JP2000517196A - Ｃｈｌａｍｙｄｉａ属の細菌の２３Ｓ ＲＮＡのヌクレオチド断片、プローブ、プライマーとしての、及び試薬と検出法における使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、Chlamydia属の種の23SリボソームRNAの鎖またはその相補的鎖に属する、12の連続的なヌクレオチド単位の少なくとも一つの配列を含む単一鎖ヌクレオチド断片であり、この配列は上記RNAの領域によって形成される以下の群のいずれか一つから選択される：Ｉ群：451-472,542-570,596-623,731-756,878-890,996-1020,1061-1094,1123-1186,1857-1880,2234-2307,2341-2370;II群：420-450,473-514,694-713,756-790,842-857,927-937,1231-1248,1241-1319,1880-1895,1943-1961,2151-2182;III群：404-426,436-457,466-515,683-722,747-808,817-863,891-955,1024-1055,1208-1251,1315-1350,1407-1548,1364-1388,1576-1622,1891-1918,2148-218[sic]；第一の数字は、参考配列として選択された、Chlamydia trachomatisのＡ血清型の23SリボソームRNAのヌクレオチド配列、配列番号５５についての上記領域の第一のヌクレオチド配列の位置に相当し、第二の数字は、この同じ参考配列についての上記領域の最後のヌクレオチドの位置に相当するものである断片に関する。本発明はまた、上記断片のプローブ、プライマーとしての、及び上記細菌の検出のための試薬と方法における使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 Chlamydia属の細菌の23S RNAのヌクレオチド断片、プローブ、プライマーとして の、及び試薬と検出法における使用 本発明は、オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーを用いた、検出及び ／または増幅法の分野に関し、及びChlamydia属の細菌の様式または同定のため の研究における応用に関する。 Chlamydiaの3の種は以下のものが現在周知である：ヒトに対して特異的であり 、15の血清型を含むChlamydia trachomatis（サブグループＡ）、トリにおいて 共生するChlamydia psitraci（サブグループＢ）、及びChlamydia pneumoniae（ Twar株）。これらの細菌の病原力は、動物におけるのと同様にヒトにおいても高 いように、大変変化する。 ヒトにおいては、Chlamydia trachomatisは、特に尿道炎、子宮頸炎または卵 管炎、結膜炎、失明を導きうるトラコーマ、関節炎、肝周囲炎を導きうる；2の 他の臨床上の形態は、主に新生児の結膜炎でまた頻発し、彼らは出産の過程で感 染し、そして水泳プール結膜炎として周知の結膜炎は、そこの水が汚れている水 泳プールにつかる過程で感染する；Chlamydia psittaciは、トリの糞を介在して ヒトに伝播し、良性の肺炎（オルニトーシス）またはより悪性の肺炎（オウム病 ）及び偽インフルエンザを引き起こす；最後に、Chlamydia pneumoniaeは、1965 年にトラコーマに対するワクチン運動の期間に結膜サンプルから単離され、1983 年に米国における急性呼吸病の流行の期間に咽頭サンプルから単離された。最近 、F.Blasi et al.(Jounal of Clinical Microbiology,(1996年11月)2766-2769) の研究により、アテローム性動脈硬化症の病因におけるC.pneumonia[sic]の直接 的な関係が示された。 長期にわたって、Chlamydiaによる感染の診断は以下のものに基づいていた： −結膜、尿道、子宮頸または肛門直腸の各切片によって得られたサンプルから生 じる標本の直接的な実験；しかしながらこの方法は、細胞を正確に広げ、染色後 にChlamydia感染の細胞内封入物の性質を示すことができるように、一つずつ分 離 することが必要であるため、扱いにくい； −培養による細菌の単離；しかしなから、Chlamydiaは特に壊れやすい細菌であ り、受精卵または細胞カルチャー(McCoyまたはHela 299細胞)のような生きた培 地でのみ増殖する申請の細胞内寄生菌である；多くの年数の間、受精卵のイノキ ュレーションのみが特別な実験室で実施され、細菌カルチャーが今後用いられ得 るが、この方法は実施するのが依然として困難であり、常に特定の実験室に制限 される； −イムノ酵素(ELISA)またはイムノ蛍光(IF)法のいずれか、または完全固定化反 応(CIR)に基づく免疫学的診断。 