WO1998055646A1 - Fragment nucleotidique de l'arn 23s de bacteries du genre chlamydia, utlisations comme sonde, amorce, et dans un reactif et un procede de detection - Google Patents

Fragment nucleotidique de l'arn 23s de bacteries du genre chlamydia, utlisations comme sonde, amorce, et dans un reactif et un procede de detection Download PDF

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chlamydia
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Claude Mabilat
Karl-Heinz Schleifer
Wolfang Ludwig
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Bio Merieux
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents

Definitions

  • the present invention relates to the field of detection and / or amplification techniques, using oligonucleotide probes or primers, and their application to the search for the presence or identification of bacteria of the genus Chlamydia.
  • Chlamydia trachomatis (subgroup A) which is specific to humans and includes 15 serovars
  • Chlamydia psittaci subgroup B
  • Chlamydia pneumoniae Twar strain.
  • the pathogenic power of these bacteria is very varied, both in humans and in animals.
  • Chlamydia trachomatis is notably responsible for urethritis, cervicitis or salpingitis, conjunctivitis, trachoma which can lead to blindness, arthritis, perihepatitis; two other clinical forms are also frequent, namely the conjunctivitis of the newborn, infected during childbirth and the so-called swimming pool conjunctivitis, contracted during a bath in a swimming pool with dirty water; Chlamydia psittaci infects humans through bird droppings, causing damage such as mild (ornithoses) or more severe pneumonia (psittacosis) and flu-like symptoms; Finally, Chlamydia pneumoniae was isolated in 1965 from a conjunctival sample during a vaccination campaign against trachoma and in 1983 from a pharyngeal sample during an epidemic of acute respiratory diseases in the United States. Recently, the work of F. Blasi et al. (Journal of Clinical Microbiology
  • Chlamydia are particularly fragile bacteria, obligate intracellular parasites which multiply only on living media such as shredded eggs or cell cultures (McCoy or Hela 299 cells); for many years, only inoculation of the embryonic egg was carried out by specialized laboratories, and although cell cultures are now used, this technique remains cumbersome to implement and always reserved for certain laboratories; - on the immunological diagnosis is based on im unoenzymatiques techniques (ELISA) or 1 imraunofluorescence (IF) either on complement-fixation reactions (RFC).
  • ELISA im unoenzymatiques techniques
  • IF imraunofluorescence
  • Bacterial ribosomes contain at least three distinct ribosomal RNA molecules called 5S, 16S and 23S RNA. According to the method implemented in the present invention, the ribosomal RNA of bacteria can be used as a target.
  • Chlamydiae 16S RNA used in the diagnosis of infections caused by these germs was described in 1990 by the company Genprobe, which developed a chemiluminescence detection kit (PACE 2-Assay).
  • PACE 2-Assay chemiluminescence detection kit
  • nucleic acid extracted from bacteria is meant either the total nucleic acid, or the ribosomal RNA, in particular the 23S rRNA. either the genomic DNA, or the DNA obtained from the reverse transcription of the 23S ribosomal RNA;
  • nucleotide fragment or an "oligonucleotide” are two synonymous terms designating a sequence of nucleotide motifs characterized by the informational sequence of natural (or possibly modified) nucleic acids and capable of hybridizing, such as natural nucleic acids with a complementary or substantially complementary nucleotide fragment, under predetermined conditions; the chain may contain nucleotide units with a structure different from that of natural nucleic acids; a nucleotide fragment (or oligonucleotide) can contain, for example, up to 100 nucleotide units; it generally contains at least 12 nucleotide motifs and can be obtained from a natural nucleic acid molecule and / or by genetic recombination and / or by chemical synthesis; - A nucleotide motif is derived from a monomer which may be a natural nucleotide of nucleic acid, the constituent elements of which are a sugar, a phosphate group and a nitrogenous base; in
  • a "probe” is a nucleotide fragment comprising for example from 12 to 100 nucleotide units, in particular from 12 to 35 nucleotide units, having a specificity of hybridization under determined conditions to form a hybridization complex with a target nucleic acid having, in in the present case, a nucleotide sequence included either in a ribosomal RNA, or in a DNA obtained by reverse transcription of said ribosomal RNA, or also in a DNA (here called ribosomal DNA or rDNA) of which said ribosomal RNA is the transcription product; a probe can be used for diagnostic purposes (in particular capture or detection probes) or for therapy purposes;
  • a "capture probe” is immobilized or immobilizable on a solid support by any suitable means, for example by covalence, by adsorption, or by direct synthesis on a solid support (see in particular patent application WO 92/10092);
  • a "detection probe” can be marked by means of a marker chosen for example from radioactive isotopes, enzymes, in particular enzymes capable of acting on a chromogenic, fluorigenic or luminescent substrate (in particular a peroxidase or a phosphatase alkaline), chromophoric chemical compounds, chromogenic, fluorigenic or luminescent compounds, nucleotide base analogs, and ligands such as biotin; -
  • a probe of the invention can also be used for therapeutic purposes, such as an antisense probe capable of inhibiting protein synthesis by specifically blocking the translation of messenger RNA into proteins.
  • a "primer” is a probe comprising for example from 12 to 100 nucleotide units and having a specificity of hybridization under conditions determined for the initiation of an enzymatic polymerization, for example in an amplification technique such as PCR (Polymerase Chain Reaction), in a sequencing process, in a reverse transcription method, etc.
  • the probes according to the invention can be used, for diagnostic purposes, in the search for the presence or absence of a target nucleic acid in a sample, according to all the known hybridization techniques and in particular the techniques of punctual deposit on filter, called “DOT-BLOT” (MANIATIS et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1982), DNA transfer techniques called “SOUTHERN BLOT” (SOUTHERN. EM, J. Mol. Biol., S58 .
  • DOT-BLOT MANIATIS et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1982
  • SOUTHERN BLOT SOUTHERN. EM, J. Mol. Biol., S58 .
  • the sandwich technique is used, with a capture probe and / or a detection probe, said probes being capable of hybridizing with two different regions of the target nucleic acid, and at least one of said probes (generally the detection probe) being capable of hybridizing with a region of the target which is specific for the species or group of species sought, it being understood that the capture probe and the detection probe must have nucleotide sequences at less partially different.
  • the capture probe and the detection probe must have nucleotide sequences at less partially different.
  • the nucleotide sequence of the rDNA corresponding to the ribosomal RNA was determined.
  • the invention provides:
  • RNA a single-stranded nucleotide fragment of the invention which comprises at least one series of 12 contiguous nucleotide motifs, belonging to a strand of the 23S ribosomal RNA of the species of the genus Chlamydia or to its complement, this series being chosen from any of the following groups consisting of regions of said RNA:
  • Group I 451-472, 542-570, 596-623, 731-756, 878-890, 996-1020, 1061-1094, 1123-1186, 1857-1880, 2234-2307, 2341-2370;
  • Group II 420-450, 473-514, 694-713, 756-790, 842-857, 927-937, 1231-1248, 1241-1319, 1371-1381, 1880-1895, 1943- 1961, 2151-2182 ;
  • a fragment of the invention comprises a series of at least 12 contiguous nucleotide motifs, included in a nucleotide sequence chosen from the sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 54, and their sequences complementary, or better still,
  • a probe for the specific detection of bacteria of the genus Chlamydia which comprises, or which advantageously consists of a series of at least 12, preferably 18, and better still 20, contiguous nucleotide motifs, included in a sequence chosen from the sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 12, their complementary sequences and their equivalent sequences;
  • a probe for the specific detection of bacteria of the Chlamydia trachomatis species which comprises, or which advantageously consists of a sequence of at least 12, preferably 18, or better still 20, contiguous nucleotide motifs included in a sequence chosen from the sequences SEQ ID NO: 13 to SEQ ID NO: 24, their complementary sequences and their equivalent sequences;
  • a probe for the specific detection of bacteria of the species Chlamydia pneumoniae which comprises, or which advantageously consists of a series of at least 12, preferably 18, or better still 20, contiguous nucleotide motifs, included in a sequence chosen from the sequences SEQ ID NO: 25 to SEQ ID NO: 39, their complementary sequences and their equivalent sequences;
  • a probe for the specific detection of bacteria of the species Chlamydia psittaci which comprises, or which advantageously consists of a series of at least 12, preferably 18, or better still 20, contiguous nucleotide motifs, included in a sequence chosen from sequences SEQ ID NO: 40 to SEQ ID NO: 54, their complementary sequences and their equivalent sequences.
