TW202043485A - 基於使用單核苷酸多型性標籤序列之單一檢測探針檢測多個目標的方法 - Google Patents

基於使用單核苷酸多型性標籤序列之單一檢測探針檢測多個目標的方法 Download PDF

Info

Publication number
TW202043485A
TW202043485A TW109102608A TW109102608A TW202043485A TW 202043485 A TW202043485 A TW 202043485A TW 109102608 A TW109102608 A TW 109102608A TW 109102608 A TW109102608 A TW 109102608A TW 202043485 A TW202043485 A TW 202043485A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
primer
detection probe
target genes
value
nucleic acid
Prior art date
Application number
TW109102608A
Other languages
English (en)
Other versions
TWI795626B (zh
Inventor
李施錫
梁銀珠
金敬卓
田美香
朴希卿
Original Assignee
南韓商海陽生物材料有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 南韓商海陽生物材料有限公司 filed Critical 南韓商海陽生物材料有限公司
Publication of TW202043485A publication Critical patent/TW202043485A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI795626B publication Critical patent/TWI795626B/zh

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1065—Preparation or screening of tagged libraries, e.g. tagged microorganisms by STM-mutagenesis, tagged polynucleotides, gene tags
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1096—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA cDNA Synthesis; Subtracted cDNA library construction, e.g. RT, RT-PCR
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6818—Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2527/00—Reactions demanding special reaction conditions
    • C12Q2527/107—Temperature of melting, i.e. Tm
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2537/00—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature
    • C12Q2537/10—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature the purpose or use of
    • C12Q2537/143—Multiplexing, i.e. use of multiple primers or probes in a single reaction, usually for simultaneously analyse of multiple analysis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2537/00—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature
    • C12Q2537/10—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature the purpose or use of
    • C12Q2537/165—Mathematical modelling, e.g. logarithm, ratio
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2561/00—Nucleic acid detection characterised by assay method
    • C12Q2561/113—Real time assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/107—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties fluorescence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6432—Quenching

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Geophysics And Detection Of Objects (AREA)

Abstract

本發明係關於基於單一檢測探針檢測多個目標的方法，尤其係關於透過以下來檢測多個目標的方法：使用包含含有SNP之標籤序列的引子擴增各目標，使用能夠結合所有標籤序列的單一檢測探針與擴增產物雜交，此標籤序列被設計成使得解鏈溫度彼此不同，並分析解鏈曲線。根據發明之檢測多種目標的方法，能夠使用單一探針檢測多個目標，由於假陽性減少且可以高靈敏度快速檢測多個目標，因此有利於檢測多個目標。

