CN103849690B - 用于检测人乙型肝炎病毒的引物组和探针 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于特异性检测人乙型肝炎病毒(HBV)的引物组和/或探针。本发明还涉及包含引物组和/或探针的用于特异性检测人乙型肝炎病毒的试剂盒和微阵列。本发明还涉及引物组和/或探针在制备用于特异性检测样品中乙型肝炎病毒的试剂盒和微阵列中的用途。本发明还涉及使用引物组和/或探针检测样品中HBV基因的方法。
Description
技术领域
本发明涉及用于特异性检测人乙型肝炎病毒(HBV)的引物组和/或探针。本发明还涉及包含引物组和/或探针的用于特异性检测人乙型肝炎病毒的试剂盒和微阵列。本发明还涉及引物组和/或探针在制备用于特异性检测样品中乙型肝炎病毒的试剂盒和微阵列中的用途。本发明还涉及使用引物组和/或探针检测样品中HBV基因的方法。
背景技术
慢性乙型肝炎、代偿期和失代偿期肝硬化的5年病死率分别为0%~2%、14%~20%和70%~86%,慢性乙型肝炎所致相关肝脏疾病是HBV感染的主要致死原因,中国每年因HBV感染导致的肝硬化、肝癌死亡达30余万例。因此,要对慢性乙型肝炎应积极进行干预治疗。慢性乙型肝炎的总体治疗目标是:最大限度地长期抑制或消除HBV,以抗病毒治疗最为关键。抗病毒治疗主要通过长期抑制HBV复制来实现上述目标。因此,首先需要通过HBVDNA的定量检测等可靠的实验室诊断来确定慢性乙型肝炎适宜治疗患者及治疗时机,并据此确定合适的治疗方案。
HBVDNA的定量检测除用于慢性乙型肝炎的诊断外,患者外周血中HBVDNA载量也是决定是否进行抗病毒治疗的重要指标,几乎各国慢性乙型肝炎防治指南均推荐依据病毒载量确定是否开始抗病毒治疗。血清HBVDNA定量是确定患者抗病毒治疗适应症的重要指标。
血清HBVDNA水平的下降为判定抗病毒治疗效果的重要依据,是基于应答指导的治疗(response-guidedtherapy)的重要指标。因此,治疗前应有基线水平检测,一旦开始治疗,则应每3~6个月检测一次,动态监测HBVDNA水平的变化。核苷(酸)类似物治疗线路图(roadmap)主要依赖HBVDNA的定量检测确定病毒学应答情况,对判断疗效、预后和耐药发生至关重要,是对治疗方案进行优化和调整的重要依据。
乙肝病毒基因检查的实验室诊断主要依赖于血清特异性抗原抗体(ELISA)检测和乙肝病毒基因(HBV-DNA)检测。ELISA方法一直是临床诊断HBV感染的传统手段,通过检测血清免疫学标志物反映机体HBV感染的免疫状态;该方法简便易行,成功用于乙型肝炎病毒感染的诊断,但是该方法灵敏度不高,也不能定量。而HBV-DNA检测则是采用聚合酶链反应(PCR)技术,特异性扩增乙肝病毒基因组保守区域基因片段,以近于2n的指数(n为循环次数),在数小时内可将极微量的HBV-DNA特定的分子片断扩增至1x107~1x108倍,可检出标本中极微量的核酸,在病毒感染后数天即能检出,可大大缩短“窗口期”,大大提高了HBV的检出率,为临床诊断是否为HBV感染提供了一种强有力的手段,但常规的聚合酶链反应(PCR)技术只是定性检测,可以检测乙型肝炎病毒的有无,不能确定体内病毒载量,不利于乙型肝炎治疗效果评价。而本发明可采用荧光定量PCR技术,其不仅有普通PCR技术的优点,还可以定量检测临床血清和血浆中乙型肝炎病毒核酸(DNA)的浓度。
发明内容
发明要解决的技术问题
目前市场上已有的同类产品已不能满足临床诊断治疗的要求,主要表现在以下几个方面:
(1)灵敏度较低,低于500IU/ml病毒载量很难检测到;
(2)手工操作,低重现性,缺乏质控,非标准化的操作流程极大的影响了病人的治疗效果;
(3)低通量,手动操作时间长,结果报告不及时;
(4)因长期进行抗病毒治疗,产生耐药性,导致假阴性率在不断升高。
为满足临床诊断治疗要求,需要具有灵敏度高、精密度高和假阴性率低的用于检测人HBV的引物、探针以及包含所述引物和探针的试剂盒。
本发明目标在于提供用于能满足上述要求的用于检测人HBV的引物组、探针以及包含所述引物组和探针的试剂盒。本发明的引物组和探针可解决因HBV高突变而产生的漏检问题,并且具有较高的灵敏度及扩增效率。
技术方案
本发明涉及一种用于检测人乙型肝炎病毒(HBV)基因的引物组。在一个实施方案中,所述引物组包括或者是至少一种选自以下的引物组:
(1)引物组1,其包含具有如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列的引物和具有如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列的引物;或者由所述引物组成;和
(2)引物组2,其包含具有如SEQIDNO:4所示的核苷酸序列的引物和具有如SEQIDNO:5所示的核苷酸序列的引物,或者由所述引物组成。
在一个实施方案中,所述引物组包括或者是至少一种选自以下的引物组:
(1)引物组1,其包含核苷酸序列如SEQIDNO:1所示的引物和核苷酸序列如SEQIDNO:2所示的引物;或者由所述引物组成;和