  • a probe of the invention can be labeled with a tracer or immobilized on a solid support.
  • a therapy probe for the treatment of infections due to a specific species of Chlamydia which comprises or which consists of a series of at least 12, preferably 18, or better still 20, contiguous nucleotide motifs, included in a nucleotide sequence chosen from the sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 54, their complementary sequences and their equivalent sequences.
  • Another subject of the invention is a primer for the specific reverse transcription of a 23S ribosomal RNA sequence of a bacterium of the genus Chlamydia, into a complementary DNA sequence or a primer in particular for enzymatic amplification, such as only by chain polymerization reaction, of the DNA sequence complementary to a 23S ribosomal RNA sequence of Chlamydia, said primer comprising a sequence of at least 12, preferably 18, or better still 20, contiguous nucleotide motifs, included in a nucleotide sequence chosen from the sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 54, their complementary sequences and their equivalent sequences.
  • the invention also relates to a reagent for detecting and / or identifying and / or quantifying at least one species of Chlamydia, comprising at least one probe for the invention, and in particular a capture probe and a detection probe, one and / or the other meeting the definition of a probe according to the invention.
  • the reagent can comprise a mixture of probes of the invention for the purpose of detecting at least two species of Chlamydia.
  • the invention provides a method for detecting and / or identifying and / or quantifying, at least one species of Chlamydia, in a biological sample capable of containing at least one nucleic acid of said species, namely the 23S ribosomal RNA, extract of Chlamydiae, optionally denatured, or genomic DNA, extracted and denatured from bacteria, comprising the steps consisting in bringing said sample into contact with at least one probe of the invention, and in detecting the hybridization of said probe by formation of a hybridization complex between the probe and said nucleic acid.
  • an amplification of this DNA is carried out in the presence of a suitable enzymatic system and at least one amplification primer of the invention and optionally a primer eubacterial.
  • the Figure represents the nucleotide sequence of the ribosomal RNA 23S of serovar A of C. trachomatis, used as reference sequence to identify the zones of 1 ⁇ RNr 23S from other Chlamydiae species.
  • A denotes Adenine
  • G denotes Guanine
  • C denotes Cytosine
  • U Uracile
  • N any of the 4 bases mentioned above
  • * represents the absence of nucleotide at the position indicated.
  • EXAMPLE 1 Determination of the nucleotide sequence of the 23S ribosomal RNAs of Chlamydia
  • the nucleotide sequence of the 23S ribosomal RNA of the following 14 strains has been determined: C. trachomatis serovar A ATCC VR571B, Lot 6W, HAR13 / 92-02
  • Chlamydia trachomatis serovar A used as a reference sequence to determine the zones of 1 ⁇ RNr constituting the fragment of the invention is identified by SEQ ID NO: 55 and is shown in the figure.
  • the total nucleic acid of the strains was isolated by centrifugation in cesium chloride. PCR amplification products which cover 90% of the sequence were generated from ribosomal RNA using eubacterial specific amplification primers.
  • the amplification products obtained were directly sequenced by the chain termination method (Sanger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977, 74: 5463-5467), by thermal cyclization using a Taq DNA polymerase thermostable (Perkin) and migration on LICOR sequencer.
  • EXAMPLE 2 Use of a probe of the invention directed against 23S ribosomal RNA for the identification of Chlamydia trachomatis The specificity of the probe starting at nucleotide No. 9 and ending at nucleotide No. 25 of SEQ ID NOs: 15 to 26, for the species C. trachomatis was verified. Its sequence on the complementary strand is as follows: ACC CTT ACG GGC CAT TG.
  • a collection of various bacteria strains showing a section of 1 • bacterial phylogenetic tree was tested by PCR amplification of a conserved portion of the 23S ribosomal DNA using eubacterial primers. Each amplification product was tested with the putative C. trachomatis probe and the results confirmed the specificity of this probe.
  • the other bacterial species were cultivated according to good bacteriological practices (Manual of clinical microbiology, fifth edition. 1991. Balows et al. ASM Eds., Washington DC, USA).
  • a strain of each following species was selected: Mycobacterium hovis BCG, Staphylococcus aureus, Enterococcu ⁇ faecium, Listeria monocytogenes, Rhodobacter capsulata, Bordetella pertus ⁇ i ⁇ , Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Campylobacter jejuni, Leptospira interrogansor, Borreliaor.
  • These strains were lysed using various techniques and an aliquot of the lysate was resuspended in the PCR tube.
  • the amplification of a 900 base pair eubacterial fragment including the area to be tested was carried out according to the methodology of the following reference: Sallen et al. (1996) Comparative analysis of 16S and 23S rRNA sequences of Listeria species, Int. J. Sys. Bact. 46: 669-674.
  • the PCR amplification primers were identical: lf. TCC GAA TGG GGA AAC CC and lOr: GA (C / T) (C / T) AG TGA GCT RTT AC.
  • the hybridization of the amplified ribosomal DNAs was carried out according to the non-radioactive and i-automated detection method described in international patent application WO-91/19812 in the name of the Applicant and the content of which is incorporated into the present description. for reference.
  • a capture probe 27 nucleotides in C. trachomatis whose 3 'end corresponds to nucleotide N ° 30 of SEQ ID NO: 15 to 26 and of sequence TCA TCA TGC AAA AGG CAC GCC GUC AAC
  • an oligonucleotide detection conjugate corresponding to the probe defined at the start of Example 2 alkaline phosphatase are used.
  • the manipulation was carried out in 1 automaton
  • VIDAS registered trademark - marketed by bioMérieux-VITEK
  • the reaction chamber is SPR (trademark) ("Solid Phase Receptacle") which is a conical support made from a material sold under the name K resin (butadiene-styrene copolymer) and marketed by the company bioMérieux.
  • K resin butadiene-styrene copolymer
  • the various reagents are placed in a strip with several cuvettes and the different stages take place in the SPR which is capable of sucking and discharging the reagents and which therefore acts as a pipette.
  • the sandwich hybridization reaction occurs on the inner wall of the cone as described below.
  • the capture oligonucleotide comprising at its 5 ′ end, the ligand Aminolink 2 (Applied Biosystems- ref. 400808) at a concentration of 1 ng / ⁇ l in a volume of 315 ⁇ l of a 4x PBS solution (200 mM sodium phosphate pH 7.0, 600 mM NaCl). After overnight at room temperature or two hours at 37 ° C., the cones are washed twice with a PBS Tween solution, then dried under vacuum.
  • the strip contains reagents in cuvettes necessary for denaturation and detection, that is to say: soda, acetic acid, 200 ⁇ l of a solution at 0.1 ng / ⁇ l of the detection conjugate oligonucleotide-alkaline phosphatase, twice 600 ⁇ l of solution PBS Tween wash and a substrate bowl.
  • ORGANISM Chlamydia sp.
  • ORGANISM Chlamydia sp.
  • ORGANISM Chlamydia sp.
  • ORGANISM Chlamydia sp.
  • CACUAUGCAA ACCUCUAAGG GGAAGUAUAU GGUGUGACGC CUGCCCAAUG CCAAAAGGUU 60
  • ORGANISM Chlamydia sp.
  • ORGANISM Chlamydia sp.
  • ORGANISM Chlamydia sp.
  • ORGANISM Chlamydia sp.
