KR19980701522A - 라임 질병 관련 보렐리아에 대한 핵산 증폭 올리고뉴클레오티드 및 프로브(Nucleic Acid Amplification Oligonucleotides and Probes to Lyme Disease Associated Borrelia) - Google Patents
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Abstract
본 발명은 보렐리아 핵산 검출에 유용한 혼성화 분석 프로브, 증폭 프라이머, 핵산 조성물 및 방법에 관한 것이다. 라임 질병 관련 보렐리아를 선택적으로 검출하고 이 보렐리아를 보렐리아 헤름시와 구별하는 혼성화 분석 프로브 및 증폭 프라이머가 개시되어 있다. 보렐리아 헤름시는 선택적으로 검출하지만 라임 질병 관련 보렐리아는 검출하지 않는 다른 혼성화 프로브도 개시되어 있다.
Description
라임 질병은 자주 진단되는 인간 질환으로서 북미, 유럽 및 기후가 온화한 지역에서 가장 유행하는 참진드기 매개 질병이다 [A. G. Barbour D. Fish, Science 260:1610-16 (1993); J. F. Anderson, Rev. Insect Dis. 11:51451-59 (1989); A. C. Steere, N. Engl. J. Med., 331:586-96 (1989) 참조]. 라임 질병 또는 라임 보렐리아 감염증은 보렐리아 스피로헤타 (Borrelia spirochete)에 의해 발생하는 다단계 감염증이다. 보렐리아 유기체는 감염된 참진드기속 (Ixodes) 진드기에 의해 인간 및 동물에 전파된다. 흰꼬리 사슴 및 흰발 마우스 페로미스쿠스 류코푸스 (Peromyscus leucopus)는 각각 성충 진드기 및 애벌레 진드기의 1차 숙주로서 작용한다.
인간 및 동물의 라임 보렐리아 감염증은 감염 단계에 따라 많은 상이한 임상적 증상을 야기한다. 인간의 초기 감염은 일반적으로 특유의 피부 발진, 소위 홍반 미그란스 (migrans)가 생기는 감기 유사 질환이다. 홍반 미그란스는 원심적으로 전파되고 일반적으로 고리 형상이다. 홍반 미그란스는 일반적으로 진드기에 물린 후 1 내지 5주 후에 발생하고 수 주 또는 수 달 내에 자연적으로 치유된다 [H. W. Pfister et al., Lancet 343:1013 (1994)].
보렐리아에 감염된 후 수주 내지 수달 내에 감염은 뇌, 신경, 눈, 관절 및 심장 등을 포함하는 상이한 기관에 퍼질 수 있다. 이러한 감염의 전파는 질병의 단계 II가 진행중이라는 것을 나타낸다. 라임 보렐리아 감염증의 신경학적 특징은 수막신경근염 (반워쓰 (Bannwarth) 신드롬), 수막염, 얼굴 신경의 두개골 신경염, 망상 신경염, 다발성 단신경염 및 드물게는 뇌염, 척수염, 뇌 혈관염, CSF 백혈구 다구증을 포함한다.
라임 심장염은 심각한 질환으로서 상이한 정도의 일시적인 심방 차단, 리듬 방해, 근-심막염 및 심장마비의 특징을 갖는다. 라임 심장염의 일반적인 증상에는 심계항진, 가슴 불쾌, 호흡의 가빠짐, 운동시 현기증 및 아담스-스토크스 발작이 포함된다.
심근계의 라임 보렐리아 감염은 근육통, 관절통, 관절염, 근염 및 임파선증과 같은 증상을 야기한다. 눈의 보렐리아 감염은 결막염, 홍채모양체염, 맥락막염, 동공부종을 갖는 안신경병, 전안염과 같은 증상을 야기한다. 다른 기관의 감염은 간종, 간염, 기침 및 고환 팽윤을 야기할 수 있다.
감염된 지 수 달 내지 수 년 후에 라임 보렐리아 감염증이 단계 III에 들어갔음을 나타내는 만성적인 기관 증상이 나타날 수 있다. 이 단계의 증상으로는 만성 관절염, 단관절성 관절염, 올리고관절성 관절염, 선단피부염, 뇌염, 근염, 각막염, 만성 다발신경병 및 확장성 심근증을 들 수 있다.
라임 보렐리아 감염증을 야기하는 것으로 알려진 보렐리아 스피로헤타는 처음에 보렐리아 부르그도르페리 (Borrelia burgdorferi)로 명명되었으나, 현재는 3개의 주요 게놈 종으로 분류된다 [T. T. Marconi C. F. Guron, J. Clin. Microbiol., 30:2830-34 (1992) 참조]. 제1 군에는 비. 부르그도르페리로 명명된 종이 포함되고, 제2 군에는 보렐리아 가리니 (garinii)로 명명된 종이 포함되고, 제3 군에는 아직 종명이 명명되지는 않았지만 VS461군으로 언급된다.
다른 보렐리아 종인 비. 헤름시 (hermsii)는 비. 부르그도르페리와 밀접한 관련이 있지만, 상이한 인간 질병인 회귀열의 원인균이다. 비. 헤름시는 DNA 혼성화에 의해 비. 파레리 (parheri) 및 비. 투리카태 (turicatae)와 동일한 종에 속하는 특징이 있지만, 각각의 유기체는 특정 절지동물 숙주에 특이적이다 [Barberi Hayes, Microbiol Reviews 50:381-400, 1986]. 다른 2개의 보렐리아 종인 비. 안세리나 (anserina) 및 비. 코리아세애 (coriaceae)는 비. 부르그도르페리와 밀접한 관련이 있지만, 인간에 감염되지 않는다.
보렐리아 유기체는 다른 스피로헤타와 같이 파형 및 태형을 갖는다 [A. G. Barbour S. F. Hayes, Microbiol. Rev., 50:381-400 (1986)]. 이들 유기체는 또한 원형 보다는 선형인 염색체 및 복수개의 세포외 염색체 성분을 갖는다 [A. G. Barbour C., F. Garon, Science, 237:409 (1987)]. 복수개의 표면 노출 리포프로테인인 OspA 및 OspB가 동정되었고 이를 혈청 시험에서 항원성 마커로서 사용한다.
체액에서 유래한 보렐리아의 배양은 어렵고 배양에 의한 라임 보렐리아 감염증의 미생물학적 진단을 불만족스럽게 만든다. 효소 결합 면역흡수 분석법 (ELISA), 간접 면역형광 분석법 (IFA) 및 웨스턴 블로팅을 포함하여 비. 부르그도르페리를 검출하기 위한 혈청 시험이 개발되었다 [M. G. Golightly, Am. J. Clin. Pathol., 99:168-74 (1993) 참조]. 그러나, 빈약한 표준화, 잘못된 양성 및 잘못된 음성 결과가 상기 혈청 시험에 발생하여 시험의 유용성을 제한한다 [Barbour, Ann. Intenr. Med., 110:504 (1989) 참조]. 초기 (단계 I) 또는 단계 II 감염의 환자는 검출가능한 수준의 항체가 아직 발생하지 않을 수 있고 트레포네마 (Treponema) 또는 라임 질병에 관련되지 않는 다른 보렐리아와의 교차 반응이 발생할 수 있다. 또한, 항생제 처리는 라임 보렐리아 감염증 환자에게 검출가능한 항체의 발생을 억제하거나 지연시킬 수 있다. 상기 결함들은 라임 보렐리아 감염증의 진단 및 치료에서 혈청 시험의 유용성 및 신뢰성을 제한한다.
감염 물질의 인식을 위한 프로브로서 특정 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드의 사용은 문제가 있는 면역학적 검출 분석법에 대한 대안이 되고 있다. 보렐리아의 게놈 및 플라스미드 DNA 서열의 적어도 일부를 수득하였다 [Schwan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 539:419 (1988); Schwan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 539:419 (1988) 참조]. 비. 부르그도르페리의 선형 플라스미드에서 유도된 핵산 혼성화 프로브를 제조하여 많은 보렐리아 종으로부터 비. 부르그도르페리를 동정하기 위해 사용하였다. 그러나, 이들 프로브는 그의 뉴클레오티드 서열이 시간 경과에 따라 불안정하게 될 수 있거나 또는 병원성 보렐리아 단리물에 존재하지 않을 수 있는 플라스미드에서 유도된 것이기 때문에 원천적으로 제한된다. 또한, 특정 보렐리아 유전자를 표적으로 하는 다른 핵산 혼성화 프로브는 표적 유전자의 진화적 안정성의 정도에 의해 역시 원천적으로 제한된다 [예를 들면, Malloy et al., J. Clin.Microbiol., 28:1089 (1990), Lebach et al., J. Clin. Microbiol., 29:731-737 (1991); 및 Goodman et al., Infect. Immun., 59:269-278 (1991) 참조].
랜덤하게 클로닝된 비. 부르그도르페리 DNA 서열을 사용하여 핵산 프라이머를 작제하고 이 프라이머를 사용하여 비. 부르그도르페리 내의 표적 DNA 서열을 증폭하였다 [Rosa et al., J. Infect. Dis., 160:1018 (1989) 참조]. 그러나 모든 비. 부르그도르페리 단리물이 검출되지는 않으며 이것은 상기 핵산 프라이머를 라임 질병을 야기하는 모든 비. 부르그도르페리의 검출에 있어 불만족스럽게 만든다.
