CN102796828A - 用于检测乙型肝炎病毒的抗药性株系的核酸引物组、测定试剂盒及检测乙型肝炎病毒的抗药性株系的方法 - Google Patents

用于检测乙型肝炎病毒的抗药性株系的核酸引物组、测定试剂盒及检测乙型肝炎病毒的抗药性株系的方法 Download PDF

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伊藤桂子
木津庆子
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高桥和明
宫崎和典
桥本幸二
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Abstract

本发明提供了检测乙型肝炎病毒的抗药性株系的方法,其包括使用引物组通过LAMP扩增样品溶液中的乙型肝炎病毒核酸以产生扩增产物,然后将扩增产物与含有来源于抗药性株系的多核苷酸的探针和/或含有来源于非抗药性株系的多核苷酸的探针杂交,以检测乙型肝炎病毒的抗药性株系。

Description

用于检测乙型肝炎病毒的抗药性株系的核酸引物组、测定试剂盒及检测乙型肝炎病毒的抗药性株系的方法
技术领域
本发明涉及用于检测编码对于抗药性乙型肝炎病毒是特异性的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸引物组、测定试剂盒及检测乙型肝炎病毒的抗药性株系的方法。
背景领域
作为治疗HBV患者的方法,存在施用抑制HBV增殖的化学药物例如逆转录酶抑制剂的方法。这样的化学药物通过结合dCTP在DNA复制过程中通常结合的位点(从而展示竞争性抑制逆转录酶在整合dCTP中的功能(work)的作用)和通过在复制过程中被整合入DNA(-)链(从而展示阻止DNA链延伸的作用)来抑制HBV增殖。
然而,已知当长时间施用例如拉米夫定时,可出现在某些氨基酸区域(例如,YMDD区域)具有突变的突变病毒,并且该突变病毒抗拉米夫定,从而引起病毒的量的再增加(“Kanzo”(Liver),第47卷,No.11,499-502(2006))。因此,当通过监测显示抗药性株系出现时,需要采取紧急对策例如改变药物等。通过使用PCR扩增乙型肝炎病毒(在下文中称为HBV)的DNA,然后通过序列分析阅读编码上述氨基酸突变的核苷酸序列来进行抗药性株系的检测(Int.J.Med.Sci.20052(1))。然而,期望有以更容易的方式检测抗药性株系的方法。
本发明的公开内容
鉴于上述问题,本发明的目的是提供能够在短时间内容易且便宜地检测HBV的抗药性株系的核酸引物组、测定试剂盒及检测乙型肝炎病毒的抗药性株系的方法。
为了实现该目的,本发明提供了检测乙型肝炎病毒的抗药性株系或非抗药性(drug-nonresistant)株系的方法,包括:
使用引物组通过LAMP扩增样品溶液中的乙型肝炎病毒的核酸以产生扩增产物,和
将扩增产物与含有来源于乙型肝炎病毒的抗药性株系的多核苷酸的探针和/或含有来源于乙型肝炎病毒的非抗药性株系的多核苷酸的探针杂交,以检测乙型肝炎病毒的抗药性或非抗药性株系,
其中所述引物组包括FIP引物、F3引物、BIP引物和B3引物,并且至少一个组选自:
引物组1,其中FIP引物由SEQ ID NO:3表示,BIP引物由SEQID NO:4表示,F3引物由SEQ ID NO:27表示,以及B3引物由SEQ IDNO:28表示,和
引物组2,其中FIP引物由SEQ ID NO:5表示,BIP引物由SEQID NO:6表示,F3引物由SEQ ID NO:29表示,以及B3引物由SEQ IDNO:30表示,
所述引物组用于扩增含有编码乙型肝炎病毒的聚合酶区域中的位点181和204上的氨基酸的核苷酸序列的核苷酸序列区域;
引物组3,其中FIP引物由SEQ ID NO:7表示,BIP引物由SEQ IDNO:8表示,F3引物由SEQ ID NO:31表示,以及B3引物由SEQ ID NO:32表示,
引物组4,其中FIP引物由SEQ ID NO:9表示,BIP引物由SEQ IDNO:10表示,F3引物由SEQ ID NO:31表示,以及B3引物由SEQ ID NO:32表示,
引物组11,其中FIP引物是由SEQ ID NO:7表示的多核苷酸,BIP引物由SEQ ID NO:121表示,F3引物由SEQ ID NO:31表示,以及B3引物由SEQ ID NO:123表示,和
引物组12,其中FIP引物是由SEQ ID NO:9表示的多核苷酸,BIP引物由SEQ ID NO:122表示,F3引物由SEQ ID NO:31表示,以及B3引物由SEQ ID NO:124表示,
所述引物组用于扩增含有编码乙型肝炎病毒的聚合酶区域中的位点204和236上的氨基酸的核苷酸序列的核苷酸序列区域;
引物组5,其中FIP引物是由SEQ ID NO:15表示的多核苷酸,BIP引物由SEQ ID NO:16表示,F3引物由SEQ ID NO:33表示,以及B3引物由SEQ ID NO:34表示,
引物组6,其中FIP引物是由SEQ ID NO:17表示的多核苷酸,BIP引物由SEQ ID NO:18表示,F3引物由SEQ ID NO:35表示,以及B3引物由SEQ ID NO:36表示,
引物组7,其中FIP引物是由SEQ ID NO:19表示的多核苷酸,BIP引物由SEQ ID NO:20表示,F3引物由SEQ ID NO:37表示,以及B3引物由SEQ ID NO:38表示,和
引物组8,其中FIP引物是由SEQ ID NO:21表示的多核苷酸,BIP引物由SEQ ID NO:22表示,F3引物由SEQ ID NO:39表示,以及B3引物由SEQ ID NO:40表示,
所述引物组用于扩增含有编码乙型肝炎病毒的聚合酶区域中的位点236上的氨基酸的核苷酸序列的核苷酸序列区域;和
引物组9,其中FIP引物是由SEQ ID NO:23表示的多核苷酸,BIP引物由SEQ ID NO:24表示,F3引物由SEQ ID NO:41表示,以及B3引物由SEQ ID NO:42表示,和
引物组10,其中FIP引物是由SEQ ID NO:25表示的多核苷酸,BIP引物由SEQ ID NO:26表示,F3引物由SEQ ID NO:43表示,以及B3引物由SEQ ID NO:44表示,
所述引物组用于扩增含有编码乙型肝炎病毒的聚合酶区域中的位点181上的氨基酸的核苷酸序列的核苷酸序列区域。
根据本发明,可在短时间内容易地、便宜地并且准确地检测到HBV的抗药性株系或非抗药性株系。
附图概述
图1是LAMP法的示意图。
图2是显示LAMP法的中间产物和内部引物(inner primer)(FIP,BIP)的退火位置的示意图。
图3是显示环引物(loop primer)的排布的示意图。
图4是显示LAMP法的中间产物和环引物(LFc,LBc)的退火位置的示意图。
图5是显示扩增产物的检测位置的示意图。
图6是固定有探针的基质的一个实施方案的平面示意图。
图7是固定有探针的基质的一个实施方案的平面示意图。
图8显示数据库中注册的HBV序列的登录号。
图9显示数据库中注册的HBV序列的登录号。
图10显示HBV的标准序列。
图11显示HBV的标准序列。
图12显示检测靶序列(detection target sequence)的核酸引物序列和相对位点。
用于进行本发明的最佳模式
HBV的抗药性株系是一种突变株。抗药性株系与为非抗药性株系的株系(野生型株系)相异在于HBV的聚合酶区域的氨基酸序列中的位点181、204或236上的氨基酸。这样的突变源自HBV基因的突变,并且突变位点是因编码氨基酸序列的核苷酸序列中存在突变而产生的。因此,HBV的抗药性株系可通过鉴定基于所述区域的碱基突变的核苷酸多态性来检测,从而可判断来自受试者例如感染HBV的患者的HBV是抗药性的还是非抗药性的。
基于这样的碱基突变(在下文中称为核苷酸多态性)的核苷酸多态性一直以来主要通过PCR(聚合酶链式反应)来检测。然而,在PCR方法中,预处理例如核酸提取是非常麻烦的。此外,存在必需通过热循环仪等进行复杂的温度控制以及需要2小时或更长的反应时间的不便之处。存在的另外的问题:因为PCR法的扩增产物是双链的,因此在检测中互补链充当了探针的竞争者,从而引起检测灵敏度的减弱。由此得出,为了使扩增产物成为单链,使用利用酶或磁珠分解或分离互补链的方法,但在任一种情况下,都存在问题例如非常麻烦的操作和更高的费用。
因此,在本发明中,使用LAMP(环介导等温扩增(loop-mediatedisothermal amplification))代替PGR,将扩增产物与核酸探针杂交,检测杂交,从而检测核苷酸多态性。
LAMP法是在等温条件下在60至65℃下扩增核酸的技术。LAMP法优于PCR法在于可在短时间内获得大量的扩增产物。也已报导LAMP法几乎不受样品中的杂质影响。通过使用LAMP法,可容易地扩增靶核酸。
例如,方法包括但不限于,可在测量中使用核酸探针来检测扩增产物。核酸探针可以是特异性检测利用根据本发明的LAMP扩增引物扩增的区域的任何探针。核酸探针是分别与野生型(即非抗性株系)的扩增产物和突变型(即,抗性株系)的扩增产物互补并且彼此之间具有更低的交叉反应性的核酸探针,将各自的核酸探针用于与各自扩增产物杂交,然后检测与各自核酸探针结合的扩增产物。可分别检测结合野生型核酸探针的扩增产物和结合突变型核酸探针的扩增产物来判断样品中的HBV病毒是抗药性的还是非抗药性的。
<LAMP法的概述>
在下文中,概述了LAMP法。在本说明书中,接受核苷酸多态性的检测的核酸称为样品核酸。利用根据本发明的LAMP引物扩增的含有编码HBV的聚合酶区域中的位点181、204或236上的氨基酸的区域的核酸称为靶核酸。通过LAMP法获得的产物称为扩增产物。含有作为扩增的受试者的HBV的溶液称为样品溶液。
在LAMP法中,使F3、F2和F1区域从靶核酸的5’-末端侧按该顺序排列,并且使B3c、B2c和B1c区域从3’-末端侧按该顺序排列。如图1中所示的4种引物用于扩增靶核酸。F1c、F2c、F3c、B1、B2和B3区域分别指F1、F2、F3、B1c、B2c和B3c区域在互补链中的区域。
在LAMP法中用于核苷酸扩增的4种类型的引物是(1)在其3’-末端侧具有与F2区域相同的序列并且在其5’-末端侧具有与F1区域互补的序列的FIP引物;(2)由与F3区域相同的序列的组成的F3引物;(3)在其3’-末端侧具有与B2c区域互补的序列并且在其5’-末端侧具有与B1c区域相同的序列的BIP引物;和(4)由与B3c区域的互补序列组成的B3引物。通常,FIP引物和BIP引物称为内部引物,F3引物和B3引物称为外部引物。
当4种引物用于LAMP扩增时,形成具有如图2中所示的哑铃结构的中间产物。FIP和BIP引物结合单链环中的F2c和B2c区域,以起始从引物3’-末端和从中间产物的3’-末端开始的延伸反应。关于详细内容,参考日本专利案3313358。
在LAMP法中,(5)称为环引物(loop primer)的引物可进一步任意地用于减少扩增时间。在该情况下,如图3中所示,将LF区域置于范围从F2区域至F1区域的部分中,以及将LBc区域置于范围从B2c区域至B1c区域的部分中。这些部分称作环引物区域。然后,除了上述4种引物外还可使用由与LF区域互补的序列组成的环引物LFc和由与LBc区域相同的序列组成的环引物LBc。关于详细内容,参考WO2002/0249028。环引物LFc和LBc可同时使用,或可只使用它们中的一个。该环引物,如图4中所示,在与FIP和BIP引物退火的环不同的环上退火,从而提供了促进扩增的另外的合成起始点。
当将要检测核苷酸多态性时,待检测的多态位点位于图5中所示的FP区域(F-环)或BPc区域(B-环)中。备选地,不同的多态性可分别位于FP和BPc区域。如图5中所述,范围从F2区域至F1区域的部分是将在扩增产物中产生单链的部分。类似地,范围从B2c区域至B1c区域的部分也是将在扩增产物中产生单链的部分。当待检测的多态位点位于为单链的部分时,其利用核酸探针进行的检测由于与核酸探针高效率的反应而得到促进。
此类引物的选择将在后而进行详细描述。
<LAMP扩增产物的检测;核酸探针>
设计核酸探针以使其结合含有多态位点的FP或BPc区域。即,核酸探针具有与在FP或BPc区域中含有多态位点的区域的序列互补的序列。
分别与FP和BPc区域互补的FPc和BP区域也存在于扩增产物中,因此,这些FPc和BP区域也可用于检测。
在本说明书中,含有与野生型的扩增产物互补的序列的核酸探针称为野生型核酸探针或非抗药性探针,而含有与突变型的扩增产物互补的序列的核酸探针称为突变型核酸探针或抗药性探针。
核酸探针包括但不限于DNA、RNA、PNA、LNA、具有甲基膦酸主链的核酸和其他人造核酸。为了固定在基质上,可用反应性官能团例如氨基、羧基、羟基、巯基或磺基修饰核酸探针的末端。可在官能团和多核苷酸之间导入间隔子。例如,可使用由烷烃或乙二醇主链组成的间隔子。
核酸探针的长度是最短15个碱基至最长45个碱基。长度更优选为15至40个碱基,更优选18至35个碱基。
<固定核酸探针的基质>
核酸探针可通过固定在基质上来使用,但核酸探针的用途不限于此。固定核酸探针的基质可以是称为DNA芯片或本身已知的DNA微阵列的装置。
在一个实施方案中的固定探针的基质的示意图示于图6中。探针被固定在基质1上的固定区域2中。基质1可以例如由硅基质等制造,但基质的材料不限于此。可通过本领域内已知的方法固定探针。可将一种探针或多种探针固定在一个基质1上,可由本领域技术人员适当地设计探针的排列和数目,以及必要时进行改变。当如后所述通过荧光检测探针时,可以使用例如本实施方案中的固定探针的基质。
另一个实施方案中的固定探针的基质的示意图示于图7中。在该实施例中,基质11具有电极12。探针被固定在电极12上。将电极12与衬垫13连接以回收(retrieving)电信息。基质11可以例如由硅基质等制造,但基质的材料不限于此。电极的制造和探针的固定可使用本领域内已知的方法来进行。电极不受特别限制,但可由单一金属或其合金例如金、金合金、银、铂、汞、镍、钯、硅、锗、镓或钨、碳例如石墨或玻璃碳或其氧化物或化合物制造。
图7中固定基质具有10个电极,但排布在一个基质上的电极的数目不限于此,其可任意改变。排布在其上的电极的模式不限于图中所示的模式,其可由本领域技术人员适当地设计和改变。必要时基质1可具有参比电极和反电极(counter electrode)。当如后所述通过电化学检测探针时,可使用例如本实施例中的固定探针的基质。
<核酸探针与扩增产物之间的杂交>
在适当的条件下进行核酸探针与扩增产物之间的杂交。适当的条件可视扩增产物的类型和结构、检测序列中含有的碱基的类型以及核酸探针的类型而变化。在例如离子强度在0.01至5的范围内和pH在5至10的范围内的缓冲液中进行杂交。可向反应溶液中加入为杂交促进剂的硫酸葡聚糖、鲑精DNA、小牛胸腺DNA、EDTA和表面活性剂。例如在10至90℃的范围内的温度下进行反应,并且可通过搅拌或振荡来增加反应的效率。关于反应后的清洗,可使用离子强度在0.01至5的范围内以及pH在5至10的范围内的缓冲液。
<检测方法>
当将固定在基质上的探针与扩增产物杂交时,形成双链核酸。可通过电化学或荧光检测该双链核酸。
(a)电流检测系统
描述了通过电化学检测双链核酸的方法。在该方法中,使用特异性识别双链核酸的双链识别物质。双链识别物质的实例包括但不限于Hoechst 33258、吖啶橙、奎纳克林(quinacrine)、柔红霉素(daunomycin)、金属插入剂(metallointercalator)、双插入剂(bisintercalator)例如双吖啶、三插入剂(trisintercalator)和多插入剂。此类物质可用电化学活性金属复合物例如二茂铁或紫罗碱进一步修饰。
双链识别物质的浓度视其类型而变化,但通常在1ng/mL至1mg/mL的范围内变化。在该情况下,可使用具有0.001至5的离子强度和pH在5至10的范围内的缓冲液。
在杂交反应过程中或之后,向反应溶液中加入双链识别物质。当双链核酸已通过杂交形成时,双链识别物质与其结合。由此得出,通过应用等于或高于引起双链识别物质的电化学反应的电压的电压,可测量来源于双链识别物质的反应电流值。在该情况下,可使用恒定速率电压(constant-rate voltage)、脉冲电压或恒压。在测量中,可使用装置例如恒电位器、数字万用表和函数发生器来调控电流和电压。例如,优选可使用描述于日本专利申请KOKAI公开案10-146183的已知的电化学检测方法。
(b)荧光检测法
描述了荧光检测双链核酸的方法。之前用荧光活性物质标记引物。备选地,在检测中使用荧光活性物质标记的第二探针。备选地,可使用多个标记。荧光活性物质包括但不限于荧光染料例如FITC、Cy3、Cy5和罗丹明。荧光物质用例如荧光检测器来检测。将经改造适用于标记的类型的适当的检测器用于检测已标记的检测序列或第二探针。
<用于选择核酸引物和核酸探针的指导方针>
如图5中所示,当所述核苷酸多态位点位于B1c和B2c之间,即位于BPc区域中时,则BIP引物是具有与B2c区域互补的序列和具有与B1c区域相同的序列的引物。因此,可设计不同的引物来产生目的扩增产物,只要B2c区域和B1c区域位于这样的位置,以使所述核苷酸多态位点夹在其间。
类似地,当所述核苷酸位点位于F2和F1之间,即位于FP区域时,则FIP引物是具有与F1区域互补的序列和具有与F2区域相同的序列的引物。因此,可设计不同的引物来产生目的扩增引物,只要F1区域和F2区域位于这样的位置,以使所述核苷酸多态性位点夹在其间。
然而,本发明者显示,LAMP法中扩增的效率视引物的类型而变化。例如,在后面显示的表1、2和3中举例说明了4种类型的引物。此类引物(FIP、BIP、F3和B3引物)用于扩增。结果,使用任何引物的扩增在短时间内顺利地完成。因此,此类引用是用于扩增的良好引物。
为了进一步使用核酸探针检测扩增产物,应当以高效率产生扩增产物与核酸探针之间的杂交。因此,扩增产物在杂交效率上是否优良,也被考虑用于评估引物。
优选在长度为优选450bp或更短,更优选350bp或更短的区域(F2和B2之间的任何地方)中设计无核苷酸多态性夹在其间的另一对内部引物。设计两个内部引物以使单链环的长度优选为100bp或更短,更优选70bp或更短。