  • ORGANISM Chlamydia trachomatis
  • ORGANISM Chlamydia trachomatis
  • ORGANISM Chlamydia trachomatis
  • ORGANISM Chlamydia trachomatis
  • ORGANISM Chlamydia trachomatis
  • ORGANISM Chlamydia trachomatis
  • ORGANISM Chlamydia trachomatis
  • ORGANISM Chlamydia trachomatis
  • ORGANISM Chlamydia trachomatis
  • ORGANISM Chlamydia pneumoniae
  • ORGANISM chlamydia pneumoniae (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 26: UCUGGAAAGU UGAACGAUAC AG 22
  • ORGANISM chlamydia pneumoniae
  • ORGANISM chlamydia pneumoniae
  • ORGANISM chlamydia pneumoniae (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 32: CACAAUGAGA CUGGUUAGUA GGC 23
  • ORGANISM Chlamydia pneumoniae
  • ORGANISM Chlamydia pneumoniae
  • ORGANISM Chlamydia pneumoniae
  • ORGANISM Chlamydia pneumoniae
  • ORGANISM Chlamydia pneumoniae
  • ORGANISM Chlamydia pneumoniae
  • ORGANISM Chlamydia pneumoniae
  • ORGANISM chlamydia psittaci
  • ORGANISM chlamydia psittaci
  • ORGANISM chlamydia psittaci
  • ORGANISM chlamydia psittaci
  • ORGANISM chlamydia psittaci
  • ORGANISM chlamydia psittaci
  • ORGANISM chlamydia psittaci
  • ORGANISM chlamydia psittaci
  • ORGANISM chlamydia psittaci

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Abstract

L'invention concerne un fragment nucléotidique monocaténaire comprenant au moins une suite de 12 motifs nucléotidiques contigus, appartenant à un brin de l'ARN ribosomique 23S des espèces du genre Chlamydia ou à son complémentaire, cette suite étant choisie dans l'un quelconque des groupes suivants constitués par des zones dudit ARN: Groupe I: 451-472, 542-570, 596-623, 731-756, 878-890, 996-1020, 1061-1094, 1123-1186, 1857-1880, 2234-2307, 2341-2370; Groupe II: 420-450, 473-514, 694-713, 756-790, 842-857, 927-937, 1231-1248, 1241-1319, 1371-1381, 1880-1895, 1943-1961, 2151-2182; Groupe III: 404-426, 436-457, 466-515, 683-722, 747-808, 817-863, 891-955, 1024-1055, 1208-1251, 1315-1350, 1407-1548, 1364-1388, 1576-1622, 1891-1918, 2148-218; le premier numéro correspondant à la position du premier nucléotide de ladite zone par rapport à la séquence nucléotidique de l'ARN ribosomique 23S du sérovar A de Chlamydia trachomatis, SEQ ID NO:55, choisie comme séquence de référence, et le second numéro correspondant à la position du dernier nucléotide de ladite zone par rapport à cette même séquence de référence, et utilisations de ce fragment comme sonde, amorce ainsi que dans un réactif et procédé de détection desdites bactéries.

Description

FRAGMENT NUCLEOTIDIQUE DE L'ARN 23S DE BACTERIES DU GENRE
CHLAMYDIA, UTILISATIONS COMME SONDE, AMORCE, ET DANS UN
REACTIF ET UN PROCEDE DE DETECTION
La présente invention relève du domaine des techniques de détection et/ou d'amplification, à l'aide de sondes ou d'amorces oligonucléotidiques, et leur application à la recherche de la présence ou à l'identification des bactéries du genre Chlamydia . Trois espèces de Chlamydia sont actuellement connues : Chlamydia trachomatis (sous-groupe A) qui est spécifique de l'homme et regroupe 15 sérovars, Chlamydia psittaci (sous-groupe B) qui est commensale chez les oiseaux et Chlamydia pneumoniae (souche Twar) . Le pouvoir pathogène de ces bactéries est très varié, aussi bien chez l'Homme que chez l'animal.
Chez l'Homme, Chlamydia trachomatis est notamment responsable d'urétrites, de cervicites ou de salpingites, de conjonctivites, du trachome pouvant conduire à la cécité, d'arthrites, de péri-hépatites ; deux autres formes cliniques sont également fréquentes, à savoir la conjonctivite du nouveau-né, infecté au cours de l'accouchement et la conjonctivite dite des piscines, contractée au cours d'un bain dans une piscine dont l'eau est souillée ; Chlamydia psittaci contamine l'homme par l'intermédiaire des excréments d'oiseaux, provoquant des atteintes telles que des pneumopathies bénignes (ornithoses) ou plus graves (psittacose) et des pseudogrippes ; enfin, Chlamydia pneumoniae a été isolée en 1965 à partir d'un prélèvement conjonctival lors d'une campagne vaccinale contre le trachome et en 1983 à partir d'un prélèvement pharyngé lors d'une épidémie de maladies respiratoires aiguës aux Etats Unis. Récemment, les travaux de F. Blasi et al. (Journal of Clinical Microbiology, (Nov. 1996) 2766-2769) ont mis en évidence l'implication directe de C . pneumonia dans l'étiologie de 1 • athérosclérose.
Pendant longtemps, le diagnostic des infections dues aux Chlamydiae reposait : - sur l'examen direct des frottis réalisés à partir de prélèvements obtenus par grattages conjonctivaux, urétraux, cervicaux ou ano-rectaux ; toutefois, cette technique est délicate car il est nécessaire que les cellules soient correctement étalées et séparées les unes des autres afin de permettre, après coloration, de mettre en évidence les inclusions intracellulaires caractéristiques des infections à Chlamydia ;
- sur 1 ' isolement du germe par culture ; Néanmoins, les Chlamydia sont des bactéries particulièrement fragiles, parasites intracellulaires obligatoires qui ne se multiplient que sur des milieux vivants tels que les oeufs e bryonnés ou les cultures cellulaires (cellules McCoy ou Hela 299) ; pendant de nombreuses années, seule l'inoculation de l'oeuf embryonne était pratiquée par des laboratoires spécialisés, et bien que les cultures cellulaires soient désormais utilisées, cette technique demeure lourde à mettre en oeuvre et toujours réservée à certains laboratoires ; - sur le diagnostic immunologique reposant soit sur des techniques im unoenzymatiques (ELISA) ou d1 imraunofluorescence (IF), soit sur des réactions de fixation du complément (RFC) .
Toutefois, ces différentes techniques ne permettaient pas un diagnostic rapide et fiable en dehors d'un contexte épidémiologique évident. Il était donc important de développer un test de diagnostic bactériologique suffisamment spécifique et sensible pour permettre une détection rapide et sélective, dans un échantillon, de bactéries appartenant au genre Chlamydia, et notamment de Chlamydia trachomatis . Une première génération de tests rapides a été proposée, basée sur les techniques d'hybridation in situ (DUTIHL et al., Ann. Microbiol. 1988, 139, 115-118). Toutefois, ce test utilisant l'ADN chromosomique total de Chlamydia trachomatis marqué comme sonde oligonucléique manque de spécificité. En effet, cet ADN renferme un grand nombre de séquences communes avec le génome d'autres bactéries qui peuvent conduire à des tests de détection faussement positifs. En outre, la préparation de telles sondes est délicate en raison notamment de leur mode de préparation et de leur taille importante.
D'autres tests de détection des Chlamydia ont été développés reposant sur des tests d'amplification et de détection d'acide nucléique (par exemple le test commercialisé par la société Hoffman la Roche reposant sur la détection d'une portion du gène cryptique propre à l'espèce Chlamydia trachomatis ou le test commercialisé par la société Abbott reposant sur la mise en évidence du gène codant pour la protéine majeure de la membrane externe des Chlamydiae appelée MOMP) .
Les ribosomes bactériens contiennent au moins trois molécules d'ARN ribosomique distinctes appelées ARN 5S, 16S et 23S. Selon le procédé mis en oeuvre dans la présente invention, l'ARN ribosomique des bactéries peut être utilisé comme cible.