Description

基於使用單核苷酸多型性標籤序列之單一檢測探針檢測多個目標的方法
本發明係關於基於單一檢測探針檢測多個目標的方法，尤其係關於透過使用包含標籤序列的引子擴增各目標來檢測多個目標的方法，此標籤序列被設計成使得擴增產物與檢測探針之雜交反應產物的解鏈溫度彼此不同，接著使用會結合所有標籤序列的單一檢測探針與目標雜交並分析解鏈曲線。
特定核酸的診斷領域用於區分單核苷酸多型性（single-nucleotide polymorphisms，SNPs）、偵測並辨識病原菌以及診斷基因疾病。因此，現已提出許多用於快速且精確檢測特定核酸的方法，並且許多相關的研究目前正在進行中（W. Shenet al. , 2013, Biosen. and Bioele., 42:165-172.; M.L. Erminiet al. , 2014, Biosen. and Bioele., 61:28-37.; K. Changet al. , 2015, Biosen. and Bioele., 66:297-307.）。
具體而言，最常用於檢測特定核酸的方法包含使用聚合酶連鎖反應（polymerase chain reaction，PCR）之方法、使用即時聚合酶連鎖反應（Real-time PCR，即時PCR）及多重聚合酶連鎖反應（multiplex PCR，多重PCR）之方法。
就能結合模版DNA且能夠僅對透過連接有螢光物質及淬滅體（quencher）之引子或探針的設計來檢測之基因的目標區域進行精確的擴增而言，PCR為有利的。然而，在一個反應中僅能擴增一種核酸，因此當要擴增的核酸的數量為大量時，需要重複相同的操作，這將會相當繁瑣。
即時PCR可即時量測擴增產物、減少交叉污染並能進行更精確的定量分析。作為與即時PCR相關的習知專利文件，有美國專利第5,210,015、5,538,848及6,326,145號。
就同時進行擴增及檢測的勻相分析方法（homogeneous assay method）而言，現有的即時PCR為有利的，但卻具有多重性的問題，由於螢光報導分子的類型限制，故能同時檢測之目標核酸序列的數量受限，這是實現高通量所面臨的最大障礙。現有能夠即時檢測目標核酸序列的熱循環儀（thermocycler）最多能同時檢測5個核酸序列，因此能同時被檢測之目標核酸序列的數量受限，且需要大量時間及額外且昂貴的即時監控設備以分析大體積的樣品。
作為代表性的即時PCR方法，TaqMan探針方法（美國專利第5,210,015號）及自淬滅螢光探針（self-quenching fluorescence probe）方法（美國專利第5,723,591號）由於雙重標記探針（dual-labeled probe）的非專一性結合，而有假陽性發生的問題，因此實際上難以進行5重反應，且操作上需要專業技術及知識。由於習知的即時PCR方法同時進行擴增及檢測，在即時PCR設備的高通量方面有限制。
多重PCR的優勢在於在單一管中可進行多個聚合酶連鎖反應，從而同時分析多個核酸。然而，由於在單一管中同時使用許多引子或探針，會發生探針與引子間或引子與引子間的交叉反應，因此一次可擴增的核酸的數量受限，且需要大量精力與時間來確定反應條件，就靈敏度及專一性而言無法獲得好的結果（Hardenbolet al ., 2003, Nat. Biotechnol., 21:673.）。
此外，由於一個待檢測之核酸僅能以一個螢光物質標記，且目前用於檢測螢光物質的設備受限於能一次同時進行分析的螢光頻道的數量通常限於4個至7個類型，故有問題在於必須重複二或多次相同的操作以分析8個或更多個核酸。
因此，以最近積極進行研究已能夠在不使用多重聚合酶連鎖反應的情況下透過使用常用的引子以同時擴增多個核酸來進行大量分析。代表性的技術包含SNPlex、Goldengate分析、分子倒置探針（molecular inversion probe，MIP）等。
SNPlex為一種方法，其包含在寡核苷酸連接分析（oligonucleotide ligation assay，OLA）後使用外切酶進行純化過程，以及使用位於探針相對兩端之常見的引子鹼基序列進行聚合酶連鎖反應擴增，最後使用包含於探針之ZipCode鹼基序列在DNA晶片上進行分析（Tobleret al. , J. Biomol. Tech., 16:398, 2005）。
Goldengate分析為一種方法，其中使用上游探針對固定於固體表面的基因組DNA進行等位基因特異性（allele-specific）的引子延長反應，之後以下游探針連接DNA並洗去未連接於DNA的探針，如同SNPlex的情況，使用包含於探針之常用的引子核苷酸序列擴增DNA，並使用Illumina BeadChip分析擴增的PCR產物（Shenet al. , Mutat. Res., 573:70, 2005）。
分子倒置探針為一種方法，其中使用扣鎖探針（padlock probe）進行缺口連接（gap ligation），之後使用外切酶移除未連接DNA的探針及基因組DNA，並使用尿嘧啶-N-醣苷酶（uracil-N-glycosylase）使扣鎖探針線性化，接著使用包含於探針之常用的引子核苷酸序列進行聚合酶連鎖反應，並與GenFlex標籤陣列（GenFlex tag array，Affymetrix）雜交以分析多種基因區域（Hardenbolet al. , Nat. Biotechnol., 21:673,2003）。
然而，這些方法的問題在於由於第一管中部分反應產物被轉移並於第二管中反應或者需要使用多種酶，故會發生樣品間的交叉汙染且實驗方法複雜。
因此，作為努力解決上述問題並發展使用單一探針檢測多個目標之方法的結果，本發明之發明人證實當透過以下方法時，可以高靈敏度與高精確度檢測多個目標，進而完成本發明，此方法如下：使用包含標籤序列的引子擴增多個目標，此標籤序列被設計成使得擴增產物與檢測探針之雜交產物的解鏈溫度（melting temperature）彼此不同，使用會結合所有標籤序列的單一檢測探針與目標雜交，接著分析解鏈曲線（melting curve）。
鑒於上述問題提出本發明，本發明的目的在於提供一種檢測多個目標的方法。
本發明另一目的在於提供用於檢測多個目標的PCR組成物。
本發明還有一目的在於提供分析多個目標基因之表現程度的方法。
根據本發明一方面，透過提供一種檢測多個目標的方法可實現上述及其他目的，此方法包含：a）從包含多個目標的一樣品獲得DNA；b）使用能夠分別擴增n個目標核酸的n個引子組擴增多個目標核酸以產生n個擴增產物（其中n為2至20的整數）；c）使用能夠與n個擴增產物雜交的單一檢測探針與n個擴增產物雜交；以及d）分析於步驟c）中雜交所得之各n個雜交反應產物的解鏈曲線以確定該些目標核酸存在或不存在，其中各n個引子組包含一正向引子及一反向引子，該反向引子包含一標籤序列，其中該標籤序列被設計成使得n個雜交反應產物的解鏈溫度彼此不同。
根據本發明另一方面，提供一種用於檢測多個目標的PCR組成物，該PCR組成物包含：i）能夠分別擴增n個目標的n個引子組；以及ii）能夠與使用n個引子組擴增所得之n個擴增產物雜交的一檢測探針（其中n為2至20的整數），其中各n個引子組由一正向引子及一反向引子組成，該反向引子包含一標籤序列，其中該標籤序列被設計成使得n個雜交反應產物的解鏈溫度彼此不同。
根據本發明另一方面，提供一種分析多個目標基因之表現程度的方法，包含：a）從包含多個目標的一樣品獲得cDNA文庫；b）使用能夠擴增一參考基因的一引子組與能夠分別擴增n個目標基因的n個引子組擴增該參考基因與多個目標基因以產生多個擴增產物（其中n為2至20的整數）；c）使用能夠與該些擴增產物雜交的一檢測探針與該些擴增產物雜交，該些擴增產物包含所有參考基因的擴增產物及n個目標基因的n個擴增產物；d）分析於步驟c）中雜交所得之雜交反應產物的解鏈曲線；以及e）在可同時檢測到該參考基因與該些目標基因的解鏈溫度下，以及在僅可檢測到該些目標基因的解鏈溫度下，比較並分析Ct值，其中各n個引子組由一正向引子及一反向引子組成，該反向引子包含一標籤序列，其中該標籤序列被設計成使得n個雜交反應產物的解鏈溫度彼此不同。
除非另有定義，否則本文所使用之技術及科學術語與本發明所屬領域中具有通常知識者通常理解的意義相同。一般而言，本文所使用之命名法及於下所述之實驗方法為本領域已知且常用。
本發明用以確認當透過以下方法時，可使用單一探針檢測多個目標，此方法如下：使用包含標籤序列的引子組擴增目標，此標籤序列被設計成使得擴增產物與檢測探針之雜交產物的解鏈溫度（melting temperature）彼此不同，使用會結合所有標籤序列的單一探針與擴增產物雜交，接著分析解鏈曲線（melting curve）。
也就是說，在本發明一實施例中，當透過以下方法時，確認可以高靈敏度檢測各病毒及細菌（參見圖1至3），此方法如下：將能夠擴增以下病毒及細菌的各引子組分別與用於各病毒及細菌之不同的標籤序列融合（fused），接著產生擴增產物並且將擴增產物與第一檢測探針及第二檢測探針雜交，之後分析解鏈曲線，其中病毒為引起腦膜炎之6種病毒（HSV-1、HSV-2、VZV、CMV、EBV及HHV-6），細菌為引起腦膜炎之5種細菌（肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae ）、流感嗜血桿菌（Haemophilus influenza ）、李斯特單胞菌（Listeria monocytogenes ）、B組鏈球菌（Group B Streptococcus ）及腦膜炎球菌（Neisseria meningitides ）），第一檢測探針能夠結合6種病毒的所有標籤序列，第二檢測探針能夠結合5種細菌的所有標籤序列。
因此，本發明一實施例係關於一種檢測多個目標的方法，包含： a）從包含多個目標的樣品獲得DNA；b）使用能夠分別擴增n個目標核酸的n個引子組擴增多個目標核酸以產生n個擴增產物（其中n為2至20的整數）；c）使用能夠與n個擴增產物雜交的單一檢測探針與n個擴增產物雜交；以及d）分析於步驟c）中雜交所得之各n個雜交反應產物的一解鏈曲線以確定目標核酸存在或不存在，其中各n個引子組包含正向引子及反向引子，反向引子包含標籤序列，標籤序列被設計成使得n個雜交反應產物的解鏈溫度彼此不同。
