CN103540686B - 一种检测hbv替比夫定耐药突变的引物、方法和试剂盒 - Google Patents
一种检测hbv替比夫定耐药突变的引物、方法和试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于医学检验领域，具体涉及一种检测HBV替比夫定耐药突变的引物、方法和试剂盒，包括：(i)？外侧特异性扩增引物：SEQ？NO1及SEQ？NO2；(ii)？内侧特异性扩增引物：SEQ？NO3及SEQ？NO4，且可作为Sanger测序的测序引物。本发明方法通过设计特异性扩增引物，采用巢式PCR方式进行扩增，PCR产物经酶纯化及测序反应后获得180和204核苷酸位点信息。此外，本发明的引物可以一次同时检测180和204核苷酸两个突变情况，具有特异性高，准确度高，灵敏度高等特点，适用于替比夫定耐药突变的临床检测。
Description
技术领域
本发明属于医学检验领域，具体涉及一种高敏感性检测HBV替比夫定耐药突变的引物、检测方法和试剂盒。
背景技术
HBV病毒持续复制导致的肝脏炎症坏死是疾病发生和发展的关键因素。我国的《慢性乙型肝炎防治指南》重点强调了抗病毒治疗的重要性：抗病毒治疗是关键，只要有适应症，且条件允许，就应进行规范的抗病毒治疗。
目前抗病毒药物核甘（酸）类似物主要包括拉米夫定、阿德福韦酷、替比夫定（telbivudine,LdT）、恩替卡韦和替诺福韦酷。其中LdT是一种具有强力特异性抑制嗜肝病毒作用的左旋核苷药物，且对HBV复制作用要强于拉米夫定，LdT600mg，l次/d，治疗52周，22%的HBeAg阳性初治患者，获得HBeAg/抗-HBe血清学转换，65%组织学改善，约80%持续应答；对HBeAg阴性的初治患者，88%血清HBVDNA水平降低，67%组织学改善。有研究表明87例接受LdT治疗的患者在治疗2年时，HBVDNA低于可检测水平，且发生了HBeAg/抗-HBe血清学转换的患者继续治疗至3年，所有患者都保持了血清学转换。此外，无论是治疗HBeAg阳性还是HBeAg阴性慢性乙型肝炎，1年时LdT疗效优于LAM，治疗失败比例小，耐药性发生少。
虽然LdT的耐受性良好，其安全性与LAM相当，但是在持续治疗后，其耐药率呈指数级增长。发生耐药主要是由于HBV聚合酶区基因突变，而rtL180M和rtM204I/V是临床治疗中公认可引起LdT耐药的HBV核苷酸突变。目前，对于检测该两个位点的方法包括：PCR-RFLP、LiPA、焦磷酸测序法、Sanger测序法、基因芯片等。
在肝病抗病毒治疗中，从发现疾病、选择合适的治疗方案到确定治疗终点、定期监测、调整用药方案，很大程度都建立在病毒载量的检测结果上。目前，一般检测方法的下限只能检测到500拷贝/毫升甚至1000拷贝/毫升的乙肝病毒，对这个数值以下的病毒载量无法准确检出。如果病毒载量在400拷贝/毫升时，那就会被判断为阴性，但这是“假阴性”，一旦停药，残余的病毒仍有可能复制导致病情复发。这时，准确检测低拷贝病毒载量是确定是否到达治疗终点、是否需要停药或确定患者已经对某种药物产生耐药性需要更换药物的关键期。
但目前PCR检测所使用的引物和检测方法对低拷贝乙肝病毒样本的扩增成功率不高，特异性不强，导致替比夫定药物在乙肝患者抗病毒治疗中，不能及时发现HBV聚合酶区基因已经发生突变，提醒医生患者在使用替比夫定药物治疗过程中，他将会或已经对LdT产生了耐药性，需要更换药物或采用其他治疗方法。若因HBV聚合酶区基因突变产生耐药的情况不能及时被发现，会延误最佳治疗期，导致病情恶化。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种能检测出低拷贝病毒载量的HBV替比夫定耐药突变的引物，包括：
特异性外侧扩增引物：
SEQNO1：GACTCGTGGTGGACTTCTCTC；
SEQNO2：CKTTGACATACTTTCCAATCAA；其中K代表G或T；
特异性内侧扩增引物：
SEQNO3：TCGTGGTGGACTTCTCTCAATT；
SEQNO4：TTCGTTGACATACTTTCCAATCA。