L'utilisation de l'ARN 16S des Chlamydiae dans le diagnostic des infections dues à ces germes a été décrite en 1990 par la société Genprobe qui a développé un kit de détection par chimioluminescence (PACE 2-Assay) . On a maintenant découvert des sondes nucléotidiques ayant pour cible l'ARN 23S des Chlamydiae , qui permettent de discriminer au moins un groupe d'espèces du genre Chlamydia d'autres genres ou groupes de genres bactériens. Avant d'exposer plus en détail l'invention, différents termes utilisés dans la description et les revendications sont définis ci-après :
- par "acide nucléique extrait de bactéries" on entend soit l'acide nucléique total, soit l'ARN ribosomique, en particulier l'ARNr 23S. soit l'ADN génomique, soit encore l'ADN obtenu à partir de la transcription inverse de l'ARN ribosomique 23S ;
- un "fragment nucléotidique", ou un "oligonucléotide" sont deux termes synonymes désignant un enchaînement de motifs nucléotidiques caractérisé par la séquence informationnelle des acides nucléiques naturels (ou éventuellement modifiés) et susceptibles de s'hybrider, comme les acides nucléiques naturels avec un fragment nucléotidique complémentaire ou sensiblement complémentaire, dans des conditions prédéterminées ; l'enchaînement peut contenir des motifs nucléotidiques de structure différente de celle des acides nucléiques naturels ; un fragment nucléotidique (ou oligonucléotide) peut contenir par exemple jusqu'à 100 motifs nucléotidiques ; il contient généralement au moins 12 motifs nucléotidiques et peut être obtenu à partir d'une molécule d'acide nucléique naturelle et/ou par recombinaison génétique et/ou par synthèse chimique ; - un motif nucléotidique est dérivé d'un monomère qui peut être un nucleotide naturel d'acide nucléique dont les éléments constitutifs sont un sucre, un groupement phosphate et une base azotée ; dans l'ADN le sucre est le désoxy-2-ribose, dans l'ARN le sucre est le ribose ; selon qu'il s'agit d'ADN ou d'ARN, la base azotée est choisie parmi l'adénine, la guanine, l'uracile, la cytosine, la thymine ; ou bien le monomère est un nucleotide modifié dans l'un au moins des trois éléments constitutifs ; à titre d'exemple, la modification peut intervenir, soit au niveau des bases, avec des bases modifiées telles que l'inosine, la méthyl-5-désoxycytidine, la désoxyuridine, la diméthylamino-5-désoxyuridine, la diamino-2 , 6-purine, la bromo-5-désoxyuridine ou toute autre base modifiée capable d'hybridation, soit au niveau du sucre, par exemple le remplacement d ' au moins un désoxyribose par un polyamide (P.E. Nielsen et al, Science, 254, 1497-1500 (1991)), soit encore au niveau du groupement phosphate, par exemple son remplacement par des esters notamment choisis parmi les diphosphates, alkyl- et aryl- phosphonates et phosphorothioates ; - par "séquence informationnelle", on entend toute suite ordonnée de motifs de type nucléotidique, dont la nature chimique et 1 ' ordre dans un sens de référence constituent une information analogue à celle donnée par la séquence des acides nucléiques naturels ; - par "hybridation", on entend le processus au cours duquel, dans des conditions appropriées, deux fragments nucléotidiques ayant des séquences suffisamment complémentaires sont susceptibles de s'associer par des liaisons hydrogène stables et spécifiques, pour former un double brin ; les conditions d'hybridation sont déterminées par la "stringence" , c'est-à-dire la rigueur des conditions opératoires ; l'hybridation est d'autant plus spécifique qu'elle est effectuée à plus forte stringence ; la stringence est fonction notamment de la composition en bases d'un duplex sonde/cible, ainsi que par le degré de mésappariement entre deux acides nucléiques ; la stringence peut également être fonction des paramètres de la réaction d'hybridation, tels que la concentration et le type d ' espèces ioniques présentes dans la solution d'hybridation, la nature et la concentration d'agents dénaturants et/ou la température d'hybridation ; la stringence des conditions dans lesquelles une réaction d'hybridation doit être réalisée dépend notamment des sondes utilisées ; toutes ces données sont bien connues et les conditions appropriées peuvent éventuellement être déterminées dans chaque cas par des expériences de routine ; en général, selon la longueur des sondes utilisées, la température pour la réaction d'hybridation est comprise entre environ 20 et 65°C, en particulier entre 35 et 65°C dans une solution saline à une concentration d'environ 0,3 à 1M ; en particulier, dans les conditions d'hybridation selon la présente invention, on choisit une température de 37 °C + 1°C, dans une solution saline PBS 3x (NaCl 0,45 M ; phosphate de sodium 0,15 M) - une "sonde" est un fragment nucléotidique comprenant par exemple de 12 à 100 motifs nucléotidiques, notamment de 12 à 35 motifs nucléotidiques, possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec un acide nucléique cible ayant, dans le cas présent, une séquence nucléotidique comprise soit dans un ARN ribosomique, soit dans un ADN obtenu par transcription inverse dudit ARN ribosomique, soit encore dans un ADN (appelé ici ADN ribosomique ou ADNr) dont ledit ARN ribosomique est le produit de transcription ; une sonde peut être utilisée à des fins de diagnostic (notamment sondes de capture ou de détection) ou à des fins de thérapie ;
- une "sonde de capture" est immobilisée ou immobilisable sur un support solide par tout moyen approprié, par exemple par covalence, par adsorption, ou par synthèse directe sur un support solide (voir notamment la demande de brevet WO 92/10092) ;
- une "sonde de détection" peut être marquée au moyen d'un marqueur choisi par exemple parmi les isotopes radioactifs, des enzymes, en particulier des enzymes susceptibles d'agir sur un substrat chromogène, fluorigène ou luminescent (notamment une peroxydase ou une phosphatase alcaline) , des composés chimiques chromophor s , des composés chromogènes, fluorigènes ou luminescents, des analogues de bases nucléotidiques, et des ligands tels que la biotine ; - une sonde de l'invention peut aussi être utilisée à des fins thérapeutiques, comme une sonde anti-sens susceptible d'inhiber la synthèse protéique en bloquant spécifiquement la traduction des ARN messagers en protéines. - une "amorce" est une sonde comprenant par exemple de 12 à 100 motifs nucléotidiques et possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour l'initiation d'une polymérisation enzymatique, par exemple dans une technique d'amplification telle que la PCR (Polymerase Chain Reaction) , dans un procédé de séquençage, dans une méthode de transcription inverse, etc.
Les sondes selon l'invention peuvent être utilisées, à des fins de diagnostic, dans la recherche de la présence ou de l'absence d'un acide nucléique cible dans un échantillon, selon toutes les techniques d'hybridation connues et notamment les techniques de dépôt ponctuel sur filtre, dites "DOT-BLOT" (MANIATIS et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1982) , les techniques de transfert d'ADN dites "SOUTHERN BLOT" (SOUTHERN. E.M. , J. Mol. Biol., S58., 503 (1975)), les techniques de transfert d'ARN dites "NORTHERN BLOT", ou les techniques dites "sandwich" (DUNN A.R. , HASSEL J.A. , Cell, 12, 23 (1977)) ; on utilise en particulier la technique sandwich, avec une sonde de capture et/ou une sonde de détection, lesdites sondes étant capables de s'hybrider avec deux régions différentes de l'acide nucléique cible, et l'une au moins desdites sondes (généralement la sonde de détection) étant capable de s'hybrider avec une région de la cible qui est spécifique de l'espèce ou du groupe d'espèces recherché, étant entendu que la sonde de capture et la sonde de détection doivent avoir des séquences nucléotidiques au moins partiellement différentes. - par "séquence équivalente" à une séquence typiquement décrite selon la présente invention, on comprend une séquence qui, dans des conditions d'hybridation prédéterminées, telles que celles définies précédemment, assure la même spécificité que la séquence décrite.
Dans des conditions qui sont précisées dans l'exemple 1 ci-après, on a déterminé la séquence nucléotidique de l'ADNr correspondant à l'ARN ribosomique
23S de 12 sérovars de Chlamydia trachomatis et d'une souche de C. psittaci et de C. pneumoniae .
Ainsi, l'invention apporte :
(a) un fragment nucléotidique monocaténaire de l'invention qui comprend au moins une suite de 12 motifs nucléotidiques contigus, appartenant à un brin de l'ARN ribosomique 23S des espèces du genre Chlamydia ou à son complémentaire, cette suite étant choisie dans l'un quelconque des groupes suivants constitués par des zones dudit ARN :
Groupe I : 451-472, 542-570, 596-623, 731-756, 878-890, 996-1020, 1061-1094, 1123-1186, 1857-1880, 2234-2307, 2341-2370 ; Groupe II : 420-450, 473-514, 694-713, 756-790, 842-857, 927-937, 1231-1248, 1241-1319, 1371-1381, 1880-1895, 1943- 1961, 2151-2182 ;
Groupe III : 404-426, 436-457, 466-515, 683-722, 747-808, 817-863, 891-955, 1024-1055, 1208-1251, 1315-1350, 1407- 1548, 1364-1388, 1576-1622, 1891-1918, 2148-218 ; le premier numéro correspondant à la position du premier nucleotide de ladite zone par rapport à la séquence nucléotidique de l'ARN ribosomique 23S du sérovar A de Chlamydia trachomatis , SEQ ID NO: 55, choisie comme séquence de référence et illustrée sur la Figure, et le second numéro correspondant à la position du dernier nucleotide de ladite zone par rapport à cette même séquence de référence ; de préférence, un fragment de l'invention comprend une suite d'au moins 12 motifs nucléotidiques contigus, incluse dans une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID NO: 1 et SEQ ID NO: 3 à SEQ ID NO: 54, et leurs séquences complémentaires, ou mieux encore, ledit fragment consiste en une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID NO: 1 et SEQ ID NO: 3 à SEQ ID NO: 54, et leurs séquences complémentaires ; (b) un fragment nucléotidique monocaténaire d'ADN, obtenu par transcription inverse d'un fragment nucléotidique ci-dessus défini selon (a) , ou son fragment complémentaire ;
(c) un fragment nucléotidique monocatênaire d'ADN génomique, dont le produit de transcription est un fragment nucléotidique ci-dessus défini selon (a) , ou son fragment complémentaire.