(2)引物组2,其包含核苷酸序列如SEQIDNO:4所示的引物和核苷酸序列如SEQIDNO:5所示的引物,或者由所述引物组成。
在一个实施方案中,本发明的引物组包括或者是:
(1)引物组1,其包含核苷酸序列如SEQIDNO:1所示的引物和核苷酸序列如SEQIDNO:2所示的引物,或者由所述引物组成;和
(2)引物组2,其包含核苷酸序列如SEQIDNO:4所示的引物和核苷酸序列如SEQIDNO:5所示的引物,或者由所述引物组成。
本发明还涉及一种用于检测人HBV基因的探针。在一个实施方案中,探针包括或者是至少一种选自以下的探针:
(1)探针1,其具有如SEQIDNO:3所示的核苷酸序列;和
(2)探针2,其具有如SEQIDNO:6所示的核苷酸序列。
在一个实施方案中,探针包括或者是至少一种选自以下的探针:
(1)探针1,其核苷酸序列如SEQIDNO:3所示;和
(2)探针2,其核苷酸序列如SEQIDNO:6所示。
在一个实施方案中,探针包括或者是:
(1)探针1,其核苷酸序列如SEQIDNO:3所示;和
(2)探针2,其核苷酸序列如SEQIDNO:6所示。
在一个实施方案中,探针通过标记物标记。在一个实施方案中,所述探针的一个末端(例如5'末端或3'末端)通过报告荧光基团标记,并且探针的另一个末端(例如3'末端或5'末端)通过淬灭荧光基团标记。在一个实施方案中,SEQIDNO:3所示的探针1的5'末端由FAM标记并且3'末端由MGB标记。在一个实施方案中,SEQIDNO:6所示的探针2的5'末端由FAM标记并且3'末端由BHQ1标记。
本发明还涉及一种用于检测人HBV基因的试剂盒或微阵列,其含有本发明的引物组。在一个实施方案中,本发明的试剂盒或微阵列包含引物组1。在又一个实施方案中,本发明的试剂盒或微阵列包含引物组2。在再一个实施方案中,本发明的试剂盒或微阵列包含引物组1以及引物组2。
本发明还涉及一种用于检测人HBV基因的试剂盒或微阵列,其含有本发明的探针。在一个实施方案中,本发明的试剂盒或微阵列包含探针1。在又一个实施方案中,本发明的试剂盒或微阵列包含探针2。在再一个实施方案中,本发明的试剂盒或微阵列包含探针1以及探针2。
本发明还涉及一种用于检测人HBV基因的试剂盒或微阵列,其含有本发明的引物组和探针。在一个实施方案中,本发明的试剂盒或微阵列包含引物组1和探针1。在又一个实施方案中,本发明的试剂盒或微阵列包含引物组2和探针2。在再一个实施方案中,本发明的试剂盒或微阵列包含引物组1和探针1以及引物组2和探针2。
本发明还涉及引物组在制备用于检测样品中HBV基因的试剂盒或微阵列中的用途。在一个实施方案中,引物组是至少一种选自以下的引物组:引物组1和引物组2。
本发明还涉及引物组和/或探针在制备用于检测样品中HBV基因的试剂盒或微阵列中的用途。在一个实施方案中,引物组和探针为引物组1和探针1。在另一个实施方案中,引物组和探针为引物组2和探针2。在又一个实施方案中,引物组和探针为引物组1和探针1以及引物组2和探针2。
本发明还涉及检测样品中HBV基因的方法,所述方法包括:
(1)提取和任选纯化样品中的核酸,和
(2)使用引物组进行扩增和/或使用探针进行特异性杂交,以检测所述核酸。
在一个实施方案中,检测样品中HBV基因的方法包括:
(1)提取和任选纯化样品中的核酸,
(2)使用引物组对从步骤(1)中获得的核酸进行扩增,从而得到扩增产物,和
(3)使探针与扩增产物进行特异性杂交,以检测所述核酸。
在一个实施方案中,检测HBV基因可为定性检测或定量检测。在另一个实施方案中,检测为定量检测。在又一个实施方案中,通过PCR法来检测。在再一个实施方案中,检测为通过荧光定量PCR检测。
在一个实施方案中,核酸包括DNA和/或RNA,优选DNA。
在一个实施方案中,通过PCR进行扩增反应。在另一个实施方案中,使用荧光定量PCR法对样品中HBV基因进行定量检测。
在一个实施方案中,检测样品中HBV基因的方法所使用的引物组和/或探针包括引物组1和/或探针1。在另一个实施方案中,检测样品中HBV基因的方法所使用的引物组和探针包括引物组2和/或探针2。在另一个实施方案中,检测样品中HBV基因的方法所使用的引物组和探针包括引物组1和探针1以及引物组2和探针2。
在一个实施方案中,样品可来源于动物受试者,例如人受试者。在一个实施方案中,样品为生物学样品,例如来源于人的生物学样品,包括但不限于体液样品或组织样品。在一个实施方案中,样品可为受试者的体液,包括但不限于血液、血清、血浆、尿液、唾液、分泌液、泪液等,优选血液、血清和血浆,和更优选血液。
在一个实施方案中,样品可不来源于人受试者或者任何其它动物来源,优选为环境样品和工业样品。在又一个实施方案中,检测样品中HBV基因的方法可不用于诊断受试者受到HBV感染,例如可用于检测环境样品和工业样品是否受到HBV污染。
在一个实施方案中,样品经过QIAsymphonySP/AS自动化仪器平台处理以提取并纯化HBV核酸,优选HBVDNA。
引物及探针
本发明的引物组包括引物组1和/或引物组2。本发明的探针包括探针1和/或探针2。
用于检测人HBV基因的本发明引物组和探针的实例分别见表1和2。