进一步地，包括Sanger测序的测序引物，所述测序引物为：
SEQNO3：TCGTGGTGGACTTCTCTCAATT；
SEQNO4：TTCGTTGACATACTTTCCAATCA。
进一步地，SEQNO1和SEQNO2的使用浓度分别为0.4μl和0.6μl。
进一步地，SEQNO3和SEQNO4的使用浓度分别为1.2μl和1μl。
进一步地，所述HBV替比夫定耐药突变的突变点为rtL180M和rtM204I/V。
本发明还提供一种检测HBV替比夫定耐药突变的方法，包括如下步骤：
（1）以抽提得到的HBVDNA为模板，依据所述的特异性外侧扩增引物SEQNO1、SEQNO2，进行第一轮PCR扩增；
（2）以第一轮PCR扩增产物为模版，依据所述的特异性内侧扩增引物SEQNO3、SEQNO4，进行第二轮PCR扩增；
（3）第二轮PCR产物经酶纯化后，以特异性内侧扩增引物SEQNO3、SEQNO4为测序引物进行Sanger测序。
进一步地，第一轮PCR扩增时，SEQNO1和SEQNO2的使用浓度分别为0.4μl和0.6μl；第二轮PCR扩增时，SEQNO3和SEQNO4的使用浓度分别为1.2μl和1μl。
本发明还提供一种检测HBV替比夫定耐药突变的试剂盒，包括：
(i)DNA提取试剂；
(ii)PCR扩增反应试剂，其包括：
特异性外侧扩增引物：
SEQNO1：GACTCGTGGTGGACTTCTCTC；
SEQNO2：CKTTGACATACTTTCCAATCAA；其中K代表G或T；
特异性内侧扩增引物：
SEQNO3：TCGTGGTGGACTTCTCTCAATT；
SEQNO4：TTCGTTGACATACTTTCCAATCA。
进一步地，还包括测序引物为：
SEQNO3：TCGTGGTGGACTTCTCTCAATT；
SEQNO4：TTCGTTGACATACTTTCCAATCA。
本发明自行设计了扩增HBV180及204这两个位点的内、外侧扩增引物。采用巢式PCR技术，构建了稳定的扩增体系。通过调整内、外侧引物的浓度、退火温度等反应条件，已使扩增效率达到最佳，同时内侧引物也适用于Sanger测序法。本发明具有特异性好、自动化程度高、污染控制好等优点。将反应体系所需的内、外侧引物用量进行合理配比，即第一轮PCR扩增时，引物SEQNO1和SEQNO2的使用浓度分别为0.4μl和0.6μl；第二轮PCR扩增时，引物SEQNO3和SEQNO4的使用浓度分别为1.2μl和1μl，这使反应条件达到最佳，从而省去了繁琐的条件摸索环节，大大提升了实验效率。
因为HBV有多种亚型，不同亚型间的同源性较差，本发明针对同源性较高的区域设计两对特异性扩增引物，因此本发明所述的引物设计不是引物设计软件随机设计的。而采用巢式PCR扩增技术，在增加了扩增特异性的同时，也提高了对低拷贝病毒样本（本发明可检出最低检测下限为200拷贝/毫升）的扩增成功率，且是基因科技（上海）有限公司的HBV耐药突变检测试剂盒及亚能生物的HBV分型及耐药突变基因检测试剂盒（两个公司的最低检测下限均为1000拷贝/毫升）检测灵敏度的5倍。此外，内侧特异性扩增引物同时可作为Sanger测序引物，准确的获得样本180及204位点信息。检测结果也有助于HBV替比夫定耐药突变的临床指导。
附图说明
图1是HBV部分野生型标准序列，其中180和204位点已用方框标记。
图2是采用本发明检测24例样本的巢式PCR。
图3是采用本发明检测6例低病毒载量样本的巢式PCR扩增的电泳结果图。
图4是使用基因科技（上海）有限公司的HBV耐药突变检测试剂盒检测6例低病毒载量样本的电泳结果，均未扩增成功。
图5是使用亚能生物的HBV分型及耐药突变基因检测试剂盒检测6例低病毒载量样本的电泳结果，均未扩增成功。
图6是样本P1323的180及204位点测序结果。结果显示180位点突变为ATG，204突变位点为GTG，即rtL180M、rtM204V。
图7是样本7024的180及204位点测序结果。结果显示180位点突变为ATG，204突变位点为GTG，即rtL180M、rtM204V。