푸쿠나가 (Fukunaga) 및 소나카 (Sohnaka)에 의해 비. 부르그도르페리의 리보좀 RNA (rRNA)의 유전자 지도가 제작되었고 클로닝되었다 [Biochem. Biophys. Res. Comm., 183:952-57 (1992) 및 Postic et al., Res. Microbiol., 141:465-475 (1990)]. 비. 부르그도르페리는 염색체당 23S RNA의 2카피 및 16S rRNA 1카피만을 포함하는 것으로 보인다는 점에서 특이하다 (Fukanaga et al., J. Gen Micobiol. 138:871-877, 1992]. 보렐리아 16S RNA의 서열을 사용하여 배양된 비. 부르그도르페리 유기체를 검출할 수 있는 혼성화 프로브를 고안하였다 [Marconi et al., J. Clin. Microbiol., 30:628-32 (1992) 참조]. 유기체를 배양하지 않고 임상 시료에서 비. 부르그도르페리를 검출하는 프로브의 유용성은 입증되지 않았다.
상기 제한들을 극복하기 위해서 리보좀 RNA 서열의 핵산 증폭은 보렐리아 16S rRNA를 증폭하기 위한 특이성이 넓은 프라이머를 사용하여 설명하였다 [Malloy et al., J. Clin. Microbiol., 28:1089-93 (1990) 참조]. 그러나, 사용된 핵산 프라이머는 에스. 아우레우스 (S. aureus) 및 피. 아에루기노사 (P. aeruginosa)도 증폭하여 보렐리아 부르그도르페리에 특이적이지 않았다.
16S rRNA 서열에서 유도된 4 세트의 프라이머를 사용하여 3개의 상이한 보렐리아 게놈 종류의 DNA를 증폭하였다 [R.T. Marconi and C.F. Baron, J. Clin. Microbiol., 30:2830-34 (1992) 참조]. 보렐리아 16S rRNA의 816-842위 및 1153-1173위에서 유도된 오직 하나의 프라이머 세트만이 상이한 배양된 시험 라임 질병 단리물에 존재하는 모든 보렐리아 유기체를 검출하였다. 다른 프라이머 세트는 라임 질병 보렐리아의 3개 군을 모두 인식하지 못하거나 라임 질병에 관여하지 않는 보렐리아를 인식하였다. 이 다른 프라이머 세트는 임상 단리물로부터 배양된 상이한 모든 보렐리아 유기체를 증폭하지 못하였다.
16S rRNA 서열, 및 16S rRNA 유전자의 V4 영역이 상이한 보렐리아 부르그도르페리의 서브타입의 증폭은 아담 (Adam) 등에 의해 설명되었다 [Infec. Immun., 59:2579-85 (1991)]. PCR 프라이머를 사용하여 보렐리아 감염증 부르그도르페리의 23S rRNA의 특정 영역을 증폭하고 이를 다른 보렐리아 종과 구분하였다 [Schwartz et al., J. Clin. Micro. 30:3082 (1992)].
보렐리아 16S rRNA 서열에 상보성인 다른 프라이머는 바이스부르크 (Weisburg)에 의해 설명되었다 [EPO 출원 공재 제EPO 0421 725A호, 출원 번호 제90310766.2호]. 화이트 (White) 및 다지 (Dodge)의 국제 출원 제PCT US91/01574호에는 프라이머 및 비. 부르그도르페리 및 비. 헤름시의 16S rRNA 유전자에서 유도된 프로브가 기재되어 있다.
라임 질병의 혈청학적 검출 및 확인에 있어서의 현재의 제한 때문에 라임 질병에 관련된 보렐리아의 각지의 모든 단리물을 검출하기 위한 감도 높은 방법에 대한 요구가 존재한다.
발명의 요약
본 발명은 신규의 유용한 증폭 올리고뉴클레오티드, 헬퍼 올리고뉴클레오티드 및 보렐리아의 rRNA (리보좀 RNA) 또는 rDNA (리보좀 DNA) 뉴클레오티드 서열의 특정 서열에 상보성이도록 고안된 올리고뉴클레오티드 혼성화 분석 프로브 또는 보렐리아 rRNA 또는 rDNA 뉴클레오티드 서열 또는 그의 상보체에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 이들 증폭 올리고뉴클레오티드, 헬퍼 올리고뉴클레오티드 및 혼성화 분석 프로브는 병원성 보렐리아의 16S 및 23S rRNA에서 유도되었기 때문에 우수한 검출 분석은 상기 rRNA 유전자로부터 발현된 RNA의 보다 높은 농도, 핵산 서열의 느린 변화 속도 및 유기체 사이의 rRNA 서열 이동의 결여에 의해 수득된다.
증폭 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 혼성화 분석 프로브는 엄격한 (stringent) 혼성화 분석 조건 하에서 표적 보렐리아 16S 및 23S rRNA 및(또는) rDNA 유전자 서열에 혼성화함으로써 기능한다. 바람직한 실시 형태에서 본 명세서에서 개시되는 프로브 및 증폭 올리고뉴클레오티드는 혈액 또는 조직과 같은 임상 시료에서 발견되는 다른 미생물 및 다른 보렐리아 종으로부터 보렐리아 부르그도르페리, 보렐리아 가리니 및 군 VS461의 보렐리아를 구별할 수 있다. 따라서, 증폭 올리고뉴클레오티드 및 혼성화 분석 프로브는 라임 질병 관련 보렐리아의 특이적인 검출 및(또는) 정량에 사용될 수 있다. 바람직한 실시 형태에서 본 명세서에서 기술되는 혼성화 분석 프로브는 엄격한 혼성화 조건 하에서 라임 질병 관련 보렐리아의 핵산에 선택적으로 혼성화하지만 보렐리아 헤름시의 핵산에는 혼성화하지 않는다. 본 발명의 특정 실시 형태에서 혼성화 분석 프로브는 프로브의 표적 서열에 대한 혼성화를 확인하기 위해 아크리디늄 에스테르 또는 방사성 동위원소와 같은 리포터 기를 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명의 특정 실시 형태에서 증폭 올리고뉴클레오티드는 RNA 폴리머라제에 의해 인식되거나 RNA 폴리머라제에 의한 개시 또는 신장을 증가시키는 핵산 서열을 선택적으로 갖는다.
본 발명은 라임 질병 관련 보렐리아 및 보렐리아 헤름시의 핵산의 존재 검출에 유용한 혼성화 분석 프로브를 제공한다. 바람직하게는, 혼성화 분석 프로브는 하기 뉴클레오티드 서열 중에서 선택된다:
서열 번호 1:,
서열 번호 2:,
서열 번호 12:,
서열 번호 13:,
서열 번호 10:,
서열 번호 33:,
서열 번호 34:,
서열 번호 35:,
서열 번호 21:,
서열 번호 24:,
서열 번호 25:,
서열 번호 26:,
서열 번호 22:,
서열 번호 30:,
서열 번호 31:, 및
서열 번호 32:.
본 발명은 라임 질병 관련 보렐리아의 핵산 검출에 유용한 혼성화 분석 프로브를 제공한다. 상기 혼성화 분석 프로브는 바람직하게는 하기 뉴클레오티드 서열 중에서 선택된다.
서열 번호 1:,
서열 번호 2:,
서열 번호 12:,
서열 번호 13:,
서열 번호 21:,
서열 번호 24:,
서열 번호 25:, 및
서열 번호 26:.
또한, 본 발명은 보렐리아 헤름시 핵산의 검출에 유용한 혼성화 분석 프로브를 제공한다. 상기 혼성화 분석 프로브는 바람직하게는 하기 뉴클레오티드 서열 중에서 선택된다.
서열 번호 10:,
서열 번호 33:,
서열 번호 34:,
서열 번호 35:,
서열 번호 22:,
서열 번호 30:,
서열 번호 31:, 및
서열 번호 32:.
본 발명의 또다른 특징은 본 발명의 혼성화 분석 프로브와 헬퍼 올리고뉴클레오티드 (프로브)를 포함하는 프로브 믹스이다. 바람직하게는, 헬퍼 올리고뉴클레오티드는 표적 서열에 대한 분석 브로브의 특이적인 혼성화를 촉진하기 위해 사용된다. 헬퍼 올리고뉴클레오티드는 문헌 [본 명세서에 참고로 포함되고 본 발명의 공동 소유권을 향유하는 Hogan and Milliman의 미국 특허 제5,030,557호]에 기재되어 있다. 헬퍼 프로브로서 본 발명에 사용되는 올리고뉴클레오티드로는 하기 서열을 들 수 있다.
서열 번호 3:,
서열 번호 4:,
서열 번호 5:,
서열 번호 6:,
서열 번호 14:,
서열 번호 15:,
서열 번호 16:,
서열 번호 17:,
서열 번호 23:,
서열 번호 27:,
서열 번호 28:, 및
서열 번호 29:.
본 발명의 다른 특징은 본 발명의 올리고뉴클레오티드와 라임 질병 관련 보렐리아의 뉴클레오티드 중합체의 특정 영역 사이에 형성된 핵산 혼성체인, 라임 질병 관련 보렐리아 검출용 조성물이다. 일반적으로, 뉴클레오티드 중합체는 본 발명의 올리고뉴클레오티드 서열에 실질적으로 대응하는 핵산 서열 또는 그의 상보체를 포함하고 보렐리아의 rRNA 또는 리보좀 RNA를 코딩하는 rDNA에서 유도된다. 상기 조성물에 존재하는 올리고뉴클레오티드는 증폭 올리고뉴클레오티드, 헬퍼 올리고뉴클레오티드, 혼성화 분석 프로브 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 1종 이상의 증폭 올리고뉴클레오티드, 1종 이상의 헬퍼 올리고뉴클레오티드 및 1종 이상의 혼성화 분석 프로브를 포함할 수 있다.
표적 서열에 혼성화되는 프로브를 포함하는 본 발명의 조성물은 핵산 서열의 존재 검출에 유용하다. 표적 핵산 서열에 혼성화하는 헬퍼 올리고뉴클레오티드를 포함하는 본 발명의 조성물은 표적 핵산의 특정 부분을 혼성화에 사용할 수 있도록 만드는데 유용하다. 표적 서열에 혼성화되는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 본 발명의 조성물은 프라이머의 3' 말단에 폴리머라제의 개시 부위를 만드는데 유용하다.