本文所使用「目標」之用語係指要檢測之所有種類的核酸，包含源自不同物種、亞種或變體的染色體核苷酸序列及相同物種內的染色體突變。目標可包含所有類型的DNA或所有類型的RNA，DNA包含基因組DNA、粒線體DNA及病毒DNA，RNA包含mRNA、miRNA、核醣體RNA、非編碼RNA、tRNA及病毒RNA，但本發明不限於此。
在本發明中，所述目標可為但不限於在核苷酸序列中包含突變的突變核苷酸序列，突變可選自由單核苷酸多型性（single-nucleotide polymorphism，SNP）、插入突變、缺失突變、點突變、融合突變、易位突變（translocation）、倒位突變（inversion）及失異合性（loss of heterozygosity，LOH）組成之群組，但本發明不限於此。
在本發明中，所述目標可為但不限於能夠檢測特定細菌或病毒的核酸。
本文所使用「核苷（nucleoside）」之用語係指核酸鹼基（核鹼基）連接至醣基的醣苷胺（glycosylamine）化合物。「核苷酸（nucleotide）」係指磷酸核苷（nucleoside phosphate）。如表1所示，可使用對應核苷酸的字母（字母名稱）來表示核苷酸。舉例而言，A係指腺苷（adenosine）（一種包含腺嘌呤核鹼基的核苷），C係指胞苷（cytidine），G係指鳥苷（guanosine），U係指尿苷（uridine），T係指胸苷（thymidine）（5-甲基尿苷）。W係指A或T/U，S係指G或C。N表示隨機的核苷，dNTP表示去氧核醣核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate）。N可為A、C、G或T/U之任一者。
〔表1〕
字母 字母表示的核苷酸
G G
A A
T T
C C
U U
R G或A
Y T/U或C
M A或C
K G或T/U
S G或C
W A或T/U
H A或C或T/U
B G或T/U或C
V G或C或A
D G或A或T/U
N G或A或T/U或C
本文所使用「寡核苷酸（oligonucleotide）」之用語係指核苷酸的寡聚物。本文所使用「核酸」之用語係指核苷酸的聚合物。本文所使用「序列」之用語係指寡核苷酸或核酸的核苷酸序列。在通篇說明書中，每當寡核苷酸或核酸以字母序列表示時，核苷酸為由左至右5端起始（5'→）之順序。寡核苷酸或核酸可為DNA、RNA或其類似物（例如硫代磷酸酯類似物（phosphorothioate analogues））。寡核苷酸或核酸可包含修飾過的鹼基及/或主鏈（backbone）（例如修飾過的磷酸鍵或修飾過的醣基）。對核酸提供穩定性及/或其他優勢的合成主鏈之非限制性示例可包含硫代磷酸酯鍵（phosphorothioate linkage）、肽核酸（peptide nucleic acid）、鎖核酸（locked nucleic acid）、木糖核酸（xylose nucleic acid）或其類似物。
本文所使用「核酸」之用語係指核苷酸聚合物，並包含天然核苷酸的已知類似物，除非另有定義，否則其以相似於天然存在之核苷酸的方式作用（例如雜交）。
「核酸」之用語包含DNA或RNA的任何形式，舉例而言，包含基因組DNA（genomic DNA）、互補DNA（complementary DNA，cDNA）、由擴增或合成產生的DNA分子及mRNA，其中互補DNA為mRNA之DNA表示，通常由反轉錄或擴增訊息RNA（mRNA）而獲得。
「核酸」之用語涵蓋雙股或三股核酸以及單股分子。在雙股或三股核酸中，核酸鏈不必共沿伸（即雙股核酸不須沿兩股的全長皆為雙股）
「核酸」之用語亦包含其任何化學修飾，例如甲基化及/或加帽（capping）。核酸修飾可包含對單獨核酸鹼基或對整個核酸添加化學基團、給予額外的電荷、極化、氫鍵、靜電交互作用或其他功能。此種修飾可包含鹼基修飾，例如2’號位置之醣修飾、5號位置之嘧啶修飾、8號位置之嘌呤修飾、在胞嘧啶環外胺（cytosine exocyclic amine）之修飾、5-溴尿嘧啶之取代、主鏈修飾以及非正常鹼基對組合，例如異鹼基異胞苷（isocytidine）及異胍（isoguanidine）
核酸可源自透過完整的化學合成而得（例如固相介導化學合成（solid-phase-mediated chemical synthesis））、來自生物來源（例如從產生核酸的任何物種分離）、來自涉及透過分子生物工具處理核酸的過程（例如DNA複製、PCR擴增及反轉錄）或這些過程之組合。
本文所使用「互補（complementary）」之用語係指兩核苷酸間精確配對的能力。也就是說，若在指定位置的核苷酸能夠與在另一核酸的核苷酸形成氫鍵，則兩個核酸被認為在該位置彼此互補。兩個單股核酸分子間的互補可為「部分的」，其中僅一些核苷酸結合，或者當單股分子間存在完全互補時兩個單股核酸分子間的互補亦可為完整的。核酸鏈間的互補程度對核酸鏈間的雜交之效率及強度具有相當大的影響。
本文所使用「引子（primer）」之用語係指短的線性寡核苷酸，其用於編程（programming）核酸合成反應之與目標核酸序列（例如要擴增之DNA模版）雜交。引子可為RNA寡核苷酸、DNA寡核苷酸或嵌合序列（chimeric sequence）。引子可包含天然的、合成的或修飾的核苷酸。引子長度的上限及下限皆由實驗確定。引子長度的下限為在核酸擴增反應條件下與目標核酸雜交即形成穩定雙鏈體所需之最小長度。在此種雜交條件下，非常短的引子（通常少於3個核苷酸長）不會與目標核酸形成熱力學穩定的雙鏈體。上限通常由在預定核酸序列以外之區域形成雙鏈體的可能性來確定。一般而言，適合的引子長度的範圍可為3個核苷酸至約50個核苷酸。
本文所使用「探針（probe）」之用語係指能夠透過一或多種類型的化學鍵來結合具有互補序列之目標核酸的核酸，一般透過互補鹼基配對結合，其通常透過形成氫鍵，進而形成雙鏈體結構。探針會結合或雜交至「探針結合位置」。具體而言，一旦探針與對探針互補之目標雜交，即可使用可檢測之標記來標記探針，以便於探針檢測。或者，然而探針可為未標記的，但可透過與標記配體（labeled ligand）的專一性結合直接或間接檢測。探針的大小可具有相當大的變化。探針一般具有至少7至18個核苷酸的長度。其他探針具有至少20、30或40個核苷酸的長度。還有其他探針更長，其具有至少50、60、70、80或90個核苷酸的長度。還有其他探針更長，其具有至少100、150、200或更多核苷酸的長度。探針亦可具有位於由上述值之任一者所限定之任何範圍內的長度（例如15至20個核苷酸之長度）。
本文所使用「雜交（hybridization）」之用語係指具有互補核苷酸序列的單股核酸間透過氫鍵形成雙股核酸，其亦可與「貼合（annealing）」之用語互換使用。就更廣義而言，雜交不僅包含兩個單股間之核苷酸序列完全互補的情況（完全匹配），亦特別包含某些核苷酸序列沒有互補的情況（不完全匹配）。
本文所使用「樣品」之用語係指包含或假設包含目標且要分析的組成物，可為從選自液體、土壤、空氣、食物、廢棄物、源自人類之物質、動物腸道、動物組織及植物組織之一或多者收集而得的樣品，但本發明不限於此。在此方面，液體可為水、血液、尿液、淚液、汗水、唾液、淋巴液、腦脊髓液等，水包含河水、海水、湖水、雨水等，廢棄物包含汙水、廢水等，動物組織及植物組織包含人類的組織。此外，動物組織及植物組織包含如黏膜、皮膚、皮質、頭髮、鱗片、眼睛、舌頭、臉頰、蹄、喙（beak）、吻（snout）、腳、手、嘴、乳頭、耳及鼻之組織。
較佳地，本發明之樣品可為使用本發明之方法來分析的生物樣品。更佳地，樣品可為與病毒物種混合之樣品或被病毒感染之個體（例如人類、哺乳動物及魚類）之樣品，源自於植物、動物、人類、真菌、細菌及病毒之生物樣品可被分析。當分析哺乳動物或人類器官之樣品時，樣品可源自於特定組織或器官。組織的代表性示例包含結締組織、皮膚組織、肌肉組織或神經組織。器官的代表性示例包含眼、腦、肺臟、肝臟、脾臟、骨髓、胸腺、心臟、淋巴、血液、骨骼、軟骨、胰臟、腎臟、膽囊、胃、小腸、睪丸、卵巢、子宮、直腸、神經系統、腺體及內部血管。要分析之生物樣品包含來自生物器官之任何細胞、組織或液體或者可根據本發明來分析的任何其他介質，並包含來自人類、動物或準備供人類或動物消耗之食物的樣品。此外，要分析之生物樣品包含體液樣品，舉例而言但不限於血液、血清、血漿、淋巴液、乳汁、尿液、糞便、眼液、唾液、精液、腦萃取物（例如基本腦部樣品（ground brain sample））、脊髓液、闌尾、脾臟及扁桃腺組織萃取物。
在本發明中，擴增可透過任何種類之聚合酶連鎖反應（polymerase chain reaction，PCR）進行，但以使用不對稱PCR（asymmetric PCR）為佳。
在本發明中，標籤序列可具有5個鹼基對（base pair，bp）至50 bp之長度。
在本發明中，標籤序列可具有20%至80%之GC比。
在本發明中，標籤序列所致之解鏈溫度可根據標籤序列的長度或組成來調整。
在本發明中，標籤序列可互補於探針序列或含有探針序列之序列。
在本發明中，解鏈溫度間的差異並無特別限制，只要其在分析圖上可區別即可，但可以2°C至40°C的範圍為佳，以5°C至30°C為較佳，以8°C至20°C為最佳。
在本發明中，在步驟b）中，可更包含能夠分別擴增p個目標的p個引子組（其中p為1至20的整數），且在步驟c）中，可更包含能夠與所有p個擴增產物雜交的檢測探針。
在本發明中，檢測探針可為寡核苷酸、肽核酸（PNA）或鎖核酸（LNA），並且在其相對兩端連接有報導體及淬滅體。
在本發明中，肽核酸（PNA）為可辨識諸如鎖核酸（LNA）或𠰌啉核酸（morpholino nucleic acid，MNA）之基因的物質，其為人工合成，並具有由聚醯胺組成的主鏈。PNA具有優異的親和性及選擇性，並對於溶核酶（nucleolytic enzyme）具有高穩定性，因此不會被現有的限制酶（restriction enzyme）切斷。此外，PNA具有優異的熱/化學性質及熱/化學穩定性，因此其容易保存且不易分解。此外，PNA-DNA結合親和性遠優於DNA-DNA結合親和性，因此即使存在單一核苷酸不匹配，解鏈溫度（Tm）的差異仍有約10°C至15°C。利用親和性的此差異，可檢測單核苷酸多型性（SNP）及插入/缺失（insertion/deletion，InDel）之核苷酸變化。