图8是样本7026的180及204位点测序结果。结果显示180位点突变为ATG，204突变位点为ATG，即rtL180M、204位点未突变。
图9是样本7208的180及204位点测序结果。结果显示180及204均为杂合突变，即180位点突变为CTG，204突变位点为ATT，即rtL180M、rtM204I。
图10是样本67的180及204位点测序结果。结果显示180位点突变为CTG，204突变位点为ATG，均未发生突变。
图11是样本P15629的180及204位点测序结果。结果显示180位点突变为TTG，204突变位点为ATT，即180位点未突变、rtM204I。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
实施例1
一种检测HBV替比夫定耐药突变的引物，该引物的设计是针对HBV不同亚型间的同源性较高的区域设计的两对特异性扩增引物，包括：
（i）特异性外侧扩增引物：
SEQNO1：GACTCGTGGTGGACTTCTCTC；
SEQNO2：CKTTGACATACTTTCCAATCAA；其中K代表G或T；
（ii）特异性内侧扩增引物：
SEQNO3：TCGTGGTGGACTTCTCTCAATT；
SEQNO4：TTCGTTGACATACTTTCCAATCA；
其中特异性内侧扩增引物SEQNO3和SEQNO4也同时可作为Sanger测序的测序引物。
利用上述引物检测HBV替比夫定耐药突变的方法包括如下步骤：
（i）提取样本血清中的HBVDNA。
（ii）以HBVDNA为模板，依据所述的特异性外侧扩增引物（SEQNO1、SEQNO2），进行第一轮PCR扩增；
（iii）以第一轮PCR扩增产物为模版，依据所述的特异性内侧扩增引物（SEQNO3、SEQNO4），进行第二轮PCR。
（iv）第二轮PCR产物经酶纯化后，以特异性内侧扩增引物（SEQNO3、SEQNO4）为测序引物进行测序反应，反应产物置于ABI3500测序检测。
（v）结果分析。
优选的方案中，第一轮PCR扩增时，SEQNO1和SEQNO2的使用浓度分别为0.4μl和0.6μl；第二轮PCR扩增时，SEQNO3和SEQNO4的使用浓度分别为1.2μl和1μl。
检测HBV替比夫定耐药突变的试剂盒包括：
(i)DNA提取试剂；
(ii)PCR扩增反应试剂，其包括包括：
特异性外侧扩增引物：
SEQNO1：GACTCGTGGTGGACTTCTCTC；
SEQNO2：CKTTGACATACTTTCCAATCAA；其中K代表G或T；
特异性内侧扩增引物：
SEQNO3：TCGTGGTGGACTTCTCTCAATT；
SEQNO4：TTCGTTGACATACTTTCCAATCA；
(iii)DNA测序试剂，其包括Sanger测序的测序引物为：
SEQNO3：TCGTGGTGGACTTCTCTCAATT；
SEQNO4：TTCGTTGACATACTTTCCAATCA；
通过该检测方法中的引物（SEQNO1、SEQNO2、SEQNO3、SEQNO4）进行样本检测，发现其具有较高的稳定性、特异性、灵敏度；同时使用SEQNO3及SEQNO4作为Sanger测序引物，可获得理想的测序结果。
实施例2：检测方法
1.使用常规的酚/氯仿抽提法提取样本血清中HBVDNA。
2.第一轮PCR扩增方法如下：
一例样本的总PCR体系为10μl：10*PCRBuffer1μl、dNTP1μl、引物SEQNO10.4μl、SEQNO20.6μl、灭菌水5.8μl、Taq酶0.2μl、HBVDNA模板1μl。
第一轮PCR反应程序：
3.第二轮PCR扩增方法如下：
一例样本的总PCR体系为20μl：10*PCRBuffer2μl、dNTP2μl、引物SEQNO31.2μl、SEQNO41μl、灭菌水12.3μl、Taq酶0.5μl、第一轮产物1μl。
第二轮PCR反应程序：
4.PCR产物酶纯化。一例样本的酶纯化体系为11μl：小牛碱性磷酸酶（CIAP）0.1μl，核酸外切酶ExoⅠ0.5μl，灭菌水1.4μl，第二轮PCR产物9μl。
酶纯化反应条件：37℃，50min孵育；95℃，5min变性；4℃保存。