또한, 본 발명은 핵산 혼성화 분석 프로브가 보렐리아 부르그도르페리 표적 핵산 서열에는 혼성화하지만 보렐리아 헤름시의 핵산 서열에는 혼성화하지 않는 엄격한 혼성화 조건 하에서 시료를 핵산 혼성화 분석 프로브와 접촉시키는 것으로 이루어지는, 라임 질병 관련 보렐리아의 존재를 검출하는 방법을 포함한다. 또한, 본 발명은 표적 서열에 대한 프로브의 혼성화 확인을 돕는 리포터 분자를 선택적으로 포함하는 상기 방법에 사용되는 올리고뉴클레오티드 및 그의 균등물을 포함한다. 본 발명은 혈액, 혈액 유도 시료, 조직, 조직 유도 시료, 기타 체액 및 인체 시료와 같은 인간의 시료에서 보렐리아 핵산의 존재 검출에 유용하다.
또한, 본 발명은 본 발명의 증폭 올리고뉴클레오티드를 하나 이상 사용하여 핵산을 증폭하는 라임 질병 관련 보렐리아의 존재를 검출하기 위한 방법을 포함한다. 바람직한 실시 형태에서 증폭을 실시한 후 본 발명의 올리고뉴클레오티드 혼성화 분석 프로브를 사용하여 증폭된 핵산을 검출하는 검출 단계를 실시한다. 본 발명의 방법은 또한 RNA 프로모터용 뉴클레오티드 서열을 포함하는 증폭 올리고뉴클레오티드의 사용을 포함한다.
또다른 면에서, 본 발명은 증폭 분석에서 보렐리아 부르그도르페리를 포함하여 라임 질병 관련 스피로헤타의 검출에 유용한 증폭 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 이 올리고머는 하기 뉴클레오티드 서열 중의 하나에 실질적으로 대응하는 것이 바람직하다.
서열 번호 7:,
서열 번호 8:,
서열 번호 9:,
서열 번호 11:,
서열 번호 18:,
서열 번호 19:,
서열 번호 20:,
서열 번호 44:,
서열 번호 45:,
서열 번호 46:,
서열 번호 47:,
서열 번호 48:,
서열 번호 49:, 및
서열 번호 50:.
상기 올리고머는 비변형되거나 또는 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 특이 핵산 서열 (T7, T3, 또는 SP6 RNA 폴리머라제에 대한 프로모터 서열을 이에 제한됨이 없이 포함함) 및(또는) RNA 폴리머라제에 의한 RNA 전사의 개시 또는 신장을 증가시키는 서열을 5' 말단에 첨가하는 것과 같이 변형될 수 있다. 프로모터 서열의 한 예는 하기 서열 번호 43의 서열이다. 유용한 프로모터 서열의 다른 예는 다양하게 시판되는 벡터, 예를 들면 Stratagene Cloning Systems사의 pBluescript (등록상표) 벡터 또는 Promega Biotec사의 pGEMTM벡터에 포함되어 있다.
서열 번호 43:.
본 발명의 다른 특징에서 증폭 올리고뉴클레오티드는 하기 서열에 실질적으로 대응하는 서열에 결합하거나 그 서열을 통하여 신장시킨다.
서열 번호 36:,
서열 번호 37:,
서열 번호 38:,
서열 번호 39:,
서열 번호 40:,
서열 번호 41:,
서열 번호 42:,
서열 번호 27:,
서열 번호 51:,
서열 번호 52:,
서열 번호 53:,
서열 번호 54:,
서열 번호 55:,
서열 번호 56:,
서열 번호 29:, 및
서열 번호 57:.
본 발명의 다른 특징은 증폭 올리고뉴클레오티드, 헬퍼 올리고뉴클레오티드 및 혼성화 분석 프로브를 포함하는 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 1종 이상 포함하는 키트를 포함한다. 바람직한 실시 형태에서 본 발명의 키트는 1종 이상의 증폭 올리고뉴클레오티드, 및 다른 미생물 및 다른 보렐리아 종과 라임 질병 관련 보렐리아를 구별할 수 있는 1종 이상의 혼성화 분석 프로브를 포함한다.
특정 핵산 서열을 검출하기 위한 핵산 혼성화의 사용에 대한 배경 설명은 문헌 [Kohne, 1989년 7월 25일에 허여된 미국 특허 제4,851,330호, 및 Hogan 등의 국체 출원 번호 제PCT/US87/03009호, 제목 'Nucleic Acid Probes for Detection and/or Quantitation of Non-Viral Organism', 두 문헌 모두 본 명세서에 참고로 포함됨]에 개시되어 있다. 호간 등의 상기 문헌에는 시료 (예를 들면, 타액, 뇨, 혈액 및 조직 시편, 음식물, 토양 및 물) 내의 비바이러스성 유기체 또는 일군의 비바이러스성 유기체의 존재를 검출하는 방법이 기재되어 있다.
본 발명은 시료, 예를 들면 조직 시료 및 체액 및 배양액 시료 내의 보렐리아 (Borrelia) 유기체의 검출을 가능하게 하는 라임 질병에 관련된 보렐리아 유기체에 대한 증폭 올리고뉴클레오티드 및 핵산 프로브의 고안 및 용도에 관한 것이다.
A. 정의
하기 용어는 상이한 의미를 갖는다는 특별히 언급하지 않는 한 하기 정의된 의미를 갖는다.
표적 핵산은 표적 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산을 의미한다.
올리고뉴클레오티드는 공유결합으로 함께 연결된 2 개 이상의 뉴클레오티드 서브유닛으로 제조된 단일 가닥 뉴클레오티드 중합체를 뜻한다. 바람직하게는 12 내지 100개의 뉴클레오티드 단위가 존재하고, 가장 바람직하게는 12 내지 50개의 뉴클레오티드 단위가 상호 결합된다. 뉴클레오티드 서브유닛의 당 기는 리보스, 데옥시리보스 또는 O-메틸 리보오스와 같은 이들의 변형된 유도체일 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서브유닛은 포스포디에스테르 결합, 포스포로티오에이트 결합, 메틸 포스포네이트 결합 또는 올리고뉴클레오티드의 혼성화를 방해하지 않는 다른 드물거나 비자연발생적 결합에 의해 연결될 수 있다. 또한, 올리고뉴클레오티드는 흔하지 않은 뉴클레오티드 또는 비뉴클레오티드 잔기를 가질 수 있다. 본 명세서에서 정의되는 올리고뉴클레오티드는 핵산, 바람직하게는 DNA이지만, RNA일 수 있거나 공유결합된 리보뉴클레오티드 및 데옥시리보뉴클레오티드의 조합물을 가질 수 있다. 규정된 서열의 올리고뉴클레오티드 프로브 및 증폭 올리고뉴클레오티드는 당업계의 숙련가에게 공지된 기술, 예를 들면 화학적 또는 생화학적 합성법에 의해 또는 재조합 핵산 분자, 예를 들면 세균 또는 레트로바이러스 벡터로부터 시험관내 또는 체내 발현시켜 제조할 수 있다. 본 명세서에서 의도하는 바와 같이 올리고뉴클레오티드는 야생형 염색체 DNA 또는 그의 체내 전사 생성물로 구성되지 않는다. 프로브의 한 용도는 혼성화 분석 프로브로서 사용하는 것으로서 프로브는 발병, 감염 또는 병원성 세포에서의 유전자 전사 또는 해독을 차단하거나 억제하는 체내 또는 시험관내 치료적 증폭 올리고머 또는 안티센스 물질로서 사용될 수도 있다.
표적 핵산 서열, 표적 뉴클레오티드 서열 또는 표적 서열은 단일 가닥 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 특정 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 서열 또는 이에 상보성인 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 서열을 뜻한다.
핵산 혼성화는 완전히 또는 부분적으로 상보성 뉴클레오티드 서열을 갖는 2개의 핵산 가닥이 소정의 반응 조건 하에 결합하여 특정 수소 결합을 갖는 안정한 이중 가닥 혼성체를 형성하는 반응이다. 핵산 가닥은 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA)일 수 있고, 따라서 혼성화는 RNA:RNA 혼성체, DNA:DNA 혼성체 또는 RNA:DNA 혼성체를 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 혼성화는 2개의 완전히 또는 부분적으로 상보성인 단일 핵산 가닥이 반대 배향으로 서로 위치하여 이중 가닥 영역을 갖는 안정한 구조를 형성하는 능력을 의미한다. 종종 혼성체로 불리는 이러한 이중 가닥 구조의 2개의 구성성분으로서의 가닥은 수소 결합으로 서로 결합된다. 이들 수소 결합이 단일 핵산 가닥 상의 염기 아데닌과 티민 또는 우라실 (A 및 T 또는 U), 또는 시토신과 구아닌 (C 및 G) 사이에 가장 흔하게 형성되지만, 염기쌍은 상기 규칙적인 쌍의 구성원이 아닌 염기 사이에 형성될 수도 있다. 비규칙적인 염기싸은 당업계에 공지되어 있다 [예를 들면, The Biochemistry of the Nucleic Acids (Adams et al., eds., 1992 참조].
엄격한 혼성화 분석 조건은 특정 혼성화 분석 프로브가 다른 미생물 (예를 들면, 보렐리아 헤름시) 또는 인간에서 유래한 시료에 존재하는 다른 핵산 보다는 표적 핵산 (바람직하게는 라임 질병 관련 보렐리아의 rRNA 또는 rDNA)과 혼성화할 수 있는 조건을 말한다. 엄격한 혼성화 분석 조건은 혼성화 분석 프로브의 GC 함량 및 길이, 혼성화 온도, 혼성화 시약 또는 용액의 조성, 및 목적하는 혼성화 특이성의 정도와 같은 인자에 따라 상이할 수 있다. 구체적인 엄격한 혼성화 조건은 후술되는 내용에서 제공할 것이다.