Tm值亦會依據PNA探針之核酸及與其互補結合之DNA的差異而改變，因此使用此應用技術的開發為容易。不同於TaqMan探針的水解反應，PNA探針使用雜交反應來分析，具有相似於PNA探針之功能的探針包含分子信標探針（molecular beacon probe）及Scorpion探針（scorpion probe）。
在本發明中，PNA探針不限於但可具有與其結合之報導體或淬滅體。本發明之包含報導體及淬滅體的PNA探針在與目標核酸雜交後產生螢光訊號，隨著溫度增加，PNA探針與目標核酸在其適當之解鏈溫度下快速解鏈，因此螢光訊號淬滅。根據溫度變化透過分析由螢光訊號而獲得之高解析的解鏈曲線，可檢測目標核酸的存在或不存在。
螢光材料可結合於本發明之探針，本發明之探針在其相對兩端包含報導體及淬滅體，淬滅體能夠使報導體的螢光淬滅，螢光材料可包含嵌入式螢光材料（intercalating fluorescent material）。報導體可選自由6-羧基螢光素（6-carboxyfluorescein，FAM）、HEX、Texas Red、JOE、TAMRA、CY5、CY3及Alexa680組成之群組之一或多者，較佳地使用6-羧基四甲基羅丹明（6-carboxytetramethyl-rhodamine，TAMRA）、BHQ1、BHQ2或Dabcyl作為淬滅體，但本發明不限於此。嵌入式螢光材料可選自由吖啶同型二聚體（acridine homodimer）及其衍生物、吖啶橙（acridine orange）及其衍生物、7-胺基放線菌黴素D（7-aminoactinomycin D，7-AAD）及其衍生物、放線菌黴素D（actinomycin D）及其衍生物、9-胺基-6-氯-2-甲氧吖啶（9-amino-6-chloro-2-methoxyacridine，ACMA）及其衍生物、DAPI及其衍生物、二氫乙錠（dihydroethidium）及其衍生物、溴化乙錠（ethidium bromide）及其衍生物、乙錠同型二聚體-1（ethidium homodimer-1，EthD-1）及其衍生物、乙錠同型二聚體-2（ethidium homodimer-2，EthD-2）及其衍生物、單疊氮乙錠（ethidium monoazide）及其衍生物、碘化己錠（hexidium iodide）及其衍生物、雙苯甲醯亞胺（bisbenzimide，Hoechst 33258）及其衍生物、Hoechst 33342及其衍生物、Hoechst 34580及其衍生物、羥茋巴脒（hydroxystilbamidine）及其衍生物、LDS 751及其衍生物、碘化丙錠（propidium iodide，PI）及其衍生物以及Cy染劑衍生物組成之群組。
在本發明中，使用螢光解鏈曲線分析（fluorescence melting curve analysis，FMCA）作為分析雜交反應的方法，並依據解鏈溫度藉由將PCR完成後產生之產物與導入之探針間的結合強度的差異分類來進行此方法。不像其他SNP檢測探針，此探針的設計相當簡單，可使用含有SNP之11至18單體單元（mer）的核苷酸序列來生產此探針。因此，為了設計具有期望解鏈溫度的探針，可根據PNA探針的長度調整Tm值，甚至在相同長度之PNA探針的情況下可透過改變探針來調整Tm值。由於PNA相較於DNA具有較高的結合強度並且具有高Tm值，故可設計具有短於DNA之長度的PNA，從而甚至可檢測到緊鄰於其的SNP。在已知的高解析度解鏈（High Resolution Melt，HRM）方法中，Tm值的差異低至約0.5°C，因此需要額外的分析程序或微小的溫度變化，當二或多個SNP出現時會難以進行分析。相反地，PNA探針不受探針序列以外之SNP影響並能夠進行快速且精確的分析。
在本發明一示例實施例中，透過即時PCR進行融合擴增產物的檢測，在此方面，擴增產物的檢測可藉由以下來進行：根據融合擴增產物的擴增僅獲得一擴增曲線以量測循環閾值（cycle threshold，Ct）、透過探針在聚合酶連鎖反應後僅獲得一解鏈曲線以量測解鏈峰，或同時獲得擴增曲線及解鏈曲線並將兩個結果結合在一起，但本發明不限於此。
由於樣品中出現目標核酸融合擴增產物，融合擴增產物擴增得早，故由檢測探針產生的訊號量增加得早，因此達到閾值所需的循環數會減少，從而量測到低Ct值，這可用於辨識目標核酸的存在或不存在。此外，一般會在即時聚合酶連鎖反應之核酸擴增過程後再進行解鏈曲線分析，在樣品溫度降至低溫（約25°C至55°C）後再以每1至10秒鐘0.3至1°C之速率升至高溫（約75°C至95°C）同時量測訊號圖譜，或者在樣品溫度升至高溫後再以每1至10秒鐘0.3至1°C之速率降至低溫同時量測訊號圖譜。當融合擴增產物擴增時，透過解鏈曲線分析，在訊號圖譜中於結合融合擴增產物之探針的解鏈溫度（Tm）附近會出現變化，並利用解鏈峰分析訊號圖譜的變化以辨識融合擴增產物。
本發明亦關於用於檢測多個目標的PCR組成物，包含： i）能夠分別擴增n個目標的n個引子組；以及ii）能夠與使用n個引子組擴增所得之n個擴增產物雜交的檢測探針（其中n為2至20的整數），其中各n個引子組由正向引子及反向引子組成，反向引子包含標籤序列，標籤序列被設計成使得n個雜交反應產物的解鏈溫度彼此不同。
在本發明中，PCR組合物可更包含能夠分別擴增p個目標的p個引子組（其中p為1至20的整數），並可更包含能夠與所有p個擴增產物雜交的檢測探針。
本發明亦關於用於檢測多個目標的套組。
在本發明中，套組可任選地包含用於目標核酸擴增反應（例如聚合酶連鎖反應）所需的試劑，例如緩衝液、DNA聚合酶、DNA聚合酶輔助因子及去氧核醣核苷-5-三磷酸（deoxyribonucleotide-5-triphosphate，dNTP）。任選地，本發明之套組亦可包含多種寡核苷酸分子、反轉錄酶、多種緩衝液及試劑以及用於抑制DNA聚合酶之活性的抗體。此外，本領域具有通常知識者可輕易決定用於本套組之特定反應的試劑的最佳量。通常，本發明之設備可以包含上述組成之單獨包裝或隔間的方式製造。
在一實施例中，套組可包含用於容納樣品的分隔載體器具、包含試劑的容器、包含引子及替代目標（surrogate target）的容器以及包含用於檢測擴增產物之探針的容器。
載體器具適用於容納諸如瓶或管之一或多個容器，各容器包含用於本發明之方法的獨立組成。在本說明書中，本領域具有通常知識者可輕易分配在容器中之所需的試劑。
同時，在本發明中，期望可使用檢測方法比較並分析相較於參考基因之目標基因的表現程度。
在本發明中，為了確認是否可分析相較於參考基因之目標基因的表現程度，分別使用各自包含標籤序列的引子組擴增參考基因與目標基因，接著使用單一檢測探針分析解鏈曲線，以確定可檢測到所有參考基因與目標基因的解鏈溫度以及僅可檢測到目標基因的解鏈溫度，比較並分析在各解鏈溫度的Ct值。
也就是說，在本發明一實施例中，將β-肌動蛋白（β-actin）設為參考基因，將PD-1及PD-L1設為目標基因，cDNA從Hcc827、MDA及MRC5細胞系的mRNA製備，使用包含標籤序列的引子擴增各基因，將能夠結合標籤序列的檢測探針與擴增產物雜交，接著分析解鏈曲線，由分析結果可確認，可同時檢測到β-肌動蛋白及PD-1/PD-L1的溫度為50°C，僅可檢測到PD-1/PD-L1的溫度為58°C。
此後，量測各溫度下的Ct值，作為比較並分析其差異的結果，可確認以下：依據在MRC5細胞中β-肌動蛋白及PD-1/PD-L1的表現（在MRC5細胞中PD-1/PD-L1表現正常），PD-1/PD-L1在Hcc827細胞中的表現分別為超過β-肌動蛋白之8倍/18倍，PD-1/PD-L1在MDA細胞中的表現分別為超過β-肌動蛋白之5倍/55倍（參見圖6至圖8）。
因此，本發明另一實施例係關於分析多個目標之表現程度的方法，包含： a）從包含多個目標的樣品獲得cDNA文庫；b）使用能夠擴增參考基因的引子組與能夠分別擴增n個目標基因的n個引子組擴增參考基因與目標基因以產生多個擴增產物（其中n為2至20的整數）；c）使用能夠與該些擴增產物雜交的一檢測探針與該些擴增產物雜交，該些擴增產物包含所有參考基因的擴增產物及n個目標基因的n個擴增產物；d）分析於步驟c）中雜交所得之雜交反應產物的解鏈曲線；以及e）在可同時檢測到參考基因與目標基因的解鏈溫度下，以及在僅可檢測到目標基因的解鏈溫度下，比較並分析Ct值，其中各n個引子組由正向引子及反向引子組成，反向引子包含標籤序列，標籤序列被設計成使得n個雜交反應產物的解鏈溫度彼此不同。
在本發明中，步驟e）之比較並分析Ct值係透過以下進行： i）獲得一差值，該差值為在可同時檢測到參考基因與目標基因的解鏈溫度下的Ct值與在僅可檢測到目標基因的解鏈溫度下的Ct值之差；ii）使用以下方程式1換算Ct值間之差值，方程式1：換算值= 2^ (控制組之在僅可檢測到目標基因的解鏈溫度下的Ct值-控制組之在可同時檢測到參考基因與目標基因的解鏈溫度下的Ct值)／2^ (實驗組之在僅可檢測到目標基因的解鏈溫度下的Ct值-實驗組之在可同時檢測到參考基因與目標基因的解鏈溫度下的Ct值) ；以及iii）透過換算值確認相對於該參考基因的表現程度。
在本發明中，可使用多種已知方法從樣品獲得cDNA文庫，較佳地，透過反轉錄PCR（RT-PCR）從萃取之mRNA獲得cDNA文庫。
在本發明中，對於癌症的診斷及治療，實驗組或目標基因可為選自由PD-1、PD-L1、CTL4、LAG3、TIM3、BTLA、TIGIT、VISTA、KIR、A2AR、B7-H3、B7-H4、CD277及IDO組成之群組之一或多個基因，或者可為選自由miR-17、miR-18a、miR-20a、miR-21、miR-27a及miR-155組成之群組之一或多者，但本發明不限於此。
在本發明中，控制組或參考基因可為選自由β-肌動蛋白、a-微管蛋白（a-tubulin）及GAPDH組成之群組之一或多個持家基因（house-keeping gene），但本發明不限於此。
〔示例〕
以下參考下述示例更詳細地描述本發明。對於本領域中具有通常知識者顯而易見的是，這些示例僅用於示例性說明，不應解釋為限制本發明的範圍。
〔示例1：引起腦膜炎之6種病毒及5種細菌之檢測〕