表1本发明所用的引物及相应的靶序列
表2本发明所用的探针
探针编号 | 名称 | 探针序列 | SEQ ID NO: |
1 | 探针1 | CCTGGCTCAGTTTAC(Tm值:69.0) | 3 |
2 | 探针2 | TTCCTCTGCATCCTGCTGCTATGCCT(Tm值:68.6) | 6 |
靶序列1对应于引物组1,靶序列2对应于引物组2。探针1可与由引物组1扩增得到的PCR产物特异性杂交。探针2可与由引物组2扩增得到的PCR产物特异性杂交。
本发明的引物和探针的核苷酸序列还包括其修饰形式,只要所述引物的扩增效果或者探针的杂交效果不受到明显的影响即可。所述修饰可以为例如在核苷酸序列中或两端添加一个或多个核苷酸残基、在核苷酸序列中缺失一个或多个核苷酸残基、或者将序列中的一个或多个核苷酸残基替换成另外的核苷酸残基,例如将A替换成T,将C替换成G等。本领域技术人员清楚,所述修饰形成的引物或探针也涵盖在本发明之内、特别是权利要求的保护范围之内。
探针的一个末端(例如5'末端或3'末端)可通过报告荧光基团标记,并且探针的另一个末端(例如3'末端或5'末端)可通过相应的淬灭荧光基团标记。一方面,SEQIDNO:3所示的探针1的5'末端可由FAM标记并且3'末端可由MGB标记。另一方面,SEQIDNO:6所示的探针2的5'末端可由FAM标记并且3'末端可由BHQ1标记。
可以使用例如通用DNA合成仪(例如由AppliedBiosystems制造的394型),经化学方法合成本发明引物组和探针中的各个核苷酸。还可采用本领域众所周知的任何其它方法来合成寡核苷酸,例如引物组和探针。
使用从样品中提取的HBV病毒核酸作为模板,并使用前述引物组对HBV基因进行扩增反应,以获得扩增产物。扩增反应包括但不限于PCR聚合酶反应、NASBA、滚环扩增等,其公开于以下参考文献(在此引作参考)中:Mullis等,美国专利第4,683,195号;第4,965,188号;第4,683,202号;第4,800,159(PCR)号;Gelfand等,美国专利第5,210,015号(用“Taqman”或”Taq”[注册商标]探针进行的实时PCR);Wittwer等,美国专利第6,174,670号;Kacian等,美国专利第5,399,491号(“NASBA”);Lizardi,美国专利第5,854,033号;Aono等,日本专利公开第JP4-262799号(滚环扩增);等等。
优选使用PCR法对HBV基因进行扩增。PCR法本身是本领域众所周知的。术语“PCR”包括该反应的衍生形式,其包括但不限于反转录PCR、实时PCR、嵌套式PCR、多重PCR和荧光定量PCR等。优选使用荧光定量PCR法对HBV基因进行定量检测。
在引物、模板DNA(即HBV基因)和耐热DNA聚合酶存在下,使用与有义链杂交的引物(反向引物)和与反义链杂交的引物(正向引物),通过使退火、延伸和变性步骤的循环重复大约30次~50次(例如45次)来进行PCR。
在本发明的HBV检测中,可使用各种常规的耐热DNA聚合酶进行扩增,包括但不限于FastStartTaqDNA聚合酶(Roche)、ExTaq(注册商标,Takara)、Z-Taq、AccuPrimeTaqDNA聚合酶和HotStarTaqPlusDNA聚合酶。优选使用HotStarTaqPlusDNA聚合酶。
基于引物Tm值选择合适PCR反应条件的方法是本领域众所周知的,本领域普通技术人员可以根据引物长度、GC含量、目标特异性和灵敏度、所使用的聚合酶性质等,选出最佳条件。例如,可使用以下条件进行荧光定量PCR反应:37℃5分钟,95℃5分钟,94℃1分钟,95℃15秒,和55℃15秒(acquiringGreen,Yellow),循环45次。反应体系可为50μL。
可将能够检测HBV的本发明探针与样品中的核酸例如HBV核酸或者由PCR扩增的DNA产物进行特异性杂交反应,从而实现对扩增产物的定量或定性检测。本发明的探针可通过标记物进行标记以方便光学仪器检测,标记物例如包括荧光物质和生物素中的任一种。标记物的实例包括FITC、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、TAMRA、Dabcyl、ROX、TET、罗丹明、德克萨斯红、HEX、CyberGreen、FAM、MGB和BHQ1等。优选的标记物可包括但不限于FAM、MGB和BHQ1等。通过采用光学检测手段,观察源于这类荧光物质的荧光强度,能够以高灵敏度检测被用于荧光标记的各种荧光物质。标记物还可包括报告荧光基团和淬灭荧光基团。报告荧光基团可为例如FAM、HEX或TET;猝灭荧光基团可为例如TAMRA、MGB或BHQ1。