D'autres objets de l'invention sont les suivants :
(d) une sonde pour la détection spécifique de bactéries du genre Chlamydia, qui comprend, ou qui avantageusement consiste en une suite d'au moins 12, de préférence 18, ou mieux encore 20, motifs nucléotidiques contigus, incluse dans une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO: 1 et SEQ ID NO: 3 à SEQ ID NO: 12, leurs séquences complémentaires et leurs séquences équivalentes ;
(e) une sonde pour la détection spécifique de bactéries de l'espèce Chlamydia trachomatis , qui comprend, ou qui avantageusement consiste en une suite d'au moins 12, de préférence 18, ou mieux encore 20, motifs nucléotidiques contigus incluse dans une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO: 13 à SEQ ID NO: 24, leurs séquences complémentaires et leurs séquences équivalentes ; (f) une sonde pour la détection spécifique de bactéries de l'espèce Chlamydia pneumoniae , qui comprend, ou qui avantageusement consiste en une suite d'au moins 12, de préférence 18, ou mieux encore 20, motifs nucléotidiques contigus, incluse dans une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO: 25 à SEQ ID NO: 39, leurs séquences complémentaires et leurs séquences équivalentes ;
(g) une sonde pour la détection spécifique de bactéries de l'espèce Chlamydia psittaci , qui comprend, ou qui avantageusement consiste en une suite d'au moins 12, de préférence 18, ou mieux encore 20, motifs nucléotidiques contigus, incluse dans une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO: 40 à SEQ ID NO: 54, leurs séquences complémentaires et leurs séquences équivalentes. Comme dit précédemment, une sonde de l'invention peut être marqué par un traceur ou immobilisée sur un support solide.
(h) une sonde de thérapie pour le traitement des infections dues à une espèce déterminée de Chlamydia, qui comprend ou qui consiste en une suite d'au moins 12, de préférence 18, ou mieux encore 20, motifs nucléotidiques contigus, incluse dans une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID NO: 1 et SEQ ID NO: 3 à SEQ ID NO: 54, leurs séquences complémentaires et leurs séquences équivalentes.
Un autre objet de l'invention est une amorce pour la transcription inverse spécifique d'une séquence d'ARN ribosomique 23S d'une bactérie du genre Chlamydia , en une séquence d'ADN complémentaire ou une amorce notamment pour l'amplification enzymatique, telle que par réaction de polymérisation en chaîne, de la séquence d'ADN complémentaire à une séquence d'ARN ribosomique 23S des Chlamydia, ladite amorce comprenant une suite d'au moins 12, de préférence 18, ou mieux encore 20, motifs nucléotidiques contigus, incluse dans une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID NO: 1 et SEQ ID NO: 3 à SEQ ID NO: 54, leurs séquences complémentaires et leurs séquences équivalentes.
L'invention concerne aussi un réactif pour détecter et/ou identifier et/ou quantifier, au moins une espèce de Chlamydia , comprenant au moins une sonde de l'invention, et en particulier une sonde de capture et une sonde de détection, l'une et/ou l'autre répondant à la définition d'une sonde selon l'invention.
Le réactif peut comprendre un mélange de sondes de 1 ' invention dans le but de détecter au moins deux espèces de Chlamydia .
Enfin, l'invention apporte un procédé pour détecter et/ou identifier et/ou quantifier, au moins une espèce de Chlamydia , dans un échantillon biologique susceptible de contenir au moins un acide nucléique de ladite espèce, à savoir l'ARN ribosomique 23S, extrait des Chlamydiae , éventuellement dénaturé, ou l'ADN génomique, extrait et dénaturé des bactéries, comprenant les étapes consistant à mettre en contact ledit échantillon avec au moins une sonde de l'invention, et à détecter l'hybridation de ladite sonde par la formation d'un complexe d'hybridation entre la sonde et ledit acide nucléique. De manière préférentielle, avant d'exposer l'ADN à la sonde de l'invention, on réalise une amplification de cet ADN en présence d'un système enzymatique adapté et au moins une amorce d'amplification de l'invention et éventuellement une amorce eubactérienne.
L'invention et certaines de ces applications sont exposées ci-après avec les exemples 1 et 2. La Figure représente la séquence nucléotidique de l'ARN ribosomique 23S du sérovar A de C. trachomatis , utilisée comme séquence de référence pour identifier les zones de 1 ΑRNr 23S des autres espèces de Chlamydiae . Dans cette séquence, A désigne l'Adénine, G la Guanine, C la Cytosine, U l'Uracile, N l'une quelconque des 4 bases précitées, * figure l'absence de nucleotide à la position indiquée.
EXEMPLE 1 : Détermination de la séquence nucléotidique des ARN ribosomiques 23S des Chlamydia La séquence nucléotidique de l'ARN ribosomique 23S des 14 souches suivantes a été déterminée: C. trachomatis sérovar A ATCC VR571B, Lot 6W, HAR13/92-02
C. trachomatis sérovar C ATCC VR572, Lot 8, HAR-32/89-01 C. trachomatis sérovar D ATCC VR 885, Lot 8, VW-3/Cx/03-89
C. trachomatis sérovar Ba ATCC VR-347, Lot 6, Apache-2/90-04
C. trachomatis sérovar E ATCC VR3488, Baur Lot 8 /92-02
C trachomatis sérovar F ATCC VR346, K-Cal-3, Lot 1OW/92-02
C. trachomatis sérovar G ATCC 878, Lot 7, 6/4/86 C trachomatis sérovar H ATCC VR-879, Lot 8W, UW-43/CX/92-12
C trachomatis sérovar I ATCC VR 880, UW-12/UR, Lot 1OW/92-08
C. trachomatis sérovar K ATCC VR887, VW-32/CX, Lot 13 W/92-02
C. trachomatis sérovar LGV2 ATCC 434, Lot 13W/92-10
C. trachomatis sérovar LGV3 ATCC VR903, Lot 6/90-03 C. pneumoniae TWAR
C. psittaci Borg
La séquence de Chlamydia trachomatis sérovar A, utilisée comme séquence de référence pour déterminer les zones de 1 ΑRNr constitutives du fragment de l'invention est identifiée par SEQ ID NO: 55 et est représentée sur la figure.
L'acide nucléique total des souches a été isolé par centrifugation en chlorure de césium. Des produits d'amplification PCR qui couvrent 90% de la séquence ont été générés à partir de l'ARN ribosomique à l'aide d'amorces d'amplification de spécificité eubactérienne.
Les produits d'amplification obtenus ont été directement séquences par la méthode de terminaison de chaîne (Sanger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977, 74: 5463-5467), par cyclisation thermique utilisant une Taq ADN polymérase thermostable (Perkin) et migration sur sêquenceur LICOR.
EXEMPLE 2 : Utilisation d'une sonde de l'invention dirigée contre l'ARN ribosomique 23S pour l'identification de Chlamydia trachomatis La spécificité de la sonde commençant au nucleotide N°9 et finissant au nucleotide N°25 des SEQ ID NO: 15 à 26, pour l'espèce C. trachomatis a été vérifiée. Sa séquence sur le brin complémentaire est la suivante: ACC CTT ACG GGC CAT TG.
Une collection de souches de bactéries diverses représentant une coupe de 1 • arbre phylogénique bactérien a été testée par amplification PCR d'une portion conservée de l'ADN ribosomique 23S à l'aide d'amorces eubactérienne. Chaque produit d'amplification a été testé avec la sonde C. trachomatis putative et les résultats ont confirmé la spécificité de cette sonde.
Les différents sérovars de C. trachomatis et les isolats de C. psittaci et de C. pneumoniae ont été cultivés en cellule McCoy monocouche. Ces cultures ont été récupérées et un aliquote de 10 μl a été directement resuspendu dans le tube d'amplification PCR.
Les autres espèces bactériennes ont été cultivées selon les bonnes pratiques de bactériologie (Manual of clinical microbiology, fifth édition. 1991. Balows et al. ASM Eds., Washington DC, USA). Une souche de chaque espèce suivante a été sélectionnée : Mycobacterium hovis BCG, Staphylococcus aureus, Enterococcuε faecium, Listeria monocytogenes , Rhodobacter capsulata, Bordetella pertusεiε, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Campylobacter jejuni, Leptospira interrogans, Borrelia burgdorferi . Ces souches ont été lysées selon diverses techniques et un aliquote du lysat a été resuspendu dans le tube PCR.