5.样本进行测序反应。一例样本的测序体系为5μl：BigDye1μl、内侧引物SEQNO3或SEQNO41μl、灭菌水2μl、酶纯化产物1μl。
测序反应：
6.测序反应产物进行酒精纯化：向每管中加入2μl的125mMEDTA，涡旋混匀，静置5min；然后加入15μl无水乙醇，13500rpm离心30min；倒置除掉上清，加入50ul冰冻的75%乙醇，13500rpm离心15min；倒置除掉上清，并放置于100℃金属浴上以完全挥发酒精；加入10μl的Hi-Di?Formamide，震荡离心后将产物转至96孔板；95℃5min变性后，将96孔板置于ABI3500进行测序。
7.结果分析，具体为：参考野生型HBV为标准序列，使用SeqMan软件判断样本的180和204位点。
实施例3：样本检测
按实施例1和2的方法检测30例HBV感染样本。结果显示所有样本均扩增成功（见图2-3），且所有样本均成功测序得到180及204位点基因信息（见表1）。
对生物医学领域的一般技术人员来说，可根据测序图谱（附图6至11）来判断检测180及204位点突变信息的新引物是有效的。
表1
| 样本编号 | rtL180M | rtM204I | rtM204V |
| 201 | 无 | 无 | 无 |
| G113 | 有 | 有 | 无 |
| G13 | 有 | 无 | 有 |
| 101 | 有 | 无 | 有 |
| T113 | 无 | 有 | 无 |
| T310 | 有 | 无 | 有 |
| 115 | 有 | 无 | 有 |
| 102 | 无 | 有 | 无 |
| 4 | 有 | 有 | 无 |
| T314 | 无 | 无 | 无 |
| 305 | 无 | 有 | 无 |
| 114 | 有 | 无 | 有 |
| 125 | 无 | 无 | 无 |
| 19 | 有 | 无 | 有 |
| 187 | 有 | 无 | 有 |
| 188 | 无 | 无 | 无 |
| 208 | 有 | 有 | 无 |
| 157 | 有 | 有 | 无 |
| 204 | 有 | 无 | 有 |
| 189 | 有 | 有 | 无 |
| T343 | 无 | 无 | 无 |
| 17 | 有 | 无 | 无 |
| T19 | 有 | 无 | 有 |
| 21 | 有 | 无 | 无 |
| P1323 | 有 | 无 | 有 |
| 7204 | 有 | 无 | 有 |
| 7206 | 有 | 无 | 无 |
| 7208 | 有 | 有 | 无 |
| 67 | 无 | 无 | 无 |
| P15629 | 无 | 有 | 无 |
实施例4：同类试剂盒检测引物灵敏度对比
取实施例2中P1323、7204、7206、7208、67、P15629六例病毒低拷贝样本（病毒拷贝数均在200拷贝/毫升左右）进行对比实验。对比试剂盒为基因科技（上海）有限公司的HBV耐药突变检测试剂盒以及亚能生物的HBV分型及耐药突变基因检测试剂盒。电泳结果见图3至图4。其中图3是采用本发明检测6例低病毒载量样本的巢式PCR扩增的电泳结果图，其表明采用本发明的引物可较理想的扩增出上述6例样本。图4是使用基因科技（上海）有限公司的HBV耐药突变检测试剂盒检测6例低病毒载量样本的电泳结果，其表明未扩增成功。图5是使用亚能生物的HBV分型及耐药突变基因检测试剂盒检测6例低病毒载量样本的电泳结果，其表明未扩增成功。上述扩增结果充分说明本发明的引物具有较好的灵敏度。根据附图6-11所示的检测结果，上述6例样本经本发明的引物扩增的产物均能成功测得180及204位点信息。
序列表
<110>长沙艾迪康医学检验所有限公司
<120>Title:一种检测HBV替比夫定耐药突变的引物、方法和试剂盒
<130>
<160>4
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
gactcgtggtggacttctctc21
<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