对于引物的非特异性扩增是在LAMP法中通常观察到的现象。FIP引物包括F1c和F2区域,从而形成长链核酸。类似地,BIP引物包括B1c和B2区域,从而形成长链核酸。因此,FIP引物或BIP引物彼此之间发生缠绕,或FIP引物与BIP引物发生缠绕,从而增加以引物为模板的扩增的可能性。在LAMP反应中,F3引物、B3引物和任选地LFc引物和LBc引物存在于反应液中,从而与PCR反应相比较,在LAMP反应中增加了非特异性反应的可能性。当产生这样的非特异性反应时,以样品核酸为模板的期望的LAMP产物的量减少。
<核酸引物和核酸探针的设计>
基于上述内容,以下列方式建立用于根据本发明的LAMP扩增的核酸引物的核苷酸序列和用于检测LAMP扩增产物的核酸探针的核苷酸序列。第一,基于数据库建立它们的标准序列。首先,从基因序列信息数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov./Genbank/index.html)获得关于HBV B型和C型的序列信息。用于建立标准序列的序列的登录号示于图8和9。
通过HBV B型和C型的比对分析,选择在核苷酸序列的各位点中以最高频率发生的碱基作为标准序列。B型和C型的标准序列分别示于图10和11中。基于该标准序列,分别确定根据本发明的12种类型的引物组(引物组1至12)和核酸探针的核苷酸序列。
<引物的设计>
[FIP引物(1)和BIP引物(3)]
首先,确定FIP引物和BIP引物。表1显示了用于检测HBV抗药性株系的12种类型的核酸引物组中的FIP引物和BIP引物。
Figure BSA00000743611700121
在表中,“组号(SET No.)”表示引物组编号;“FIP或BIP”表示引物是FIP引物或BIP引物;“SEQ.ID.NO.”表示赋予各探针的序列编号;“靶类型”或”靶型”表示引物的检测靶是B或C型HBV;和“检测靶”表示含有靶碱基突变位点的核酸相应的氨基酸的位点。通过使用这样的FIP引物和BIP引物,可获得在其环中具有编码检测靶氨基酸的核苷酸多态位点的LAMP扩增产物(通常也称为靶核酸或靶DNA)。
如表1中所示,引物组1至4、11和12中的每一组引物靶向待检测的2个位点上的核苷酸多态性。即,可通过扩增样品核酸获得在2个位点上含有核苷酸多态性的扩增产物。例如,使用引物组1获得在F环的位点181上含有多态性和在B环的位点204上含有多态性的扩增产物。在另一方面,用引物组5至10的每一个引物组获得在1个位点上含有核苷酸多态性的扩增产物,如表1中所示。
图12显示相应于例如引物组1至4的序列区域和其对于检测靶氨基酸的相对位置关系。
括起来的3碱基是编码检测靶氨基酸的密码子区域。在引物组1中,括起来的区域“GCT”是编码位点181上的氨基酸的区域。类似地,括起来的区域“ATG”是编码位点204上的氨基酸的区域。在引物组2中,括起来的区域“GCT”是编码位点181上的氨基酸区域,以及括起来的区域“ATG”是编码位点204上的氨基酸的区域。在引物组3中,括起来的区域“AAC”是编码位点236上的氨基酸的区域。在引物组4中,括起来的区域“AAC”是编码位点236上的氨基酸的区域。
单下划线表示用于内部引物(FIP和BIP)的设计的F2和B2区域,双下划线表示用于内部引物(FIP和BIP)的设计中的F1和B1区域。
只要表1中显示的引物可保持它们作为其中显示的引物的功能,可部分置换位于除多态碱基的位点外的位点的碱基;可向除多态性碱基的位点外的位点加入另外的碱基;或可部分缺失在除了多态性碱基的位点外的位点上的碱基。
[F3引物(2)和B3引物(4)]
F3和B3引物可以是具有结合F2区域的5’-末端上游区域和B2c区域的3’-末端下游区域的序列的引物。表2中显示的序列用作表1中显示的引物组中的每一个引物组的F3和B3引物组。
表2F3和B3引物候选物
在表中,“引物No.”表示引物编号;“F或B”表示探针是F3引物或B3引物;“引物序列”表示各引物的核苷酸序列;“SEQ.ID.NO.”表示赋予各引物的序列编号;以及“靶引物组”表示表1中优选组合的引物组编号。
只要表2中显示的引物可保持它们作为其中显示的引物的功能,可部分置换位于除了多态碱基的位点外的位点上的碱基;可向除了多态碱基的位点外的位点加入另外的碱基;或可部分缺失除了SNP的位点外的位点上的碱基。
[环引物(5)]
为了提高扩增效率,可将环引物加入至各引物组。根据本发明,例如表3中显示的序列可用作环引物。
表3环引物候选物
Figure BSA00000743611700151
在表中,“引物No.”表示引物编号;“F或B”表示探针是F环引物或B环引物;“引物序列”表示各引物的核苷酸序列;“SEQ.ID.NO.”表示赋予各探针的序列编号;以及“靶引物组”表示表1中优选组合的引物组编号。
只要表3中显示的引物可保持它们作为其中显示的引物的功能,可部分置换位于除多态碱基的位点外的位点上的碱基;可向除了多态碱基的位点外的位点加入另外的碱基;或可部分缺失除多态碱基的位点外的位点上的碱基。
<探针的设计>
基于图10和11中所示的标准序列设计探针。括起来的3碱基位于编码突变位点即位点181、位点204或位点236上的氨基酸的密码子区域。理所当然的事是,基于碱基突变使括起来的3碱基的序列不同。在用于本发明的核酸探针当中,视其期望的检测靶选择相应于B型或C型中的位点181、位点204或位点236上的靶氨基酸的探针。
用于本发明的探针序列的所必需的序列区域的实例示于表4中。
Figure BSA00000743611700161
Figure BSA00000743611700171
Figure BSA00000743611700191
Figure BSA00000743611700201
Figure BSA00000743611700211
在表中,“探针No.”表示探针编号,“靶氨基酸编号”表示待检测的突变位点是位点181、位点204或位点236,“靶类型”表示HBV是B型或C型,“氨基酸”表示检测靶氨基酸的类型,“抗药性”表示探针是非抗性探针(即,非抗药性探针)或抗性探针(即,抗药性探针),“核苷酸序列”表示各探针所必需的核苷酸序列,以及“SEQ.ID.NO.”表示赋予各探针的序列编号。在表4中,具有*的序列是与图10或11中所示的标准序列相同的核苷酸序列。
本发明的核酸探针是含有表4中显示的核苷酸序列的全长为15至45个碱基的核酸链或其互补链。“含有表4中显示的核苷酸序列的全长为15至45个碱基的核酸链或其互补链”更具体地是位于图10(对于用于B型检测的探针)中的标准序列或图11(对于用于C型检测的探针)中的标准序列中的连续15至45个碱基的核苷酸序列或其互补链,其中优选地用表4中显示的各序列替代波纹线部分。
在含有表4中显示的序列的核酸链或其互补链当中,更优选序列示于表5中。
在表5中显示的序列当中由SEQ ID NOS:92至120表示的多核苷酸组成的探针,或由其互补链组成的探针是能够在限定的检测条件下更有效地确定编码样品中病毒DNA的聚合酶中的位点204上的氨基酸的核苷酸序列展示抗药性还是非抗药性的探针序列。特别地如果假定各探针DNA被固定在固相中,那么将其与靶核酸(使用引物组1至4,11和12的任一组从病毒DNA扩增的LAMP产物)反应,然后在37℃下于0.2×SSC中进行清洗,则可优选通过使用探针明确地鉴定编码聚合酶中的位点204上的氨基酸的核苷酸序列,所述探针是由SEQ ID NO:93表示的多核苷酸或其互补链组成的探针,或由SEQ ID NO:96表示的多核苷酸或其互补链组成的探针,由SEQ ID NO:99表示的多核苷酸或其互补链组成的探针,由SEQ ID NO:105表示的多核苷酸或其互补链组成的探针,由SEQ ID NO:108表示的多核苷酸或其互补链组成的探针,由SEQ ID NO:113表示的多核苷酸或其互补链组成的探针,由SEQ ID NO:117表示的多核苷酸或其互补链组成的探针,或由SEQID NO:119表示的多核苷酸或其互补链组成的探针。
由表5中显示的序列当中的SEQ ID NOS:147至167表示的多核苷酸组成的探针,或由其互补链组成的探针是能够在限定的检测条件下更有效地确定编码样品中病毒DNA的聚合酶的位点236上的氨基酸的核苷酸序列展示抗药性还是非抗药性的探针序列。特别地如果假定各探针DNA被固定在固相中,那么将其与靶核酸(使用引物组3、4、5、6、7、8、11和12的任一组从病毒DNA扩增的LAMP产物)反应,然后在37℃下于0.2×SSC进行清洗,则可优选通过使用探针明确地鉴定编码聚合酶中的位点236上的氨基酸的核苷酸序列,所述探针是由SEQID NO:147表示的多核苷酸或其互补链组成的探针,由SEQ ID NO:149表示的多核苷酸或其互补链组成的探针,由SEQ ID NO:151表示的多核苷酸或其互补链组成的探针,由SEQ ID NO:155表示的多核苷酸或其互补链组成的探针,由SEQ ID NO:157表示的多核苷酸或其互补链组成的探针,由SEQ ID NO:158表示的多核苷酸或其互补链组成的探针,由SEQ ID NO:161表示的多核苷酸或其互补链组成的探针,由SEQ ID NO:164表示的多核苷酸或其互补链组成的探针,或由SEQ IDNO:167表示的多核苷酸或其互补链组成的探针。
由表5中显示的序列当中的SEQ ID NOS:168至196表示的多核苷酸组成的探针,或由其互补链组成的探针是能够在限定的检测条件下更有效地确定编码样品中病毒DNA的聚合酶的位点181上的氨基酸的核苷酸序列展示抗药性还是非抗药性的探针序列。特别地如果假定各探针DNA被固定在固相中,那么将其与靶核酸(使用引物组1、2、9和10的任一组从病毒DNA扩增的LAMP产物)反应,然后在37℃下于0.2×SSC进行清洗,则可优选通过使用探针明确地鉴定编码聚合酶中的位点181上的氨基酸的核苷酸序列,所述探针是由SEQ ID NO:169表示的多核苷酸或其互补链组成的探针,由SEQ ID NO:171表示的多核苷酸或其互补链组成的探针,由SEQ ID NO:173表示的多核苷酸或其互补链组成的探针,由SEQ ID NO:176表示的多核苷酸或其互补链组成的探针,由SEQ ID NO:179表示的多核苷酸或其互补链组成的探针,由SEQ ID NO:181表示的多核苷酸或其互补链组成的探针,由SEQ ID NO:183表示的多核苷酸或其互补链组成的探针,由SEQ ID NO:184表示的多核苷酸或其互补链组成的探针,由SEQ ID NO:186表示的多核苷酸或其互补链组成的探针,由SEQ ID NO:188表示的多核苷酸或其互补链组成的探针,由SEQ ID NO:190表示的多核苷酸或其互补链组成的探针,由SEQ ID NO:192表示的多核苷酸或其互补链组成的探针,由SEQ ID NO:193表示的多核苷酸或其互补链组成的探针,或由SEQ ID NO:195表示的多核苷酸或其互补链组成的探针。
只要表4或5中显示的序列可保持它们作为本发明中使用的探针的功能,可部分置换位于除了多态碱基的位点外的位点上的碱基;可向除了多态碱基的位点外的位点加入另外的碱基;或可部分缺失除了多态位点外的位点上的碱基。
作为探针,可视其期望的检测靶而选择相应于3个位点即位点181、204和236的一个位点上的靶氨基酸的探针,优选可同时使用多个在多态碱基的位点上包含不同碱基的探针。例如,当检测编码位点204上的靶氨基酸的核苷酸多态性时,使用含有由SEQ ID NOS:50至57和SEQ ID NOS:92至120表示的多核苷酸或其互补链的探针(探针组1)。当检测编码B和C型中的位点236上的靶氨基酸的核苷酸多态性时,使用含有由SEQ ID NOS:58至75和SEQ ID NOS:147至167表示的多核苷酸或其互补链的探针(探针组2)。当检测编码B和C型中的位点181上的靶氨基酸的核苷酸多态性时,使用含有由SEQID NOS:76至91、SEQ ID NOS:132至136和SEQ ID NOS:168至196表示的多核苷酸或其互补链的探针(探针组3)。当检测编码B和C型中的位点181、204或236上的靶氨基酸的核苷酸多态性时,同时使用探针组1至3。
在上述数据库的序列信息中,存在注册另外的序列的可能性,或不保证在特定群体中显示一致的碱基频率,因此,假定标准序列随时间或视靶群体而变化。因此,上述标准序列是暂定序列,以便当序列信息被改变时,表1至5中显示的序列也如期望地随其改变。由此,所使用的序列可具有与上述序列80%或更大的同源性或具有达到这样的程度如与HBV产生扩增反应的同源性。含有表1至4中的序列的核苷酸序列可用作核酸引物或核酸探针,即使它们由于部分碱基的消除而具有更少的碱基或由于添加通过参照标准排列获得的外周序列(peripheral sequence)而具有更多的碱基。当存在高频突变、类型特异性突变等时,可将混合碱基(即,多种类型碱基的混合物)或修饰碱基导入核酸引物序列或核酸探针序列。
<各引物组的用途>
当将引物组1至12用于通过LAMP扩增样品核酸时,取决于待检测的基因型或多态碱基的类型,可通过单独地使用引物组1至12或使用多个选自引物组1至12的引物组来进行扩增。
即,可以以多个引物组的组合使用引物组1至12来检测所有位点181、204和236,或可单独地或作为多个引物组的组合使用引物组1至12来检测位点181、204和236的至少一个位点。引物组1至12可以以其组合的形式使用来检测基因型B和C或可单独使用或作为多个引物组的组合使用来检测B型或C型。
取决于它们的目的,多个引物组的组合可包括相同基因型的引物组的组合、用于检测靶中相同核苷酸多态性的引物组的组合或用于检测靶和其相同位点(F环或B环)中的相同核苷酸多态性的引物组的组合,其中,考虑到扩增效率和检测效率的提高,期望组合用于检测靶和其相同位点(F-环或B-环)中的相同的核苷酸多态性的引物。例如,引物组1和2、引物组3和4、引物5和6、引物组7和8、引物组9和10或引物组11和12的组合是用于检测靶和其相同位置(F-环或B-环)中相同的核苷酸多态性的引物组的组合。
为了检测多个基因型或不同核苷酸多态性,通过单独地或以其组合使用引物组1至12进行LAMP扩增来产生扩增产物,然后进一步进行分开的LAMP扩增来产生扩增产物。可将两次扩增中获得的扩增产物混合并且使之经历与核酸探针的杂交。
其中检测靶是B和C型中的位点181、204和236的在扩增效率和检测效率上表现优异的期望的实施方案的实例如下:
(A)将样品核酸经历利用引物组1和2的引物混合物(检测靶:B和C型中的位点181和204)的LAMP扩增反应以产生扩增产物(第一扩增产物)。分开地,将样品核酸经历利用引物组3和4的引物混合物(检测靶:B和C型中的位点204和236)的LAMP扩增反应以产生扩增产物(第二扩增产物)。将第一和第二扩增产物混合,然后将混合物与用于检测B型和C型中的位点181、204和236的探针杂交。
(B)将样品核酸经历利用引物组1和2的引物混合物(检测靶:B和C型中的位点181和204)的LAMP扩增反应以产生扩增产物(第一扩增产物)。分开地,将样品核酸经历利用引物组5和6的引物混合物(检测靶:B型和C型中的位点236)的LAMP扩增反应以产生扩增产物(第二扩增产物)。将第一和第二扩增产物混合,然后将混合物与用于检测B型和C型中的位点181、204和236的探针杂交。
(C)将样品核酸经历利用引物组1和2的引物混合物(检测靶:B和C型中的位点181和204)的LAMP扩增反应以产生扩增产物(第一扩增产物)。分开地,将样品核酸经历利用引物组7和8的引物混合物(检测靶:B和C型中的位点236)的LAMP扩增反应以产生扩增产物(第二扩增产物)。将第一和第二扩增产物混合,然后将混合物与用于检测B型和C型中的位点181、204和236的探针的杂交。
(D)将样品核酸经历利用引物组1和2的引物混合物(检测靶:B和C型中的位点181和204)的LAMP扩增反应以产生扩增产物(第一扩增产物)。分开地,将样品核酸经历利用引物组11和12的引物混合物(检测靶:B和C型中的位点204和236)的LAMP扩增反应以产生扩增产物(第二扩增产物)。将第一和第二扩增产物混合,然后将混合物与用于检测B型和C型中的位点181、204和236的探针杂交。
(E)将样品核酸经历利用引物组3和4的引物混合物(检测靶:B和C型中的位点204和236)的LAMP扩增反应以产生扩增产物(第一扩增产物)。分开地,将样品核酸经历利用引物组9和10的引物混合物(检测靶:B和C型中的位点181)的LAMP扩增反应以产生扩增产物(第二扩增产物)。将第一和第二扩增产物混合,然后将混合物经历与用于检测B型和C型中的位点181、204和236的探针杂交。
(F)将样品核酸经历利用引物组9和10的引物混合物(检测靶:B和C型中的位点181)的LAMP扩增反应以产生扩增产物(第一扩增产物)。分开地,将样品核酸经历利用引物组11和12的引物混合物(检测靶:B和C型中的位点204和236)的LAMP扩增反应以产生扩增产物(第二扩增产物)。将第一和第二扩增产物混合,然后将混合物与用于检测B型和C型中的位点181、204和236的探针杂交。
<实施例>
用于根据本发明的LAMP扩增的核酸引物组的实例和探针组的实例示于下面。
<实施例1>(引物组1、2、3和4的用途)。
当此类引物由FIP、F3、BIP和B3引物组成,以检测编码聚合酶区域中的位点181、204和236上的氨基酸的核苷酸序列,并且F3、F2和F1区域从双链靶核酸的一条单链核酸的5’-末端侧开始以该顺序排列同时B3c、B2c和B1c区域从另一条单链核酸的3’-末端侧开始以该顺序排列时,则,
FIP引物组包括由SEQ ID NO:3表示的引物,由SEQ ID NO:5表示的引物,由SEQ ID NO:7表示的引物,和由SEQ ID NO:9表示的引物,
BIP引物组包括由SEQ ID NO:4表示的引物,由SEQ ID NO:6表示的引物,由SEQ ID NO:8表示的引物和由SEQ ID NO:10表示的引物,
F3引物组包括由SEQ ID NO:27表示的引物,由SEQ ID NO:29表示的引物,由SEQ ID NO:31表示的引物和
B3引物组包括由SEQ ID NO:28表示的引物,由SEQ ID NO:30表示的引物和由SEQ ID NO:32表示的引物。
此外,可同时使用环引物组。在上述情况下,优选用作环引物的引物的组合是由SEQ ID NO:45表示的引物和/或由SEQ ID NO:46表示的引物,和由SEQ ID NO:47表示的引物,以及由SEQ ID NO:48表示的引物和由SEQ ID NO:49表示的引物。