しかしながら、これらの異なる反応は、明らかな疫学的背景を別にして、急速 な信頼できる診断を許容しない。それ故、サンプルにおいて、Chlamydia属、及 び特にCh1amydia trachomatisに属する細菌の急速で選択的な検出を許容する特 異的で感度のよい細菌学的診断試験を開発することが重要である。 急速な試験の第一世代が、in situハイブリダイゼーションの方法に基づいて 提案された(D0TIHL et al.,Ann.Microbiol.1988,139,115-118)。しかしながら、 オリゴヌクレオチドプローブとしてラベルされたChlamydia trachomatisの全染 色体DNAを用いたこの試験は、特異性を欠いている。これは、このDNAが偽のポジ ティブ検出試験を導きうる得る他の細菌のゲノムを有する多くの共通の配列を含 むためである。加えて上記サンプルの調製は、特にその調整法及びその考え得る サイズのために扱いにくい。 他のChlamydia検出法が、核酸増幅及び検出試験に基づいて開発された（例え ばChlamydiatrachomatis株に特徴的な謎の遺伝子の一部の検出に基づくHoffman la Roche社によって販売されている試験、またはMOMPと呼ばれているCh1amydia の主要外膜タンパク質についてコードする遺伝子の証明に基づくAbbott社によっ て販売されている試験）。 細菌リボソームは、5S,16S及び23S RNAと呼ばれる少なくとも3の別々のリボソ ームRNA分子を含む。本発明に示された方法にしたがって、該細菌のリボソームR NAは、ターゲットとして用い得る。 これらの細菌による感染の診断において、Chlamydiaの16S RNAの使用は、1990 年に化学発光検出キット(PACE 2-アッセイ)を開発したGenprobe社によって記載 された。 ターゲットについてChlamydiaeの23S RNAを有するヌクレオチドプローブが今 回発見され、そのRNAはChlamydia属の少なくとも一つの種の群を、細菌属の他の 属または群とは区別することを許容する。 本発明をより詳細に説明する前に、発明の詳細な説明及び請求の範囲で用いら れる異なる語を以下に定義する： −「細菌から抽出された核酸」とは、全核酸またはリボソームRNA、特に23S rRN A、あるいはゲノムRNA、さらには23SリボソームRNAの逆転写産物から得られたDN Aのそれぞれを意味するように理解される。 −「核酸断片」または「オリゴヌクレオチド」とは、天然の核酸（または修飾さ れていてもよい）の情報を含む配列によって特性指摘されるヌクレオチド群の結 合と、所定の条件下で相補的なまたはほぼ相補的なヌクレオチド断片と、天然の 核酸のようなハイブリダイズできるヌクレオチド群の結合を示す2の同義語であ る；該結合は、天然の核酸のものと異なる構造のヌクレオチド群を含みうる；ヌ クレオチド（またはオリゴヌクレオチド）断片は、例えば100ヌクレオチド単位 まで含みうる；それは一般的に少なくとも12のヌクレオチドユニットを含み、天 然の核酸分子から及び／または遺伝学的組換えによって及び／または化学的合成 によって得ることができる； −ヌクレオチド単位は、その構成要素が糖、リン酸基、及び窒素性塩基である天 然の核酸ヌクレオチドであり得るモノマーから由来する；DNAにおいてば糖は2- デオキシリボースであり、RNAにおいては糖はリボースである；DNAまたはRNAの いずれが考慮されるかに依存して、窒素性塩基はアデニン、グアニン、ウラシル 、シトシン、チミンから選択される；あるいはまたモノマーは、該3の構成要素 の少なくとも一つにおいて修飾されたヌクレオチドである；例えば該修飾は、塩 基のレベルでイノシン、5-メチルデオキシシチジン、デオキシウリジン、5-ジメ チルアミノデオキシウリジン、2,6-ジアミノプリン、5-ブロモデオキシウリジン のような修飾塩基、またはハイブリダイゼーション可能ないかなる他の修飾塩基 を用い、糖のレベルでは、例えばボリアミドによる少なくとも一つのデオキシリ ボースの 置換を用い(P.E.Nielsen et al.,Science,254,1497-1500(1991))、リン酸基のレ ベルでは、例えば特にジリン酸、アルキル−及びアリルホスホナート及びホスホ ロチオアートから選択されるエステルによって置換されたものを用いて生じうる ； −「情報を含む配列」とは、ヌクレオチド型単位のいかなる順番の配列をも意味 するために用いられ、その化学的性質及び順番は参考として、天然の核酸の配列 によって与えられるものに情報的に類似する事項を構成する； −「ハイブリダイゼーション」とは、適切なコンディションの下で、十分に相補 的な配列を有する2のヌクレオチド断片が、二本鎖を形成する安定で特異的な水 素結合によって会合できる過程における工程を意味するように理解される；ハイ ブリダイゼーション条件は「厳格性」によって決定され、それは実施される条件 の厳格さをいうものである；ハイブリダイゼーションは、より厳格性を有して実 施される場合、必ずより特異的である。