ckttgacatactttccaatcaa22
<210>3
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
tcgtggtggacttctctcaatt22
<210>4
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
ttcgttgacatactttccaatca23
序列表
<110>长沙艾迪康医学检验所有限公司
<120>Title:一种检测HBV替比夫定耐药突变的引物、方法和试剂盒
<130>
<160>4
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
gactcgtggtggacttctctc21
<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
ckttgacatactttccaatcaa22
<210>3
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
tcgtggtggacttctctcaatt22
<210>4
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
ttcgttgacatactttccaatca23
Claims (7)
1.一种检测HBV替比夫定耐药突变的引物，其特征在于包括：
特异性外侧扩增引物：
SEQNO1：GACTCGTGGTGGACTTCTCTC；
SEQNO2：CKTTGACATACTTTCCAATCAA；其中K代表G或T；
特异性内侧扩增引物：
SEQNO3：TCGTGGTGGACTTCTCTCAATT；
SEQNO4：TTCGTTGACATACTTTCCAATCA；
所述引物设计在同源性较高的区域。
2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，还包括Sanger测序的测序引物，所述测序引物为：
SEQNO3：TCGTGGTGGACTTCTCTCAATT；
SEQNO4：TTCGTTGACATACTTTCCAATCA。
3.如权利要求1所述的引物，其特征在于，SEQNO1和SEQNO2的使用浓度分别为0.4μl和0.6μl。
4.如权利要求1所述的引物，其特征在于，SEQNO3和SEQNO4的使用浓度分别为1.2μl和1μl。
5.如权利要求1所述的引物，其特征在于，所述HBV替比夫定耐药突变的突变点为rtL180M和rtM204I/V。
6.一种检测HBV替比夫定耐药突变的试剂盒，包括：
(i)DNA提取试剂；
(ii)PCR扩增反应试剂，其包括：
特异性外侧扩增引物：
SEQNO1：GACTCGTGGTGGACTTCTCTC；
SEQNO2：CKTTGACATACTTTCCAATCAA；其中K代表G或T；
特异性内侧扩增引物：
SEQNO3：TCGTGGTGGACTTCTCTCAATT；
SEQNO4：TTCGTTGACATACTTTCCAATCA；
所述引物设计在同源性较高的区域；
测序引物为：
SEQNO3：TCGTGGTGGACTTCTCTCAATT；
SEQNO4：TTCGTTGACATACTTTCCAATCA
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增反应试剂还包括10*PCRBuffer、dNTP、灭菌水和Taq酶。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310456379.2A CN103540686B (zh) | 2013-09-30 | 2013-09-30 | 一种检测hbv替比夫定耐药突变的引物、方法和试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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