当使用此类引物组时,与其同时使用的优选探针是由SEQ ID NO:50表示的探针,由SEQ ID NO:51表示的探针,由SEQ ID NO:52表示的探针,由SEQ ID NO:53表示的探针,由SEQ ID NO:54表示的探针,由SEQ ID NO:55表示的探针,由SEQ ID NO:56表示的探针,由SEQ ID NO:57表示的探针,由SEQ ID NO:58表示的探针,由SEQID NO:59表示的探针,由SEQ ID NO:60表示的探针,由SEQ ID NO:61表示的探针,由SEQ ID NO:62表示的探针,由SEQ ID NO:63表示的探针,由SEQ ID NO:64表示的探针,由SEQ ID NO:65表示的探针,由SEQ ID NO:66表示的探针,由SEQ ID NO:67表示的探针,由SEQ ID NO:68表示的探针,由SEQ ID NO:69表示的探针,由SEQID NO:70表示的探针,由SEQ ID NO:71表示的探针,由SEQ ID NO:72表示的探针,由SEQ ID NO:73表示的探针,由SEQ ID NO:74表示的探针,由SEQ ID NO:75表示的探针,由SEQ ID NO:76表示的探针,由SEQ ID NO:77表示的探针,由SEQ ID NO:78表示的探针,由SEQ ID NO:79表示的探针,由SEQ ID NO:80表示的探针,由SEQID NO:81表示的探针,由SEQ ID NO:82表示的探针,由SEQ ID NO:83表示的探针,由SEQ ID NO:84表示的探针,由SEQ ID NO:85表示的探针,由SEQ ID NO:86表示的探针,由SEQ ID NO:87表示的探针,由SEQ ID NO:88表示的探针,由SEQ ID NO:89表示的探针,由SEQ ID NO:90表示的探针,由SEQ ID NO:91表示的探针,由SEQID NO:132表示的探针,由SEQ ID NO:133表示的探针,由SEQ IDNO:134表示的探针,由SEQ ID NO:135表示的探针,由SEQ ID NO:136表示的探针。备选地,还可使用此类探针的互补链。
此类引物组可用于通过在短时间内容易地且便宜地检测HBV的抗药性株系的本身已知的LAMP扩增法从HBV扩增核酸,并且它们的效应可通过将它们与探针组合使用来增强。
<实施例2>(引物组1、2、5和6的用途)
当此类引物由FIP、F3、BIP和B3引物组成,以检测编码聚合酶区域中的位点181、204和236上的氨基酸的核苷酸序列,并且F3、F2和F1区域从双链靶核酸的一条单链核酸的5’-末端侧开始以该顺序排列同时B3c、B2c和B1c区域从另一条单链核酸的3’-末端侧开始以该顺序排列时,则,
FIP引物组包括由SEQ ID NO:3表示的引物,由SEQ ID NO:5表示的引物,由SEQ ID NO:15表示的引物和由SEQ ID NO:17表示的引物,
BIP引物组包括由SEQ ID NO:4表示的引物,由SEQ ID NO:6表示的引物,由SEQ ID NO:16表示的引物和由SEQ ID NO:18表示的引物,
F3引物组包括由SEQ ID NO:27表示的引物,由SEQ ID NO:29表示的引物,由SEQ ID NO:33表示的引物和由SEQ ID NO:35表示的引物,和
B3引物组包括由SEQ ID NO:28表示的引物,由SEQ ID NO:30表示的引物,由SEQ ID NO:34表示的引物和由SEQ ID NO:36表示的引物。
当使用此类引物组时,与其同时使用的优选探针是由SEQ ID NO:50表示的探针,由SEQ ID NO:51表示的探针,由SEQ ID NO:52表示的探针,由SEQ ID NO:53表示的探针,由SEQ ID NO:54表示的探针,由SEQ ID NO:55表示的探针,由SEQ ID NO:56表示的探针,由SEQ ID NO:57表示的探针,由SEQ ID NO:58表示的探针,由SEQID NO:59表示的探针,由SEQ ID NO:60表示的探针,由SEQ ID NO:61表示的探针,由SEQ ID NO:62表示的探针,由SEQ ID NO:63表示的探针,由SEQ ID NO:64表示的探针,由SEQ ID NO:65表示的探针,由SEQ ID NO:66表示的探针,由SEQ ID NO:67表示的探针,由SEQ ID NO:68表示的探针,由SEQ ID NO:69表示的探针,由SEQID NO:70表示的探针,由SEQ ID NO:71表示的探针,由SEQ ID NO:72表示的探针,由SEQ ID NO:73表示的探针,由SEQ ID NO:74表示的探针,由SEQ ID NO:75表示的探针,由SEQ ID NO:76表示的探针,由SEQ ID NO:77表示的探针,由SEQ ID NO:78表示的探针,由SEQ ID NO:79表示的探针,由SEQ ID NO:80表示的探针,由SEQID NO:81表示的探针,由SEQ ID NO:82表示的探针,由SEQ ID NO:83表示的探针,由SEQ ID NO:84表示的探针,由SEQ ID NO:85表示的探针,由SEQ ID NO:86表示的探针,由SEQ ID NO:87表示的探针,由SEQ ID NO:88表示的探针,由SEQ ID NO:89表示的探针,由SEQ ID NO:90表示的探针,由SEQ ID NO:91表示的探针,由SEQID NO:132表示的探针,由SEQ ID NO:133表示的探针,由SEQ IDNO:134表示的探针,由SEQ ID NO:135表示的探针和由SEQ ID NO:136表示的探针。备选地,还可使用此类探针的互补链。
此类引物组可用于通过在短时间内容易地且便宜地检测HBV的抗药性株系的本身已知的LAMP扩增法从HBV扩增核酸,并且它们的效应可通过将它们与探针组合使用来增强。
<实施例3>(引物组1、2、7和8的用途)
当此类引物由FIP、F3、BIP和B3引物组成,以检测编码聚合酶区域中的位点181、204和236上的氨基酸的核苷酸序列,并且F3、F2和F1区域从双链靶核酸的一条单链核酸的5’-末端侧开始以该顺序排列同时B3c、B2c和B1c区域从另一条单链核酸的3’-末端侧开始以该顺序排列时,则,
FIP引物组包括由SEQ ID NO:3表示的引物,由SEQ ID NO:5表示的引物,由SEQ ID NO:19表示的引物和由SEQ ID NO:21表示的引物,
BIP引物组包括由SEQ ID NO:4表示的引物,由SEQ ID NO:6表示的引物,由SEQ ID NO:20表示的引物和由SEQ ID NO:22表示的引物,
F3引物组包括由SEQ ID NO:27表示的引物,由SEQ ID NO:29表示的引物,由SEQ ID NO:37表示的引物和由SEQ ID NO:39表示的引物,和
B3引物组包括由SEQ ID NO:28表示的引物,由SEQ ID NO:30表示的引物,由SEQ ID NO:38表示的引物和由SEQ ID NO:40表示的引物。
当使用此类引物组时,与其同时使用的优选探针是由SEQ ID NO:50表示的探针,由SEQ ID NO:51表示的探针,由SEQ ID NO:52表示的探针,由SEQ ID NO:53表示的探针,由SEQ ID NO:54表示的探针,由SEQ ID NO:55表示的探针,由SEQ ID NO:56表示的探针,由SEQ ID NO:57表示的探针,由SEQ ID NO:58表示的探针,由SEQID NO:59表示的探针,由SEQ ID NO:60表示的探针,由SEQ ID NO:61表示的探针,由SEQ ID NO:62表示的探针,由SEQ ID NO:63表示的探针,由SEQ ID NO:64表示的探针,由SEQ ID NO:65表示的探针,由SEQ ID NO:66表示的探针,由SEQ ID NO:67表示的探针,由SEQ ID NO:68表示的探针,由SEQ ID NO:69表示的探针,由SEQID NO:70表示的探针,由SEQ ID NO:71表示的探针,由SEQ ID NO:72表示的探针,由SEQ ID NO:73表示的探针,由SEQ ID NO:74表示的探针,由SEQ ID NO:75表示的探针,由SEQ ID NO:76表示的探针,由SEQ ID NO:77表示的探针,由SEQ ID NO:78表示的探针,由SEQ ID NO:79表示的探针,由SEQ ID NO:80表示的探针,由SEQID NO:81表示的探针,由SEQ ID NO:82表示的探针,由SEQ ID NO:83表示的探针,由SEQ ID NO:84表示的探针,由SEQ ID NO:85表示的探针,由SEQ ID NO:86表示的探针,由SEQ ID NO:87表示的探针,由SEQ ID NO:88表示的探针,由SEQ ID NO:89表示的探针,由SEQ ID NO:90表示的探针,由SEQ ID NO:91表示的探针,由SEQID NO:132表示的探针,由SEQ ID NO:133表示的探针,由SEQ IDNO:134表示的探针,由SEQ ID NO:135表示的探针和由SEQ ID NO:136表示的探针。备选地,还可使用此类探针的互补链。
此类引物组可用于通过在短时间内容易地且便宜地检测HBV的抗药性株系的本身已知的LAMP扩增法从HBV扩增核酸,并且它们的效应可通过将它们与探针组合使用来增强。
<实施例4>(引物组1、2、11和12的用途)
当此类引物由FIP、F3、BIP和B3引物组成,以检测编码聚合酶区域中的位点181、204和236上的氨基酸的核苷酸序列,并且F3、F2和F1区域从双链靶核酸的一条单链核酸的5’-末端侧开始以该顺序排列同时B3c、B2c和B1c区域从另一条单链核酸的3’-末端侧开始以该顺序排列时,则,
FIP引物组包括由SEQ ID NO:3表示的引物,由SEQ ID NO:5表示的引物,由SEQ ID NO:7表示的引物和由SEQ ID NO:9表示的引物,
BIP引物组包括由SEQ ID NO:4表示的引物,由SEQ ID NO:6表示的引物,由SEQ ID NO:121表示的引物和由SEQ ID NO:122表示的引物,
F3引物组包括由SEQ ID NO:27表示的引物,由SEQ ID NO:29表示的引物,由SEQ ID NO:31表示的引物,和
B3引物组包括由SEQ ID NO:28表示的引物,由SEQ ID NO:30表示的引物,由SEQ ID NO:123表示的引物和由SEQ ID NO:124表示的引物。
此外,可同时使用环引物组。在上述情况下,优选用作环引物的引物的组合是由SEQ ID NO:45表示的引物和/或由SEQ ID NO:46表示的引物,和由SEQ ID NO:47表示的引物以及由SEQ ID NO:125表示的引物和由SEQ ID NO:126表示的引物。
当使用此类引物组时,与其同时使用的优选探针是由SEQ ID NO:50表示的探针,由SEQ ID NO:51表示的探针,由SEQ ID NO:52表示的探针,由SEQ ID NO:53表示的探针,由SEQ ID NO:54表示的探针,由SEQ ID NO:55表示的探针,由SEQ ID NO:56表示的探针,由SEQ ID NO:57表示的探针,由SEQ ID NO:58表示的探针,由SEQID NO:59表示的探针,由SEQ ID NO:60表示的探针,由SEQ ID NO:61表示的探针,由SEQ ID NO:62表示的探针,由SEQ ID NO:63表示的探针,由SEQ ID NO:64表示的探针,由SEQ ID NO:65表示的探针,由SEQ ID NO:66表示的探针,由SEQ ID NO:67表示的探针,由SEQ ID NO:68表示的探针,由SEQ ID NO:69表示的探针,由SEQID NO:70表示的探针,由SEQ ID NO:71表示的探针,由SEQ ID NO:72表示的探针,由SEQ ID NO:73表示的探针,由SEQ ID NO:74表示的探针,由SEQ ID NO:75表示的探针,由SEQ ID NO:76表示的探针,由SEQ ID NO:77表示的探针,由SEQ ID NO:78表示的探针,由SEQ ID NO:79表示的探针,由SEQ ID NO:80表示的探针,由SEQID NO:81表示的探针,由SEQ ID NO:82表示的探针,由SEQ ID NO:83表示的探针,由SEQ ID NO:84表示的探针,由SEQ ID NO:85表示的探针,由SEQ ID NO:86表示的探针,由SEQ ID NO:87表示的探针,由SEQ ID NO:88表示的探针,由SEQ ID NO:89表示的探针,由SEQ ID NO:90表示的探针,由SEQ ID NO:91表示的探针,由SEQID NO:132表示的探针,由SEQ ID NO:133表示的探针,由SEQ IDNO:134表示的探针,由SEQ ID NO:135表示的探针和由SEQ ID NO:136表示的探针。备选地,还可使用此类探针的互补链。
此类引物组可用于通过在短时间内容易地且便宜地检测HBV的抗药性株系的本身已知的LAMP扩增法从HBV扩增核酸,并且它们的效应可通过将它们与探针组合使用来增强。
<实施例5>(引物组3、4、9和10的用途)
当此类引物由FIP、F3、BIP和B3引物组成,以检测编码聚合酶区域中的位点181、204和236上的氨基酸的核苷酸序列,并且F3、F2和F1区域从双链靶核酸的一条单链核酸的5’-末端侧开始以该顺序排列同时B3c、B2c和B1c区域从另一条单链核酸的3’-末端侧开始以该顺序排列时,则,
FIP引物组包括由SEQ ID NO:7表示的引物,由SEQ ID NO:9表示的引物,由SEQ ID NO:23表示的引物和由SEQ ID NO:25表示的引物,
BIP引物组包括由SEQ ID NO:8表示的引物,由SEQ ID NO:1O表示的引物,由SEQ ID NO:24表示的引物和由SEQ ID NO:26表示的引物,
F3引物组包括由SEQ ID NO:31表示的引物,由SEQ ID NO:41表示的引物,由SEQ ID NO:43表示的引物,和
B3引物组包括由SEQ ID NO:32表示的引物,由SEQ ID NO:42表示的引物和由SEQ ID NO:44表示的引物。
当使用此类引物组时,与其同时使用的优选探针是由SEQ ID NO:50表示的探针,由SEQ ID NO:51表示的探针,由SEQ ID NO:52表示的探针,由SEQ ID NO:53表示的探针,由SEQ ID NO:54表示的探针,由SEQ ID NO:55表示的探针,由SEQ ID NO:56表示的探针,由SEQ ID NO:57表示的探针,由SEQ ID NO:58表示的探针,由SEQID NO:59表示的探针,由SEQ ID NO:60表示的探针,由SEQ ID NO:61表示的探针,由SEQ ID NO:62表示的探针,由SEQ ID NO:63表示的探针,由SEQ ID NO:64表示的探针,由SEQ ID NO:65表示的探针,由SEQ ID NO:66表示的探针,由SEQ ID NO:67表示的探针,由SEQ ID NO:68表示的探针,由SEQ ID NO:69表示的探针,由SEQID NO:70表示的探针,由SEQ ID NO:71表示的探针,由SEQ ID NO:72表示的探针,由SEQ ID NO:73表示的探针,由SEQ ID NO:74表示的探针,由SEQ ID NO:75表示的探针,由SEQ ID NO:76表示的探针,由SEQ ID NO:77表示的探针,由SEQ ID NO:78表示的探针,由SEQ ID NO:79表示的探针,由SEQ ID NO:80表示的探针,由SEQID NO:81表示的探针,由SEQ ID NO:82表示的探针,由SEQ ID NO:83表示的探针,由SEQ ID NO:84表示的探针,由SEQ ID NO:85表示的探针,由SEQ ID NO:86表示的探针,由SEQ ID NO:87表示的探针,由SEQ ID NO:88表示的探针,由SEQ ID NO:89表示的探针,由SEQ ID NO:90表示的探针,由SEQ ID NO:91表示的探针,由SEQID NO:132表示的探针,由SEQ ID NO:133表示的探针,由SEQ IDNO:134表示的探针,由SEQ ID NO:135表示的探针和由SEQ ID NO:136表示的探针。备选地,还可使用此类探针的互补链。
此类引物组可用于通过在短时间内容易地且便宜地检测HBV的抗药性株系的本身已知的LAMP扩增法从HBV扩增核酸,并且它们的效应可通过将它们与探针组合使用来增强。
<实施例6>(引物组9、10、11和12的用途)
当此类引物由FIP、F3、BIP和B3引物组成,以检测编码聚合酶区域中的位点181、204和236上的氨基酸的核苷酸序列,并且F3、F2和F1区域从双链靶核酸的一条单链核酸的5’-末端侧开始以该顺序排列同时B3c、B2c和B1c区域从另一条单链核酸的3’-末端侧开始以该顺序排列时,则,
FIP引物组包括由SEQ ID NO:23表示的引物,由SEQ ID NO:25表示的引物,由SEQ ID NO:7表示的引物和由SEQ ID NO:9表示的引物,
BIP引物组包括由SEQ ID NO:24表示的引物,由SEQ ID NO:26表示的引物,由SEQ ID NO:121表示的引物和由SEQ ID NO:122表示的引物,
F3引物组包括由SEQ ID NO:41表示的引物,由SEQ ID NO:43表示的引物,由SEQ ID NO:31表示的引物,和
B3引物组包括由SEQ ID NO:42表示的引物,由SEQ ID NO:44表示的引物、由SEQ ID NO:123表示的引物和由SEQ ID NO:124表示的引物。
此外,可同时使用环引物组。在上述情况下,优选用作环引物的引物的组合是由SEQ ID NO:125表示的引物和由SEQ ID NO:126表示的引物。