L'amplification d'un fragment eubactérien de 900 paires de base incluant la zone à tester a été effectué selon la méthodologie de la référence suivante: Sallen et al. (1996) Comparative analysis of 16S and 23S rRNA séquences of Listeria species, Int. J. Sys. Bact. 46: 669-674. Les amorces d'amplification PCR étaient identiques: lf. TCC GAA TGG GGA AAC CC et lOr: GA(C/T) (C/T)AG TGA GCT RTT AC.
L'hybridation des ADN ribosomiques amplifiés a été conduite selon le procédé de détection non-radioactif et se i-automatisé décrit dans la demande de brevet internationale WO-91/19812 au nom de la Demanderesse et dont le contenu est incorporé à la présente description à titre de référence. Une sonde de capture (27 nucléotides chez C. trachomatis dont l'extrémité 3' correspond au nucleotide N°30 des SEQ ID NO: 15 à 26 et de séquence TCA TCA TGC AAA AGG CAC GCC GUC AAC) et un conjugué de détection oligonucléotide (correspondant à la sonde définie au début de l'exemple 2) phosphatase alcaline sont utilisés. La manipulation a été conduite dans 1 ' automate
VIDAS (marque déposée - commercialisé par la société bioMérieux-VITEK) . La chambre de réaction est le SPR (marque de commerce) ("Solid Phase Réceptacle") qui est un support conique réalisé à partir d'un matériau vendu sous la dénomination K résine (copolymere butadiène-styrène) et commercialisé par la société bioMérieux. Les divers réactifs sont disposés dans une barrette à plusieurs cuvettes et les différentes étapes se déroulent dans le SPR qui est capable d'aspirer et de refouler les réactifs et qui fait donc office de pipette. La réaction d'hybridation sandwich se produit sur la paroi interne du cône tel que décrit cidessous.
Sur la surface interne du SPR, est fixé passivement l' oligonucléotide de capture comportant à son extrémité 5', le ligand Aminolink 2 (Applied Biosystems- réf.400808) à une concentration de 1 ng/μl dans un volume de 315 μl d'une solution de PBS 4x (phosphate de sodium 200 mM pH 7,0, NaCl 600 mM) . Après une nuit à température ambiante ou deux heures à 37 °C, les cônes sont lavés 2 fois par une solution PBS Tween, puis séchés sous vide. La barrette contient dans des cuvettes les réactifs nécessaires à la dénaturation et à la détection, c'est-à- dire : soude, acide acétique, 200 μl d'une solution à 0,1 ng/μl du conjugué de détection oligonucléotide- phosphatase alcaline, 2 fois 600 μl de solution de lavage PBS Tween et une cuvette de substrat.
Dans le premier puits de la barrette, sont déposés 10 μl du produit PCR à tester. Après dénaturation et neutralisation, le produit est incubé 30 minutes avec la sonde de détection, le cône est lavé 2 fois par une solution de PBS Tween. 250 μl de substrat MUP (méthyl-4 umbelliféryl phosphate) en solution dans un tampon diéthanola ine sont aspirés dans le cône, puis relâchés dans une cuvette de lecture. L'appareil mesure le signal fluorescent exprimé en URF (unités relatives de fluorescence) de la cuvette.
Les résultats obtenus indiquent que la combinaison de sondes utilisée est spécifique de C. trachomatis . Elle ne présente pas de réactions croisées avec les acides nucléiques, en particulier l'ADN ribosomique, des espèces représentant les familles bactériennes (coupe phylogénique) . On a contrôlé que les ADN ribosomiques- cibles des autres espèces étaient bien disponibles pour l'hybridation en visualisant ces produits d'amplification sur gel d'agarose.
LISTAGE DE SEQUENCES
(1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: BIO MERIEUX
(B) RUE: Chemin de l'Orme
(C) VILLE: MARCY L'ETOILE
(D) ETAT OU PROVINCE: (E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 69280
(ii) TITRE DE L'INVENTION: Fragment nucléotidique de l'ARNr 23S de bactéries du genre Chlamydia, utilisations comme sonde, amorce et dans un réactif et un procédé de détection.
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 55
(iv) ADRESSE DE CORRESPONDANCE: (A) NOM: Cabinet GERMAIN & MAUREAU
(B) RUE: 12 rue Boileau
(C) VILLE: LYON
(D) PAYS: FRANCE
(E) CODE POSTAL: 69006 (F) TELEPHONE: 04 72 69 84 30
(G) TELEFAX: 04 72 69 84 31
(v) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: disquette 3,5 pouces DS, HD (B) ORDINATEUR: EPSON (compatible IBM)
(C) SYSTEME D'EXPLOITATION: DOS
(D) LOGICIEL: MICROSOFT WORD POUR WINDOWS (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1 :
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 22 paires de bases
(B) TYPE: nucl otide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linçaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ARNr
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Chlamydia sp.
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1: GAUACAGGGU GAUAGUCCCG UA 22
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 7 paires de bases
(B) TYPE: nuclç'otide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linçaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ARNr
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Chlamydia sp.
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ED NO: 2: UAGUCCC 7
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 29 paires de bases
(B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linfaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ARNr
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Chlamydia sp.
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ DD NO: 3: CUAGUCUGAA UCUGGGGAGA CCACUCUCC 29
(2) INFORMAΗONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 23 paires de bases
(B) TYPE: nucl otide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linfaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ARNr
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Chlamydia sp.
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4: GUUAAGCACG CGGACGAUUG GAA 23
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 74 paires de bases
(B) TYPE: nuclfotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linfaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ARNr
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Chlamydia sp. (xi) DESCRIPTION E LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
CACUAUGCAA ACCUCUAAGG GGAAGUAUAU GGUGUGACGC CUGCCCAAUG CCAAAAGGUU 60
AAAGGGAUAU GUCA 74
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases
(B) TYPE: nuclfotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linfaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ARNr
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Chlamydia sp.
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6: UGGUGAAUGG CCGCCGUAAC UAUAACGGUG 30
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 28 paires de bases
(B) TYPE: nuclfotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: lin^ire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ARNr
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Chlamydia sp.
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7: AUAGUGAACC AGUACUGUGA AGGAAAGG 28
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 25 paires de bases
(B) TYPE: nuclfttide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: lin&ire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ARNr
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Chlamydia sp. (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8: UUGCAUGAUG AGCCAGGGAG UUAAG 25
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 13 paires de bases
(B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linfaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ARNr
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Chlamydia sp.
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9: CUAUUUAUGA CCA 13
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 10:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 25 paires de bases
(B) TYPE: nuclfotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linfaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ARNr
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Chamydia sp.
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10: UCUUGUUCUC UCCGAAAUAA CUUUA 25
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 11 :
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 33 paires de bases
(B) TYPE: nuclfotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linçaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ARNr
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Chlamydia sp. (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11 : CUGAAUUCUA GCGGGGGCCU ACCGGCUUAC CAA 33
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 12:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 60 paires de bases
(B) TYPE: nuclfotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linjaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ARNr
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Chlamydia sp.