可采用Taqman技术使用本发明的引物组和探针进行PCR检测。TaqMan技术的要点是在普通PCR原有的特异性引物对基础上增加了特异性的荧光双标记探针。该探针同样与病原体核酸特异性结合,而且结合部位位于引物结合区域的中间。探针的5′端和3′端分别标记不同的荧光素,如5′端标记FAM荧光素,它发出的荧光能够被检测仪器接收,称为报告荧光基团(用R表示),3′端一般标记TAMRA荧光素,它在近距离内能吸收5′端报告荧光基团发出的荧光信号,称为淬灭荧光基团(用Q表示)。当PCR反应在退火阶段时,引物对和探针同时与目的基因片段结合,此时探针上R基团发出的荧光信号被Q基团所吸收,仪器检测不到R所发出的荧光信号;当PCR反应进行到延伸阶段时,Taq酶在引物的引导下,以四种核苷酸为底物,根据碱基配对的原则,沿着模板链合成新链;当链的延伸进行到探针结合部位时,受到探针的阻碍而无法继续,此时的Taq酶发挥它的5′→3′外切核酸酶的功能,将探针切成单核苷酸,消除阻碍,与此同时标记在探针上的R基团游离出来,R所发出的荧光再不为Q所吸收而被检测仪所接收;在Taq酶的作用下继续延伸过程合成完整的新链,R和Q基团均游离于溶液中,仪器可继续检测到R所发出的荧光信号。如上所述,PCR进行一个循环,合成了N条新链的同时,就水解了N条探针,亦释放了相应数量的荧光基团。仪器所接收到荧光信号的强度与PCR反应产物的量呈对应关系。随着PCR反应的循环往复,PCR产物呈指数形式增长,荧光信号也相应增长。如果以每一个PCR循环结束时所测得的荧光值为纵坐标,以PCR循环数为横坐标作图,即可得到一条连接每一个循环后荧光值的曲线—称为扩增曲线。当检测标本中含有所要检测病原体的核酸序列时,所得到的曲线呈“S”型;而当标本中不含病原体,则PCR过程不发生,探针不被水解,不产生荧光信号,其扩增曲线为一水平线。PCR扩增信号进入相对稳定对数增长期的最下限,通常设定在S型扩增曲线的增长拐点处附近,称为阈值线(Threshold);而扩增曲线与阈值线交叉点的循环数称为Ct值。样本中病原体的浓度越高,Ct值就越小。以此方法测定未知标本中的病原体核酸,不仅能快速定性,还因为荧光PCR本身先进的荧光信号检测系统和强大的信息处理能力,可以实现对病原体核酸的定量。
样品
本发明所用的样品可以是生物来源、环境来源、医学来源或患者来源的一定量的材料。一方面,它可包括标本或培养物(例如微生物培养物)。另一方面,它也可包括但不限于生物学样品和非生物样品(例如环境样品和工业样品等)。生物学样品可包括采自受试者的材料,其包括但不限于体液样品(例如血液、血清、血浆、唾液、尿液、组织液、精液、分泌液、脓汁和呼吸液(respiratoryfluid)和粘液)和组织样品(例如活组织切片等)。生物学样品可获自人受试者或其它动物。环境样品是指取自例如自然环境、生活环境、工作环境和生产环境等的样品,包括但不限于天然食物、表面物质、土壤、水。工业样品是指取自工业制品的样品,包括但不限于从加工食品和奶制品、加工设备、仪器、装置、器具、一次性用品和非一次性用品中获得的样品。这些实例不能理解为限制适用于本发明的样品类型。
从样品中提取核酸的方法是本领域众所周知的,可用例如苯酚和氯仿进行DNA提取,或者使用市售DNA提取试剂进行提取。例如,可使用柱试剂盒(例如GENERATION(注册商标)CaptureColumnKitGentra)进行提取。
核酸可通过本领域众常规的纯化方法来纯化。本发明优选采用磁珠法核酸纯化技术实现病毒核酸纯化。在磁珠(纯化)法中,加入蛋白酶使病毒裂解并将病毒DNA释放出来,磁珠表面包裹有一层二氧化硅,二氧化硅在高离液剂的条件下特异吸附核酸DNA,接着通过洗涤步骤有效去除二价阳离子和蛋白质等PCR反应抑制物,最后用洗脱液(低盐)将病毒DNA从磁珠上洗脱下来,完成纯化。经过纯化的病毒DNA不含蛋白质、核酸酶和其他杂质,而且回收率高。
本发明可以采用QIAsymphonySP/AS自动化仪器平台进行核酸提取并纯化。
试剂盒
本发明涉及一种用于检测人HBV基因的试剂盒,其含有本发明的引物组或者引物组与探针的组合。本发明还涉及引物组或者引物组与探针的组合在制备用于检测样品中HBV基因的试剂盒中的用途。在一个实施方案中,引物组选自引物组1和引物组2。在一个实施方案中,所述引物组和探针的组合选自至少一种以下组合:引物组1和探针1的组合,和引物组2和探针2的组合。
试剂盒可包含实施本发明方法所用的材料或试剂(包括引物组和探针)。试剂盒可以包括储存反应试剂(例如在合适容器中的引物、探针、酶等)和/或支持材料(例如缓冲液、实施检测的说明书等)。例如,试剂盒可以包括一个或多个含有相应反应试剂和/或支持材料的容器(例如盒子)。这样的内容物可一起或分开递送给既定的接受者。例如,第一个容器可含有用于测定的酶,第二个容器含有引物组、而第三个容器含有探针。所述试剂盒还可含有适合容纳所述试剂或容器的隔室。作为一个实例,试剂盒可含有引物组、探针、PCR反应缓冲液、使用说明书。试剂盒还可含有聚合酶和dTNP等。试剂盒还可含有UNG、用于质控的内标、阳性和阴性对照和HBV假病毒标准品等。试剂盒还可包含用于从样品制备HBVDNA的试剂。本发明试剂盒还可包含除了本发明的引物组和探针之外的其它任何引物组和/或探针,例如能够有效检测人HBV基因的引物组和/或探针。以上实例不能理解为限制适用于本发明的试剂盒及其内容物。
微阵列