当使用此类引物组时,与其同时使用的优选探针是由SEQ ID NO:50表示的探针,由SEQ ID NO:51表示的探针,由SEQ ID NO:52表示的探针,由SEQ ID NO:53表示的探针,由SEQ ID NO:54表示的探针,由SEQ ID NO:55表示的探针,由SEQ ID NO:56表示的探针,由SEQ ID NO:57表示的探针,由SEQ ID NO:58表示的探针,由SEQID NO:59表示的探针,由SEQ ID NO:60表示的探针,由SEQ ID NO:61表示的探针,由SEQ ID NO:62表示的探针,由SEQ ID NO:63表示的探针,由SEQ ID NO:64表示的探针,由SEQ ID NO:65表示的探针,由SEQ ID NO:66表示的探针,由SEQ ID NO:67表示的探针,由SEQ ID NO:68表示的探针,由SEQ ID NO:69表示的探针,由SEQID NO:70表示的探针,由SEQ ID NO:71表示的探针,由SEQ ID NO:72表示的探针,由SEQ ID NO:73表示的探针,由SEQ ID NO:74表示的探针,由SEQ ID NO:75表示的探针,由SEQ ID NO:76表示的探针,由SEQ ID NO:77表示的探针,由SEQ ID NO:78表示的探针,由SEQ ID NO:79表示的探针,由SEQ ID NO:80表示的探针,由SEQID NO:81表示的探针,由SEQ ID NO:82表示的探针,由SEQ ID NO:83表示的探针,由SEQ ID NO:84表示的探针,由SEQ ID NO:85表示的探针,由SEQ ID NO:86表示的探针,由SEQ ID NO:87表示的探针,由SEQ ID NO:88表示的探针,由SEQ ID NO:89表示的探针,由SEQ ID NO:90表示的探针,由SEQ ID NO:91表示的探针,由SEQID NO:132表示的探针,由SEQ ID NO:133表示的探针,由SEQ IDNO:134表示的探针,由SEQ ID NO:135表示的探针和由SEQ ID NO:136表示的探针。备选地,还可使用此类探针的互补链。
此类引物组可用于通过在短时间内容易地且便宜地检测HBV的抗药性株系的本身已知的LAMP扩增法从HBV扩增核酸,并且它们的效应可通过将它们与探针组合使用来增强。
<实施例7>(引物组1和3的用途)
此类引物组可以是检测B型HBV的抗药性的引物组。当此类引物组由FIP、F3、BIP和B3引物组成,以检测编码聚合酶区域中的位点181、204和236上的氨基酸的核苷酸序列,并且F3、F2和F1区域从双链靶核酸的一条单链核酸的5’-末端侧开始以该顺序排列同时B3c、B2c和B1c区域从另一条单链核酸的3’-末端侧开始以该顺序排列时,则,
FIP引物组包括由SEQ ID NO:3表示的引物,由SEQ ID NO:7表示的引物,
BIP引物组包括由SEQ ID NO:4表示的引物,由SEQ ID NO:8表示的引物,
F3引物组包括由SEQ ID NO:27表示的引物,由SEQ ID NO:31表示的引物,和
B3引物组包括由SEQ ID NO:28表示的引物和由SEQ ID NO:32表示的引物。
此外,可同时使用环引物组。在上述情况下,优选用作环引物的引物的组合是由SEQ ID NO:45表示的引物和/或由SEQ ID NO:46表示的引物,和由SEQ ID NO:47表示的引物以及由SEQ ID NO:48表示的引物和由SEQ ID NO:49表示的引物。
当使用此类引物组时,与其同时使用的优选探针是由SEQ ID NO:50表示的探针,由SEQ ID NO:51表示的探针,由SEQ ID NO:52表示的探针,由SEQ ID NO:53表示的探针,由SEQ ID NO:54表示的探针,由SEQ ID NO:55表示的探针,由SEQ ID NO:56表示的探针,由SEQ ID NO:57表示的探针,由SEQ ID NO:58表示的探针,由SEQID NO:59表示的探针,由SEQ ID NO:60表示的探针,由SEQ ID NO:61表示的探针,由SEQ ID NO:62表示的探针,由SEQ ID NO:63表示的探针,由SEQ ID NO:76表示的探针,由SEQ ID NO:77表示的探针,由SEQ ID NO:78表示的探针,由SEQ ID NO:79表示的探针,由SEQ ID NO:80表示的探针,由SEQ ID NO:81表示的探针,由SEQID NO:82表示的探针,由SEQ ID NO:83表示的探针,由SEQ ID NO:132表示的探针,由SEQ ID NO:133表示的探针,由SEQ ID NO:134表示的探针,由SEQ ID NO:135表示的探针,由SEQ ID NO:136表示的探针。备选地,还可使用此类探针的互补链。
此类引物组可用于通过在短时间内容易地且便宜地检测HBV的抗药性株系的本身已知的LAMP扩增法从HBV扩增核酸,并且它们的效应可通过将它们与环引物组和探针组合使用来增强。
<实施例8>(引物组2和4的用途)
此类引物组可以是检测C型HBV的抗药性的引物组。当此类引物组由FIP、F3、BIP和B3引物组成,以检测编码聚合酶区域中的位点181、204和236上的氨基酸的核苷酸序列,并且F3、F2和F1区域从双链靶核酸的一条单链核酸的5’-末端侧开始以该顺序排列同时B3c、B2c和B1c区域从另一条单链核酸的3’-末端侧开始以该顺序排列时,则,
FIP引物组包括由SEQ ID NO:5表示的引物,由SEQ ID NO:9表示的引物,
BIP引物组包括由SEQ ID NO:6表示的引物,由SEQ ID NO:10表示的引物,
F3引物组包括由SEQ ID NO:29表示的引物和由SEQ ID NO:31表示的引物,和
B3引物组包括由SEQ ID NO:30表示的引物和由SEQ ID NO:32表示的引物。
此外,可同时使用环引物组。在上述情况下,优选用作环引物的引物的组合是由SEQ ID NO:45表示的引物和/或由SEQ ID NO:46表示的引物,和由SEQ ID NO:47表示的引物以及由SEQ ID NO:48表示的引物和由SEQ ID NO:49表示的引物。
当使用此类引物组时,与其同时使用的优选探针是由SEQ ID NO:50表示的探针,由SEQ ID NO:51表示的探针,由SEQ ID NO:52表示的探针,由SEQ ID NO:53表示的探针,由SEQ ID NO:54表示的探针,由SEQ ID NO:55表示的探针,由SEQ ID NO:56表示的探针,由SEQ ID NO:57表示的探针,由SEQ ID NO:64表示的探针,由SEQID NO:65表示的探针,由SEQ ID NO:66表示的探针,由SEQ ID NO:67表示的探针,由SEQ ID NO:68表示的探针,由SEQ ID NO:69表示的探针,由SEQ ID NO:70表示的探针,由SEQ ID NO:71表示的探针,由SEQ ID NO:72表示的探针,由SEQ ID NO:73表示的探针,由SEQ ID NO:74表示的探针,由SEQ ID NO:75表示的探针,由SEQID NO:84表示的探针,由SEQ ID NO:85表示的探针,由SEQ ID NO:86表示的探针,由SEQ ID NO:87表示的探针,由SEQ ID NO:88表示的探针,由SEQ ID NO:89表示的探针,由SEQ ID NO:90表示的探针,由SEQ ID NO:91表示的探针,由SEQ ID NO:132表示的探针,由SEQ ID NO:133表示的探针,由SEQ ID NO:134表示的探针,由SEQ ID NO:135表示的探针,由SEQ ID NO:136表示的探针。备选地,还可使用此类探针的互补链。
此类引物组可用于通过在短时间内容易地且便宜地检测HBV的抗药性株系的本身已知的LAMP扩增法从HBV扩增核酸,并且它们的效应可通过将它们与环引物组和探针组合使用来增强。
<实施例9>(引物组1和5的用途)
此类引物组可以是检测B型HBV的抗药性的引物组。当此类引物组由FIP、F3、BIP和B3引物组成,以检测编码聚合酶区域中的位点181、204和236上的氨基酸的核苷酸序列,并且F3、F2和F1区域从双链靶核酸的一条单链核酸的5’-末端侧开始以该顺序排列同时B3c、B2c和B1c区域从另一条单链核酸的3’-末端侧开始以该顺序排列时,则,
FIP引物组包括由SEQ ID NO:3表示的引物,由SEQ ID NO:15表示的引物,
BIP引物组包括由SEQ ID NO:4表示的引物,由SEQ ID NO:16表示的引物,
F3引物组包括由SEQ ID NO:27表示的引物和由SEQ ID NO:33表示的引物,和
B3引物组包括由SEQ ID NO:28表示的引物和由SEQ ID NO:34表示的引物。
当使用此类引物组时,与其同时使用的优选探针是由SEQ ID NO:50表示的探针,由SEQ ID NO:51表示的探针,由SEQ ID NO:52表示的探针,由SEQ ID NO:53表示的探针,由SEQ ID NO:54表示的探针,由SEQ ID NO:55表示的探针,由SEQ ID NO:56表示的探针,由SEQ ID NO:57表示的探针,由SEQ ID NO:58表示的探针,由SEQID NO:59表示的探针,由SEQ ID NO:60表示的探针,由SEQ ID NO:61表示的探针,由SEQ ID NO:62表示的探针,由SEQ ID NO:63表示的探针,由SEQ ID NO:76表示的探针,由SEQ ID NO:77表示的探针,由SEQ ID NO:78表示的探针,由SEQ ID NO:79表示的探针,由SEQ ID NO:80表示的探针,由SEQ ID NO:81表示的探针,由SEQID NO:82表示的探针,由SEQ ID NO:83表示的探针,由SEQ ID NO:132表示的探针,由SEQ ID NO:133表示的探针,由SEQ ID NO:134表示的探针,由SEQ ID NO:135表示的探针,由SEQ ID NO:136表示的探针。备选地,还可使用此类探针的互补链。
此类引物组可用于通过在短时间内容易地且便宜地检测HBV的抗药性株系的本身已知的LAMP扩增法从HBV扩增核酸,并且它们的效应可通过将它们与探针组合使用来增强。
<实施例10>(引物组2和6的用途)
此类引物组可以是检测C型HBV的抗药性的引物组。当此类引物组由FIP、F3、BIP和B3引物组成,以检测编码聚合酶区域中的位点181、204和236上的氨基酸的核苷酸序列,并且F3、F2和F1区域从双链靶核酸的一条单链核酸的5’-末端侧开始以该顺序排列同时B3c、B2c和B1c区域从另一条单链核酸的3’-末端侧开始以该顺序排列时,则,
FIP引物组包括由SEQ ID NO:5表示的引物,由SEQ ID NO:17表示的引物,
BIP引物组包括由SEQ ID NO:6表示的引物,由SEQ ID NO:18表示的引物,
F3引物组包括由SEQ ID NO:29表示的引物和由SEQ ID NO:35表示的引物,和
B3引物组包括由SEQ ID NO:30表示的引物和由SEQ ID NO:36表示的引物。
当使用此类引物组时,与其同时使用的优选探针是由SEQ ID NO:50表示的探针,由SEQ ID NO:51表示的探针,由SEQ ID NO:52表示的探针,由SEQ ID NO:53表示的探针,由SEQ ID NO:54表示的探针,由SEQ ID NO:55表示的探针,由SEQ ID NO:56表示的探针,由SEQ ID NO:57表示的探针,由SEQ ID NO:58表示的探针,由SEQID NO:59表示的探针,由SEQ ID NO:60表示的探针,由SEQ ID NO:61表示的探针,由SEQ ID NO:62表示的探针,由SEQ ID NO:63表示的探针,由SEQ ID NO:76表示的探针,由SEQ ID NO:77表示的探针,由SEQ ID NO:78表示的探针,由SEQ ID NO:79表示的探针,由SEQ ID NO:80表示的探针,由SEQ ID NO:81表示的探针,由SEQID NO:82表示的探针,由SEQ ID NO:83表示的探针,由SEQ ID NO:132表示的探针,由SEQ ID NO:133表示的探针,由SEQ ID NO:134表示的探针,由SEQ ID NO:135表示的探针和由SEQ ID NO:136表示的探针。备选地,还可使用此类探针的互补链。
此类引物组可用于通过在短时间内容易地且便宜地检测HBV的抗药性株系的本身已知的LAMP扩增法从HBV扩增核酸,并且它们的效应可通过将它们与探针组合使用来增强。
<实施例11>(引物组1和7的用途)
此类引物组可以是检测B型HBV的抗药性的引物组。当此类引物组由FIP、F3、BIP和B3引物组成,以检测编码聚合酶区域中的位点181、204和236上的氨基酸的核苷酸序列,并且F3、F2和F1区域从双链靶核酸的一条单链核酸的5’-末端侧开始以该顺序排列同时B3c、B2c和B1c区域从另一条单链核酸的3’-末端侧开始以该顺序排列时,则,
FIP引物组包括由SEQ ID NO:3表示的引物,由SEQ ID NO:19表示的引物,
BIP引物组包括由SEQ ID NO:4表示的引物,由SEQ ID NO:20表示的引物,
F3引物组包括由SEQ ID NO:27表示的引物和由SEQ ID NO:37表示的引物,和
B3引物组包括由SEQ ID NO:28表示的引物和由SEQ ID NO:38表示的引物。
当使用此类引物组时,与其同时使用的优选探针是由SEQ ID NO:50表示的探针,由SEQ ID NO:51表示的探针,由SEQ ID NO:52表示的探针,由SEQ ID NO:53表示的探针,由SEQ ID NO:54表示的探针,由SEQ ID NO:55表示的探针,由SEQ ID NO:56表示的探针,由SEQ ID NO:57表示的探针,由SEQ ID NO:58表示的探针,由SEQID NO:59表示的探针,由SEQ ID NO:60表示的探针,由SEQ ID NO:61表示的探针,由SEQ ID NO:62表示的探针,由SEQ ID NO:63表示的探针,由SEQ ID NO:76表示的探针,由SEQ ID NO:77表示的探针,由SEQ ID NO:78表示的探针,由SEQ ID NO:79表示的探针,由SEQ ID NO:80表示的探针,由SEQ ID NO:81表示的探针,由SEQID NO:82表示的探针,由SEQ ID NO:83表示的探针,由SEQ ID NO:132表示的探针,由SEQ ID NO:133表示的探针,由SEQ ID NO:134表示的探针,由SEQ ID NO:135表示的探针和由SEQ ID NO:136表示的探针。备选地,还可使用此类探针的互补链。
此类引物组可用于通过在短时间内容易地且便宜地检测HBV的抗药性株系的本身已知的LAMP扩增法从HBV扩增核酸,并且它们的效应可通过将它们与探针组合使用来增强。
<实施例12>(引物组2和8的用途)
此类引物组可以是检测C型HBV的抗药性的引物组。当此类引物组由FIP、F3、BIP和B3引物组成,以检测编码聚合酶区域中的位点181、204和236上的氨基酸的核苷酸序列,并且F3、F2和F1区域从双链靶核酸的一条单链核酸的5’-末端侧开始以该顺序排列同时B3c、B2c和B1c区域从另一条单链核酸的3’-末端侧开始以该顺序排列时,则,
FIP引物组包括由SEQ ID NO:5表示的引物,由SEQ ID NO:21表示的引物,
BIP引物组包括由SEQ ID NO:6表示的引物,由SEQ ID NO:22表示的引物,
F3引物组包括由SEQ ID NO:29表示的引物和由SEQ ID NO:39表示的引物,和
B3引物组包括由SEQ ID NO:30表示的引物和由SEQ ID NO:40表示的引物。
当使用此类引物组时,与其同时使用的优选探针是由SEQ ID NO:50表示的探针,由SEQ ID NO:51表示的探针,由SEQ ID NO:52表示的探针,由SEQ ID NO:53表示的探针,由SEQ ID NO:54表示的探针,由SEQ ID NO:55表示的探针,由SEQ ID NO:56表示的探针,由SEQ ID NO:57表示的探针,由SEQ ID NO:58表示的探针,由SEQID NO:59表示的探针,由SEQ ID NO:60表示的探针,由SEQ ID NO:61表示的探针,由SEQ ID NO:62表示的探针,由SEQ ID NO:63表示的探针,由SEQ ID NO:76表示的探针,由SEQ ID NO:77表示的探针,由SEQ ID NO:78表示的探针,由SEQ ID NO:79表示的探针,由SEQ ID NO:80表示的探针,由SEQ ID NO:81表示的探针,由SEQID NO:82表示的探针,由SEQ ID NO:83表示的探针,由SEQ ID NO:132表示的探针,由SEQ ID NO:133表示的探针,由SEQ ID NO:134表示的探针,由SEQ ID NO:135表示的探针和由SEQ ID NO:136表示的探针。备选地,还可使用此类探针的互补链。
此类引物组可用于通过在短时间内容易地且便宜地检测HBV的抗药性株系的本身已知的LAMP扩增法从HBV扩增核酸,并且它们的效应可通过将它们与探针组合使用来增强。
<实施例13>(引物组1和11的用途)
此类引物组可以是检测B型HBV的抗药性的引物组。当此类引物组由FIP、F3、BIP和B3引物组成,以检测编码聚合酶区域中的位点181、204和236上的氨基酸的核苷酸序列,并且F3、F2和F1区域从双链靶核酸的一条单链核酸的5’-末端侧开始以该顺序排列同时B3c、B2c和B1c区域从另一条单链核酸的3’-末端侧开始以该顺序排列时,则,
FIP引物组包括由SEQ ID NO:3表示的引物,由SEQ ID NO:7表示的引物,
BIP引物组包括由SEQ ID NO:4表示的引物,由SEQ ID NO:121表示的引物,
F3引物组包括由SEQ ID NO:27表示的引物和由SEQ ID NO:31表示的引物,和
B3引物组包括由SEQ ID NO:28表示的引物和由SEQ ID NO:123表示的引物。
此外,可同时使用环引物组。在上述情况下,优选用作环引物的引物的组合是由SEQ ID NO:45表示的引物和/或由SEQ ID NO:46表示的引物,和由SEQ ID NO:47表示的引物以及由SEQ ID NO:125表示的引物。