為了檢測引起腦膜炎之6種病毒（HSV-1、HSV-2、VZV、CMV、EBV及HHV-6）及引起腦膜炎之5種細菌（肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae ）、流感嗜血桿菌（Haemophilus influenza ）、李斯特單胞菌（Listeria monocytogenes ）、B組鏈球菌（Group B Streptococcus ，亦稱為無乳鏈球菌Streptococcus agalactiae ）及腦膜炎球菌（Neisseria meningitides ）），而製作正向引子、各自包含標籤序列的反向引子以及雙官能PNA螢光探針（參見表2及表3）。
〔表2〕
SEQ ID NO: 名稱 序列 (5'-3') 目標
1 V1-F GCTGTTCTCGTTCCTCACTGCC HSV-1
2 V1-R TGAAAATGCGAGTGTC CATACCCTACCCGCGTTCGGAC
3 V2-F CGCCAAATACGCCTTAGCAGAC HSV-2
4 V2-R TGAAAATGGAAGTGTC AGGTTCTTCCCGCGAAATCG
5 V3-F CCTTCAATTGCTTGGCGGACTCGG VZV
6 V3-R TGATAATGCAAGTCTC ACAAGATGAGCGAGTGTACCGATG
7 V4-F GCTGTAACTGTGGTTTCCATGACG CMV
8 V4-R TGAAAATGCAAGTGTC CGTGTGGCTTACCTGCTGCC
9 V5-F AGCGGGGTATGAGCTTTCCTGTTAC EBV
10 V5-R TCAAAATGCAAGTGTC CAGTCGGGCGAAATCTGTGTACC
11 V6-F GATATCGGATCGCAACAAGACCTCG HHV-6
12 V6-R TGAAGATGGAAGTGTC TCCGTTGCGTAATATGTCAAGGATGC
13 B1-F GGTCAATTCCTGTCGCAGTACC 肺炎鏈球菌
14 B1-R CATGTGCCTACACCTG GTCCAAACAGCCTTAGGTCTTATGG
15 B2-F GTACGCTAACACTGCACGACG 流感嗜血桿菌
16 B2-R CATGTGCATACACCTG GTAACACTGATGAACGTGGTACACCAG
17 B3-F GTTGACCGCAAATAGAGCCAAGC 李斯特單胞菌
18 B3-R CATGTGCCTACACGAG GTATTAGCGAGAACGGGACCATCATG
19 B4-F CAGCAACAACGATTGTTTCGCC B組鏈球菌
20 B4-R CATGTCCATACACCTG CTTCCTCTTTAGCTGCTGGAAC
21 B5-F GCACACTTAGGTGATTTACCTGCAT 腦膜炎球菌
22 B5-R CATATCCCTACACCTG CCACCCGTGTGGATCATAATAGA
底線字母：反向引子之5'-標籤序列
〔表3〕 探針序列
SEQ ID NO: 名稱 序列(5'-3') 螢光
23 檢測探針1 CAT GTG CCT ACA CCT G FAM
24 檢測探針2 TGA AAA TGC AAG TGT C TxR
使用不對稱PCR進行即時聚合酶連鎖反應實驗，以產生單股目標核酸。不對稱PCR條件如下：加入2X SeaSunBio Real-Time FMCA™緩衝液（SeaSunBio, Korea）、2.5 mM氯化鎂（MgCl2 ）、200 μM dNTPs、1.0 U Taq聚合酶、0.05 μM正向引子（參見表2）及0.5 μM反向引子（參見表2）（不對稱PCR）以及0.5微升之螢光PNA探針（參見表3）至最終體積為20微升，以進行即時PCR分析與解鏈曲線分析，分析條件如圖2所示。
結果，如圖3所示，確認可檢測到引起腦膜炎之5個細菌與6個病毒。
各病毒與各細菌的來源如下表4所示。
〔表4〕 病毒與細菌的來源
No. 名稱 來源
1 肺炎鏈球菌 ATCC27336
2 腦膜炎球菌 ATCC13100
3 流感嗜血桿菌 ATCC19418
4 李斯特單胞菌 ATCC15313
5 無乳鏈球菌 ATCC14364
6 人類疱疹病毒1 （Human herpesvirus 1） KBPV-VR-52
7 人類疱疹病毒2 （Human herpesvirus 2） KBPV-VR-53
8 水痘帶狀皰狀病毒 （Varicella zoster virus） AMX VZV Plasma Pnl ,Acrometrix
9 Epstein-Barr二氏病毒 （Epstein-Barr virus） Acromatrix panel
10 人類巨細胞病毒 （Human cytomegalovirus） KBPV-VR-7
11 人類疱疹病毒6 （Human herpesvirus 6） HHV-6 Virus 1st WHo International standard
〔示例2：基因表現程度分析〕
〔2-1確定控制組與實驗組的解鏈溫度〕
為了比較基因表現，選標準細胞系Hcc827、MDA及MRC5（EA. Mittendorfet al. , 2014, RHJ Janseet al. , 2018, H Solimanet al. , 2014），使用SuperiorScrip III反轉錄套組（SuperiorScrip III Reverse Transcriptase kit，Enzynomics，RT006）從對應的細胞系萃取RNA以合成cDNA。cDNA合成的條件如下：加入5x Fist-Strand緩衝液、200單位之SuperiorScriptIII反轉錄酶、0.5 mM dNTP混合物、10 mM DTT、4 µM oligo dT以及20單位之RNase抑制劑至最終體積為20微升，在37°C反應5分鐘、在50°C反應1小時並在70°C反應15分鐘。
為了分析基因表現，如表5所示製備參考基因與目標基因的引子。使用根據示例1製作的雙官能PNA螢光探針在CFX96™即時系統（CFX96™Real-Time system，BIO-RAD，U.S.）中進行PCR。
使用不對稱PCR進行即時聚合酶連鎖反應實驗，以產生單股目標核酸。不對稱PCR條件如下：加入2X SeaSunBio Real-Time FMCA™緩衝液（SeaSunBio, Korea）、2.5 mM氯化鎂（MgCl2 ）、200 μM dNTPs、1.0 U Taq聚合酶、0.05 μM正向引子（參見表2）及0.5 μM反向引子（參見表2）（不對稱PCR）以及0.5微升之螢光PNA探針（參見表3）至最終體積為20微升，以進行即時PCR分析與解鏈曲線分析，分析條件如圖4所示。
為了確定適用於分析β-肌動蛋白及PD-1/PD-L1之Ct值的貼合溫度（annealing temperature），將PD-1/PD-L1的檢測條件設為54°C至60°C，將可同時檢測β-肌動蛋白及PD-1/PD-L1的條件設為48°C至52°C，並進行分析。由此可確認50°C與58°C為最合適的分析溫度（參見圖5）。
〔表5〕 引子序列
SEQ ID NO: 名稱 序列(5'-3') 目標
25 β-actin-F GCACTCTTCCAGCCTTCC β-肌動蛋白
26 β-actin-R TGAAAATGGAAGTGTC AGCACTGTGTTGGCGTACAG β-肌動蛋白
27 PD-1-F CAGAGCTCAGGGTGACAGAGAG PD-1
28 PD-1-R TGAAAATGCAAGTCTC CCACGACACCAACCACCAGG PD-1
29 PD-L1-F TGCTGAACGCATTTACTGTCACGG PD-L1
30 PD-L1-R TGAAAATGCAAGTCTC ACCATAGCTGATCATGCAGCGGTA PD-L1
底線字母：反向引子之5'-標籤序列
〔2-2分析控制組與實驗組的表現程度〕
為了量測在使用示例2-1之方法確定之50°C及58°C的解鏈溫度下的Ct值，使用如示例2-1所示之材料在如圖6所示之條件下進行即時PCR，接著使用以下方程式分析基因表現程度。 用於基因表現程度分析的方程式： 2^參考基因之(Ct58-Ct50)/ 2^目標基因之(Ct58-Ct50)
由此結果可知，如圖7及圖8所示，相較於作為控制組之MRC-5細胞系，PD-1及PD-L1基因在HCC-827細胞及MDAMB-231細胞中顯現出表現程度差異。
細胞系的來源如表6所示。
〔表6〕 細胞系的來源
No. 細胞系名稱 來源
1 MRC-5 KCLB10171
2 HCC-827 KCLB70827
3 MDAMB-231 ATCC HTB-26
儘管已詳細說明本發明特定實施例，對於本領域具有通常知識者顯而易見的是提供此詳細描述僅用於示例性說明，而不旨在限制本發明的範圍。因此，本發明之實質範圍應由所附申請專利範圍及其均等範圍所定義。
根據本發明之檢測多個目標的方法能夠使用單一探針檢測多個目標物，由於假陽性減少且可以高靈敏度快速檢測多個目標，因此有利於檢測多個目標。