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12:
GAGUCCGGGA GAUAGACAGC GGGGGCUAAG CUUCGUUGUC GAGAGGGGAA CAGCCCAGAC 60
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 13:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 73 paires de bases
(B) TYPE: nuclçotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linçaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ARNr
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Chlamydia trachomatis
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ED NO: 13:
AGACAGUUGG AAUGUUGGCU UAGAGGCAGC AAUCAUUUAA AGAGUGCGUA ACAGCUCACC 60
AAUCGAGAAU CAU 73
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ED NO: 14:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 31 paires de bases
(B) TYPE: nuclfotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: lin^ire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ARNr (vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Chlamydia trachomatis
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 14: CUCCUAGUUG AACACAUCUG GAAAGAUGGA U 31
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 15:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 29 paires de bases
(B) TYPE: nuclfotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ARNr
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Chlamydia trachomatis
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 15: GACGAAAGGA GAGAAAGACC GACCUCAAC 29
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 16:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 paires de bases
(B) TYPE: nuclçotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linfaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ARNr
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Chlamydia trachomatis
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 16: CAAUGGCCCG UAAGGGUCAA 20
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 17:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 41 paires de bases
(B) TYPE: nuclfotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linfaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ARNr (vi) ORIGINE: (A) ORGANISME: Chlamydia trachomatis 23
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 17: GCUAAACGGC GAGGUUAAGG GAUAUACAUU CCGGAGCCGG A 41
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 18:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 16 paires de bases
(B) TYPE: nuclfotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linçaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ARNr
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Chlamydia trachomatis
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 18: AAGAGUCGUU UGGUUU 16
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 19:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 11 paires de bases
(B) TYPE: nuclfotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ARNr
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Chlamydia trachomatis
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 19: CUAGUACCUG U 11
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 20:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 18 paires de bases
(B) TYPE: nuclfotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linfaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ARNr
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Chlamydia trachomatis (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ED NO: 20: GAUGAUUCGA AGACAGUU 18
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 21:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 11 paires de bases
(B) TYPE: nuclfotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linçaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ARNr
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Chlamydia trachomatis
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 21: GUCGAUAAGA C 11
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ED NO: 22:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 16 paires de bases
(B) TYPE: nuclfotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linçaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ARNr
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Chlamydia trachomatis
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 22: AGAGUCCGUA GAGCGA 16
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ED NO: 23:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 19 paires de bases
(B) TYPE: nuclfotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linçaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ARNr
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Chlamydia trachomatis (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 23:
GGUCGCGAUC AAGGGGAAU 19
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 24:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 31 paires de bases
(B) TYPE: nuclçbtide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linçaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ARNr
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Chlamydia trachomatis
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ED NO: 24: UUUUAGGGUG ACUAUGGAAC GAUAGGAGCC C 31
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 25:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 26 paires de bases
(B) TYPE: nuclç'otide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linçaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ARNr
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Chlamydia pneumoniae
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 25: CGAUAACAUG GGAUCUUAAG UUUUAG 26
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 26:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 22 paires de bases
(B) TYPE: nuclç'otide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linçaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ARNr
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: chlamydia pneumoniae (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 26: UCUGGAAAGU UGAACGAUAC AG 22
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 27:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 36 paires de bases
(B) TYPE: nuclfotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ARNr
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: chlamydia pneumoniae
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 27: UCCCGUAAAC GAAAAAACAA AAGACGCUAA UCGAUA 36
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 28:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 37 paires de bases
(B) TYPE: nucl otide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linçaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ARNr
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Chlamydia peumoniae
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 28: UCGGAGACCU AUAACUCUUC GGAGUAAUGG UUGACGG 37
(2) INFORMAΗONS POUR LA SEQ ED NO: 29:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 61 paires de bases
(B) TYPE: nuclç'otide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linfaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ARNr
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: CHLAMYDIA PNEUMONIAE (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 29:
GGAGUUAAGU UAAACGGCGAGAUUAAGGGA UUUACAUUCC GGAGUCGAAG CGAAAGCGAG 60
U 61
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 30:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 32 paires de bases
(B) TYPE: nuclfotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linfaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ARNr
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: CHLAMYDIA PNEUMONIAE
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 30: UCAUCGCGCC AAUAAUGAUC GGGCUCAAGC AU 32
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 31 :
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 19 paires de bases
(B) TYPE: nuclfotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linfaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ARNr
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: chlamydia pneumoniae
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 31 : CGGGUGUAUA UUAUGUAUA 19
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 32:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 23 paires de bases
(B) TYPE: nuclfotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ARNr
(vi) ORIGINE.
(A) ORGANISME: chlamydia pneumoniae (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 32: CACAAUGAGA CUGGUUAGUA GGC 23
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 33:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 37 paires de bases
(B) TYPE: nuclfotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linfaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ARNr
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Chlamydia pneumoniae
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ED NO: 33: GCCUCUUAAG GUGAUUACCC AGCGGUAUGA GCCUCGG 37
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 34:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 37 paires de bases
(B) TYPE: nuclfotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: Impure
(ii) TYPE DE MOLECULE: ARNr
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Chlamydia pneumoniae
(B) SOUCHE: TWAR
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 34: UAUUCAGCAG UGAAGGUAUA CCGAAAGGAG UGCUGGA 37
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 35:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 47 paires de bases
(B) TYPE: nuclçotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linfaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ARNr
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Chlamydia pneumoniae
(B) SOUCHE: TWAR (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 35: AAGUAACGAU AAAGGAAGUG AAAAUCUUCC UCGCCGUAAG CCCAAGG 47
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 36:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 26 paires de bases
(B) TYPE: nuclfotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linçaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ARNr
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Chlamydia pneumoniae
(B) SOUCHE: TWAR
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ED NO: 36: AGCGUUUUAG UCGUUUGAUU UAGACA 26
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 37:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 65 paires de bases
(B) TYPE: nuclfotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple P) CONFIGURATION: linfaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ARNr
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Chlamydia pneumoniae
(B) SOUCHE: TWAR
(xi) DESCRIPTION DE LASEQUENCE: SEQID NO: 37:
GGUUGCAGCAUUGGUAAGAC UUUGUGGAGG ACCGAACCAG UACAUGUUGA AAAAUGUUUG 60
GAUGA 65
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 38:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 31 paires de bases
(B) TYPE: nuclfotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linçaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ARNr
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Chlamydia pneumoniae
(B) SOUCHE: TWAR
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 38: UUAGCCUCGG AUAUUAAGUU UUUGGGGGUA G 31
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 39:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 44 paires de bases
(B) TYPE: nuclfotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linçaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ARNr
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Chlamydia pneumoniae
(B) SOUCHE: TWAR
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 39: UUAUGCUAAG UGAGUAAGGA AGUGAUAAUU CUAAGACAGU UGGA 44
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 40:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 26 paires de bases
(B) TYPE: nuclfotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURAΉON: linçaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ARNr
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: chlamydia psittaci
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 40: CGAUAACAUG GGCUCUUAAG UUUUAG 26
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 41:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 22 paires de bases
(B) TYPE: nuclçόtide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ARNr
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: chlamydia psittaci
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 41: UCUGGAAAGU AGAACGAUAC AG 22
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 42:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 36 paires de bases
(B) TYPE: nuclfotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linçaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ARNr
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: chlamydia psittaci
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 42: UCCCGUAGAC GAAAAAACAA GAGACUCUAU UCGAUA 36
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ED NO: 43:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 39 paires de bases
(B) TYPE: nuclfotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linçaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ARNr
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: chlamydia psittaci
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 43: UCGGAGACCU AUAACUUCUU AGGAAGUCAU GGUUGACGG 39
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 44:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 61 paires de bases
(B) TYPE: nuclfotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linjaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ARNr
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: chlamydia psittaci
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 44:
GGAGUUAAUC UAAACGGCGA GGUUAAGGGA UCUACAUUCC GGAGCCGAAG CGAAAGCGAG 60
U 61
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ED NO: 45:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 32 paires de bases
(B) TYPE: nuclfotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: Impaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ARNr
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: chlamydia psittaci
(xi) DESCREPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 45: UCAUUGCGCC AAUAAUAAUC GGGCUCAAGC AU 32
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 46:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 19 paires de bases
(B) TYPE: nuclfotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linfaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ARNr
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: chlamydia psittaci
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 46: CGGGUGUAUA UUAUAUAUA 19
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 47:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 23 paires de bases
(B) TYPE: nuclfotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linfaire 33
(ii) TYPE DE MOLECULE: ARNr
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: chlamydia psittaci
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 47: CACAAUGAGA CCGGUUAGUA GGC 23
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 48:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 38 paires de bases
(B) TYPE: nuclfotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linfaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ARNr
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: chlamydia psittaci
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ED NO: 48: GCCUCUUAGG GUGAUUGCCU UUACGGCAUG AGCUCCGG 38
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 49:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 37 paires de bases
(B) TYPE: nuclfotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linfaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ARNr
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Chlamydia psittaci
(B) SOUCHE: borg VR 601
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 49: UAUUCAGCAG UGAAGGUAUA CCGUAAGGAG UGCUGGA 37
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 50:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 47 paires de bases
(B) TYPE: nuclfotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linçaire 34
(ii) TYPE DE MOLECULE: ARNr
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Chlamydia psittaci
(B) SOUCHE: BORG VR 601
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ED NO: 50: AAGUAACGAU AAAGGAAGUG AAAAUCUUCC UCGCCGUAAG CACAAGG 47
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 51:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 25 paires de bases
(B) TYPE: nuclfotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linfaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ARNr
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Chlamydia psittaci
(B) SOUCHE: BORG
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 51: ANCGUUUAGU CGUUUGAUUU AGAÇA 25
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 52:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 65 paires de bases
(B) TYPE: nuclçbtide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linçaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ARNr
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Chlamydia psittaci
(B) SOUCHE: VR 601 borg
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 52:
GGUUNNAGCA UGGGUAAGAC CCUGUGAAGG ACCGAACCAG UACAUGUUGA AAAAUGUUUG 60
GAUGA 65
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 53: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 31 paires de bases
(B) TYPE: nuclç tide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linçaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ARNr
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Chlamydia psittaci
(B) SOUCHE: Borg VR 601
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 53: UUAGCCUCGG AUAUUAAGCU UUUGGGGGUA G 31
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 54:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 44 paires de bases
(B) TYPE: nuclfotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linfaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ARNr
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Chlamydia psittaci
(B) SOUCHE: Borg VR 601
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 54: UUAUGCUAAG UGAGUAAGGA AGUGAUGAUU CUAAGACAGU UGGA 44
(2) INFORMATION POUR LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 55 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 3383 paires de bases
(B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ARNr
(iv) ORGANISME: Chlamydia trachomatis sérovar A (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 55 cf figure

Claims

REVENDICATIONS
1. Fragment nucléotidique monocaténaire comprenant au moins une suite de 12 motifs nucléotidiques contigus, appartenant à un brin de l'ARN ribosomique 23S des espèces du genre Chlamydia ou à son complémentaire, cette suite étant choisie dans l'un quelconque des groupes suivants constitués par des zones dudit ARN : Groupe I : 451-472, 542-570, 596-623, 731-756, 878-890, 996-1020, 1061-1094, 1123-1186, 1857-1880, 2234-2307, 2341-2370 ;
Groupe II : 420-450, 473-514, 694-713, 756-790, 842-857, 927-937, 1231-1248, 1241-1319, 1371-1381, 1880-1895, 1943- 1961, 2151-2182 ; Groupe III : 404-426, 436-457, 466-515, 683-722, 747-808, 817-863, 891-955, 1024-1055, 1208-1251, 1315-1350, 1407- 1548, 1364-1388, 1576-1622, 1891-1918, 2148-218 ; le premier numéro correspondant à la position du premier nucleotide de ladite zone par rapport à la séquence nucléotidique de l'ARN ribosomique 23S du sérovar A de Chlamydia trachomatis , SEQ ID NO: 55, choisie comme séquence de référence, et le second numéro correspondant à la position du dernier nucleotide de ladite zone par rapport à cette même séquence de référence.