本发明涉及一种用于检测人HBV基因的微阵列,其含有本发明的引物组和/或探针。本发明还涉及引物组和/或探针在制备用于检测样品中HBV基因的微阵列中的用途。在一个实施方案中,引物组选自引物组1和引物组2。在一个实施方案中,探针选自探针1和探针2。在一个实施方案中,引物组和探针的组合选自至少一种以下组合:引物组1和探针1的组合,和引物组2和探针2的组合。
微阵列是指具有平坦表面的固相支持体,其具有核酸阵列,阵列中的各个成员包含固定在空间上确定的区域或位点上的寡核苷酸或多核苷酸的相同的拷贝,所述区域或位点不与阵列中的其它成员的区域或位点重叠;也就是说,所述区域或位点在空间上是离散的。此外,空间上确定的杂交位点可为“可寻址的”,因为其位置及其固定化的寡核苷酸的身份是已知或预先确定的(例如在其使用前是已知或预先确定的)。通常寡核苷酸或多核苷酸为单链,并通常由5'-端或3'-端与固相支持体共价连接。微阵列中含有非重叠区的核酸的密度通常大于100/cm2,更优选大于1000/cm2。微阵列技术公开于例如以下参考文献中:Schena编辑的Microarrays:APracticalApproach(IRLPress,Oxford,2000);Southern,CurrentOpin.Chem.Biol.,2:404-410,1998,其全部内容通过引用结合到本文中。
有益效果
本发明提供了假阴性率低、灵敏度高、以及精密度高的用于人HBV基因检测的引物组和探针、包含它们的试剂盒以及检测方法。
附图说明
图1表示本发明试剂盒的最低检测限(LOD),结果显示20IU/ml样品的检出率为96%。
图2表示本发明试剂盒的定量检测限(LOQ),结果显示样品浓度为40IU/ml时,定量准确率达到22/25。
图3表示本发明试剂盒通过荧光定量PCR检测高浓度临床样品的阴性血清稀释液(从20IU/ml至1.10x108IU/ml)的线性范围。
图4表示本发明试剂盒的精密度。通过荧光定量PCR检测了三个浓度的临床样品的阴性血清稀释液(1.0x102IU/ml、2.5x103IU/ml和2.5x105IU/ml),变异系数(CV%)均低于5%。
图5表示本发明试剂盒相比于对照试剂盒通过荧光定量PCR检测354例临床样本的定量相关性。
图6表示本发明试剂盒和对照试剂盒检测354例临床样本中有6例不一致样品的情况下,使用第三方试剂盒(Roche公司生产的COBASAmpliPrep/COBASTaqManHBVTest,version2.0)复核的结果。结果显示本发明试剂盒的结果更接近第三方试剂盒,并且在5号样品中第三方试剂盒未能检测出来的情况下,本发明试剂盒可以检测出来。
图7表示检测HBV基因型A-H标准样品的结果。检测结果均为阳性,表明本发明试剂盒不会漏检所述各种基因型
图8表示检测组合1(图8-1)、检测组合2(图8-2)以及检测组合3(检测组合1+检测组合2)(图8-3)通过荧光定量PCR检测3个浓度的临床样本稀释液(1x102IU/ml、1x103IU/ml和1x104IU/ml)的结果。结果显示,检测组合3比单独的检测组合1和检测组合2的荧光增幅显著更高,并且Ct值明显小于单独的检测组,表明检测组合3更有利于检测和提高灵敏度。图8-4为图8-1、图8-2和图8-3的合并。图中X轴为PCR循环数,Y轴为荧光增幅。
图9表明检测组合1、检测组合2和检测组合3通过荧光定量PCR检测标准品的阴性血浆稀释液(10、20、30、100和200IU/ml)的检测结果。结果显示检测组合3的检测限相对于单独的检测组合1或2的检测限更低,因此灵敏度更高。
本发明的目的、特征及优点将结合实施例,参照附图作进一步详细阐述。应当理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,0989)中所述的条件,或者试剂盒生产厂家推荐的方法。
实施例
实施例1
材料
1.试剂盒
1.1本发明试剂盒包含以下组分:HBVHSPCR溶液、HotstarTaqplus聚合酶(5U/μl)和UNG(1U/μl))。
HBVHSPCR溶液包含以下组分:超纯水、MultiplexVirusPCR缓冲液20x、Q-solution5x、25mmol/LMgCl2、100mmol/LdATP、100mmol/LdCTP、100mmol/LdGTP、100mmol/LdUTP、引物组1(正向引物1和反向引物1)、探针1(探针1)、引物组2(正向引物2和反向引物2)和探针2(探针2)。
1.2对照试剂盒
对照试剂盒为凯杰生物工程(深圳)有限公司生产的“乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法)”(商品名称:careHBVPCRASSAY;批准文号:国食药监械(准)字2009第3401037)。
1.3第三方试剂盒
第三方试剂盒为Roche公司生产的COBASAmpliPrep/COBASTaqManHBVTest,version2.0。
2.HBV标准品及样本
2.1WHO定量标准品