当使用此类引物组时,与其同时使用的优选探针是由SEQ ID NO:50表示的探针,由SEQ ID NO:51表示的探针,由SEQ ID NO:52表示的探针,由SEQ ID NO:53表示的探针,由SEQ ID NO:54表示的探针,由SEQ ID NO:55表示的探针,由SEQ ID NO:56表示的探针,由SEQ ID NO:57表示的探针,由SEQ ID NO:58表示的探针,由SEQID NO:59表示的探针,由SEQ ID NO:60表示的探针,由SEQ ID NO:61表示的探针,由SEQ ID NO:62表示的探针,由SEQ ID NO:63表示的探针,由SEQ ID NO:76表示的探针,由SEQ ID NO:77表示的探针,由SEQ ID NO:78表示的探针,由SEQ ID NO:79表示的探针,由SEQ ID NO:80表示的探针,由SEQ ID NO:81表示的探针,由SEQID NO:82表示的探针,由SEQ ID NO:83表示的探针,由SEQ ID NO:132表示的探针,由SEQ ID NO:133表示的探针,由SEQ ID NO:134表示的探针,由SEQ ID NO:135表示的探针和由SEQ ID NO:136表示的探针。备选地,还可使用此类探针的互补链。
此类引物组可用于通过在短时间内容易地且便宜地检测HBV的抗药性株系的本身已知的LAMP扩增法从HBV扩增核酸,并且它们的效应可通过将它们与环引物组和探针组合使用来增强。
<实施例14>(引物组2和12的用途)
此类引物组可以是检测C型HBV的抗药性的引物组。当此类引物组由FIP、F3、BIP和B3引物组成,以检测编码聚合酶区域中的位点181、204和236上的氨基酸的核苷酸序列,并且F3、F2和F1区域从双链靶核酸的一条单链核酸的5’-末端侧开始以该顺序排列同时B3c、B2c和B1c区域从另一条单链核酸的3’-末端侧开始以该顺序排列时,则,
FIP引物组包括由SEQ ID NO:5表示的引物,由SEQ ID NO:9表示的引物,
BIP引物组包括由SEQ ID NO:6表示的引物,由SEQ ID NO:122表示的引物,
F3引物组包括由SEQ ID NO:29表示的引物和由SEQ ID NO:31表示的引物,和
B3引物组包括由SEQ ID NO:30表示的引物和由SEQ ID NO:124表示的引物。
此外,可同时使用环引物组。在上述情况下,优选用作环引物的引物的组合是由SEQ ID NO:45表示的引物和/或由SEQ ID NO:46表示的引物和由SEQ ID NO:47表示的引物以及由SEQ ID NO:126表示的引物和由SEQ ID NO:49表示的引物。
当使用此类引物组时,与其同时使用的优选探针是由SEQ ID NO:50表示的探针,由SEQ ID NO:51表示的探针,由SEQ ID NO:52表示的探针,由SEQ ID NO:53表示的探针,由SEQ ID NO:54表示的探针,由SEQ ID NO:55表示的探针,由SEQ ID NO:56表示的探针,由SEQ ID NO:57表示的探针,由SEQ ID NO:127表示的探针,由SEQ ID NO:128表示的探针,由SEQ ID NO:129表示的探针,由SEQID NO:130表示的探针,由SEQ ID NO:131表示的探针,由SEQ ID NO:64表示的探针,由SEQ ID NO:65表示的探针,由SEQ ID NO:66表示的探针,由SEQ ID NO:67表示的探针,由SEQ ID NO:68表示的探针,由SEQ ID NO:69表示的探针,由SEQ ID NO:70表示的探针,由SEQ ID NO:71表示的探针,由SEQ ID NO:72表示的探针,由SEQID NO:73表示的探针,由SEQ ID NO:74表示的探针,由SEQ ID NO:75表示的探针,由SEQ ID NO:84表示的探针,由SEQ ID NO:85表示的探针,由SEQ ID NO:86表示的探针,由SEQ ID NO:87表示的探针,由SEQ ID NO:88表示的探针,由SEQ ID NO:89表示的探针,由SEQ ID NO:90表示的探针,由SEQ ID NO:91表示的探针,由SEQID NO:132表示的探针,由SEQ ID NO:133表示的探针,由SEQ IDNO:134表示的探针,由SEQ ID NO:135表示的探针和由SEQ ID NO:136表示的探针。备选地,还可使用此类探针的互补链。
此类引物组可用于通过在短时间内容易地且便宜地检测HBV的抗药性株系的本身已知的LAMP扩增法从HBV扩增核酸,并且它们的效应可通过将它们与环引物和探针组合使用来增强。
<实施例15>(引物组3和9的用途)
此类引物组可以是检测B型HBV的抗药性的引物组。当此类引物组由FIP、F3、BIP和B3引物组成,以检测编码聚合酶区域中的位点181、204和236上的氨基酸的核苷酸序列,并且F3、F2和F1区域从双链靶核酸的一条单链核酸的5’-末端侧开始以该顺序排列同时B3c、B2c和B1c区域从另一条单链核酸的3’-末端侧开始以该顺序排列时,则,
FIP引物组包括由SEQ ID NO:7表示的引物,由SEQ ID NO:23表示的引物,
BIP引物组包括由SEQ ID NO:8表示的引物,由SEQ ID NO:24表示的引物,
F3引物组包括由SEQ ID NO:31表示的引物和由SEQ ID NO:41表示的引物,和
B3引物组包括由SEQ ID NO:32表示的引物和由SEQ ID NO:42表示的引物。
当使用此类引物组时,与其同时使用的优选探针是由SEQ ID NO:50表示的探针,由SEQ ID NO:51表示的探针,由SEQ ID NO:52表示的探针,由SEQ ID NO:53表示的探针,由SEQ ID NO:54表示的探针,由SEQ ID NO:55表示的探针,由SEQ ID NO:56表示的探针,由SEQ ID NO:57表示的探针,由SEQ ID NO:58表示的探针,由SEQID NO:59表示的探针,由SEQ ID NO:60表示的探针,由SEQ ID NO:61表示的探针,由SEQ ID NO:62表示的探针,由SEQ ID NO:63表示的探针,由SEQ ID NO:76表示的探针,由SEQ ID NO:77表示的探针,由SEQ ID NO:78表示的探针,由SEQ ID NO:79表示的探针,由SEQ ID NO:80表示的探针,由SEQ ID NO:81表示的探针,由SEQID NO:82表示的探针,由SEQ ID NO:83表示的探针,由SEQ ID NO:132表示的探针,由SEQ ID NO:133表示的探针,由SEQ ID NO:134表示的探针,由SEQ ID NO:135表示的探针和由SEQ ID NO:136表示的探针。备选地,还可使用此类探针的互补链。
此类引物组可用于通过在短时间内容易地且便宜地检测HBV的抗药性株系的本身已知的LAMP扩增法从HBV扩增核酸,并且它们的效应可通过将它们与探针组合使用来增强
<实施例16>(引物组4和10的用途)
此类引物组可以是检测C型HBV的抗药性的引物组。当此类引物组由FIP、F3、BIP和B3引物组成,以检测编码聚合酶区域中的位点181、204和236上的氨基酸的核苷酸序列,并且F3、F2和F1区域从双链靶核酸的一条单链核酸的5’-末端侧开始以该顺序排列同时B3c、B2c和B1c区域从另一条单链核酸的3’-末端侧开始以该顺序排列时,则,
FIP引物组包括由SEQ ID NO:9表示的引物,由SEQ ID NO:25表示的引物,
BIP引物组包括由SEQ ID NO:10表示的引物,由SEQ ID NO:26表示的引物,
F3引物组包括由SEQ ID NO:31表示的引物和由SEQ ID NO:33表示的引物,和
B3引物组包括由SEQ ID NO:32表示的引物和由SEQ ID NO:44表示的引物。
当使用此类引物组时,与其同时使用的优选探针是由SEQ ID NO:50表示的探针,由SEQ ID NO:51表示的探针,由SEQ ID NO:52表示的探针,由SEQ ID NO:53表示的探针,由SEQ ID NO:54表示的探针,由SEQ ID NO:55表示的探针,由SEQ ID NO:56表示的探针,由SEQ ID NO:57表示的探针,由SEQ ID NO:58表示的探针,由SEQID NO:59表示的探针,由SEQ ID NO:60表示的探针,由SEQ ID NO:61表示的探针,由SEQ ID NO:62表示的探针,由SEQ ID NO:63表示的探针,由SEQ ID NO:76表示的探针,由SEQ ID NO:77表示的探针,由SEQ ID NO:78表示的探针,由SEQ ID NO:79表示的探针,由SEQ ID NO:80表示的探针,由SEQ ID NO:81表示的探针,由SEQID NO:82表示的探针,由SEQ ID NO:83表示的探针,由SEQ ID NO:132表示的探针,由SEQ ID NO:133表示的探针,由SEQ ID NO:134表示的探针,由SEQ ID NO:135表示的探针和由SEQ ID NO:136表示的探针。备选地,还可使用此类探针的互补链。
此类引物组可用于通过在短时间内容易地且便宜地检测HBV的抗药性株系的本身已知的LAMP扩增法从HBV扩增核酸,并且它们的效应可通过将它们与探针组合使用来增强
<实施例17>(引物组9和11的用途)
此类引物组可以是检测B型HBV的抗药性的引物组。当此类引物组由FIP、F3、BIP和B3引物组成,以检测编码聚合酶区域中的位点181、204和236上的氨基酸的核苷酸序列,并且F3、F2和F1区域从双链靶核酸的一条单链核酸的5’-末端侧开始以该顺序排列同时B3c、B2c和B1c区域从另一条单链核酸的3’-末端侧开始以该顺序排列时,则,
FIP引物组包括由SEQ ID NO:23表示的引物,由SEQ ID NO:7表示的引物,
BIP引物组包括由SEQ ID NO:24表示的引物,由SEQ ID NO:121表示的引物,
F3引物组包括由SEQ ID NO:41表示的引物和由SEQ ID NO:31表示的引物,和
B3引物组包括由SEQ ID NO:42表示的引物和由SEQ ID NO:123表示的引物。
此外,可同时使用环引物组。在上述情况下,优选用作环引物的引物的序列是由SEQ ID NO:125表示的引物。
当使用此类引物组时,与其同时使用的优选探针是由SEQ ID NO:50表示的探针,由SEQ ID NO:51表示的探针,由SEQ ID NO:52表示的探针,由SEQ ID NO:53表示的探针,由SEQ ID NO:54表示的探针,由SEQ ID NO:55表示的探针,由SEQ ID NO:56表示的探针,由SEQ ID NO:57表示的探针,由SEQ ID NO:58表示的探针,由SEQID NO:59表示的探针,由SEQ ID NO:60表示的探针,由SEQ ID NO:61表示的探针,由SEQ ID NO:62表示的探针,由SEQ ID NO:63表示的探针,由SEQ ID NO:76表示的探针,由SEQ ID NO:77表示的探针,由SEQ ID NO:78表示的探针,由SEQ ID NO:79表示的探针,由SEQ ID NO:80表示的探针,由SEQ ID NO:81表示的探针,由SEQID NO:82表示的探针,由SEQ ID NO:83表示的探针,由SEQ ID NO:132表示的探针,由SEQ ID NO:133表示的探针,由SEQ ID NO:134表示的探针,由SEQ ID NO:135表示的探针和由SEQ ID NO:136表示的探针。备选地,还可使用此类探针的互补链。
此类引物组可用于通过在短时间内容易地且便宜地检测HBV的抗药性株系的本身已知的LAMP扩增法从HBV扩增核酸,并且它们的效应可通过将它们与环引物和探针组合使用来增强。
<实施例18>(引物组10和12的用途)
此类引物组可以是检测C型HBV的抗药性的引物组。当此类引物组由FIP、F3、BIP和B3引物组成,以检测编码聚合酶区域中的位点181、204和236上的氨基酸的核苷酸序列,并且F3、F2和F1区域从双链靶核酸的一条单链核酸的5’-末端侧开始以该顺序排列同时B3c、B2c和B1c区域从另一条单链核酸的3’-末端侧开始以该顺序排列时,则,
FIP引物组包括由SEQ ID NO:25表示的引物,由SEQ ID NO:9表示的引物,
BIP引物组包括由SEQ ID NO:26表示的引物,由SEQ ID NO:122表示的引物,
F3引物组包括由SEQ ID NO:43表示的引物和由SEQ ID NO:31表示的引物,和
B3引物组包括由SEQ ID NO:44表示的引物和由SEQ ID NO:124表示的引物。
此外,可同时使用环引物组。在上述情况下,优选用作环引物的引物的序列是由SEQ ID NO:126表示的引物。
当使用此类引物组时,与其同时使用的优选探针是由SEQ ID NO:50表示的探针,由SEQ ID NO:51表示的探针,由SEQ ID NO:52表示的探针,由SEQ ID NO:53表示的探针,由SEQ ID NO:54表示的探针,由SEQ ID NO:55表示的探针,由SEQ ID NO:56表示的探针,由SEQ ID NO:57表示的探针,由SEQ ID NO:64表示的探针,由SEQID NO:65表示的探针,由SEQ ID NO:66表示的探针,由SEQ ID NO:67表示的探针,由SEQ ID NO:68表示的探针,由SEQ ID NO:69表示的探针,由SEQ ID NO:70表示的探针,由SEQ ID NO:71表示的探针,由SEQ ID NO:72表示的探针,由SEQ ID NO:73表示的探针,由SEQ ID NO:74表示的探针,由SEQ ID NO:75表示的探针,由SEQID NO:84表示的探针,由SEQ ID NO:85表示的探针,由SEQ ID NO:86表示的探针,由SEQ ID NO:87表示的探针,由SEQ ID NO:88表示的探针,由SEQ ID NO:89表示的探针,由SEQ ID NO:90表示的探针,由SEQ ID NO:91表示的探针,由SEQ ID NO:132表示的探针,由SEQ ID NO:133表示的探针,由SEQ ID NO:134表示的探针,由SEQ ID NO:135表示的探针和由SEQ ID NO:136表示的探针。备选地,还可使用此类探针的互补链。
此类引物组可用于通过在短时间内容易地且便宜地检测HBV的抗药性株系的本身已知的LAMP扩增法从HBV扩增核酸,并且它们的效应可通过将它们与环引物和探针组合使用来增强。
<实施例19>
本发明的测定试剂盒包括根据本发明的引物组(任选地环引物)和根据本发明的探针。测定试剂盒可任选地包括进行LAMP所必需的试剂,并且可包括以固定在基质上的状态存在的探针。
<实施例20>
将来自受试者的血液、血清和器官用作样品,将任何用于LAMP扩增的核酸引物组和任何如上所述的探针用于检查来自HBV的靶核酸是抗药性的还是非抗药性的。
首先,从样品提取核酸。在其中可达到的适当扩增的条件下,即在等温条件下在60至65℃的适当缓冲液中,将所得样品溶液经历利用实施例1至8中的每一个中所示的引物的LAMP扩增。
用其上固定有实施例1至8的每一个中所示的核酸探针的基质检测所得的扩增产物。通过将扩增产物加入至固定有核酸的基质来使其经历杂交,从而电化学检测杂交的存在或不存在,以判断来自样品的HBV是抗药性株系还是非抗药性株系。
通过在本身已知的LAMP扩增法中使用此类引物组扩增来自HBV的核酸,然后用探针进行检测,由此可在短时间内容易且便宜地检测HBV的抗药性株系。
<实施例21>
在下文中,描述了使用引物组1至12的扩增试验。
当将LAMP产物用作靶核酸时,首先必需确定检测靶碱基的排列。在LAMP产物中,存在两种类型的环序列(即,F-环和B-环;例如,在图2(a)中,相应于F环的F2c部分和相应于B环的B2的部分)。当检测靶碱基排列在环序列中时,其与探针反应的效率良好。为了检测靶碱基,即,在本实施例中为编码3个位点(位点181、204和236)上的氨基酸的核苷酸序列,环序列中检测靶碱基的排列需要两个LAMP产物(总共4个环序列),并且引物组1至12是用于在4个环序列中3个位点上的检测靶序列的排列的组合。引物组1和2,引物组3和4,引物组5和6,引物组7和8,引物组9和10或引物组11和12是在检测靶的排列上相同但在靶基因型(B或C)上不同的引物组。在下文中,描述了使用每一个引物组的扩增实验。
(1)模板序列
将分别含有下列序列的两种类型的质粒DNA制备为模板序列。
(基因型B)
CACAACTCCTGCTCAAGGAACCTCTATGTTTCCCTCATGTTGCTGTACAAAACCTACGGA
CGGAAACTGCACCTGTATTCCCATCCCATCATCTTGGGCTTTCGCAAAATACCTATGGGA
GTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCTTGCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGT
AGGGCTTTCCCCCACTGTCTGGCTTTCAGTTAT
Figure BSA00000743611700532
GATGATGTGGTATTGGGGGCCAAG
TCTGTACAACATCTTGAGTCCCTTTATGCCGCTGTTACCAATTTTCTTTTGTCTTTGGGT
ATACATTTA
Figure BSA00000743611700533
CCTCACAAAACAAAAAGATGGGGATATTCCCTTAACTTCATGGGATAT
GTAATTGGGAGTTGGGGCACATTGCCACAGGAACATATTGTACAAAAAATCAAACTTTGT
TTTAGGAAACTTCCTGTAAACAGGCCTATTGATTGGAAAGTTTGTCAACGAATTGTGGGT
(基因型C)
CACGATTCCTGCTCAAGGCACCTCTATGTTTCCCTCTTGTTGCTGTACAAAACCTTCGGA
TGGAAACTGCACTTGTATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTCGCAAGATTCCTATGGGA
GTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCCTGCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGT
AGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGTTAT
Figure BSA00000743611700535
GATGATGTGGTATTGGGGGCCAAG