無。 序列表 >110>  南韓商海陽生物材料有限公司 >120>  基於使用單核苷酸多型性標籤序列之單一檢測探針檢測多個目標的方法 >130>  P18-B315 >160>  30 >170>  PatentIn version 3.2 >210>  1 >211>  22 >212>  DNA >213>  人工序列 >220> >223>  人工序列 >400>  1 gctgttctcg ttcctcactg cc                                              22 >210>  2 >211>  38 >212>  DNA >213>  人工序列 >220> >223>  人工序列 >400>  2 tgaaaatgcg agtgtccata ccctacccgc gttcggac                             38 >210>  3 >211>  22 >212>  DNA >213>  人工序列 >220> >223>  人工序列 >400>  3 cgccaaatac gccttagcag ac                                              22 >210>  4 >211>  36 >212>  DNA >213>  人工序列 >220> >223>  人工序列 >400>  4 tgaaaatgga agtgtcaggt tcttcccgcg aaatcg                               36 >210>  5 >211>  24 >212>  DNA >213>  人工序列 >220> >223>  人工序列 >400>  5 ccttcaattg cttggcggac tcgg                                            24 >210>  6 >211>  40 >212>  DNA >213>  人工序列 >220> >223>  人工序列 >400>  6 tgataatgca agtctcacaa gatgagcgag tgtaccgatg                           40 >210>  7 >211>  24 >212>  DNA >213>  人工序列 >220> >223>  人工序列 >400>  7 gctgtaactg tggtttccat gacg                                            24 >210>  8 >211>  36 >212>  DNA >213>  人工序列 >220> >223>  人工序列 >400>  8 tgaaaatgca agtgtccgtg tggcttacct gctgcc                               36 >210>  9 >211>  25 >212>  DNA >213>  人工序列 >220> >223>  人工序列 >400>  9 agcggggtat gagctttcct gttac                                           25 >210>  10 >211>  39 >212>  DNA >213>  人工序列 >220> >223>  人工序列 >400>  10 tcaaaatgca agtgtccagt cgggcgaaat ctgtgtacc                            39 >210>  11 >211>  25 >212>  DNA >213>  人工序列 >220> >223>  人工序列 >400>  11 gatatcggat cgcaacaaga cctcg                                           25 >210>  12 >211>  42 >212>  DNA >213>  人工序列 >220> >223>  人工序列 >400>  12 tgaagatgga agtgtctccg ttgcgtaata tgtcaaggat gc                        42 >210>  13 >211>  22 >212>  DNA >213>  人工序列 >220> >223>  人工序列 >400>  13 ggtcaattcc tgtcgcagta cc                                              22 >210>  14 >211>  41 >212>  DNA >213>  人工序列 >220> >223>  人工序列 >400>  14 catgtgccta cacctggtcc aaacagcctt aggtcttatg g                         41 >210>  15 >211>  21 >212>  DNA >213>  人工序列 >220> >223>  人工序列 >400>  15 gtacgctaac actgcacgac g                                               21 >210>  16 >211>  43 >212>  DNA >213>  人工序列 >220> >223>  人工序列 >400>  16 catgtgcata cacctggtaa cactgatgaa cgtggtacac cag                       43 >210>  17 >211>  23 >212>  DNA >213>  人工序列 >220> >223>  人工序列 >400>  17 gttgaccgca aatagagcca agc                                             23 >210>  18 >211>  42 >212>  DNA >213>  人工序列 >220> >223>  人工序列 >400>  18 catgtgccta cacgaggtat tagcgagaac gggaccatca tg                        42 >210>  19 >211>  22 >212>  DNA >213>  人工序列 >220> >223>  人工序列 >400>  19 cagcaacaac gattgtttcg cc                                              22 >210>  20 >211>  38 >212>  DNA >213>  人工序列 >220> >223>  人工序列 >400>  20 catgtccata cacctgcttc ctctttagct gctggaac                             38 >210>  21 >211>  25 >212>  DNA >213>  人工序列 >220> >223>  人工序列 >400>  21 gcacacttag gtgatttacc tgcat                                           25 >210>  22 >211>  39 >212>  DNA >213>  人工序列 >220> >223>  人工序列 >400>  22 catatcccta cacctgccac ccgtgtggat cataataga                            39 >210>  23 >211>  16 >212>  DNA >213>  人工序列 >220> >223>  人工序列 >400>  23 catgtgccta cacctg                                                     16 >210>  24 >211>  16 >212>  DNA >213>  人工序列 >220> >223>  人工序列 >400>  24 tgaaaatgca agtgtc                                                     16 >210>  25 >211>  18 >212>  DNA >213>  人工序列 >220> >223>  人工序列 >400>  25 gcactcttcc agccttcc                                                   18 >210>  26 >211>  36 >212>  DNA >213>  人工序列 >220> >223>  人工序列 >400>  26 tgaaaatgga agtgtcagca ctgtgttggc gtacag                               36 >210>  27 >211>  22 >212>  DNA >213>  人工序列 >220> >223>  人工序列 >400>  27 cagagctcag ggtgacagag ag                                              22 >210>  28 >211>  36 >212>  DNA >213>  人工序列 >220> >223>  人工序列 >400>  28 tgaaaatgca agtctcccac gacaccaacc accagg                               36 >210>  29 >211>  24 >212>  DNA >213>  人工序列 >220> >223>  人工序列 >400>  29 tgctgaacgc atttactgtc acgg                                            24 >210>  30 >211>  40 >212>  DNA >213>  人工序列 >220> >223>  人工序列 >400>  30 tgaaaatgca agtctcacca tagctgatca tgcagcggta                           40
由以下詳細說明與附圖將更清楚理解本發明之上述及其他目的、特徵及其他優點，其中： 圖1為根據本發明之檢測多個目標的方法的概念示意圖； 圖2揭示即時聚合酶連鎖反應（PCR）的條件，其用於使用根據本發明之檢測多個目標的方法來檢測腦膜炎相關病毒及細菌； 圖3揭示使用根據本發明之檢測多個目標的方法來同時檢測腦膜炎病毒及細菌的結果； 圖4為即時聚合酶連鎖反應（PCR）的條件示意圖，其用於使用根據本發明之檢測多個目標的方法來確定Tm值以分析相較於參考基因之目標基因的表現程度。 圖5揭示根據溫度分析Ct值的結果，其用於使用根據本發明之檢測多個目標的方法來確認相較於參考基因之目標基因的表現程度。 圖6為即時PCR的條件示意圖，其用於使用根據本發明之檢測多個目標的方法來分析相較於參考基因之目標基因的表現程度。 圖7揭示使用根據本發明之檢測多個目標的方法來分析相較於參考基因之第一目標基因的表現程度的結果。 圖8揭示用根據本發明之檢測多個目標的方法來分析相較於參考基因之第二目標基因的表現程度的結果。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010