用HBV假病毒(HBVarmoredDNA)(WHO标准品,2ndWHOInternationalStandardforHepatitisBVirusDNA;NIBSCcode:97/750)制备。首先标定浓度,然后使用市售阴性且外观澄清的血浆稀释至合适浓度。检测定量标准品3次,计算每一标准品标示浓度的对数值,以浓度的对数值为Yi,Ct均值为Xi,进行线性拟合并计算线性相关系数,线性相关系数应|r|值≥0.98。
2.2L0标准品
中国食品药品检定研究院HBV核酸国家参考品(批号0711)中的L0,使用市售阴性且外观澄清的血浆稀释至合适浓度。
2.3B/C/D基因型样本
SeraCareLifeSciences的WorldwideHBVDNAperformancePanel(LotNumber:121977)中的B/C/D基因型样本,使用市售阴性且外观澄清的血浆稀释至合适浓度。
2.4A-H基因型样本
SeraCareLifeSciences的WorldwideHBVDNAperformancePanel(LotNumber:121977)中HBV的A-H基因型样本。
3.HBV对照
3.1HBVHS阴性对照
市售阴性(HBV-DNA=0IU/ml)且外观澄清的血浆。
3.2HBVHS强阳性对照
用HBV假病毒(HBVarmoredDNA)(WHO标准品,2ndWHOInternationalStandardforHepatitisBVirusDNA;NIBSCcode:97/750),使用市售阴性且外观澄清的血浆稀释至浓度为HBV-DNA=3.16x105-3.16x106U/mL。
3.3HBVHS临界阳性对照
用HBV假病毒(WHO标准品,2ndWHOInternationalStandardforHepatitisBVirusDNA;NIBSCcode:97/750),使用市售阴性且外观澄清的血浆稀释至浓度为HBV-DNA=3.16x103-2.85x104U/mL。
4.DNA样品制备试剂
样本提取纯化采用QIAGEN的EnzymeRackVirus/Bact.Mini,G(货号:1054137)、ReagentRackVirus/Bact.Mini(96),G(货号:1054128)进行制备。
方法
1.HBVDNA样品的制备
通过以下步骤制备临床样本、阴性对照、临界阳性对照、强阳性对照和定量标准品的DNA样品:
1)在样本处理反应管内加入30μL蛋白酶PK。
2)在样本处理反应管加入140μL裂解液QSL2。
3)在样本处理反应管加入120μLIC-载体RNA–AVE混合物,配置方法如下,准备IC-载体RNA–AVE混合物,每个样本提取所需IC-载体RNA–AVE混合物配制如下表3:
表3
载体RNA(μL) | 内标IC(μL) | AVE(μL) | 总体积(μL) |
2.5 | 9 | 108.5 | 120 |
4)然后在样本处理反应管加入200μl待测样本(阴性对照、临界阳性对照、强阳性对照、定量标准品当做样本同时进行提取),充分混匀。
5)56℃温浴15分钟。
6)在样本处理反应管加入370μL裂解液QSB1。
7)在样本处理反应管加入25μL磁珠MBS,充分混匀,室温静置5分钟。
8)将样本处理反应管放入磁分离器(适配样本处理管1),丢弃上清液,留下磁珠;然后加入450μL洗液QSW1。
9)从磁分离器上取下样本处理管,充分混匀2分钟。
10)将样本处理反应管放入磁分离器,丢弃上清液,留下磁珠;然后加入450μL洗液QSW5。
11)从磁分离器上取下样本处理管,充分混匀2分钟。
12)将样本处理反应管放入磁分离器,丢弃上清液,留下磁珠;然后加入650μL洗液QSW2。
13)从磁分离器上取下样本处理管,充分混匀2分钟。
14)将样本处理反应管放入磁分离器,丢弃上清液,留下磁珠;然后加入300μL洗液QSW2。
15)从磁分离器上取下样本处理管,充分混匀2分钟。
16)将样本处理反应管放入磁分离器,丢弃上清液,留下磁珠。
17)从磁分离器上取下样本处理管,打开盖子,56℃静置3分钟,以彻底去除残留的液体。
18)加入90μL洗脱液AVE,充分混匀2分钟。
19)将样本处理反应管放入磁分离器,吸走上清液,做好标记。得到的DNA样品在4℃保存备用。
2.荧光定量PCR反应
在使用本发明试剂盒进行的荧光定量PCR反应中,使用以下引物和探针:
正向引物1TGGGCCTCAGTCCGTTTC
反向引物1:CCTACGAACCACTGAACAAATGG
探针1:CCTGGCTCAGTTTAC(标记:5'FAM,3'MGB)
正向引物2:TGTCCTGGCTATCGCTGGATGTGT
反向引物2:AGAGGACAAACGGGCAACATACCT
探针2:TTCCTCTGCATCCTGCTGCTATGCCT(标记:5'FAM,3'BHQ1)。
反应条件如下:37℃:5分钟;95℃:5分钟;94℃:1分钟;95℃:15秒,55℃:15秒(acquiringGreen,Yellow),45个循环。反应体系为50μL。
按照下表4配制荧光定量PCR反应液(HBVHSPCR溶液):
表4
按照下表5配制荧光定量PCR扩增试剂:
表5
荧光定量PCR反应液 | HS-Taq plus酶 | UNG酶 |