厳格性は、特にプローブ／ターゲット二 本鎖の塩基組成物の関数であると同様に、2の核酸の間のミスマッチの程度にも よる；加えて厳格性は、ハイブリダイゼーション溶液に存在するイオン種の濃度 及びタイプ、変性試薬の性質及び濃度、及び／またはハイブリダイゼーション温 度といった、ハイブリダイゼーション反応のパラメーターの関数であり得る；ハ イブリダイゼーション反応が実施される条件の厳格性は、特に用いられるプロー ブに依存する；全てのこれらのデータは周知であり、適切な条件は日常の実験に よって各場合で決定することが可能である；一般的に、用いられるプローブの長 さに依存して、ハイブリダイゼーション反応に対する温度は、およそ20から65℃ の間であり、特におよそ0.3から１Mの濃度での塩水溶液では35から65℃の間であ る；特に本発明にしたがったハイブリダイゼーション条件の下では、3×PBS塩水 溶液(NaCl 0.45m;リン酸ナトリウム0.15M)では、37℃±1℃の温度が選択される 。 −「プローブ」とは、例えば12から100のヌクレオチド単位、特に12から35のヌ クレオチド単位を含むヌクレオチド断片であり、本場合においてはリボソームRN A、または上記リボソームRNAの逆転写物によって得られたDNA、または代わりに 上記リボソームRNAがそれの転写産物であるDNA（リボソームDNAまたはrDNAとこ こで呼ばれる）のそれぞれを含む、ヌクレオチド配列を有するターゲット核酸と ハイブ リダイゼーション複合体を形成するように決定された条件下でハイブリダイゼー ション特異性を有する断片である；プローブは診断目的において、または治療目 的において用いられ得る（特にキャプチャープローブまたば検出プローブ）； −「キャプチャープローブ」とは、適切な手段によって、例えば固体の支持体上 への共有結合、吸着、直接的な合成によって固体の支持体へ固定化されるまたは 固定化可能である（特に特許出願WO 92/10092参照）； −「検出プローブ」とは、例えば放射性活性アイソトープ、酵素、特に色素形成 性、蛍光形成性、または化学発光性基質に作用することが可能な酵素（特にベル オキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）、色素産生化学化合物、色素形成 性、蛍光形成性または化学発光性化合物、ヌクレオチド塩基の類似体、及びビオ チンのようなリガンドから選択される標識によって標識されうる； −本発明のプローブは、メッセンジャーRNAのタンパク質への翻訳を特異的にブ ロックすることによってタンパク質合成を阻害しうるアンチデンスプローブのよ うに、治療目的のためにも用い得る。 −「プライマー」とは、例えば12から100ヌクレオチド単位を含むプローブであ り、例えばPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）のような増幅法、シークエンシング法 、逆転写法等において、酵素的な重合化を開始するために所定の条件下でハイブ リダイゼーション特異性を有するプローブである。 本発明に記載のプローブは、診断目的のため、サンプルにおけるターゲット核 酸の存在または不存在を調べるために用い得、その方法は全ての周知のハイブリ ダイゼーション法に従い、特に「ドットブロット」と呼ばれるフィルター上への 点沈殿の方法(MANIATIS et al.,Molecular Cloning,Cold Spring Harbor,1982) 、「サザンブロット」と呼ばれるDNAトランスファー法(SOUTHERN,E.H.,J.Mol.Bi ol.,98,503(1975))、「ノーザンブロット」と呼ばれるRNAトランスファー法、ま たは「サンドイッチ」と呼ばれる方法(DUNN A.R.,HASSEL J.A.,Cell,12,23(1977 ))にしたがって実施される。特にサンドイッチ法では、キャプチャープローブ及 び／または検出プローブが用いられ、上記プローブはターゲット核酸の2の異な る領域にハイブリダイゼーション可能であり、上記プローブの少なくとも一つ（ 一般的に検出プローブ）は、調べられる種または種の群に対して特異的であるタ ーゲッ トの領域とハイブリダイズ可能であり、キャプチャープローブ及び検出プローブ は、少なくとも部分的に異なるヌクレオチド配列を有す必要があることが理解さ れる。 −本発明に典型的に記載された配列に対する「同等な配列」とは、以前に定義し たような所定のハイブリダイゼーション条件の下で、記載された配列と同様な特 異性を確実にする配列を意味するように理解される。 以下の実施例１に特異化された条件の下で、Chlamydia trachomatisの12の血 清型の23SリボソームRNAに相当するrDNAのヌクレオチド配列、及びc.psittaci及 びC.pneumoniaeの一つの株のヌクレオチド配列が決定された。 それ故本発明は以下のものを提供する： (a)少なくとも12の連続的なヌクレオチド単位の配列を含む本発明の単一鎖ヌク レオチド断片であり、該断片はChlamydia属の種の23SリボソームRNAの鎖、また はその相補的な鎖に属し、この配列は上記RNAの領域によって形成される以下の 群のいずれか一つから選択される： Ｉ群：451-472,542-570,596-623,731-756,878-890,996-1020,1061-1094,1123-11 86,1857-1880,2234-2307,2341-2370; II群：420-450,473-514,694-713,756-790,842-857,927-937,1231-1248,1241-131 9,1371-1381,1880-1895,1943-1961,2151-2182; III群：404-426,436-457,466-515,683-722,747-808,817-863,891-955,1024-1055 ,1208-1251,1315-1350,1407-1548,1364-1388,1576-1622,1891-1918,2148-218[si c]； 第一の数字は、参考配列として選択され図面において示されている、Chlamydia trachomatisのＡ血清型の23SリボソームRNAのヌクレオチド配列、配列番号５５ についての上記領域の第一のヌクレオチド配列の位置に相当し、第二の数字は、 この同じ参考配列についての上記領域の最後のヌクレオチドの位置に相当する； 好ましくは本発明の断片は、少なくとも12の連続的なヌクレオチド単位の配列を 含み、配列番号１及び配列番号３から配列番号５４の配列から選択されたヌクレ オチド配列、及びその相補的配列に含まれ、より好適には上記断片は、配列番号 １及び配列番号３から配列番号５４の配列から選択されたヌクレオチド配列、及 び その相補的配列より成る； (b)(a)にしたがって定義された上記ヌクレオチド断片の逆転写物によって得られ るDNAの単一鎖ヌクレオチド断片、またはその相補的断片； (c)その転写産物が(a)にしたがって定義された上記ヌクレオチド断片である、ゲ ノムDNAの単一鎖ヌクレオチド断片、またはその相補的断片； 本発明の他の主題は以下のものである： (d)Chlamydia属の細菌の特異的な検出のためのプローブであり、それは配列番号 １及び配列番号３から配列番号１２の配列より選択される配列に含まれる、少な くとも12，好ましくは18，より好ましくは20の連続的なヌクレオチド単位の配列 、その相補的配列及びその同等な配列を含む、または代わりにそれらより成る； (e)Chlamydia trachomatis種の細菌の特異的な検出のためのプローブであり、そ れは配列番号１３から配列番号２４の配列から選択される配列に含まれる、少な くとも12，好ましくは18，より好ましくは20の連続的なヌクレオチド単位の配列 、その相補的配列及びその同等な配列を含む、または代わりにそれらより成る； (f)Chlamydia pneumoniae種の細菌の特異的な検出のためのプローブであり、そ れは配列番号２５から配列番号３９の配列から選択される配列に含まれる、少な くとも12，好ましくは18，より好ましくは20の連続的なヌクレオチド単位の配列 、その相補的配列及びその同等な配列を含む、または代わりにそれらより成る； (g)Chlamydia psittaci種の細菌の特異的な検出のためのプローブであり、それ は配列番号４０から配列番号５４の配列から選択される配列に含まれる、少なく とも12，好ましくは18，より好ましくは20の連続的なヌクレオチド単位の配列、 その相補的配列及びその同等な配列を含む、または代わりにそれらより成る。 前記議論のように、本発明のプローブは、トレーサーによってラベルされうる かまたは固体の支持体に固定化しうる。 (h)Chlamydiaの所定の種による感染の治療のための治療上のプローブであり、そ れは少なくとも12，好ましくは18，より好ましくは20の連続的なヌクレオチド単 位の配列を含む、または代わりにそれらより成り、配列番号１及び配列番号３か ら配列番号５４の配列から選択されるヌクレオチド配列、その相補的配列及びそ の同等な配列に含まれる。 本発明のもう一つの主題は、Chlamydia属の細菌の23SリボソームRNA配列の相 補的DNA配列への特異的な逆転写物に対するプライマー、または特に、Chlamlydi aの23SリボソームRNA配列に相補的であるDNA配列の、連鎖重合化反応のような酵 素的増幅に対するプライマーであり、上記プライマーは少なくとも12，好ましく は18，より好ましくは20の連続的なヌクレオチド単位の配列を含む、または代わ りにそれらより成り、配列番号１及び配列番号３から配列番号５４の配列から選 択されるヌクレオチド配列、その相補的配列及びその同等な配列に含まれる。 本発明はまた、Chlamydiaの少なくとも一種の検出及び／または同定及び／ま たは定量のための試薬に関し、該試薬は少なくとも一つの本発明のプローブ、特 にキャプチャープローブ及び検出プローブ、本発明に記載のプローブの定義に相 当する一つ及び／または他のものを含む。 該試薬は、少なくとも２種のChlamydiaを検出する目的で、本発明のプローブ の混合物を含みうる。 最後に本発明は、Chlamydia種の少なくとも一つの核酸、主にChlamydiaeから 抽出されて変性されている可能性を有する23SリボソームRNA、または細菌のゲノ ムの抽出され変性されたDNAを含むことが可能な生物学的サンプルにおける、少 なくとも一種のChlamydiaを検出及び／または同定及び／または定量するための 工程を提供し、該工程は、本発明の少なくとも一つのプローブと上記サンプルを 接触させ、該プローブと上記核酸の間のハイブリダイゼーション複合体の形成に よって上記プローブのハイブリダイゼーションを検出することより成る段階を含 む。好ましくは、該DNAを本発明のプローブに対してさらす前に、このDNAの増幅 を、適応する酵素系及び少なくとも一つの本発明の増幅プライマー及びもしかし たら真正細菌プライマーの存在下で実施する。 本発明及びこれらの応用のいくつかは、実施例１及び２を用いて以下に説明さ れる。 図は、C.trachomatisのＡ血清型の12SリボソームRNAのヌクレオチド配列を表 し、Chlamydiaeの他の種の23S rRNAの領域を同定するために参考配列として用い た。 この配列において、Ａはアデニンを表し、Ｇはグアニン、Ｃはシトシン、 Ｕはウラシル、Ｎは前記記載の４の前記のいずれでもよく、^*は示された位置で ヌクレオ チドの不存在を表す。 実施例１：Chlamydiaの23SリボソームRNAのヌクレオチド配列の決定 以下の１４の株の23SリボソームRNAのヌクレオチド配列を決定した。 C.trachomatis血清型Ａ ATCC VR571B、バッチ6W、HAR13/92-02 C.trachomatis血清型Ｃ ATCC VR572、バッチ8、HAR-32/89-01 C.trachomatis血清型Ｄ ATCC VR885、バッチ8、VW-3/Cx/03-89 C.trachomatis血清型Ｂａ ATCC VR-347、バッチ6、Apache-2/90-04 C.trachomatis血清型Ｅ ATCC VR3488、Baurバッチ5W/92-02 C.trachomatis血清型Ｆ ATCC VR346、K-Cal-3、バッチ10W-92-02 C.trachomatis血清型Ｇ ATCC 87B、バッチ7、6/4/86 C.trachomatis血清型Ｈ ATCC VR-879、バッチ8W、UW-43/CX/92-12 C.trachomatis血清型Ｉ ATCC VR 880、UW-12/0R、バッチ10W/92-08 C.trachomatis血清型Ｋ ATCC VR887、VW-32/CX、バッチ13W/92-02 C.trachomatis血清型ＬＧＶ２ ATCC 434、バッチ13W/92-10 C.trachomatis血清型ＬＧＶ３ ATCC VR903、バッチ6/90-03 C.pneumoniae TWAR C.psittaci Borg 本発明の断片の構成的rRNAの領域を決定するための参考配列として用いたChla mydia trachomatis血清型Ａの配列は、配列番号５５によって示され、図面に表 されている。 該株の全核酸は、塩化セシウムにおける遠心分離によって単離された。該配列 の90％をカバーするPCR増幅産物が、真正細菌特異性を有する増幅プライマーの 助けを借りてリボソームRNAから生産された。 