Claims (14)

  1. 一種檢測多個目標的方法，該方法包含下述步驟：a）從包含多個目標的一樣品獲得DNA；b）使用能夠分別擴增n個目標核酸的n個引子組擴增多個目標核酸以產生n個擴增產物，其中n為2至20的整數；c）使用能夠與該n個擴增產物雜交的單一檢測探針與該n個擴增產物雜交；以及d）分析於步驟c）中雜交所得之各n個雜交反應產物的一解鏈曲線以確定該些目標核酸存在或不存在，其中各該n個引子組包含一正向引子及一反向引子，該反向引子包含一標籤序列，其中該些標籤序列被設計成使得該n個雜交反應產物的多個解鏈溫度彼此不同。
  2. 如請求項1所述之方法，其中該些解鏈溫度之差異的範圍為2°C至40°C。
  3. 如請求項1所述之方法，其中步驟b）中更包含能夠分別擴增p個目標的p個引子組，其中p為1至20的整數，步驟c）中更包含能夠與所有p個擴增產物雜交的另一檢測探針。
  4. 如請求項1所述之方法，其中該檢測探針為寡核苷酸、肽核酸（PNA）或鎖核酸（LNA），該檢測探針在其相對兩端具有與其結合一報導體及一淬滅體。
  5. 如請求項3所述之方法，其中該檢測探針及該另一檢測探針之至少一者為寡核苷酸、肽核酸（PNA）或鎖核酸（LNA），該檢測探針及該另一檢測探針之至少一者在其相對兩端具有與其結合一報導體及一淬滅體。
  6. 如請求項4或5所述之方法，其中該報導體包含選自由6-羧基螢光素（FAM）、Texas Red、2',4',5',7'-四氯-6-羧基-4,7-二氯螢光素（HEX）及CY5組成之群組之一或多者。
  7. 如請求項4或5所述之方法，其中該淬滅體包含選自由6-羧基四甲基羅丹明（TAMRA）、BHQ1、BHQ2及Dabcyl組成之群組之一或多者。
  8. 如請求項1所述之方法，其中該解鏈曲線的該分析係透過螢光解鏈曲線分析（FMCA）進行。
  9. 如請求項1所述之方法，其中該擴增係透過即時聚合酶連鎖反應進行。
  10. 如請求項1所述之方法，其中該樣品選自水、土壤、廢棄物、食物、源自人類之物質、動物腸道、動物組織及植物組織。
  11. 一種用於檢測多個目標的PCR組成物，該PCR組成物包含：i）能夠分別擴增n個目標的n個引子組；以及ii）能夠與使用該n個引子組擴增所得之n個擴增產物雜交的一檢測探針，其中n為2至20的整數，其中各該n個引子組由一正向引子及一反向引子組成，該反向引子包含一標籤序列，其中該些標籤序列被設計成使得n個雜交反應產物的多個解鏈溫度彼此不同。
  12. 如請求項11所述之PCR組成物，更包含能夠分別擴增p個目標的p個引子組，其中p為1至20的整數，並更包含能夠與所有p個擴增產物雜交的另一檢測探針。
  13. 一種分析多個目標基因之表現程度的方法，該方法包含下述步驟：a）從包含多個目標的一樣品獲得一cDNA文庫；b）使用能夠擴增一參考基因的一引子組與能夠分別擴增n個目標基因的n個引子組擴增該參考基因與多個目標基因以產生多個擴增產物，其中n為2至20的整數；c）使用能夠與該些擴增產物雜交的一檢測探針與該些擴增產物雜交，該些擴增產物包含所有該參考基因的擴增產物及該n個目標基因的n個擴增產物；d）分析於步驟c）中雜交所得之多個雜交反應產物的多個解鏈曲線；以及e）在可同時檢測到該參考基因與該些目標基因的解鏈溫度下，以及在僅可檢測到該些目標基因的解鏈溫度下，比較並分析Ct值，其中各該n個引子組由一正向引子及一反向引子組成，該反向引子包含一標籤序列，其中該些標籤序列被設計成使得該n個雜交反應產物的多個解鏈溫度彼此不同。
  14. 如請求項13所述之方法，其中步驟e）之比較並分析Ct值係透過以下進行：i）獲得一差值，該差值為在可同時檢測到該參考基因與該些目標基因的解鏈溫度下的Ct值與在僅可檢測到該些目標基因的解鏈溫度下的Ct值之差；ii）使用以下方程式1換算該些Ct值間之差值，方程式1：換算值= 2^ (控制組之在僅可檢測到該些目標基因的解鏈溫度下的Ct值-控制組之在可同時檢測到該參考基因與該些目標基因的解鏈溫度下的Ct值)／2^ (實驗組之在僅可檢測到該些目標基因的解鏈溫度下的Ct值-實驗組之在可同時檢測到該參考基因與該些目標基因的解鏈溫度下的Ct值) ；以及iii）透過換算值確認相對於該參考基因的表現程度。
TW109102608A 2019-01-24 2020-01-22 基於使用單核苷酸多型性標籤序列之單一檢測探針檢測多個目標的方法 TWI795626B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020190009061A KR102097721B1 (ko) 2019-01-24 2019-01-24 태그서열 snp를 이용한 단일 검출 프로브 기반 다중 표적 검출방법
KR10-2019-0009061 2019-01-24