2. Fragment selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend une suite d'au moins 12 motifs nucléotidiques contigus, incluse dans une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID NO: 1 et SEQ ID NO: 3 à SEQ ID NO: 54 et leurs séquences complémentaires.
3. Fragment selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il consiste en une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID NO: 1 et SEQ ID NO: 3 à à SEQ ID NO: 54, et leurs séquences complémentaires.
4. Fragment nucléotidique monocaténaire d'ADN, caractérisé en ce qu'il est obtenu par transcription inverse d'un fragment nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, ou son fragment complémentaire.
5. Fragment nucléotidique monocaténaire d'ADN génomique, caractérisé en ce que son produit de transcription est un fragment nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, ou son fragment complémentaire.
6. Sonde pour la détection spécifique de bactéries du genre Chlamydia, caractérisée en ce qu'elle comprend une suite d'au moins 12, de préférence 18, ou mieux encore 20, motifs nucléotidiques contigus, incluse dans une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO: 1 et SEQ ID NO: 3 à SEQ ID NO: 12, leurs séquences complémentaires et leurs séquences équivalentes.
7. Sonde selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle consiste en une suite de 12, de préférence 18, ou mieux encore 20, motifs nucléotidiques contigus, incluse dans une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO: 1 et SEQ ID NO: 3 à SEQ ID NO: 12 et leurs séquences complémentaires.
8. Sonde pour la détection spécifique de bactéries de l'espèce Chlamydia trachomatis , caractérisée en ce qu'elle comprend une suite d'au moins 12, de préférence 18, ou mieux encore 20, motifs nucléotidiques contigus incluse dans une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO: 13 à SEQ ID NO: 24, leurs séquences complémentaires et leurs séquences équivalentes.
9. Sonde selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'elle consiste en une suite de 12, de préférence 18, ou mieux encore 20, motifs nucléotidiques contigus, incluse dans une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO: 13 à SEQ ID NO: 24 et leurs séquences complémentaires .
10. Sonde pour la détection spécifique de bactéries de l'espèce Chlamydia pneumoniae , caractérisée en ce qu'elle comprend une suite d'au moins 12, de préférence 18, ou mieux encore 20, motifs nucléotidiques contigus, incluse dans une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO: 25 à SEQ ID NO: 39, leurs séquences complémentaires et leurs séquences équivalentes.
11. Sonde selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'elle consiste en une suite de 12, de préférence 18, ou mieux encore 20, motifs nucléotidiques contigus, incluse dans une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO: 25 à SEQ ID NO: 39 et leurs séquences complémentaires.
12. Sonde pour la détection spécifique de bactéries de l'espèce Chlamydia psittaci , caractérisée en ce qu'elle comprend une suite d'au moins 12, de préférence 18, ou mieux encore 20, motifs nucléotidiques contigus, incluse dans une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO: 40 à SEQ ID NO: 54, leurs séquences complémentaires et leurs séquences équivalentes.
13. Sonde selon la revendication 12, caractérisée en ce qu'elle consiste en une suite de 12, de préférence 18, ou mieux encore 20, motifs nucléotidiques contigus, incluse dans une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO: 40 à SEQ ID NO: 54 et leurs séquences complémentaires .
14. Sonde selon l'une quelconque des revendications 6 à 13, caractérisée en ce qu'elle est immobilisée sur un support solide.
15. Sonde selon l'une quelconque des revendications 6 à 14, caractérisée en ce qu'elle est marquée avec un agent traceur, notamment choisi parmi les isotopes radioactifs, des enzymes, en particulier des enzymes susceptibles d'agir sur un substrat chromogène, fluorigène ou luminescent telle qu'une peroxydase ou une phosphatase alcaline, des composés chimiques chromophores , des composés chromogènes, fluorigènes ou luminescents, des analogues de bases nucléotidiques, et des ligands tels que la biotine.
16. Sonde de thérapie pour le traitement des infections dues à une espèce déterminée de Chlamydia, caractérisée en ce qu'elle comprend une suite d'au moins 12, de préférence 18, ou mieux encore 20, motifs nucléotidiques contigus, incluse dans une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO: 1 et SEQ ID NO: 3 à SEQ ID NO: 54, leurs séquences complémentaires et leurs séquences équivalentes.
17. Amorce pour la transcription inverse d'une séquence d'ARN ribosomique 23S d'une bactérie du genre
Chlamydia, caractérisée en ce qu'elle comprend une suite d'au moins 12, de préférence 18, ou mieux encore 20, motifs nucléotidiques contigus, incluse dans une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID NO: 1 et SEQ ID NO: 3 à SEQ ID NO: 54, leurs séquences complémentaires et leurs séquences équivalentes.
18. Amorce pour l'amplification enzymatique d'au moins une séquence d'acide nucléique, telle que l'amplification par réaction de polymérisation en chaîne, caractérisée en ce qu'elle comprend une suite d'au moins 12, de préférence 18, ou mieux encore 20, motifs nucléotidiques contigus, incluse dans une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID NO: 1 et SEQ ID NO: 3 à SEQ ID NO: 54, leurs séquences complémentaires et leurs séquences équivalentes.
19. Réactif pour détecter et/ou identifier et/ou quantifier au moins une espèce de Chlamydia , caractérisé en ce qu'il comprend au moins une sonde selon l'une quelconque des revendications 6 à 15.
20. Réactif selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'il comprend une sonde de capture selon la revendication 14 , et une sonde de détection selon la revendication 15.
21. Réactif selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une amorce selon la revendication 17 et/ou une amorce selon la revendication 18.
22. Procédé pour détecter et/ou identifier et/ou quantifier au moins une espèce de Chlamydia , dans un échantillon biologique, susceptible de contenir au moins un acide nucléique de ladite espèce, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à mettre ledit échantillon en contact avec au moins une sonde selon l'une quelconque des revendications 6 à 15, et à détecter la formation éventuelle d'un complexe d'hybridation entre ladite sonde et ledit acide nucléique.
23. Procédé selon la revendication 22, caractérisé en ce qu'on met en contact ledit échantillon avec une première sonde selon la revendication 6 ou 7 , et éventuellement 14 ou 15, et une seconde sonde selon la revendication 8 à 13, et éventuellement 14 ou 15.
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