프로브는 검출하고자 하는 핵산 서열에 완전히 또는 부분적으로 상보성이어서 엄격한 혼성화 분석 조건 하에서 그에 혼성화하는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 의미한다. 용어 프로브는 자연 발생적인 핵산은 제외하는 것을 의미한다. 정제된 올리고뉴클레오티드 프로브는 당업계의 숙련가에게 공지된 기술, 예를 들면 화학적 또는 생화학적 합성법에 의해 또는 재조합 핵산 분자, 예를 들면 세균 또는 레트로바이러스 벡터로부터 시험관내 또는 체내 발현시켜 제조할 수 있다. 바람직하게는 프로보의 길이는 10 내지 100 뉴클레오티드이다. 프로브는 표적 서열이 엄격한 혼성화 조건 하에서 실질적으로 혼성화에 영향을 주지 않는 한 표적 서열에 상보성이 아닌 영역을 가질 수도 있고 갖지 않을 수도 있다. 이러한 영역이 존재하는 경우 그 영역은 5' 프로모터 서열, 및(또는) RNA 전사를 위한 결합 부위, 제한 효소 인식 부위를 포함할 수 있거나, 또는 프로브 상에, 표적 핵산 상에 또는 두 개 모두에 촉매 활성 부위 또는 헤어핀 구조와 같은 바람직한 이차 또는 삼차 구조를 부여하는 서열을 포함할 수 있다. 프로브는 효소 또는 다른 리간드를 사용하여 방사성 동위원소, 형광 또는 화학발광 잔기와 같은 리포터 기로 표지될 수 있고, 이를 프로브가 표적 핵산에 혼성화하였음을 검출하거나 확인하기 위해 사용할 수 있다.
본 명세세에서 사용된 구문 일군의 특정 서열 중에서 선택된 서열을 필수 성분으로 하는 핵산 서열을 갖는 프로브 (또는 올리고뉴클레오티드)는 기본적인 신규 특성으로서 프로브가 엄격한 혼성화 조건 하에서 상기 군의 핵산 서열 중의 하나와 정확한 상보체를 갖는 핵산에 안정적으로 혼성화할 수 있음을 의미한다. 정확한 상보체는 대응하는 DNA 또는 RNA 서열을 포함한다.
구문 핵산 서열에 실질적으로 대응하는은 언급되는 핵산 서열이 엄격한 혼성화 조건 하에서 동일한 표적 핵산 서열과 혼성화할 것이라는 점에서 핵산 서열에 유사한 혼성화 특성을 가질 정도로 핵산 서열에 충분히 유사하다는 것을 의미한다.
당업계의 숙련가는 본 발명의 실질적으로 대응하는 프로브 및 프라이머가 언급되는 서열과 상이하지만 동일한 표적 핵산 서열에 혼성화할 수 있음을 이해할 것이다. 이러한 핵산의 차이는 서열 내의 동일한 염기의 비율 또는 프로브 또는 프라이머와 그의 표적 서열 사이의 완전히 상보성인 염기의 비율의 측면에서 언급할 수 있다. 당업계의 숙련가는 또한 상기 차이가 프로브 또는 프라이머 내의 동일하지 않은 염기의 수 또는 표적 핵산 서열의 대응하는 염기에 혼성화하지 않는 프로브의 미스매치(mismatch) 염기의 수로서 표현될 수 있음을 이해할 것이다. 본 발명의 프로브 또는 프라이머는 상기 동일 비율이 100 내지 80%이거나 또는 10개의 뉴클레오티드 표적 서열 내에 미스매치 염기가 0 내지 2개인 경우에 실질적으로 핵산 서열에 대응한다.
바람직한 실시 형태에서 상기 비율은 100 내지 85%이다. 보다 바람직한 실시 형태에서 상기 비율은 90 내지 100%일 수 있고, 다른 바람직한 실시 형태에서는 95 내지 100%이다. 당업계의 숙련가는 수용할 수 없는 수준의 비특이적 혼성화를 야기하지 않으면서 특정 표적 서열에 혼성화할 수 있는 다양한 비율의 상보성에 요구되는 혼성화 조건에 대한 다양한 변형 방법을 이해할 것이다.
핵산 혼성체 또는 혼성체는 이중 가닥의 수소 결합 영역을 포함하는, 바람직하게는 길이가 10 내지 100 뉴클레오티드이고 더욱 바람직하게는 길이가 12 내지 50 뉴클레오티드이고 각 가닥이 서로 상보성이고 수소 결합 영역이 엄격한 혼성화 조건 하에서 충분히 안정하여 형광발광 또는 형광 광검출, 방사능 사진, 또는 겔 전기영동과 같은 수단에 의해 검출되는 핵산 구조를 의미한다. 이러한 혼성체에는 RNA:RNA, RNA:DNA 또는 DNA:DNA 이중가닥 분자가 포함된다.
상보성이란 2개의 단일 가닥 핵산의 유사한 영역의 뉴클레오티드 서열 또는 하나의 동일한 단일 가닥 핵산의 상이한 영역의 뉴클레오티드 서열이 엄격한 혼성화 분석 조건 하에서 단일 가닥이 안정한 이중 가닥의 수소 결합 영역으로 혼성화하도록 하는 뉴클레오티드 염기 조성을 갖는다는 것을 의미한다. 하나의 단일 가닥 영역의 뉴클레오티드의 인접 서열이, A가 U 또는 T와 염기쌍을 형성하고 C가 G와 염기쌍을 형성하는 일련의 규칙적인 수소 결합 염기쌍을 다른 단일 가닥 영역의 뉴클레오티드의 유사 서열과 형성할 때 뉴클레오티드 서열은 완전히 상보성이다.
보존적 변이체는 기준 핵산에 완전히 상보성인 다른 핵산의 핵산 영역에 상보성인 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 또는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 이러한 보존적 변이체는 엄격한 혼성화 조건 하에서 보렐리아 뉴클레오티드 서열을 갖는 표적 핵산 서열에 안정적으로 혼성화할 수 있다.
증폭 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산 서열과 혼성화하고 핵산 합성에서 핵산 합성의 개시를 위한 프라이머 및(또는) 프로모터 주형 (예를 들면, 상보성 가닥을 합성하여 기능성 프로모터 서열을 형성하기 위한)으로 작용할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 증폭 올리고뉴클레오티드를 RNA 합성을 개시하도록 고안하는 경우, 올리고뉴클레오티드는 표적 서열에 비상보성이지만 T7, T3 및 SP6 RNA 폴리머라제와 같은 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 증폭 올리고뉴클레오티드는 프라이머 신장을 억제하거나 그 양을 저하시키기 위해 변형된 3' 말단을 가질 수도 있고 갖지 않을 수도 있다. 본 명세서에서 규정되는 증폭 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 길이가 10 내지 100 뉴클레오티드이고 가장 바람직하게는 길이가 12 내지 50 뉴클레오티드이다. 본 발명의 증폭 올리고뉴클레오티드는 화학적으로 합성되거나 벡터에서 유도된 것을 의미하며 자연 발생 핵산은 해당하지 않는다.
핵산 증폭 또는 표적 증폭은 적어도 하나의 표적 핵산 서열을 가진 핵산 분자의 수를 증가시키는 것을 뜻한다.
안티센스 또는 음성 센스는 기준 핵산 서열에 상보성인 핵산 서열을 갖는 것을 뜻한다.
센스, 동일 센스 또는 양성 센스는 기준 핵산 서열에 유사한 핵산 서열을 갖는 것을 뜻한다.
헬퍼 올리고뉴클레오티드는 표지된 프로브와 상이한 부위에서 표적 핵산과 혼성화하도록 고안되어 표지된 프로브의 혼성화 속도를 증가시키거나 표적:표지 프로브 혼성체의 융해 온도 (Tm)를 증가시키거나 또는 두 개 모두를 증가시키는 핵산 프로브를 의미한다.
라임 질병 관련 보렐리아는 라임 질병을 야기하는 보렐리아 종으로서 보렐리아 종 또는 아종인 보렐리아 부르그도르페리, 보렐리아 가리니 및 보렐리아 VS461을 포함한다. 일반적으로 라임 질병 관련 보렐리아는 라임 질병에 걸린 포유동물로부터 단리할 수 있다.
계통발생적으로 밀접한 관련이 있는은 유기체가 진화 개념에서 서로 밀접한 관련이 있고 따라서 유연관계가 먼 유기체보다는 형태학적 유사성이 크고 전체 핵산 서열 상동성이 높다는 것을 의미한다. 계통수(係統樹)에 있어서 인접 또는 그 다음으로 인접한 유기체는 밀접한 관련이 있다. 계통수에서 인접 또는 그 다음으로 인접한 것보다 멀리 위치하는 유기체는 상당한 전체 핵산 서열 상동성을 보이는 경우에 밀접하게 관련될 것이다.
B.혼성화 조건 및 프로브/프라이머 구성
혼성화 반응 조건, 가장 중요하게는 혼성화 온도 및 혼성화 용액 중 염 농도는 본 발명의 증폭 올리고뉴클레오티드 또는 혼성화 프로브가 바람직하게는 시료에 존재하는 것으로 추정되는 다른 비표적 핵산에 비해 표적 보렐리아 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산과 혼성화되도록 선택될 수 있다. 감소된 염 농도 및(또는) 증가된 온도 (증가된 엄격함 (stringency)이라 불림)에서, 핵산 혼성화 정도는 이중가닥 혼성체 분자 중 뉴클레오티드 염기쌍 간의 수소 결합이 감소됨에 따라 붕괴되고, 이 과정은 융해(melting)라 불리운다.