TCTGTACAACATCTTGAGTCCCTTTTTACCTCTATTACCAATTTTCTTTTGTCTTTGGGT
ATACATTTGCCTAATAAAACCAAACGTTGGGGCTACTCCCTTAACTTCATGGGATAT
GTAATTGGAAGTTGGGGTACTTTACCGCAAGACCATATTGTACTAAAACTCAAGCAATGT
TTTCGAAAACTGCCTGTAAATAGACCTATTGATTGGAAAGTATGTCAGAGA
在基因型B和C的序列中,括起来的3碱基密码子表示分别编码从上游开始的位点181、204和236上的3个氨基酸的碱基。
(2)通过LAMP法进行的靶核酸的扩增
制备分别含有表1中的引物组1至12的12种LAMP反应溶液,所述LAMP反应溶液含有进行LAMP反应所必需的酶、dNTP和缓冲液。在63℃下进行LAMP扩增,使用浊度计检测LAMP扩增中的上升时间以比较引物组。“上升时间”是其中用浊度计最早检测到随扩增反应增加的浊度的时间。
(3)结果
从12个引物组获得的LAMP扩增中的上升时间示于表6中。
对于基因型B和C的扩增时间都小于60分钟所用的引物组是引物组1和2或引物组11和12。对于引物组1和2,编码aa181和aa204的核苷酸序列在每一种扩增产物中分别排列在F-环和B-环中(参见表1)。对于引物组11和12,编码aa204和aa236的核苷酸序列在每一种扩增产物中分别排列在F环和B环中(参见表1)。对于基因型B和C的扩增时间都为60分钟至70分钟之间所用的引物组是引物组3和4或引物组7和8的组合。对于引物组3和4,编码aa204和aa236的核苷酸序列在每一种扩增产物中分别排列在F环和B环中(参见表1)。对于引物组7和8,编码aa236的核苷酸序列排列在每一种扩增产物的B环中(参见表1)。其它引物组,虽然显示超过70分钟的上升时间,但实际上使用是令人满意的。
当检测病毒DNA的序列时,将方案大致分为3个步骤:(1)DNA提取,(2)靶核酸的扩增,和(3)序列的检测。为了减少该检查的总时间,进行这些步骤的每一个步骤所必需的时间优选更短,其标准为大约60分钟。
引物组3和4的组合、引物组7和8的组合以及引物组11和12的组合之间的比较表明,因为使用引物组3和4或使用引物组11和12的扩增产物具有排列在F-环中的aa204,因此当与引物组1和2组合时使用这些引物组扩增的LAMP扩增产物在环中含有aa.204。
当扩增病毒DNA时,扩增反应可因在检测靶外存在的突变而被抑制。为了减少上述抑制的产生,优选将检测靶的核苷酸序列包含在使用不同引物区扩增的两种类型或更多种类型的LAMP产物中。因此,更优选考虑将靶核酸经历其中用引物组1和2扩增aa181(F-环)和aa204(B-环)和同时用引物组3和4或引物组11和12扩增aa204(F-环)和aa236(B-环)的LAMP扩增。
Figure BSA00000743611700551
<实施例22>
对于实施例11中确定的每一个优选引物组,确定用于每一个氨基酸的检测的探针序列。
在下文中,描述了其中将引物组1用于LAMP扩增来检测编码乙型肝炎病毒的聚合酶区域中位点204上的氨基酸的核苷酸序列的实例。
(1)模板序列
合成下列8个序列作为模板序列。
模板1具有下列序列:
·模板-1
TGGACCTGTATTCCCATCCCATCATCTTGGGCTTTCGCAAAATACCTATGGGAGTGGGCC
TCAGTCCGTTTCTCTTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTT
TCCCCCACTGTCTGGCTTTCAGTTAT
Figure BSA00000743611700561
GATGATGTGGTTTTGGGGGCCAAGTCTGTAC
AACATCTTGAGTCCCTTTATGCCGCTGTTACCAATTTTCTTTTGTCTTTGGGTATACATT
TAAACCCTCACAAAACAAAAAGATGGGGATATTCCCTTAACTTCATGGGATATG
模板2是其中括起来的序列即“ATG”被“ATC”替代的上述模板1的该核苷酸序列。
模板3是其中括起来的序列即“ATG”被“ATT”替代的上述模板1的该核苷酸序列。
模板4是其中括起来的序列即“ATG”被“ATA”替代的上述模板1的该核苷酸序列。
模板5是其中括起来的序列即“ATG”被“GTG”替代的上述模板1的该核苷酸序列。
模板6是其中括起来的序列即“ATG”被“GTC”替代的上述模板1的该核苷酸序列。
模板7是其中括起来的序列即“ATG”被“GTT”替代的上述模板1的该核苷酸序列。
模板8是其中括起来的序列即“ATG”被“GTA”替代的上述模板1的该核苷酸序列。
(2)通过LAMP法进行的靶核酸的扩增
制备含有表1和2中所示的引物组1(40pmol FIP,40pmol BIP,5pmol F3,5pmol B3)、表3中显示的环引物19(20pmol)、LAMP反应所必需的酶(1μL Bst-DNP聚合酶,由NEB生产的)、dNTP和用于LAMP反应的缓冲液的8种LAMP反应溶液。分别以1E+03个拷贝/反应的终浓度向制备的8种反应溶液中加入模板1至8,然后在63℃下反应1小时。将所得反应溶液的等分进行电泳以确认获得LAMP产物。
将其余反应溶液用作LAMP产物溶液,然后以2×SSC的终浓度向其中加入20×SSC溶液来产生靶核酸溶液。即,从模板1至8获得的靶核酸溶液分别用作核酸溶液1至8。其中含有的靶核酸分别称为靶核酸1至8。分开地,将除了其不含有靶核酸外具有与靶核酸溶液中的组成相同的组成的溶液制备为阴性对照核酸溶液9。
(3)固定核酸探针的电极的制备
在本实施例中,将金电极用作DNA探针的支持物。制备DNA芯片的基质,其中具有固定至其上的核酸探针的工作电极、反电极和参比电极(其两者都是电化学测量所必需的)和与此类电极连接的电极垫以多个排列在一个玻璃基质上。
将含有由SEQ ID NOS:92至120的序列(每一个所述序列用SH基在其末端进行修饰)组成的核酸探针的每一种核酸探针溶液滴至工作电极上并且放置1小时。之后,用超纯水清洗电极,将其干燥从而产生固定有核酸探针的电极(DNA芯片)。
(4)靶核酸的检测
向固定核酸探针的电极加入靶核酸溶液1至8的每一种溶液,然后在45℃下反应10分钟,从而将靶核酸与核酸探针杂交。之后,通过在各温度(35、37、39℃)下与0.2×SSC溶液反应20分钟以除去非特异性吸附或结合的靶核酸来清洗电极。在除去清洗缓冲液后,加入作为能够结合核酸的插入剂的Hoechst 33258。之后,根据通过线性扫描伏安法获得的伏安图计算产生自Hoechst 33258的氧化的峰电流值。
在加入靶核酸溶液后,在建立的温度下进行的杂交反应,清洗缓冲液的加入,在建立的温度下的清洗,插入剂的加入,电流的检测和获自各电极的电流值的比较通过使用进行这些步骤所必需的手段来进行,例如加液调控系统(liquid feeding regulation system)、温度调控系统、自动检测器,包括恒电位器和各部件的控制软件。
(5)结果
在本实施例中,选择探针和其部分与所述探针完全互补的靶核酸的组合以及探针和其部分与所述探针只相异1个碱基的靶核酸的组合,获自各已固定核酸探针的电极的电流值表示为其对背景电流值的比率(S/B比率)并且示于表7至14中。
表7显示通过将靶核酸溶液1、2、3、4、5和9与探针43至45反应获得的S/B比率;表8显示通过将核酸溶液1、2、6和9与探针46至48反应获得的S/B比率;表9显示通过将核酸溶液1、3、7和9与探针49至53反应获得的S/B比率;表10显示通过将核酸溶液1、4、8和9与探针54至57反应获得的S/B比率;表11显示通过将核酸溶液1、5和9与探针58至62反应获得的S/B比率;表12显示通过将核酸溶液2、6和9与探针63至65反应获得的S/B比率;表13显示通过将核酸溶液3、7和9与探针66至68反应获得的S/B比率;和表14显示通过将核酸溶液4、8和9与探针69至71反应获得的S/B比率。通过在35、37或39℃的温度下清洗获得S/B的比率。
例如,表7显示通过将核酸溶液1、2、3、4、5或9与探针43至45反应获得的S/B比率,其中探针43至45在碱基的数目上彼此不同,具有与靶核酸1的一部分互补的序列,和具有与靶核酸2、3、4和5的互补链相异于1个碱基的序列。在各表中的每一个阴影栏中,所使用的探针与靶核酸完全互补,因此这些栏是其值应当高的部分。在每一个其他栏中,在另一方面,所使用的探针与靶核酸相异于1个碱基,因而这些栏是其值应当低的部分。
在表7中,已显示,当清洗温度是37℃时,探针44在与核酸溶液1反应时显示更高的值,在与核酸溶液2、3、4和5反应时显示更低的值。因此,当清洗温度为37℃时,优选使用探针44。
如表8至14中所示,同样类似地获得关于探针46至71的数值,根据各探针序列中碱基的数目确定碱基的最优选的碱基数目。
在探针46至48当中,根据表8中所示的结果探针47是优选的;在探针49至53当中,根据表9中所示的结果探针50是优选的;在探针54至57当中,根据表10中所示的结果探针56是优选的;在探针58至62当中,根据表11中所示的结果探针59是优选的;在探针63至65当中,根据表12中所示的结果探针64是优选的;在探针66至68当中,根据表13中所示的结果探针68是优选的;以及在探针69至71当中,根据表14中所示的结果探针70是优选的。
根据这些结果,显示了在37℃的清洗温度下,由SEQ ID NO:93表示的核苷酸序列或其互补链组成的探针,由SEQ ID NO:96表示的核苷酸序列或其互补链组成的探针,由SEQ ID NO:99表示的核苷酸序列或其互补链组成的探针,由SEQ ID NO:105表示的核苷酸序列或其互补链组成的探针,由SEQ ID NO:108表示的核苷酸序列或其互补链组成的探针,由SEQ ID NO:113表示的核苷酸序列或其互补链组成的探针,由SEQ ID NO:117表示的核苷酸序列或其互补链组成的探针,和由SEQ ID NO:119表示的核苷酸序列或其互补链组成的探针可明确地辨别出目的靶核酸链。
也显示了,当改变清洗温度时,表5中显示的其他探针可明确地辨别出目的靶核酸链。
Figure BSA00000743611700601
Figure BSA00000743611700611
Figure BSA00000743611700621
Figure BSA00000743611700631
Figure BSA00000743611700641
表12
Figure BSA00000743611700651
表13
Figure BSA00000743611700652
表14
Figure BSA00000743611700653
<实施例23>
在下文中,描述了其中将引物组11和12用于LAMP扩增以检测编码乙型肝炎和丙型肝炎病毒的聚合酶中的位点236上的氨基酸的核苷酸序列的实例。
(1)模板序列
合成了作为模板序列的下列9个序列。
模板15具有下列序列:
·模板-15
ACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGAACACCCGTGTGTCTTGGCCA
AAATTCGCAGTCCCAAATCTCCAGTCACTCACCAACCTGTTGTCCTCCAATTTGTCCTGGTTATCG
CTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTGCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTT
GGTTCTTCTGGACTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTAATTCCAGGATCATCAACAACCAG
CACCGGACCATGCAAAACCTGCACAACTCCTGCTCAAGGAACCTCTATGTTTCCCTCATGTTGCTG
TACAAAACCTACGGACGGAAACTGCACCTGTATTCCCATCCCATCATCTTGGGCTTTCGCAAAATA
CCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCTTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTT
CGTAGGGCTTTCCCCCACTGTCTGGCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGTTTTGGGGGCCAAGTCT
GTACAACATCTTGAGTCCCTTTATGCCGCTGTTACCAATTTTCTTTTGTCTTTGGGTATACATTTACCTCACAAAACAAAAAGATGGGGATATTCCCTTAACTTCATGGGATATGTAATTGGGAGTTGG
GGCACATTGCCACAGGAACATATTGTACAAAAAATCAAAATGTGTTTTAGGAAACTTCCTGTAAAC
AGGCCTATTGATTGGAAAGTATGTCAACGAATTGTGGGTCTTTTGGGGTTTGCCGCCCCTTTCACG
CAATGTGGATATCCTGCTTTAATGCCTTTATATGCATGTATACAAGCAAAACAGGCTTTTACTTTC
TCGCCAACTTACAAGGCCTTTCTAAGTAAACAGTATCTGAACCTTTACCCCGTTGCTCGGCAACGG
CCTGGTCTGTGCCAAGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCTTGGCCATAGGCCATCAG
CGCATGCGTG
模板16是其中括起来的序列即“AAC”被“AAT”替代的上述模板15的该核苷酸序列。
模板17是其中括起来的序列即“AAC”被“ACC”替代的上述模板15的该核苷酸序列。
模板18具有下列序列:
·模板-18
AGAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGAGCACCCACGTGTCCTGGCCA
AAATTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAACCTCTTGTCCTCCAATTTGTCCTGGCTATCG
CTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATATTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTT
GGTTCTTCTGGACTACCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTACTTCCAGGAACATCAACTACCAG
CACGGGACCATGCAAGACCTGCACGATTCCTGCTCAAGGAACCTCTATGTTTCCCTCTTGTTGCTG
TACAAAACCTTCGGACGGAAACTGCACTTGTATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTCGCAAGATT
CCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCCTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTT
CGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCT
GTACAACATCTTGAGTCCCTTTTTACCTCTATTACCAATTTTCTTTTGTCTTTGGGTATACATTTG
Figure BSA00000743611700671
CCTAATAAAACCAAACGTTGGGGCTACTCCCTTAACTTCATGGGATATGTAATTGGAAGTTGG
GGTACTTTACCACAGGAACATATTGTACTAAAAATCAAGCAATGTTTTCGAAAACTGCCTGTAAAT
AGACCTATTGATTGGAAAGTATGTCAAAGAATTGTGGGTCTTTTGGGCTTTGCTGCCCCTTTTACA
CAATGTGGCTATCCTGCCTTAATGCCTTTATATGCATGTATACAATCTAAGCAGGCTTTCACTTTC
TCGCCAACTTACAAGGCCTTTCTGTGTAAACAATATCTGAACCTTTACCCCGTTGCCCGGCAACGG
TCAGGTCTCTGCCAAGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGATGGGGCTTGGCCATAGGCCATCGG
CGCATGCGTG
模板19是其中括起来的序列即“GAAC”被“GAAT”替代的上述模板18的该核苷酸序列。
模板20是其中括起来的序列即“GAAC”被“GACC”替代的上述模板18的该核苷酸序列。
模板21是其中括起来的序列即“GAAC”被“AAAC”替代的上述模板18的该核苷酸序列。
模板22是其中括起来的序列即“GAAC”被“AAAT”替代的上述模板18的该核苷酸序列。
模板23是其中括起来的序列即“GAAC”被“AACC”替代的上述模板18的该核苷酸序列。
(2)通过LAMP法进行的靶核酸的扩增
制备含有表1和2中所示的引物组11和12(40pmol FIP,40pmolBIP,5pmol F3,5pmol B3)、表3中显示的环引物125和126(20pmol)、LAMP反应所必需的酶(2μL Bst-DNP聚合酶,由NEB生产的)、dNTP和用于LAMP反应的缓冲液的9种LAMP反应溶液。分别以1E+03个拷贝/反应的终浓度向制备的9种反应溶液中加入模板15至23,然后在63℃下反应1小时。将所得反应溶液的等分进行电泳以确认获得LAMP产物。
将剩余反应溶液用作LAMP产物溶液,然后以2×SSC的终浓度向其中加入20×SSC溶液来产生靶核酸溶液。即,从模板15至23获得的靶核酸溶液分别用作核酸溶液15至23。其中含有的靶核酸分别称为靶核酸15至23。分开地,将除了其不含有靶核酸外具有与靶核酸溶液中的组成相同的组成的溶液制备为阴性对照核酸溶液9。