得られた増幅産物ば、チェーンターミネーシヨン法(Sanger et al.,Proc.Natl .Acad.Sci.USA,1977,74:5463-5467)により直接的に、熱安定性Taq DNAポリメラ ーゼ(Perkin)を用いた熱環状化及びLIC0Rシークエンサー上での移動により、配 列決定された。 実施例２：Chlamydia trachomatisの同定のための23SリボソームRNAに対して向 けられた本発明のプローブの使用 C.trachomatis種に対する配列番号１５から２６のヌクレオチド番号９で始ま り、ヌクレオチド番号２５で終わるプローブの特異性を確認した。 相補的な鎖上の配列は、以下のものであった：ACC CTT ACG GGC CAT TG。 細菌系統発生ツリーの部分を代表する様々な細菌の株のコレクションを、真正 細菌プライマーの助けを借りて、23SリボソームRNAの保存的部分のPCR増幅によ って試験した。各増幅産物を椎定のC.trachomatisプローブを用いて試験し、そ の結果はこのプローブの特異性を確認した。 C.trachomatisの異なる血清型、及びc.psittaciとC.pneuloniaeの単離物を、M cCoy単層細胞において培養した。これらのカルチャーを回収し、10μｌの等量物 をPCR増幅チューブにおいて直接的に再懸濁した。 他の細菌種を適切な細菌学的方法に従って培養した(Manual of clinical micr obiology,fifth edition,1991,Balows et al.ASM eds.,Washington DC.USA)。以 下の各種の株を選択した：Hycobacterium bovis BCG,Staphylococcus aureus,En terococcus faecium,Listeria monocytogenes,Rhodobacter capsulata,Bordetel la pertussis,Escherichia coli,Haemophilus influenzae,Campylobactor jejun i,Leptospira interrogans,Borrelia burgdorferi。これらの株を様々な方法に したがって溶解し、その溶解物の等量をPCRチューブに再懸濁した。 試験される領域を含む900塩基対の真正細菌断片の増幅を、以下の参考文献の 方法にしたがって実施した：Sallen et al.(1996)Comparative analysis of 16S and 23S rRNA sequences of Listeria species,Int.J.Sys.Bact.46:669-674。P CR増幅プライマーは同一であった：1f.TCC GAA TGG GGA AAC CC及び10r:GA(C/T) (C/T)AG TGA GCT RTT AC。 増幅されたリボソームDNAのハイブリダイゼーションを、当該出願人の名にお ける国際特許出願WO-91/19812に記載された非放射性活性の半自動化検出法に従 って実施し、その内容は参考として本記載に取り込まれる。キャプチャープロー ブ（その3'末端が配列番号１５から２６のヌクレオチド番号３０に相当し、TCA TCA TGC AAA AGG CAC GCC GUC AACの配列を有するC.trachomatisにおける２７ヌ ク レオチド）及びオリゴヌクレオチド−アルカリホスファターゼ検出接合物（実施 例2の最初に定義されたプローブに相当する）を用いる。 操作をVIDAS自動化マシーン（登録商標-bioMerieux-VITEK社により販売）で実 施した。反応チェンバーはSPR（商標名）("Solid Phase Receptacle")であり、 それはＫ樹脂（ブタジエン−スチレンコポリマー）の名の下で販売され、bioMer ieux社によって販売されている物質から生産された円錐形の支持体である。様々 な試薬をいくつかのキュベットを用いて断片に置き、異なる段階を試薬を吸い取 り輸送することが可能であり、それ故ピペットとして機能するSPRで行った。サ ンドイッチハイブリダイゼーション反応を、以下に記載される円錐の内壁で行っ た。 SPRの内側表面に、315μｌの４×PBSの溶液(200mMリン酸ナトリウムpH7.0,600 mM NaCl)で1ng/μｌの濃度で、その5'末端でAminolink 2リガンド(Applied Bios ystems-ref.400808)を含むキャプチャーオリゴヌクレオチドを受動的に固定化し た。環境温度で一晩または37℃で２時間後、該円錐体をPBS Tween溶液を用いて 二度洗浄し、それから真空下で乾燥した。