일반적으로, 가장 안정한 혼성체는 가장 많은 수의 완벽하게 매치된 (즉, 수소결합된) 연속적인 뉴클레오티드 염기쌍을 갖는 것이다. 따라서, 이러한 혼성체는 통상적으로 혼성화 조건의 엄격성이 증가됨에 따라 융해되지 않을 것으로 기대된다. 그러나, 하나 이상의 미스매치, 비규칙적 또는 불완전한 염기쌍 (핵산의 뉴클레오티드 서열 중 그 위치에서 보다 약하거나 또는 존재하지 않는 염기쌍을 초래)을 함유하는 이중 가닥 핵산 영역은 핵산 혼성체가 시료 중에 존재하는 다른 비표적화된 핵산과 교차 반응함이 없이 혼성화 분석에서 검출되도록 하는 상대적으로 매우 엄격한 조건 하에서는 여전히 충분히 안정할 것이다.
따라서, 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열과 계통발생적 유연관계가 멀지만 다른 한편으로는 밀접하게 관련되는 비표적 핵산 서열 사이의 유사도 및 특정 증폭 올리고뉴클레오티드 또는 혼성화 프로브의 뉴클레오티드 서열과 다른 표적 및 비표적 핵산의 뉴클레오티드 서열 간의 상보성 정도에 의존하기 때문에, 하나 이상의 미스매치는 올리고뉴클레오티드가 표적 핵산에 혼성화하고 비표적 핵산에 혼성화하지 않는 능력을 반드시 파괴시키지는 않을 것이다.
본 발명의 혼성화 분석 프로브들은 프로브:표적 혼성체의 융해 온도(Tm, 반응 혼합물 중의 잠재적 이중 가닥 분자의 1/2이 단일 가닥의 변성된 상태인 온도로 정의됨)와, 시험 시료 중 존재하는 것으로 예상되지만 검출되지 않기를 바라는 계통발생적으로 가장 밀접하게 관련된 유기체의 rRNA 또는 rDNA와 프로브 간에 형성된 미스매치 혼성체의 Tm 간의 상이성을 최소화하도록 선정, 선택 및(또는) 구성되어 결정된다. 비표지된 증폭 올리고뉴클레오티드 및 헬퍼 올리고뉴클레오티드는 본 발명에 유용한 표지된 혼성화 분석 프로브와 같이 특이성 정도가 매우 높을 필요는 없으나, 일반적으로 바람직하게는 다른 핵산에 비해 하나 이상의 유기체의 표적 핵산과 혼성화되는 유사한 방법으로 구성된다.
원핵생물의 뉴클레오티드 서열은 5S, 16S 및 23S rRNA를 코딩하는 rRNA 유전자를 포함한다. 또한, 렙토스피라 (Leptospira), 렙토네마 (Leptonema), 세르풀라 (Serpula), 스피로헤타 및 트레포네마 (Treponema)의 16S 핵산 서열의 리보좀 RNA 유전자 (rDNA)의 보렐리아 핵산 서열을 비교용으로 사용하였다. 보렐리아 핵산 서열 정보는 연구소의 연구 및 출판된 문헌으로부터 수득하였다 [Marconi and Garon, J. Gen. Microbiol. 138:533-536 (1992); Paster et al., J. Bacteriol. 173:6161-6109 (1991); Marconi and Garon, J. Bacteriol. 174:241-244 (1992); Marconi Garow, J. Clin. Microbiol. 30:2830-34 (1992); Davidson et al., J. Bacteriol. 174:3766-74 (1992)].
프로브 및 증폭 올리고뉴클레오티드로서 사용되는 핵산 서열의 확인을 촉진하기 위해 상이한 종의 유기체로부터 유래한 뉴클레오티드 서열을 먼저 상동성을 최대로 하여 정렬시켰다. rRNA 분자 내에는 전체 구조 및 기능 사이에 밀접한 관련이 있다. 이것은 1차 서열 내의 진화상의 변화를 제한하여 2차 구조가 유지된다. 예를 들면, 염기가 나선 구조의 한쪽에서 변경되면 상쇄적인 변화가 다른 쪽에 생겨 상보성을 보존한다 (이를 동시 변이로 명명함). 이것은 2개의 매우 상이한 서열이 보존된 1차 서열 및 보존된 2차 구조 성분을 기초로 하여 배열될 수 있도록 한다. 혼성화 프로브에 대한 잠재적인 표적 서열은 배열된 서열의 상동성에서의 변이를 대조함으로써 확인하였다.
각각의 가변 영역에서의 서열 진화는 대부분 확산적이다. 확산성 때문에 라임 질병 관련 보렐리아의 계통발생적으로 보다 유연관계가 먼 친척종은 계통발생적으로 보다 밀접한 친척종보다 가변 영역에서의 보다 큰 가변성을 보인다. 본 발명자들은 바람직한 표적 부위를 확인하고 유용한 프로브를 고안하기 위해 동일한 시료에서 발견될 수 있는 라임 질병 관련 보렐리아과 다른 보렐리아 종 사이의 충분한 변이를 관찰하였다.
본 발명자들은 문헌에 기재되거나 실험실에서 정한 rRNA 서열의 비교 분석에 의해 라임 질병 관련 보렐리아와 다른 보렐리아 종 사이에 상이한 서열을 확인하였다. 본 발명의 목적을 위해 사용하거나 적용할 수 있는 컴퓨터 및 컴퓨터 프로그램은 시판되고 있다. 본 발명자들은 동일한 시료에서 발견될 수 있는 표적 유기체와 계통발생학상 가장 유연관계가 밀접한 친척종 사이의 변이를 충분히 관찰하여 본 발명의 프로브를 고안하였다.
단순히, 잠재적 표적 뉴클레오티드의 추정 특이 서열의 확인은 기능적으로 종 특이적 혼성화 분석 프로브가 이 서열을 함유하는 보렐리아 rRNA 또는 rDNA와 혼성화될 수 있다는 것을 보증하지는 않는다. 다양한 다른 인자가 종 특이적 프로브에 대한 표적 부위로서의 핵산 좌위의 적합성을 결정할 것이다. 수많은 인자에 의해 영향받는 본 명세서에 기재된 것과 같은 혼성화 반응의 정도 및 특이성 때문에 하나 이상의 상기 인자의 조작은 표적에 완전하게 상보성인지의 여부에 따라 특정 올리고뉴클레오티드의 정확한 감수성 및 특이성을 결정할 것이다. 상이한 분석 조건의 중요성 및 효과는 본 명세서에 참고로 포함되고 본 출원의 동일한 권리자인 호간 등의 문헌 및 국제 출원 번호 제PCT/US87/03009호가 부여된 하몬드의 미국 특허 제5,216,143호, 코네의 미국 특허 제4,8351,330호에 기재된 바와 같이 당업계의 숙련가에게 공지되어 있다.
예를 들어, 잠재적 표적 뉴클레오티드 서열의 GC 함량의 증가 (따라서, 이중 가닥 프로브:표적 혼성체의 양도 증가)는 일반적으로 안정성을 증가시켜서 혼성체 Tm을 증가시킨다. 하나 이상의 비표적 유기체와 동일한 이 서열 영역 내의 인접 뉴클레오티드의 수도 안정성에 영향을 미쳐, 보렐리아 rRNA에 대해 완벽하게 상보성인 프로브와 비표적 유기체 또는 유기체들의 rRNA 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 간의 부분적으로 미스매치된 혼성체의 Tm'을 증가시킨다.
혼성화의 바람직한 온도 및 혼성화 용액 조성 (예를 들어, 염 농도, 세제 및 다른 용질)은 이중 가닥 혼성체의 안정성에 크게 영향을 끼친다. 이온 세기 및 프로브가 표적에 혼성화하도록 하는 온도는 군 또는 종 특이적 프로브를 작제하는데 있어서 고려되어야만 한다. 혼성체 핵산의 열 안정성은 반응 혼합물의 이온 세기와 함께 증가된다. 다른 한편으로는, 수소 결합을 파괴하는 화학 시약, 예를 들어, 포름아미드, 우레아, 디메틸술폭시드 및 알코올은 혼성체의 열 안정성을 크게 감소시킬 수 있다.
표적에 대한 프로브의 특이성을 최대화하기 위하여, 본 발명의 대상 프로브는 매우 엄격한 조건 하에서 그의 표적물과 혼성화되도록 구성하였다. 이러한 조건 하에서 높은 상보성을 갖는 단일 핵산 가닥만이 서로 혼성화되고, 이러한 높은 상보성이 없는 단일 핵산 가닥은 혼성체를 형성하지 않을 것이다. 따라서, 분석 조건의 엄격성은 혼성체를 형성하기 위한 두 핵산 간에 존재해야 하는 상보성의 양을 결정할 수 있다. 본 발명에 있어서, 엄격성은 프로브와 표적 핵산간에 형성된 혼성체 및 프로브와 임의의 존재하는 단일 가닥 비표적 핵산 간에 형성된 잠재적 혼성체 간의 안정성의 차이를 최소화하기 위하여 선택된다.
적절한 프로브 특이성은 비표적 유기체의 서열에 대해 완벽하게 상보성인 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브의 길이를 최소화하고, 비표적 서열에 대한 G 및 C 풍부 (rich) 영역의 유사성을 피하고, 비표적 서열에 대해 가능한 한 많은 불안정화 미스매치를 함유하는 프로브를 제작함으로써 달성될 수 있다. 프로브 서열이 오직 특정 종류의 유기체만의 검출에 유용한 지의 여부는 주로 프로브:표적 혼성체 대 잠재적 프로브:비표적 혼성체 사이의 열 안정성 차이에 의존한다. 프로브 고안에 있어서 이들 혼성체 사이의 Tm값의 상이함은 가능한 한 크게 (바람직하게는 약 5℃ 이상)으로 만들어야 한다. Tm은 프로브 길이 및 프로브 조성 (GC 함량 대 AT 함량)을 변경시켜 조작할 수 있다.