(3)固定有核酸探针的电极的制备
在本实施例中,将金电极用作DNA探针的支持物。制备DNA芯片的基质,其中具有被固定至其上的核酸探针的工作电极、反电极和参比电极(其两者都是电化学测量所必需的)和与此类电极连接的电极垫以多个排列在一个玻璃基质上。
将含有由SEQ ID NOS:147至167的序列(每一个所述序列用SH基在其末端进行修饰)组成的核酸探针的每一种核酸探针溶液滴至工作电极上并且放置1小时。之后,用超纯水清洗电极,将其干燥从而产生固定有核酸探针的电极(DNA芯片)。
(4)靶核酸的检测
向固定有核酸探针的电极加入靶核酸溶液15至23的每一种,然后在45℃下反应10分钟,从而使靶核酸与核酸探针杂交。之后,通过在各温度(35、37、39℃)下与0.2×SSC溶液反应10分钟以除去非特异性吸附或结合的靶核酸来清洗电极。在除去清洗缓冲液后,加入作为能够结合核酸的插入剂的Hoechst 33258。之后,根据通过线性扫描伏安法获得的伏安图计算产生自Hoechst 33258的氧化的峰电流值。
在加入靶核酸溶液后,在所建立的温度下进行的杂交反应,清洗缓冲液的加入,在所建立的温度下的清洗,插入剂的加入,电流的检测和获自各电极的电流值的比较通过使用进行这些步骤所必需的手段来进行,例如加液调控系统(liquid feeding regulation system)、温度调控系统、自动检测器,包括恒电位器和各部件的控制软件。
(5)结果
在本实施例中,选择探针和其部分与所述探针完全互补的靶核酸的组合以及探针和其部分与所述探针只相异1或2个碱基的靶核酸的组合,获自各固定有核酸探针的电极的电流值表示为其对背景电流值的比率(S/B比率)并且示于表A至28中。
表A显示通过将靶核酸溶液15、17和9与探针92至93反应获得的S/B比率;表B显示通过将核酸溶液16、17和9与探针94至95反应获得的S/B比率;表C显示通过将核酸溶液15、17和9与探针96至98反应获得的S/B比率;表D显示通过将核酸溶液18、20和9与探针99至101反应获得的S/B比率;表E显示通过将核酸溶液19、20和9与探针102反应获得的S/B比率;表F显示通过将核酸溶液18、20和9与探针103和104反应获得的S/B比率;表G显示通过将核酸溶液21、23和9与探针105至108反应获得的S/B比率;表H显示通过将核酸溶液22、23和9与探针109和110反应获得的S/B比率;和表I显示通过将核酸溶液21、23和9与探针111和112反应获得的S/B比率。通过在35、37或39℃的温度下清洗获得S/B的比率。
在各表中的每一个阴影栏中,所使用的探针与靶核酸完全互补,因此这些栏是其值应当高的部分。在每一个其他栏中,在另一方面,所使用的探针与靶核酸相异于1或2个碱基,因而这些栏是其值应当低的部分。
在表A中,已显示,当清洗温度是37℃时,探针92在与核酸溶液15反应时显示更高的值,在与核酸溶液17反应时显示更低的值。因此,当清洗温度为37℃时,优选使用探针92。
如表B至I中所示,同样类似地获得关于探针94至112的数值,根据各探针序列中碱基的数目确定碱基的最优选数目。
在探针94和95当中,根据表B中所示的结果探针94是优选的;在探针96~98当中,根据表C中所示结果探针97是优选的;在探针99至101当中,根据表D中所示的结果探针99是优选的;根据表E中所示的结果探针102是优选的;在探针103和104当中,根据表F中所示的结果探针103是优选的;在探针105至108当中,根据表G中所示的结果探针106是优选的;在探针109和110当中,根据表H中所示的结果探针109是优选的;以及在探针111和112当中,根据表I中所示的结果探针112是优选的。
根据这些结果,显示了在37℃的清洗温度下,由SEQ ID NO:147表示的核苷酸序列或其互补链组成的探针,由SEQ ID NO:149表示的核苷酸序列或其互补链组成的探针,由SEQ ID NO:152表示的核苷酸序列或其互补链组成的探针,由SEQ ID NO:155表示的核苷酸序列或其互补链组成的探针,由SEQ ID NO:157表示的核苷酸序列或其互补链组成的探针,由SEQ ID NO:158表示的核苷酸序列或其互补链组成的探针,由SEQ ID NO:161表示的核苷酸序列或其互补链组成的探针,由SEQ ID NO:164表示的核苷酸序列或其互补链组成的探针,和由SEQ ID NO:167表示的核苷酸序列或其互补链组成的探针可明确地辨别出目的靶核酸链。
也显示了,当改变清洗温度时,表5中显示的其他探针可明确地辨别出目的靶核酸链。
表A
Figure BSA00000743611700701
表B
Figure BSA00000743611700711
表C
Figure BSA00000743611700712
表D
表E
Figure BSA00000743611700714
表F
Figure BSA00000743611700721
表G
Figure BSA00000743611700722
表H
Figure BSA00000743611700723
表I
<实施例24>
在下文中,描述了其中将引物组1和2用于LAMP扩增以检测编码乙型肝炎和丙型肝炎病毒的聚合酶中的位点181上的氨基酸的核苷酸序列的实例。
(1)模板序列
合成了作为模板序列的下列15个序列。
模板24具有下列序列:
·模板-24
ACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGAACACCCGTGTGTCTTGGCCA
AAATTCGCAGTCCCAAATCTCCAGTCACTCACCAACCTGTTGTCCTCCAATTTGTCCTGGTTATCG
CTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTGCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTT
GGTTCTTCTGGACTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTAATTCCAGGATCATCAACAACCAG
CACCGGACCATGCAAAACCTGCACAACTCCTGCTCAAGGAACCTCTATGTTTCCCTCATGTTGCTG
TACAAAACCTACGGACGGAAACTGCACCTGTATTCCCATCCCATCATCTTGGGCTTTCGCAAAATA
CCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCTTG
Figure BSA00000743611700731
CAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTT
CGTAGGGCTTTCCCCCACTGTCTGGCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGTTTTGGGGGCCAAGTCT
GTACAACATCTTGAGTCCCTTTATGCCGCTGTTACCAATTTTCTTTTGTCTTTGGGTATACATTTA
AACCCTCACAAAACAAAAAGATGGGGATATTCCCTTAACTTCATGGGATATGTAATTGGGAGTTGG
GGCACATTGCCACAGGAACATATTGTACAAAAAATCAAAATGTGTTTTAGGAAACTTCCTGTAAAC
AGGCCTATTGATTGGAAAGTATGTCAACGAATTGTGGGTCTTTTGGGGTTTGCCGCCCCTTTCACG
CAATGTGGATATCCTGCTTTAATGCCTTTATATGCATGTATACAAGCAAAACAGGCTTTTACTTTC
TCGCCAACTTACAAGGCCTTTCTAAGTAAACAGTATCTGAACCTTTACCCCGTTGCTCGGCAACGG
CCTGGTCTGTGCCAAGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCTTGGCCATAGGCCATCAG
CGCATGCGTG
模板25是其中括起来的序列即“GCT”被“GCC”替代的上述模板24的该核苷酸序列。
模板26是其中括起来的序列即“GCT”被“GCA”替代的上述模板24的该核苷酸序列。
模板27是其中括起来的序列即“GCT”被“GCG”替代的上述模板24的该核苷酸序列。
模板28是其中括起来的序列即“GCT”被“GTT”替代的上述模板24的该核苷酸序列。
模板29具有下列序列:
·模板-29
ACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGAGCACCCACGTGTCCTGGCCA
AAATTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAACCTCTTGTCCTCCAATTTGTCCTGGCTATCG
CTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATATTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTT
GGTTCTTCTGGACTACCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTACTTCCAGGAACATCAACTACCAG
CACGGGACCATGCAAGACCTGCACGATTCCTGCTCAAGGAACCTCTATGTTTCCCTCTTGTTGCTG
TACAAAACCTTCGGACGGAAACTGCACTTGTATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTCGCAAGATT
CCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCCTG
Figure BSA00000743611700741
CAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTT
CGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCT
GTACAACATCTTGAGTCCCTTTTTACCTCTATTACCAATTTTCTTTTGTCTTTGGGTATACATTTG
AACCCTAATAAAACCAAACGTTGGGGCTACTCCCTTAACTTCATGGGATATGTAATTGGAAGTTGG
GGTACTTTACCACAGGAACATATTGTACTAAAAATCAAGCAATGTTTTCGAAAACTGCCTGTAAAT
AGACCTATTGATTGGAAAGTATGTCAAAGAATTGTGGGTCTTTTGGGCTTTGCTGCCCCTTTTACA
CAATGTGGCTATCCTGCCTTAATGCCTTTATATGCATGTATACAATCTAAGCAGGCTTTCACTTTC
TCGCCAACTTACAAGGCCTTTCTGTGTAAACAATATCTGAACCTTTACCCCGTTGCCCGGCAACGG
TCAGGTCTCTGCCAAGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGATGGGGCTTGGCCATAGGCCATCGG
CGCATGCGTG
模板30是其中括起来的序列即“GCT”被“GCC”替代的上述模板29的该核苷酸序列。
模板31是其中括起来的序列即“GCT”被“GCA”替代的上述模板29的该核苷酸序列。
模板32是其中括起来的序列即“GCT”被“GCG”替代的上述模板29的该核苷酸序列。
模板33是其中括起来的序列即“GCT”被“GTT”替代的上述模板29的该核苷酸序列。
模板34具有下更序列:
·模板-34
ACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGAGCACCCACGTGTCCTGGCGA
AAATTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAACCTCTTGTCCTCCAATTTGTCCTGGCTATCG
CTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATATTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTT
GGTTCTTCTGGACTACCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTACTTCCAGGAACATCAACTACCAG
CACGGGACCATGCAAGACCTGCACGATTCCTGCTCAAGGAACCTCTATGTTTCCCTCTTGTTGCTG
TACAAAACCTTCGGACGGAAACTGCACTTGTATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTCGCAAGATT
CCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCATG
Figure BSA00000743611700751
CAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTT
CGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCT
GTACAACATCTTGAGTCCCTTTTTACCTCTATTACCAATTTTCTTTTGTCTTTGGGTATACATTTG
AACCCTAATAAAACCAAACGTTGGGGCTACTCCCTTAACTTCATGGGATATGTAATTGGAAGTTGG
GGTACTTTACCACAGGAACATATTGTACTAAAAATCAAGCAATGTTTTCGAAAACTGCCTGTAAAT
AGACCTATTGATTGGAAAGTATGTCAAAGAATTGTGGGTCTTTTGGGCTTTGCTGCCCCTTTTACA
CAATGTGGCTATCCTGCCTTAATGCCTTTATATGCATGTATACAATCTAAGCAGGCTTTCACTTTC
TCGCCAACTTACAAGGCCTTTCTGTGTAAACAATATCTGAACCTTTACCCCGTTGCCCGGCAACGG
TCAGGTCTCTGCCAAGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGATGGGGCTTGGCCATAGGCCATCGG
CGCATGCGTG
模板35是其中括起来的序列即“GCT”被“GCC”替代的上述模板34的该核苷酸序列。
模板36是其中括起来的序列即“GCT”被“GCA”替代的上述模板34的该核苷酸序列。
模板37是其中括起来的序列即“GCT”被“GCG”替代的上述模板34的该核苷酸序列。
模板38是其中括起来的序列即“GCT”被“GTT”替代的上述模板34的该核苷酸序列。
(2)通过LAMP法进行的靶核酸的扩增
制备含有表1和2中所示的引物组11和12(40pmol FIP,40pmolBIP,5pmol F3,5pmol B3)、表3中显示的环引物46(各20pmol)、LAMP反应所必需的酶(2μL Bst-DNP聚合酶,由NEB生产的)、dNTP和用于LAMP反应的缓冲液的9种LAMP反应溶液。分别以1E+03个拷贝/反应的终浓度向制备的9种反应溶液中加入模板24至38,然后在63℃下反应1小时。将所得反应溶液的等分进行电泳以确认获得LAMP产物。
将剩余反应溶液用作LAMP产物溶液,然后以2×SSC的终浓度向其中加入20×SSC溶液来产生靶核酸溶液。即,从模板24至38获得的靶核酸溶液分别用作核酸溶液24至38。其中含有的靶核酸分别称为靶核酸24至38。分开地,将除了其不含有靶核酸外具有与靶核酸溶液中的组成相同的组成的溶液制备为阴性对照核酸溶液9。
(3)固定有核酸探针的电极的制备
在本实施例中,将金电极用作DNA探针的支持物。制备DNA芯片的基质,其中具有被固定至其上的核酸探针的工作电极、反电极和参比电极(其两者都是电化学测量所必需的)和与此类电极连接的电极垫以多个排列在一个玻璃基质上。
将含有由SEQ ID NOS:168至196的序列(每一个所述序列用SH基在其末端进行修饰)组成的核酸探针的每一种核酸探针溶液滴至工作电极上并且放置1小时。之后,用超纯水清洗电极,将其干燥从而产生固定有核酸探针的电极(DNA芯片)。
(4)靶核酸的检测
向固定有核酸探针的电极加入靶核酸溶液24至38的每一种溶液,然后在45℃下反应10分钟,从而使靶核酸与核酸探针杂交。之后,通过在各温度(35、37、39℃)下与0.2×SSC溶液反应10分钟以除去非特异性吸附或结合的靶核酸来清洗电极。在除去清洗缓冲液后,加入作为能够结合核酸的插入剂的Hoechst 33258。之后,根据通过线性扫描伏安法获得的伏安图计算产生自Hoechst 33258的氧化的峰电流值。
在加入靶核酸溶液后,在建立的温度下进行的杂交反应,清洗缓冲液的加入,在建立的温度下的清洗,插入剂的加入,电流的检测和获自各电极的电流值的比较通过使用进行这些步骤所必需的手段来进行,例如加液调控系统(liquid feeding regulation system)、温度调控系统、自动检测器,包括恒电位器和各部件的控制软件。
(5)结果
在本实施例中,选择探针和其部分与所述探针完全互补的靶核酸的组合以及探针和其部分与所述探针只相异1或2个碱基的靶核酸的组合,获自各固定有核酸探针的电极的电流值表示为其对背景电流值的比率(S/B比率)并且示于表J至43中。