19.3 μL | 0.7 μL | 0.06 μL |
对于对照试剂盒和第三方试剂盒,荧光定量PCR反应分别按照各自产品说明书中的试剂、条件和步骤进行。
实施例2—本发明试剂盒的最低检测限(LOD)
使用实施例1中所述的WHO定量标准品,用阴性血浆稀释至200、100、30、20、10IU/ml(IU/ml表示每毫升所含病毒的量)。通过实施例1中所述的方法制备标准品的HBVDNA。使用本发明试剂盒,通过荧光定量PCR反应对每个浓度梯度重复检测25次。确定在各标准品浓度下本发明试剂盒的检出率,从而确定最低检测限。结果如图1所示,显示20IU/ml样品的检出率可达96%。
实施例3—本发明试剂盒的定量检测限(LOQ)
使用实施例1中所述的WHO定量标准品、L0标准品以及B/C/D基因型标准品,分别用阴性血浆稀释至40和20IU/ml。通过实施例1中所述的方法制备所述标准品的HBVDNA。使用3个批次的本发明试剂盒,通过荧光定量PCR反应对每个浓度梯度重复检测25次。
依照以下标准判定本发明试剂盒的定量检测限(LOQ):计算定量结果的对数值,统计各样本浓度下定量结果的对数值在理论值的±0.5log10范围内的比例(定量准确率),比例要大于或等于22/25。
实验结果如图2所示,在各标准品的浓度为40IU/ml下,本发明试剂盒的定量准确率大于或等于22/25。
实施例4—本发明试剂盒的线性范围
取高浓度血清临床样本(经过注册试剂盒(乙型肝炎病毒(HBV)核酸扩增(PCR)荧光定量检测试剂盒国食药监械(准)字2009第3401037)确定为阳性样品并定量),用阴性血浆进行梯度稀释(从1.10x108IU/ml至20IU/ml)。通过实施例1中所述的方法制备各浓度样本的HBVDNA。使用本发明试剂盒进行荧光定量PCR定量检测所述DNA样品。
通过以下标准判定线性范围:首先判断检测结果的准确度,计算每一浓度绝对偏差(B):B=M-T(M为测试结果值,T为该浓度标示值),若每个浓度的绝对偏差(B)不超过正负0.5log值,则此浓度样本的准确度符合要求,可用于线性范围的分析。然后计算每一浓度标示值的对数值和Ct值,以浓度标示值的对数值为Yi,Ct值为Xi,进行线性拟合,计算其线性相关系数r,若│r│≥0.980,则该系列浓度处于线性范围之内。
检测结果如表6所示。
表6
将表6的数据拟合,得到图3所示的本发明试剂盒的线性范围。
实施例5—本发明试剂盒的精密度
将高浓度血清临床样本(经过注册试剂盒(乙型肝炎病毒(HBV)核酸扩增(PCR)荧光定量检测试剂盒国食药监械(准)字2009第3401037)确定为阳性样品并定量)用阴性血浆稀释至3个不同的浓度:2.5x105IU/mL、2.5x103IU/mL、1.0x102IU/mL。通过实施例1中所述的方法制备各浓度样本的HBVDNA。使用本发明试剂盒,通过荧光定量PCR反应对每个浓度的DNA样品进行定量检测。每个浓度DNA样品分别用3批本发明试剂盒重复检测80次,计算每批的定量检测结果log值的平均值。
通过以下标准判定精密度:以同一浓度样品的定量检测结果的对数值计算变异系数(CV,%)(CV=STD/平均值x100%,即分别计算定量检测结果对数值的标准偏差和平均值,然后用标准偏差除以平均值得到变异系数),同一批次试剂盒的检测结果用于计算批内精密度。要求CV小于5%。
结果如图4所示。通过本发明试剂盒检测的三个浓度的临床样品的变异系数(CV%)均低于5%。
实施例6—本发明试剂盒与对照试剂盒的效果比较
1.定量相关性
分别用本发明试剂盒和实施例1的对照试剂盒检测354例临床样本(血清样品),比较这两种试剂盒定量测定结果的log值。从临床样品制备HBVDNA的方法以及荧光定量PCR方法如实施例1中所述。
存在以下两种情况的样本表明所述两种试剂盒的检测结果不一致,需要用第三方试剂盒(Roche公司生产的COBASAmpliPrep/COBASTaqManHBVTest,version2.0)复核,并以复核结果为准:(1)本发明试剂盒与对照试剂盒的阴阳性检测结果不相符;(2)这些两种试剂盒定量检测结果的log值差值大于1。
以对照试剂盒检测值(如果有Roche试剂盒复核结果,则用Roche试剂盒检测结果)的对数值为Xi,本发明试剂盒检测值的对数值为Yi,进行线性拟合,计算其线性相关系数。
结果如图5所示。从该图中可以看出本发明试剂盒与对照试剂盒之间的相关性较好。
2.结果不一致的样本的复核
在上述354例临床样本中,有6个存在本发明试剂盒和对照试剂盒检测结果不一致的情况。经过第三方试剂盒复核,发现在这6个不一致的样本中,本发明试剂盒的检测结果与第三方试剂盒的检测结果更相近。详细结果参见图6。
此外,值得留意的是,在第5号样品中,第三方试剂盒未能检测出来,而本发明试剂盒则可以检测到病毒的存在。
实施例7—本发明试剂盒检测各种HBV基因型
使用如实施例1所述的A-H基因型样本,按照该实施例中描述的方法制备HBVDNA样品并且使用本发明试剂盒进行荧光定量PCR检测。对于每一种不同的样本,检测3个不同样品批次。如图6所示,检测结果均为阳性,表明本发明试剂盒不会漏检HBV基因型A-H。