일반적으로 길이가 약 10 내지 50 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드 프로브에 대한 최적 혼성화 온도는 제시된 이중가닥의 융해 온도의 약 5℃ 미만이다. 최적 온도 미만에서의 배양은 미스매치 염기 서열이 혼성화하여 특이성을 감소시킬 수 있다. 프로브의 길이가 길면 길수록 염기쌍 사이의 수소결합이 더 많아지고 일반적으로 Tm은 증가한다. G 및 C의 비율이 높으면 G-C 염기쌍이 추가의 수소 결합을 가지므로 Tm이 증가하고 따라서 A-T 염기쌍보다 열 안정성이 크다.
Tm을 측정하기 위한 바람직한 방법은 아놀드 등의 상기 문헌 Homogenous Protection Assay에 따른 혼성화 보호 분석법 (HPA)을 사용하여 혼성화를 측정하는 것이다. Tm은 다음과 같이 HPA를 사용하여 측정할 수 있다. 프로브:표적 혼성체를 과량의 표적을 사용하여 숙신산리튬염 완충 용액 (0.1 M 숙신산리튬 완충액, pH 5.0, 2 mM 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 2 mM 에틸렌글리콜 비스(베타-아미노-에틸 에테르) N,N,N',N' 테트라아세트산 (EGTA), 10% (w/v) 리튬 라우릴 술페이트) 중에 형성시켰다. 이어서, 혼성체의 분취액을 숙신산리튬 완충 용액으로 희석하고 예상 Tm(일반적으로 55℃) 미만의 온도에서 시작하여 2 내지 5℃씩 증가시킨 상이한 온도에서 5분 동안 배양하였다. 이어서, 이 용액을 온화한 알칼린 보레이트 완충액 (0.15 M 사붕산나트륨 (pH 7.6), 5% (v/v) 트리톤 (등록상표) X-100)으로 희석하고 보다 낮은 온도 (예를 들면 50℃)에서 10분 동안 배양하였다. 상기 조건 하에서 단일 가닥 프로브에 부착된 아크리디늄 에스테르를 가수분해하고 혼성화된 브로브에 부착된 아크리디늄 에스테르는 가수분해로부터 상대적으로 보호하였다. 따라서, 아크리디늄 에스테르 잔류량은 혼성체의 양에 비례하고 과산화수소에 이어 알칼리 첨가시에 아크리디늄 에스테르로부터 생성되는 화학발광에 의해 측정할 수 있다. 화학발광은 광도계 (예를 들면, 젠-프로브 리더(LEADER, 등록상표) I 또는 리더 (등록상표) 50으로 측정할 수 있다. 생성 데이터를 최대 신호 (일반적으로 가장 낮은 온도에서 발생)의 비율 대 온도로서 그래프화하였다. Tm은 최대 신호의 50%가 남아있는 온도로서 규정하였다. 상기 방법 외에, Tm은 당업계의 숙련가에게 공지된 동위원소 방법 (예를 들면 호간 등의 상기 문헌)에 의해 측정할 수 있다.
제시된 혼성체에 대한 Tm은 사용된 혼성화 용액에 따라 상이하다는 것을 유의해야 한다. 염 농도, 세제 및 다른 용질과 같은 인자는 열 변성 동안에 혼성체 안정성에 영향을 줄 수 있다 [J. Sambrook, E.F. Fritsch and T. Maniatis, Molecular Cloning, ch. 11 (2d ed. 1989)]. 이온 세기 및 프로브를 표적에 혼성화시키기 위해 사용된 배양 온도와 같은 조건을 프로브 작제시에 고려하여야 한다. 다른 한편으로, 수소 결합을 파괴하는 화학 시약, 예를 들면 포름아미드, 우레아, 디메틸술폭시드 및 알콜은 혼성체의 열 안정성을 크게 저하시킬 수 있다.
프로브가 그의 표적에 특이성을 갖도록 보장하기 위해서 매우 엄격한 조건 하에서만 혼성화하는 프로브를 제공하는 것이 바람직하다. 매우 엄격한 조건 하에 상보성이 매우 높은 핵산 혼성체만이 형성될 것이고 상보성이 충분하지 않은 혼성체는 형성되지 않을 것이다. 따라서, 분석 조건의 엄격성은 혼성체를 형성하기 위해 필요한 2개의 핵산 가닥 사이에 필요한 혼성화의 양을 결정한다. 엄격성은 표적과 형성된 혼성체와 다른 핵산 서열 사이의 안정성 차이를 최대로 하도록 선택된다.
적합한 특이성은 비표적 핵산에 완전히 상보성인 길이를 최소화시키고, 비표적 서열에 대한 GC 풍부 영역의 상동성을 피하고 가능한 한 비표적 서열에 대한 불안정한 미스매치를 많이 함유하는 프로브를 제조함으로써 달성할 수 있다. 프로브 서열이 특정 종류의 유기체만을 검출하기에 유용한 지의 여부는 주로 프로브:표적 혼성체와 프로브:비표적 혼성체 사이의 열 안정성 차이에 달려 있다. 프로브 고안시에 이들 Tm값의 차이를 가능한 한 크게 (바람직하게는 약 5℃ 이상) 하여야 한다.
표적 핵산 서열의 길이, 즉 프로브 서열의 총 길이도 특이성에 중요할 수 있다. 어떤 경우에는 바람직한 혼성화 특성을 갖는 프로브를 생성시키는 좌위 및 길이가 상이한 특정 영역, 예를 들면 가변 영역에서 유래한 여러 서열이 존재 할 수 있다. 다른 경우에는 한 프로브가 염기 하나가 상이한 뉴클레오티드 서열을 갖는 다른 프로브보다 상당히 우수할 수 있다. 완전히 상보성이지는 않은 핵산들이 혼성화할 수 있는 반면, 가장 긴 완벽한 상동 염기 서열은 일반적으로 염기쌍의 조성이 일정 기능을 수행하면서 혼성체 안정성을 결정할 것이다. 표적 핵산 서열의 길이, 따라서 프로브 서열의 길이도 중요할 수 있다. 어떤 경우에는 바람직한 혼성화 특성을 갖는 브로브의 고안에 사용될 수 있는 좌위 및 길이가 상이한 특정 가변 영역에서 유래한 여러 뉴클레오티드 서열이 존재 할 수 있다.
프로브로서 본 발명에 사용되는 올리고뉴클레오티드의 길이는 상이하다. 바람직한 프로브는 길이가 10 내지 100 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드이다. 보다 바람직한 프로브의 길이는 15 내지 50 염기이다.
혼성화를 억제하는 강력한 분자내 구조를 형성하는 rRNA의 영역은 헬퍼 프로브가 사용되지 않는 분석에서는 바람직하지 못한 표적 영역이다. 이와 같이, 강력한 자기 상보성을 초래하는 프로브 구성은 삼가해야한다. 상기한 바와 같이, 혼성화는 수소 결합된 이중 가닥 혼성체를 형성하기 위한 상보성 핵산의 두개의 단일 가닥의 결합이다. 따라서, 두개의 가닥 중 하나 또는 둘의 전부 또는 일부가 분자내 또는 분자간 결합에 관여하는 경우, 신규 분자간 프로브:표적 혼성체의 형성에 덜 관여하게 될 것이다. 예를 들어, 리보좀 RNA 분자는 수소 결합에 의해 매우 안정한 분자내 나선 구조(helices) 및 2차 구조를 형성하는 것으로 공지되어 있다. 프로브와 혼성화될 때까지 표적 서열의 상당 부분이 단일 가닥 상태로 남아있도록 혼성화 분석법을 구성함으로써, 프로브와 표적물 간의 혼성화 속도 및 정도는 크게 증가할 것이다. 하나의 방법으로 이는 표적 뉴클레오티드 서열로 상대적으로 분자내 수소 결합에 관여하지 않는 서열을 선택함으로써 수행될 수 있다. 별법으로 또는 추가적으로, 혼성화 분석 프로브는 표적 부위를 혼성화 분석 프로브와 혼성화되기 쉽게할 수 있는 헬퍼 올리고뉴클레오티드를 프로브와 혼합하여 사용할 수 있다.
표적 핵산에 대해 완벽하게 매치된 올리고뉴클레오티드에 대한 융해 온도의 추정치를 제공하는 많은 식이 있다. 이러한 식 중 하나로, Tm = 81.5 + 16.6 (log10[Na+]) + 0.41 (분획 G + C) - (600/N) (여기서, N=뉴클레오티드수 중 올리고뉴클레오티드 길이)는 길이가 약 14 내지 60 또는 70 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드의 Tm에 대해 양호한 추정치를 제공한다. 이러한 계산으로부터, 후속되는 Tm의 실험적 입증 또는 미세 조정을 당업계에 공지된 스크리닝 방법을 사용하여 할 수 있다. 혼성화 및 올리고뉴클레오티드 프로브에 대한 추가의 정보를 위해 본 출원서에 참고 문헌으로 인용된 문헌 [삼브룩크(Sambrook) 등,Molecular Cloning: A laboratory manual, Chapter 11(Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989)]을 참조. 당업계에 공지된 다른 문헌 중에서 이 참고 문헌도 혼성체의 Tm 상의 미스매치의 효과에 대한 추정치를 제공한다. 따라서, 2종 이상의 유기체의 리보좀 RNA (또는 rDNA)의 제공된 영역의 공지 뉴클레오티드 서열로부터 이들 유기체를 서로 식별하는 올리고뉴클레오티드를 고안할 수 있다.
