保存，用Trizol提出细胞中的RNA后，以Poly(T)18逆转录合成cDNA第一链。
本实施例中逆转录合成的单链cDNA样品的通用引物联合标记步骤如下：
1)用Oligo 6.0设计通用引物U及UNN，并交由Tri-link公司合成。
2)样品的第一轮扩增：以K562细胞的cDNA一链产物约1μg，加入UNN 40pmol，rTaq 10μl(TaKaRa公司)，加双蒸水调整体积为20μl，95℃变性5min后，按照下列条件扩增2个循环：95℃ 30s，5℃ 20min，10℃ 10min，13℃ 10min，16℃ 10min，20℃ 10min，23℃ 8min，26℃ 8min，30℃ 5min，34℃ 5min，38℃ 5min，40℃ 5min，44℃ 5min，48℃ 5min，52℃ 3min，58℃ 1min，72℃ 1min。最后72℃延伸5min后，4℃保存。
3)样品的第二轮扩增标记：取第一轮扩增产物10μl共两份，分别加入cy3和cy5标记的通用引物U 100pmol，rTaq 50μl(TaKaRa公司)，双蒸水调整总体积为100μl。95℃变性5min，然后94℃ 30s，40℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 2min扩增30个循环，最后72℃延伸5min，4℃保存。。
4)将上述两种荧光标记的产物等体积混合后用3S PCR纯化试剂盒除去产物中的酶、dNTP、cy3-U和cy5-U，将纯化产物抽干-20℃保存。
在将样品与芯片杂交中，将抽干的荧光标记物溶于杂交缓冲液，与芯片进行杂交清洗后扫描分析杂交结果。
图9～11所示的是K562细胞的基因表达谱芯片检测图。
Claims (2)
1、一种通用引物联合标记法，包括以下步骤：
1)用oligo6.0设计通用引物U和随机通用引物UNN，其中
所述通用引物U为CTATACTGAGTCGTTGATC；
所述随机通用引物UNN为CTATACTGAGTCGTTGATCNN，N代表G、A、T或C；
所述cy3-U为cy3标记的通用引物U；
所述cy5-U为cy5标记的通用引物U；
2)对于RNA样品，先用随机通用引物UNN在逆转录酶的作用下逆转录合成cDNA第一链，然后再用于下面的两轮扩增标记；对于DNA单链或双链样品，直接用于下面的两轮扩增标记；
3)样品的第一轮扩增：用随机通用引物UNN对DNA单链或双链样品在Taq酶的作用下进行两个循环的扩增，产生两端带有通用引物U的互补序列的DNA片段；
4)样品的第二轮扩增：第一轮扩增样品通过下述两种荧光标记方法进行第二轮扩增标记：a)用cy3-U或cy5-U扩增标记第一轮的扩增产物，得到用于杂交的荧光标记样品；或b)用通用引物U对第一轮扩增产物进行扩增的过程中掺入荧光标记的dUTP或dCTP，得到用于杂交的荧光标记样品。
2、根据权利要求1所述的通用引物联合标记法，其特征是第一轮扩增样品直接进行第二轮扩增标记，在标记的DNA样品量低于100ng时，需将第一轮扩增样品用通用引物U扩增后再进行第二轮扩增标记。
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