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW202043485A true TW202043485A (zh) 2020-12-01
TWI795626B TWI795626B (zh) 2023-03-11

Family

ID=70281949

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW110142190A TW202208636A (zh) 2019-01-24 2020-01-22 基於使用單核苷酸多型性標籤序列之單一檢測探針檢測多個目標的方法
TW109102608A TWI795626B (zh) 2019-01-24 2020-01-22 基於使用單核苷酸多型性標籤序列之單一檢測探針檢測多個目標的方法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW110142190A TW202208636A (zh) 2019-01-24 2020-01-22 基於使用單核苷酸多型性標籤序列之單一檢測探針檢測多個目標的方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20220145284A1 (zh)
KR (1) KR102097721B1 (zh)
DE (1) DE112020000525T5 (zh)
TW (2) TW202208636A (zh)
WO (1) WO2020153764A1 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114395633A (zh) * 2022-02-11 2022-04-26 内蒙古农业大学职业技术学院 一种快速鉴别马属动物速度基因snp位点基因型的核酸检测pcr引物、探针及方法
CN114807334A (zh) * 2022-05-31 2022-07-29 深圳联合医学科技有限公司 目标基因的检测方法、引物组、试剂盒及应用

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5210015A (en) 1990-08-06 1993-05-11 Hoffman-La Roche Inc. Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase
US5538848A (en) 1994-11-16 1996-07-23 Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe
GB9812768D0 (en) 1998-06-13 1998-08-12 Zeneca Ltd Methods
KR100571817B1 (ko) * 2003-09-19 2006-04-17 삼성전자주식회사 태그 서열에 혼성화하는 검출 프로브를 이용하는 표적핵산의 검출방법
KR20120081482A (ko) * 2011-01-11 2012-07-19 주식회사 씨젠 태그 프로브 절단 및 연장에 의한 타겟 핵산서열의 검출
KR20130008283A (ko) * 2011-07-12 2013-01-22 주식회사 파나진 평행결합 구조의 이중 혼성화 ｐｎａ 프로브 시스템을 포함하는 실시간 다중 중합효소 연쇄반응에 의한 결핵균 및 비결핵 항산균의 동시 검출용 조성물 및 이를 이용한 검출 방법
NZ723399A (en) * 2014-02-18 2020-08-28 Illumina Inc Methods and compositions for dna profiling
KR101609451B1 (ko) * 2014-05-21 2016-04-06 한양대학교 에리카산학협력단 Ｐｎａ 프로브 및 ｆｍｃａ를 이용한 세가지 마이코플라즈마 동시 진단법

Also Published As

Publication number Publication date
US20220145284A1 (en) 2022-05-12
TW202208636A (zh) 2022-03-01
WO2020153764A1 (ko) 2020-07-30
TWI795626B (zh) 2023-03-11
KR102097721B1 (ko) 2020-04-06
DE112020000525T5 (de) 2021-10-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11041190B2 (en) Genetic markers for discrimination and detection of red sea bream iridovirus causing infectious aquatic organism diseases, and method of discriminating and detecting the virus using the same
TWI324182B (en) Detection of nucleic acid variation by cleavage-amplification method
CN111511925B (zh) 用于扩增靶核酸的方法及用于扩张靶核酸的组合物
EP2276858A2 (en) Restriction endonuclease enhanced polymorphic sequence detection
KR20150028063A (ko) 리포터 및 소광자가 결합된 프로브를 이용한 액상형 어레이 및 이를 이용한 표적핵산 또는 돌연변이 검출방법
TWI795626B (zh) 基於使用單核苷酸多型性標籤序列之單一檢測探針檢測多個目標的方法
EP3805408B1 (en) Method of detecting target nucleic acid using rolling circle amplification and composition for detecting target nucleic acid
CN107109398B (zh) 单核苷酸多态性检测用寡核苷酸探针及单核苷酸多态性检测方法
TWI659106B (zh) 檢測黃頭病毒基因一型的遺傳標記以及使用其檢測黃頭病毒基因一型的方法
KR20200129600A (ko) 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori) 유전형 판별용 PNA 프로브 및 이를 이용한 헬리코박터 파일로리 유전형 판별방법
US20240035074A1 (en) Target nucleic acid amplification method with high specificity and target nucleic acid amplifying composition using same
KR102575618B1 (ko) 가이드 프로브 및 클램핑 프로브를 이용한 표적핵산 증폭방법 및 이를 포함하는 표적핵산 증폭용 조성물