C.핵산 증폭
바람직하게는, 본 발명의 증폭 올리고뉴클레오티드는 올리고데옥시뉴클레오티드이고, 핵산 폴리머라제에 의한 특이적 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 주형으로 사용되기에 충분히 길다. 최적 프라이머 길이는 여러 인자, 즉 반응 온도, 프라이머의 구조 및 염기 조성, 및 프라이머의 사용 방법 등을 고려해야한다. 예를 들어, 최적 특이성을 위해, 올리고뉴클레오티드 프라이머는 표적 핵산 서열의 복합성에 의존하며, 일반적으로 약 12개 이상의 뉴클레오티드를 함유해야한다. 이러한 특이성이 필수적이지 않은 경우, 좀 더 짧은 프라이머를 사용할 수 있고, 이러한 경우에는 주형 핵산과의 안정한 혼성체 복합체를 형성하기 위해 좀 더 낮은 온도에서 반응을 수행하는 것이 바람직할 수 있다.
바람직한 특성을 갖는 증폭 올리고뉴클레오티드 및 프로브의 고안을 위한 유용한 지침을 설명한다. 본 발명의 최량 고안 부위는 단일 핵산 분자의 약 350 염기 내, 보다 바람직하게는 150개의 인접 뉴클레오티드 내의 약 15 염기 이상의 라임 질병 관련 보렐리아 핵산의 2개, 바람직하게는 3개의 보존 영역을 포함한다.
한 세트의 프라이머 또는 프로모터 프라이머를 사용하여 관찰한 증폭의 정도는 올리고뉴클레오티드의 그의 상보성 서열에 혼성화하는 능력 및 효소에 의해 신장되거나 복제되는 능력을 포함한 여러 인자에 달려 있다. 길이 및 염기 조성이 상이한 올리고뉴클레오티드를 사용할 수 있지만, 본 발명에 바람직한 올리고뉴클레오티드는 표적에 대한 Tm예상치가 약 65℃인 18 내지 40 염기의 표적 결합 영역을 갖는다.
프로브의 혼성화에 영향을 끼치는 변수, 예를 들면 Tm, 상보성 및 표적 서열의 2차 구조도 프라이머 혼성화, 따라서 성능에 영향을 끼친다. 또한, 비특이적 신장 (프라이머-다이머 또는 비표적 복제)의 정도는 증폭 효율에 영향을 끼칠 수 있고 따라서 프라이머는 낮은 자기상보성 또는 교차 상보성을 특히 서열의 3'에서 갖도록 선택된다. 긴 단일체 서열 및 높은 GC 함량은 허위의 프라이머 신장을 감소시키기 위해 피한다. 컴퓨터 프로그램을 사용하여 상기 특징에서 올리고뉴클레오티드의 고안을 도울 수 있다.
본 발명의 증폭 올리고뉴클레오티드와 함께 사용된 핵산 폴리머라제는 리보 또는 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 모두를 주형 의존적 방법으로 공유 결합된 핵산 폴리머 또는 가닥에 혼입시키는 화학적, 물리적 또는 생물학적 작용제를 의미한다. 핵산 폴리머라제의 예로는 DNA 지향 DNA 폴리머라제, RNA 지향 DNA 폴리머라제 및 RNA 지향 RNA 폴리머라제를 들 수 있다. DNA 폴리머라제는, 주형 의존적 방법으로, 5' 에서 3' 방향으로 핵산 합성을 일으킨다. 이중 가닥 핵산 중 두가닥이 평행의 역방향이기 때문에, 이 방향은 주형의 3' 영역에서 주형의 5' 영역으로 향한다. DNA 지향 DNA 폴리머라제는 이. 콜리 DNA 폴리머라제 I, 써머스 아쿠아티쿠스 (Thermus auaticus(Taq))로 부터의 열 안정성 DNA 폴리머라제 및 바실러스 스테아로써모필러스 (Bacillus Stearothermophilus(Bst))로 부터의 열 안정성 DNA 폴리머라제를 포함한다. RNA 지배적 DNA 폴리머라제의 예로는 다양한 레트로바이러스 역전사 효소, 예를 들어, 몰로니 무린 백혈병 바이러스 (MMLV) 역전사효소 또는 조류 골수성 백혈병 바이러스 (AMV) 역전사효소를 포함한다.
대부분의 핵산 증폭 반응 동안, 핵산 폴리머라제는 뉴클레오티드 잔기를 표적 핵산을 주형으로 사용하여 프라이머의 3' 말단에 첨가하여서, 표적 핵산 영역에 부분적 또는 완전 상보성 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 핵산 가닥을 합성한다. 많은 핵산 증폭 반응에서, 생성된 이중가닥 구조를 갖는 두가닥은 증폭 반응을 진행하기 위하여 화학적 또는 물리적 수단에 의해 분리될 수 있다. 별법으로, 새로이 합성된 주형 가닥은 가닥 변위 또는 본래의 표적 가닥의 부분 또는 전부를 소화시키는 핵산 분해 효소를 사용하여, 제2 프라이머 또는 프로모터-프라이머와 혼성화될 수 있다. 이러한 방법으로, 과정을 수회 반복하여 표적 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자 수를 증가시킬 수 있다.
제1 또는 제2 증폭 올리고뉴클레오티드, 또는 모두가 프로모터-프라이머일 수 있다. 이러한 프로모터-프라이머는 통상적으로 표적 핵산 분자, 또는 프라이머 연장 상물의 뉴클레오티드 서열에 대해 상보성이 아닌 뉴클레오티드 서열을 함유한다. 이 비상보성 서열은 증폭 올리고뉴클레오티드 상의 상보성 서열의 5'에 위치할 수 있고, 핵산 폴리머라제의 작용에 의해 이중가닥으로 만들어 질때, RNA 합성의 개시 좌위를 제공할 수 있다. 따라서, 제공된 프로모터는 표적 핵산 서열의 다중 RNA 카피(copy)의 시험관 내 전사를 가능하게 할 수 있다. 본 출원서에서 대조구가 프라이머로 만들어질 때, 이러한 대조구는, 대조구의 정황이 명확하게 다른 것을 의미하지 않는 한, 프로모터-프라이머의 프라이머 측면을 포함하는 것으로 이해된다.
특정 증폭 시스템, 예를 들어, 다타굽타 등의 상기 문헌의 증폭 방법에서는, 증폭 올리고뉴클레오티드는 가닥 치환을 지원하는 5' 비상보성 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 더우기, 5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 핵산 폴리머라제와 함께 사용되는 경우, 증폭 올리고뉴클레오티드는 그의 5' 말단에서 변형되어 효소 소화를 방지할 수 있다. 별법으로, 핵산 폴리머라제는, 예를 들어, 5' 뉴클레아제 도메인 없이 활성 폴리머라제 단편을 방출하는 프로테아제로 처리하여, 5' 엑소뉴클레아제 활성이 제거되도록 변형될 수 있다. 이러한 경우에, 올리고뉴클레오티드는 그의 말단에서 변형될 필요가 없다.
1.올리고뉴클레오티드의 제조
올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 서브 유닛들이 함께 공유 결합되어 만들어진다. 뉴클레오티드 서브유닛들의 당(糖) 기들은 리보스, 데옥시리보스 또는 그의 변성 유도체, 예를 들어 O-메틸 리보스일 수 있다. 뉴클레오티드 서브유닛들은 포스포디에스테르 결합, 변형된 결합과 같은 결합, 또는 올리고뉴클레오티드의 혼성화를 방해하지 않는 비뉴클레오티드 잔기에 의해 결합될 수 있다. 비변형된 결합은 표준 포스포디에스테르 결합이 상이한 결합, 예를 들어, 포스포로티오에이트 결합, 또는 메틸포스포네이트 결합으로 치환되는 것을 포함한다. 상기한 바와 같이, 혼성화 분석 프로브로 사용되는 경우, 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 아크리디늄 에스테르 또는 방사능 동위원소와 같은 레포터기를 함유하여 그의 표적 서열에 대한 프로브의 혼성화의 확인을 돕는다.
본 발명의 모든 증폭 올리고뉴클레오티드는 당 업계에 공지된 방법으로 쉽게 제조될 수 있다. 바람직하게는, 프라이머는 고상 방법을 사용하여 합성된다. 예를 들어, 카루테르스(Carruthers) 등은 표준 포스포라미디트 고상 화학법을 사용하여 포스포디에스테르 결합에 의한 뉴클레오티드의 결합을 기재하고 있다. 시아노에틸포스포라미디트 전구체를 사용하는 자동화 고상 화학 합성법이 문헌 [Barone, et al., Nucleic Acids Research, 12:405 (1984)]에 기재되어 있다. (Methods in Enzymology, Volume 143, 287 (1987)). 또한, 바트 (Bhatt)는 포스포로티오에이트 결합을 함유하는 올리고뉴클레오티드 합성 방법을 기재하고 있다. (미국 특허 번호 제07/319,579호 (본 발명과 공동 소유권을 가짐) Methods and Reagent for Sulphurization of Organophosphorous Compounds). 또한, 클렘(Klem) 등의 문헌 [PCT 출원 제WO92/07864호, Imporved Process for the Synthesis fo Oligomers]에서는 메틸포스포네이트 결합을 함유하는 상이한 결합을 갖는 올리고뉴클레오티드 합성에 대해 기재하고 있다. 후자의 세가지 문헌은 본 출원서에 참고 문헌으로 인용되고 있다. 또한, 올리고뉴클레오티드의 유기 합성 방법은 당 업계의 기술자에게 공지되어 있고, 본 출원서에 참고문헌으로 인용된 삼부르크 등의 상기 문헌에 기재되어 있다.
특정 올리고뉴클레오티드의 합성 및 정제 후에 여러 상이한 방법을 사용하여 프로브 또는 프라이머의 크기 및 순도의 허용성을 측정할 수 있다. 적합한 방법으로는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 고압 액체 크로마토그래피를 들 수 있다. 이 두 개의 방법은 당업계의 숙련가에게 공지되어 있다.