キュベットにおいては、該断片は変性 及び検出に必要な試薬を含み、それは以下のものである：水酸化ナトリウム、酢 酸、オリゴヌクレオチド−アルカリホスファターゼ検出接合物の0.1ng/μｌ溶液 を200μｌ、２×600μｌのPBS Tween洗浄溶液、及び基質キュベット。 断片の第一のウェルで、試験される10μｌのPCR産物が沈着する。変性と中和 の後、該産物を検出プローブを用いて30分インキュベートし、該円錐体をPBS Tw een溶液を用いて２度洗浄する。ジエタノールアミンバッファーにおける溶液中 の250μlのMUP基質(4-メチルウンベリフェリルホスファート)を円錐体内に吸引 し、それからリーデイングキュベット内に放出した。外装値は、該キュベットの RFU（相対的蛍光ユニット）で発現される蛍光シグナルを測定する。 得られた結果は、用いられたプローブの組み合わせがC.trachomatisに特異的 であることを示す。細菌科（系統発生的区分）を代表する種の核酸、特にリボソ ームDNAとのいかなる交差反応をも示さない。他種のリボソームDNAターゲットは 実際、アガロースゲル上でのこれらの増幅産物を顕在化することによってハイブ リダイゼーションのために入手可能であることが調べられた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ルドヴィク，ヴォルフガング ドイツ国 Ｄ―83679 サクセンカム ア ルペンブリックストラッセ ８

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 1．Chlamydia属の種の23SリボソームRNAの鎖またはその相補的鎖に属する、12の 連続的なヌクレオチド単位の少なくとも一つの配列を含む単一鎖ヌクレオチド断 片であり、この配列は上記RNAの領域によって形成される以下の群のいずれか一 つから選択される： Ｉ群：451-472,542-570,596-623,731-756,878-890,996-1020,1061-1094,1123-11 86,1857-1880,2234-2307,2341-2370; II群：420-450,473-514,694-713,756-790,842-857,927-937,1231-1248,1241-131 9,1880-1895,1943-1961,2151-2182; III群：404-426,436-457,466-515,683-722,747-808,817-863,891-955,1024-1055 ,1208-1251,1315-1350,1407-1548,1364-1388,1576-1622,1891-1918,2148-218[si c]; 第一の数字は、参考配列として選択された、Chlamydia trachomatisのＡ血清型 の23SリボソームRNAのヌクレオチド配列、配列番号５５についての上記領域の第 一のヌクレオチド配列の位置に相当し、第二の数字は、この同じ参考配列につい ての上記領域の最後のヌクレオチドの位置に相当し、そして以下の配列を除外す る： 2．配列番号１，配列番号３から配列番号１８，配列番号２０，配列番号２２か ら配列番号５４の配列、及びその相補的配列から選択されるヌクレオチド配列に 含まれる、少なくとも12の連続的なヌクレオチド単位の配列を含むことを特徴と する請求項１記載の断片。 3．配列番号１，配列番号３から配列番号１８，配列番号２０，配列番号２２か ら配列番号５４の配列、及びその相補的配列から選択されるヌクレオチド配列よ り 成ることを特徴とする請求項２記載の断片。 4．請求項１から３のいずれか一項記載のヌクレオチド断片の逆転写物によって 得られることを特徴とするDNAの一本鎖ヌクレオチド断片、またはその相補的断 片。 5．その転写産物が請求項１から３のいずれか一項記載のヌクレオチド断片であ ることを特徴とするゲノムDNAの単一鎖ヌクレオチド断片、またはその相補的断 片。 6．配列番号１及び配列番号３から配列番号１２の配列，その相補的配列及びそ の同等な配列から選択される配列に含まれる、少なくとも12，好ましくは18，ま たはより好ましくは20の連続的なヌクレオチド単位を含むことを特徴とする、Ch lamydia属の細菌の特異的な検出のためのプローブ。 7．配列番号１及び配列番号３から配列番号１２の配列，及びその相補的配列か ら選択される配列に含まれる、少なくとも12，好ましくは18，またはより好まし くは20の連続的なヌクレオチド単位より成ることを特徴とする、請求項６記載の プローブ。 8．配列番号１３から配列番号１８，配列番号２０，及び配列番号２２から配列 番号２４の配列，その相補的配列及びその同等な配列から選択される配列に含ま れる、少なくとも12，好ましくは18，またはより好ましくは20の連続的なヌクレ オチド単位を含むことを特徴とする、Chlamydia trachomatis種の細菌の特異的 な検出のためのプローブ。 