实施例8—本发明两组引物探针合并与单独一组的效果比较
将高浓度血清临床样本(用注册试剂盒(乙型肝炎病毒(HBV)核酸扩增(PCR)荧光定量检测试剂盒国食药监械(准)字2009第3401037)确定为阳性并定量)稀释3个不同浓度:1x104IU/ml、1x103IU/ml和1x102IU/ml,按照实施例1中所述的方法对其制备HBVDNA样品。分别用表7中的检测组合1-3对各浓度样本的DNA进行荧光定量PCR检测。
表7
检测组合1的结果如图8-1所示,检测组合2的结果如图8-2所示,和检测组合3的结果如图8-3所示。图8-4为这三个检测结果的合并图。
从图8-4可以看出,与单独的检测组合1和2相比,检测组合3的荧光增幅更高,Ct值更小。Ct值为每个反应管内的荧光信号达到所设定的阈值(阈值既是图中绿色横线)时,所经历的反应循环数。同样扩增条件下,扩增不同样本,Ct值越小代表达到所设定的阈值的循环数越少,说明样本浓度越高。
以上结果表明检测组合3更有利于检测和提高灵敏度。
取WHO标准品,用阴性血浆稀释至5个不同浓度200、100、30、20、10IU/ml。使用实施例1所述的方法制备HBVDNA样品,并且分别使用检测组合1-3按照该实施例的方法进行荧光定量PCR检测。每个浓度梯度重复检测25次。如图9所示,与单独的检测组合1和2相比,检测组合3的灵敏度明显更高。
本领域技术人员应该明白,本文所述发明除明确阐述的内容外,还容允变化和修改,特别是等同的变化和修改。应该理解,所有这样的变化和修改均落入本发明,特别是权利要求中所限定的保护范围内。
Claims (21)
1.一种用于检测人乙型肝炎病毒HBV基因的引物组,所述引物组包括:
(1)引物组1,其包含具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO:2所示的核苷酸序列的引物;和
(2)引物组2,其包含具有SEQIDNO:4所示的核苷酸序列的引物和具有SEQIDNO:5所示的核苷酸序列的引物。
2.一种用于检测人HBV基因的试剂盒或微阵列,其包含权利要求1的引物组,和用于检测人HBV基因的探针,所述探针包括:
(1)探针1,其具有如SEQIDNO:3所示的核苷酸序列;和
(2)探针2,其具有如SEQIDNO:6所示的核苷酸序列。
3.权利要求2的试剂盒或微阵列,其中所述探针通过标记物来标记。
4.权利要求2或3的试剂盒或微阵列,其中所述探针的一个末端通过报告荧光基团标记,并且探针的另一个末端通过淬灭荧光基团标记。
5.权利要求4的试剂盒或微阵列,其中所述探针的5'末端通过报告荧光基团标记,并且探针的3'末端通过淬灭荧光基团标记。
6.权利要求5的试剂盒或微阵列,其中所述报告荧光基团为FAM,并且所述淬灭荧光基团为MGB或BHQ1。
7.权利要求1的引物组在制备用于检测样品中HBV基因的试剂盒或微阵列中的用途。
8.权利要求1的引物组和用于检测人HBV基因的探针在制备用于检测样品中HBV基因的试剂盒或微阵列中的用途,所述探针包括:
(1)探针1,其具有如SEQIDNO:3所示的核苷酸序列;和
(2)探针2,其具有如SEQIDNO:6所示的核苷酸序列。
9.权利要求7或8的用途,其中所述样品选自生物学样品、环境样品和工业样品。
10.权利要求7或8的用途,其中所述样品为体液样品或组织样品。
11.权利要求7或8的用途,其中所述样品选自血液、血清、血浆、尿液和分泌液。
12.权利要求7或8的用途,其中所述样品选自唾液和泪液。
13.权利要求7或8的用途,其中所述检测是PCR检测。
14.权利要求13的用途,其中所述检测是荧光定量PCR检测。
15.检测样品中HBV基因的方法,所述方法包括:
(1)提取和任选纯化样品中的核酸,和
(2)使用权利要求1的引物组进行扩增,以检测所述核酸,
其中所述方法不用于诊断受试者受到HBV感染。
16.权利要求15的方法,所述方法还包括在步骤(2)中使用用于检测人HBV基因的探针进行特异性杂交,其中所述探针包括:
探针1,其具有如SEQIDNO:3所示的核苷酸序列;和
探针2,其具有如SEQIDNO:6所示的核苷酸序列。
17.检测样品中HBV基因的方法,所述方法包括:
(1)提取和任选纯化样品中的核酸,
(2)使用权利要求1的引物组对从步骤(1)中获得的核酸进行扩增,从而得到扩增产物,和
(3)使用于检测人HBV基因的探针与扩增产物进行特异性杂交,以检测所述核酸,其中所述探针包括:
探针1,其具有如SEQIDNO:3所示的核苷酸序列;和
探针2,其具有如SEQIDNO:6所示的核苷酸序列,
其中所述方法不用于诊断受试者受到HBV感染。
18.权利要求15-17中任一项的方法,其中所述核酸为DNA或RNA。
19.权利要求15-17中任一项的方法,其中所述检测是PCR检测。
20.权利要求15或16的方法,其中所述检测是荧光定量PCR检测。
21.权利要求16-17中任一项的方法,其中所述样品选自环境样品和工业样品。
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