表J显示通过将靶核酸溶液24、28和9与探针113至115反应获得的S/B比率;表K显示通过将核酸溶液25、28和9与探针116和117反应获得的S/B比率;表L显示通过将核酸溶液26、28和9与探针118反应获得的S/B比率;表M显示通过将核酸溶液27、28和9与探针119反应获得的S/B比率;表N显示通过将核酸溶液24、28和9与探针120至122反应获得的S/B比率;表O显示通过将核酸溶液29、33和9与探针123至125反应获得的S/B比率;表P显示通过将核酸溶液30、33和9与探针126至127反应获得的S/B比率;表Q显示通过将核酸溶液31、33和9与探针128反应获得的S/B比率;表R显示通过将核酸溶液32、33和9与探针129反应获得的S/B比率;表S显示通过将核酸溶液29、33和9与探针130至132反应获得的S/B比率;表T显示通过将核酸溶液34、38和9与探针133和134反应获得的S/B比率;表U显示通过将核酸溶液35、38和9与探针135和136反应获得的S/B比率;表V显示通过将核酸溶液36、38和9与探针137反应获得的S/B比率;表W显示通过将核酸溶液37、38和9与探针138反应获得的S/B比率;表X显示通过将核酸溶液34、38和9与探针139至141反应获得的S/B比率。通过在35、37或39℃的温度下清洗获得S/B的比率。
在各表中的每一个阴影栏中,所使用的探针与靶核酸完全互补,因此这些栏是其值应当高的部分。在每一个其他栏中,在另一方面,所使用的探针与靶核酸相异于1或2个碱基,因而这些栏是其值应当低的部分。
在表J中,已显示,当清洗温度是37℃时,探针114在与核酸溶液24反应时显示更高的值,在与核酸溶液28反应时显示更低的值。因此,当清洗温度为37℃时,优选使用探针114。
如表K至X中所示,同样类似地获得关于探针116至141的数值,根据各探针序列中碱基的数目确定碱基的最优选数目。
在探针116和117当中,根据表K中所示的结果探针116是优选的;根据表L中所示的结果探针118是优选的;根据表M中所示的结果探针119是优选的;在探针120至122当中,根据表N中所示的结果探针121是优选的;在探针123至125当中,根据表O中所示的结果探针124是优选的;在探针126和127当中,根据表P中所示的结果探针126是优选的;根据表Q中所示的结果探针128是优选的;根据表R中所示的结果探针129是优选的;在探针130至132当中,根据表S中所示的结果探针131是优选的;在探针133和134当中,根据表T中所示的结果探针133是优选的;在探针135和136当中,根据表U中所示的结果探针135是优选的;根据表V中所示的结果探针137是优选的;根据表W中所示的结果探针138是优选的;以及在探针139至141当中,根据表X中所示的结果探针140是优选的。
根据这些结果,显示了在37℃的清洗温度下,由SEQ ID NO:169表示的核苷酸序列或其互补链组成的探针,由SEQ ID NO:171表示的核苷酸序列或其互补链组成的探针,由SEQ ID NO:173表示的核苷酸序列或其互补链组成的探针,由SEQ ID NO:174表示的核苷酸序列或其互补链组成的探针,由SEQ ID NO:176表示的核苷酸序列或其互补链组成的探针,由SEQ ID NO:179表示的核苷酸序列或其互补链组成的探针,由SEQ ID NO:181表示的核苷酸序列或其互补链组成的探针,由SEQ ID NO:183表示的核苷酸序列或其互补链组成的探针,由SEQ ID NO:184表示的核苷酸序列或其互补链组成的探针,由SEQ IDNO:186表示的核苷酸序列或其互补链组成的探针,由SEQ ID NO:188表示的核苷酸序列或其互补链组成的探针,由SEQ ID NO:190表示的核苷酸序列或其互补链组成的探针,由SEQ ID NO:192表示的核苷酸序列或其互补链组成的探针,由SEQ ID NO:193表示的核苷酸序列或其互补链组成的探针,和由SEQ ID NO:195表示的核苷酸序列或其互补链组成的探针可明确地辨别出目的靶核酸链。
也显示了,当改变清洗温度时,表5中显示的其他探针可明确地辨别出目的靶核酸链。
表J
Figure BSA00000743611700791
表K
表L
Figure BSA00000743611700793
表M
Figure BSA00000743611700801
表N
表O
Figure BSA00000743611700803
表P
Figure BSA00000743611700804
表Q
Figure BSA00000743611700811
表R
Figure BSA00000743611700812
表S
Figure BSA00000743611700813
表T
表U
Figure BSA00000743611700821
表V
Figure BSA00000743611700822
表W
表X
Figure ISA00000743611900011
Figure ISA00000743611900021
Figure ISA00000743611900041
Figure ISA00000743611900051
Figure ISA00000743611900061
Figure ISA00000743611900071
Figure ISA00000743611900081
Figure ISA00000743611900091
Figure ISA00000743611900101
Figure ISA00000743611900111
Figure ISA00000743611900121
Figure ISA00000743611900131
Figure ISA00000743611900141
Figure ISA00000743611900151
Figure ISA00000743611900171
Figure ISA00000743611900181
Figure ISA00000743611900191
Figure ISA00000743611900201
Figure ISA00000743611900211
Figure ISA00000743611900221
Figure ISA00000743611900231
Figure ISA00000743611900251
Figure ISA00000743611900261
Figure ISA00000743611900271
Figure ISA00000743611900281
Figure ISA00000743611900291
Figure ISA00000743611900301
Figure ISA00000743611900311
Figure ISA00000743611900321
Figure ISA00000743611900331
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Figure ISA00000743611900351
Figure ISA00000743611900361
Figure ISA00000743611900371
Figure ISA00000743611900381
Figure ISA00000743611900391
Figure ISA00000743611900401
Figure ISA00000743611900411
Figure ISA00000743611900421
Figure ISA00000743611900431
Figure ISA00000743611900441
Figure ISA00000743611900451
Figure ISA00000743611900461

Claims (11)

1.用于LAMP扩增以检测乙型肝炎病毒的抗药性株系和非抗药性株系的核酸引物组,其包括FIP引物、F3引物、BIP引物和B3引物,
其中所述引物组选自:
引物组2,其中FIP引物由SEQ ID NO:5表示的多核苷酸组成,BIP引物由SEQ ID NO:6表示的多核苷酸组成,F3引物由SEQ ID NO:29表示的多核苷酸组成,以及B3引物由SEQ ID NO:30表示的多核苷酸组成,
所述引物组用于扩增含有编码乙型肝炎病毒的聚合酶区域中的位点181和204上的氨基酸的核苷酸序列的核苷酸序列区域。
2.权利要求1的引物组,其还包括,由至少一个来自SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46中的序列表示的多核苷酸组成的引物,作为环引物。
3.检测乙型肝炎病毒的抗药性或非抗药性株系的方法,其包括:
使用引物组,通过LAMP扩增样品溶液中的乙型肝炎病毒核酸以产生扩增产物,和
将所述扩增产物与含有来源于乙型肝炎病毒的抗药性株系的多核苷酸的探针和/或含有来源于乙型肝炎病毒的非抗药性株系的多核苷酸的探针杂交,以检测乙型肝炎病毒的抗药性或非抗药性株系,
其中所述引物组包括FIP引物、F3引物、BIP引物和B3引物,并且包括:
引物组2,其中FIP引物由SEQ ID NO:5表示的多核苷酸组成,BIP引物由SEQ ID NO:6表示的多核苷酸组成,F3引物由SEQ ID NO:29表示的多核苷酸组成,以及B3引物由SEQ ID NO:30表示的多核苷酸组成,且
所述引物组用于扩增含有编码乙型肝炎病毒的聚合酶区域中的位点181和204上的氨基酸的核苷酸序列的核苷酸序列区域。
4.权利要求3的方法,其中所述探针包含于探针组中,所述探针组含有至少一个由多核苷酸和任选的分别与所述多核苷酸的端部连接的一个至两个核苷酸片段和另外一个至5个核苷酸片段组成的探针,所述多核苷酸选自:
由SEQ ID NO:50表示的多核苷酸或其互补链,由SEQ ID NO:51表示的多核苷酸或其互补链,由SEQ ID NO:52表示的多核苷酸或其互补链,由SEQ ID NO:53表示的多核苷酸或其互补链,由SEQ ID NO:54表示的多核苷酸或其互补链,由SEQ ID NO:55表示的多核苷酸或其互补链,由SEQ ID NO:56表示的多核苷酸或其互补链,由SEQ IDNO:57表示的多核苷酸或其互补链,由SEQ ID NO:84表示的多核苷酸或其互补链,由SEQ ID NO:85表示的多核苷酸或其互补链,由SEQID NO:86表示的多核苷酸或其互补链,由SEQ ID NO:87表示的多核苷酸或其互补链,由SEQ ID NO:88表示的多核苷酸或其互补链,由SEQ ID NO:89表示的多核苷酸或其互补链,由SEQ ID NO:90表示的多核苷酸或其互补链,由SEQ ID NO:91表示的多核苷酸或其互补链,由SEQ ID NO:132表示的多核苷酸或其互补链,由SEQ ID NO:133表示的多核苷酸或其互补链,由SEQ ID NO:134表示的多核苷酸或其互补链,由SEQ ID NO:135表示的多核苷酸或其互补链,和由SEQ ID NO:136表示的多核苷酸或其互补链。
5.权利要求4的方法,其中所述引物组含有:
引物组2,其中FIP引物由SEQ ID NO:5表示的多核苷酸组成,BIP引物由SEQ ID NO:6表示的多核苷酸组成,F3引物由SEQ ID NO:29表示的多核苷酸组成,以及B3引物由SEQ ID NO:30表示的多核苷酸组成,
所述探针包含于探针组中,所述探针组含有至少一个由多核苷酸和任选的分别与所述多核苷酸的端部连接的一个至两个核苷酸片段和另外一个至5个核苷酸片段组成的探针,所述多核苷酸选自:
由SEQ ID NO:50表示的多核苷酸或其互补链,由SEQ ID NO:51表示的多核苷酸或其互补链,由SEQ ID NO:52表示的多核苷酸或其互补链,由SEQ ID NO:53表示的多核苷酸或其互补链,由SEQ ID NO:54表示的多核苷酸或其互补链,由SEQ ID NO:55表示的多核苷酸或其互补链,由SEQ ID NO:56表示的多核苷酸或其互补链,由SEQ IDNO:57表示的多核苷酸或其互补链,由SEQ ID NO:84表示的多核苷酸或其互补链,由SEQ ID NO:85表示的多核苷酸或其互补链,由SEQID NO:86表示的多核苷酸或其互补链,由SEQ ID NO:87表示的多核苷酸或其互补链,由SEQ ID NO:88表示的多核苷酸或其互补链,由SEQ ID NO:89表示的多核苷酸或其互补链,由SEQ ID NO:90表示的多核苷酸或其互补链,由SEQ ID NO:91表示的多核苷酸或其互补链,由SEQ ID NO:132表示的多核苷酸或其互补链,由SEQ ID NO:133表示的多核苷酸或其互补链,由SEQ ID NO:134表示的多核苷酸或其互补链,由SEQ ID NO:135表示的多核苷酸或其互补链,和由SEQ ID NO:136表示的多核苷酸或其互补链。
6.权利要求5的方法,其中所述引物组包含引物组2,其中FIP引物由SEQ ID NO:5表示的多核苷酸组成,BIP引物由SEQ ID NO:6表示的多核苷酸组成,F3引物由SEQ ID NO:29表示的多核苷酸组成,以及B3引物由SEQ ID NO:30表示的多核苷酸组成,
所述探针包含于探针组中,所述探针组含有来源于抗药性株系的多核苷酸和/或包含来源于非抗药性株系的多核苷酸的探针,所述探针组包含至少一个选自如下的探针:
由SEQ ID NO:92多核苷酸或其互补链表示的探针,由SEQ ID NO:93多核苷酸或其互补链表示的探针,由SEQ ID NO:94多核苷酸或其互补链表示的探针,由SEQ ID NO:95多核苷酸或其互补链表示的探针,由SEQ ID NO:96多核苷酸或其互补链表示的探针,由SEQ ID NO:97多核苷酸或其互补链表示的探针,由SEQ ID NO:98多核苷酸或其互补链表示的探针,由SEQ ID NO:99多核苷酸或其互补链表示的探针,由SEQ ID NO:100多核苷酸或其互补链表示的探针,由SEQ ID NO:101多核苷酸或其互补链表示的探针,由SEQ ID NO:102多核苷酸或其互补链表示的探针,由SEQ ID NO:103多核苷酸或其互补链表示的探针,由SEQ ID NO:104多核苷酸或其互补链表示的探针,由SEQ IDNO:105多核苷酸或其互补链表示的探针,由SEQ ID NO:106多核苷酸或其互补链表示的探针,由SEQ ID NO:107多核苷酸或其互补链表示的探针,由SEQ ID NO:108多核苷酸或其互补链表示的探针,由SEQ ID NO:109多核苷酸或其互补链表示的探针,由SEQ ID NO:110多核苷酸或其互补链表示的探针,由SEQ ID NO:111多核苷酸或其互补链表示的探针,由SEQ ID NO:112多核苷酸或其互补链表示的探针,由SEQ ID NO:113多核苷酸或其互补链表示的探针,由SEQ ID NO:114多核苷酸或其互补链表示的探针,由SEQ ID NO:115多核苷酸或其互补链表示的探针,由SEQ ID NO:116多核苷酸或其互补链表示的探针,由SEQ ID NO:117多核苷酸或其互补链表示的探针,由SEQ ID NO:118多核苷酸或其互补链表示的探针,由SEQ ID NO:119多核苷酸或其互补链表示的探针,由SEQ ID NO:120多核苷酸或其互补链表示的探针,由SEQ ID NO:178多核苷酸或其互补链表示的探针,由SEQ ID NO:179多核苷酸或其互补链表示的探针,由SEQ ID NO:180多核苷酸或其互补链表示的探针,由SEQ ID NO:181多核苷酸或其互补链表示的探针,由SEQ ID NO:182多核苷酸或其互补链表示的探针,由SEQ ID NO:183多核苷酸或其互补链表示的探针,由SEQ ID NO:184多核苷酸或其互补链表示的探针,由SEQ ID NO:185多核苷酸或其互补链表示的探针,由SEQ ID NO:186多核苷酸或其互补链表示的探针,由SEQ ID NO:187多核苷酸或其互补链表示的探针,由SEQ ID NO:188多核苷酸或其互补链表示的探针,由SEQ ID NO:189多核苷酸或其互补链表示的探针,由SEQ ID NO:190多核苷酸或其互补链表示的探针,由SEQ ID NO:191多核苷酸或其互补链表示的探针,由SEQ ID NO:192多核苷酸或其互补链表示的探针,由SEQ ID NO:193多核苷酸或其互补链表示的探针,由SEQ ID NO:194多核苷酸或其互补链表示的探针,由SEQ ID NO:195多核苷酸或其互补链表示的探针,和由SEQ ID NO:196多核苷酸或其互补链表示的探针。
7.用于检测乙型肝炎病毒的抗药性或非抗药性株系的测定试剂盒,其包括:
权利要求1的引物组,和
含有来源于乙型肝炎病毒的抗药性株系的多核苷酸的探针和/或含有来源于乙型肝炎病毒的非抗药性株系的多核苷酸的探针。
8.权利要求7的用于检测乙型肝炎病毒的抗药性的测定试剂盒,所述探针包含于探针组中,所述探针组含有至少一个由多核苷酸和任选的分别与所述多核苷酸的端部连接的一个至两个核苷酸片段和另外一个至5个核苷酸片段组成的探针,所述多核苷酸选自:
由SEQ ID NO:50表示的多核苷酸或其互补链,由SEQ ID NO:51表示的多核苷酸或其互补链,由SEQ ID NO:52表示的多核苷酸或其互补链,由SEQ ID NO:53表示的多核苷酸或其互补链,由SEQ ID NO:54表示的多核苷酸或其互补链,由SEQ ID NO:55表示的多核苷酸或其互补链,由SEQ ID NO:56表示的多核苷酸或其互补链,由SEQ IDNO:57表示的多核苷酸或其互补链,由SEQ ID NO:84表示的多核苷酸或其互补链,由SEQ ID NO:85表示的多核苷酸或其互补链,由SEQID NO:86表示的多核苷酸或其互补链,由SEQ ID NO:87表示的多核苷酸或其互补链,由SEQ ID NO:88表示的多核苷酸或其互补链,由SEQ ID NO:89表示的多核苷酸或其互补链,由SEQ ID NO:90表示的多核苷酸或其互补链,由SEQ ID NO:91表示的多核苷酸或其互补链,由SEQ ID NO:132表示的多核苷酸或其互补链,由SEQ ID NO:133表示的多核苷酸或其互补链,由SEQ ID NO:134表示的多核苷酸或其互补链,由SEQ ID NO:135表示的多核苷酸或其互补链,和由SEQ ID NO:136表示的多核苷酸或其互补链。
9.权利要求1的引物组,其中所述引物组用于检测其基因型为C型的乙型肝炎病毒的抗药性。
10.权利要求3的引物组,其中所述引物组用于检测其基因型为C型的乙型肝炎病毒的抗药性。
11.权利要求6的引物组,其中所述引物组用于检测其基因型为C型的乙型肝炎病毒的抗药性。
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