9．配列番号１３から配列番号１８，配列番号２０，及び配列番号２２から配列 番号２４の配列，及びその相補的配列から選択される配列に含まれる、少なくと も12，好ましくは18，またはより好ましくは20の連続的なヌクレオチド単位より 成ることを特徴とする、請求項８記載のプローブ。 10．配列番号２５から配列番号３９の配列，その相補的配列及びその同等な配列 から選択される配列に含まれる、少なくとも12，好ましくば18，またはより好ま しくは20の連続的なヌクレオチド単位を含むことを特徴とする、Chlamydia pneu moniae種の細菌の特異的な検出のためのプローブ。 11．配列番号２５から配列番号３９の配列，及びその相補的配列から選択される 配列に含まれる、少なくとも12，好ましくは18，またはより好ましくは20の連続 的なヌクレオチド単位より成ることを特徴とする、請求項１０記載のプローブ。 12．配列番号４０から配列番号５４の配列，その相補的配列及びその同等な配列 から選択される配列に含まれる、少なくとも12，好ましくは18，またはより好ま しくは20の連続的なヌクレオチド単位を含むことを特徴とする、Chlamydia psit taci種の細菌の特異的な検出のためのプローブ。 13．配列番号４０から配列番号５４の配列，及びその相補的配列から選択される 配列に含まれる、少なくとも12，好ましくは18，またはより好ましくは20の連続 的なヌクレオチド単位より成ることを特徴とする、請求項１２記載のプローブ。 14．固体の支持体に固定化されていることを特徴とする請求項６から１３のいず れか一項記載のプローブ。 15．特に、放射性活性アイソトープ、酵素、特にペルオキシダーゼまたはアルカ リホスファターゼのような色素形成性、蛍光形成性、または化学発光性基質に作 用することが可能な酵素、色素産生化学化合物、色素形成性、蛍光形成性または 化学発光性化合物、ヌクレオチド塩基の類似体、及びビオチンのようなリガンド から選択されるトレーサーを用いて標識されることを特徴とする請求項６から１ ４のいずれか一項記載のプローブ。 16．配列番号１，配列番号３から配列番号１８，配列番号２０，配列番号２２か ら配列番号５４の配列、その相補的配列及びその同等な配列から選択されるヌク レオチド配列に含まれる、少なくとも12、好ましくは18，またはより好ましくは 20の連続的なヌクレオチド単位の配列を含むことを特徴とする、Chlamydiaの所 定の種による感染の治療のための治療上のプローブ。 17．配列番号１，配列番号３から配列番号１８，配列番号２０，配列番号２２か ら配列番号５４の配列、その相補的配列及びその同等な配列から選択されるヌク レオチド配列に含まれる、少なくとも12、好ましくは18，またはより好ましくは 20の連続的なヌクレオチド単位の配列を含むことを特徴とする、Chlamydia属の 細菌の23SリボソームRNA配列の逆転写のためのプライマー。 18．配列番号１，配列番号３から配列番号１８，配列番号２０，配列番号２２か ら配列番号５４の配列、その相補的配列及びその同等な配列から選択されるヌク レオチド配列に含まれる、少なくとも12、好ましくは18，またはより好ましくは 20の連続的なヌクレオチド単位の配列を含むことを特徴とする、連鎖重合化反応 による増幅のような少なくとも一つの核酸配列の酵素的増幅のためのプライマー 。 19．請求項６から１５のいずれか一項記載の少なくとも一つのプライマーを含む ことを特徴とする、Chlamydiaの少なくとも一種を検出及び／または同定及び／ または定量するための試薬。 20．請求項１４記載のキャプチャープローブ、及び請求項１５記載の検出プロー ブを含むことを特徴とする請求項１９記載の試薬。 21．請求項１７記載のプライマー及び／または請求項１８記載のプライマーをさ らに含むことを特徴とする請求項１９記載の試薬。 22．Chlamydia種の少なくとも一つの核酸を含むことが可能である生物学的サン プルにおけるChlamydiaの少なくとも一種を検出及び／または同定及び／または 定量 するための方法であり、該方法は請求項６から１５のいずれか一項記載の少なく とも一つのプローブと上記サンプルを接触させ、上記プローブと上記核酸の間の ハイブリダイゼーション複合体の起こりうる形成を検出することより成る段階を 含むことを特徴とする方法。 23．上記サンプルを請求項６または７及びおそらく請求項１４または１５に記載 の第一のプローブと、請求項８から１３のいずれか一項及びおそらく請求項１４ または１５に記載の第二のプローブと接触させることを特徴とする請求項２２記 載の工程。