본 발명의 모든 올리고뉴클레오티드에서, 혼성화 분석 프로브, 증폭 올리고뉴클레오티드 또는 헬퍼 올리고뉴클레오티드는 화학적 기로 변형되어 그들의 수행능을 증진시키거나, 또는 증폭 산물의 특성화를 용이하게 할 수 있다. 예를 들어, 특정 폴리머라제의 핵산 분해 활성에 내성인 올리고뉴클레오티드를 가능하게하는 골격 변형된 올리고뉴클레오티드, 예를 들어, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트기를 갖는 것은 증폭 반응 또는 다른 반응에서 이러한 효소의 사용을 가능하게 한다. 변형의 다른 예로는 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 말단 간에 혼입되는 비뉴클레오티드 링커 (예를 들어, 아놀드 등, Non-Nucleotide Linking Reagents for Nucleotide Probes, 유럽 특허 출원 제88308766-0호로 본 출원서에 참고 문헌으로 인용됨)를 사용하여 프라이머의 혼성화 또는 신장을 막지 않는 것이다. 증폭 올리고뉴클레오티드도 바람직하게 변형된 뉴클레오티드와 천연 뉴클레오티드와의 혼합물을 함유할 수 있다.
본 발명과 공동 소유권을 가지며 본 출원서에 참고문헌으로 인용된 맥도너프(McDonugh)등의 미국 특허 출원 제07/925405호 (제목: Nucleic Acid Sequence Amplification)에서 기재된 방법과 같이, 증폭 올리고뉴클레오티드의 3' 말단을 봉쇄하여 DNA 합성 개시를 예방할 수 있다. 상이하게 3' 봉쇄된 증폭 올리고뉴클레오티드의 혼합물, 또는 3' 봉쇄된 올리고뉴클레오티드와 비봉쇄된 올리고뉴클레오티드의 혼합물은, 상기 문헌에 기재된 바와 같이, 핵산 증폭 효율을 증가시킬 수 있다.
상기한 바와 같이, 올리고뉴클레오티드의 5' 말단은 변성되어 특정 핵산 폴리머라제 중 존재하는 5'-엑소뉴클레아제 활성에 대해 내성을 가질 수 있다. 이러한 변형물은, 본 출원서에 참고 문헌으로 인용된 아놀드 등의 상기 문헌 [Non-Nucleotide Linking Reagents for Nucleotide Probes]에 기재된 기술을 사용하여, 비뉴클레오티드기를 프라이머의 5' 말단 뉴클레오티드에 가하여 수행할 수 있다.
일단 합성된 후에 선택된 올리고뉴클레오티드 프로브는 여러 공지 방법 (예를 들면, J. Sambrook, 상기 문헌) 중의 어느 한 방법으로 표지할 수 있다. 유용한 표지로는 방사성 동위원소 및 비방사성 리포터기를 들 수 있다. 동위원소 표지로는3H,35S,32P,125I,57Co 및14C를 들 수 있다. 동위원소 표지는 당업계에 공지된 기술, 예를 들면 닉 트랜스레이션 (nick translation), 말단 표지화, 제2 가닥 합성, 역전사의 이용 및 화학 방법에 의해 올리고뉴클레오티드에 도입할 수 있다. 방사 표지 프로브를 사용하여 방사선 사진, 신틸레이션 계수법 또는 감마 계수법에 의해 혼성화를 검출할 수 있다.
또한, 비동위원소 물질을 표지화를 위해 사용할 수 있고 핵산 서열 내부에 또는 핵산 서열의 말단에 도입될 수 있다. 변형 뉴클레오티드는 효소에 의해 또는 화학적으로 혼입될 수 있다. 프로브의 화학적 변형은 예를 들면 본 출원서에 참고 문헌으로 인용된 아놀드 등의 상기 문헌 Non-Nucleotide Linking Reagents for Nucleotide Probes, 유럽 특허 출원 제88308766.0호, 공개 번호 제313219호에 기재된 비뉴클레오티드 링커기를 사용하여 프로브의 합성 중에 또는 합성 후에 수행할 수 있다. 비동위원소 표지로는 형광 분자, 화학발광 분자, 효소, 코팩터, 효소 기질, 합텐 또는 다른 리간드를 들 수 있다.
바람직하게는, 프로브는 아크리디늄 에스테르로 표지될 수 있다. 아크리디늄 에스테르 표지화는 아놀드 등의 1993년 2월 9일 허여되고 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제5,185,439호 (제목: Acridinium Ester Labeling and Purkfication of Nucleotide Probes)에 기재된 바와 같이 실시할 수 있다.
2.보렐리아 rRNA 및 rDNA의 증폭
본 발명의 증폭 올리고뉴클레오티드는 특정 보렐리아 16S 또는 23S rRNA 뉴클레오티드 서열 또는 그의 rDNA 대응물을 지향한다. 이들 증폭 올리고뉴클레오티드는 핵산 증폭 분석에서 보렐리아의 존재를 검출하기 위한 혼성화 분석 프로브로서 사용되는 하나 이상의 표적 뉴클레오티드 서열 내에 포함되거나 인접할 수 있다. 본 명세서에서 기술되고 특허 청구되는 증폭 올리고뉴클레오티드는 두 세트의 증폭 올리고뉴클레오티드로 이루어진다. 증폭 올리고뉴클레오티드 세트의 구성원은, 하기 뉴클레오티드 서열 중의 하나를 갖거나 이에 실질적으로 대응하는 핵산과 혼성화할 수 있다.
서열 번호 36:,
서열 번호 37:,
서열 번호 38:,
서열 번호 39:,
서열 번호 40:,
서열 번호 41:,
서열 번호 42:,
서열 번호 51:,
서열 번호 52:,
서열 번호 53:,
서열 번호 54:,
서열 번호 55:,
서열 번호 56:,
서열 번호 27:,
서열 번호 57:, 및
서열 번호 29:.
바람직한 실시 형태에서 상기 증폭 올리고뉴클레오티드는 하기 서열을 갖거나 실질적으로 대응한다.
서열 번호 7:,
서열 번호 9:,
서열 번호 11:,
서열 번호 18:,
서열 번호 19:,
서열 번호 20:,
서열 번호 23:,
서열 번호 44:,
서열 번호 45:,
서열 번호 46:,
서열 번호 47:,
서열 번호 48:,
서열 번호 49:,
서열 번호 50:, 및
서열 번호 28:.
또한, 이들 올리고뉴클레오티드는, RNA 폴리머라제에 결합하고 주형으로서 표적 핵산을 사용하여 RNA 전사를 조절할 수 있는 프로모터 서열을 함유하는 부가적, 비상보성 염기를 그의 5' 말단에 지닐 수 있다.
보렐리아의 16S rRNA를 지향하는 바람직한 증폭 프라이머는 하기 핵산 서열을 갖거나 하기 서열에 실질적으로 대응한다.
서열 번호 7:,
서열 번호 9:,
서열 번호 11:,
서열 번호 44:,
서열 번호 46:, 및
서열 번호 47:.
이들 16S rRNA 증폭 올리고뉴클레오티드는 특정 보렐리아 16S rRNA 핵산 서열, rDNA 대응 서열 및 이들 서열과 부분적으로 또는 완전히 중복하는 서열을 지향할 수 있다.
또한, 하기 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 대응하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 16S 증폭 올리고뉴클레오티드가 바람직하다.
서열 번호 8:.
하기 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 대응하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 16S 증폭 올리고뉴클레오티드가 가장 바람직하다.
서열 번호 8:.
보렐리아의 23S rRNA를 지향하는 바람직한 증폭 프라이머는 하기 핵산 서열을 갖거나 이에 대응한다.
서열 번호 18:,
서열 번호 19:,
서열 번호 20:,
서열 번호 48:,
서열 번호 49:, 및
서열 번호 50:.
이들 23S rRNA 증폭 올리고뉴클레오티드는 특정 보렐리아 23S rRNA 핵산 서열, rDNA 대응 서열 및 이들 서열과 부분적으로 또는 완전히 중복하는 서열을 지향할 수 있다.
본 발명의 모든 증폭 올리고뉴클레오티드는 상기 서열에 대해 변형, 또는 부가물을 함유하지 않는 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 증폭 올리고뉴클레오티드 역시, 또는 별법으로 봉쇄된 3' 및(또는) 5' 말단과 같은 변형, 또는 RNA 폴리머라제에 인식되는 특정 뉴클레오티드 서열의 부가 (예를 들어, T7, T3, 또는 SP6 RNA 폴리머라제에 대한 프로모터 서열), RNA 폴리머라제에 의한 RNA 전사의 개시 또는 신장을 증진시키는 서열의 부가, 또는 분자내 염기쌍을 제공하고 2차 또는 3차 핵산 구조의 형성을 촉진시킬 수 있는 서열의 부가 등의 부가물을 이에 제한됨이 없이 포함할 수 있다.
증폭 올리고뉴클레오티드는, 모두 본 출원서의 참고 문헌으로 인용되고 앞에 둘은 본 발명과 공동 소유권을 갖는, 카시안 및 풀츠의 상기 문헌, 다타굽타 등의 상기 문헌, 및 스닌스키 등의 미국 특허 제 5079351호에서 기재된 방법과 같이, 핵산 증폭 방법, 예를 들어, RNA 폴리머라제, DNA 폴리머라제 및 RNAse 또는 그의 균등물을 사용하는 중합효소 연쇄 반응 또는 증폭 반응에 사용된다.
증폭된 표적 서열을 검출하는데 유용한 광범위하고 다양한 방법이 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드 기질 또는 프라이머는 새로이 합성된 DNA로 혼입되는 검출가능한 표지를 함유할 수 있다. 이어서, 생성된 표지된 증폭 산물은 사용되지 않는 표지된 뉴클레오티드 또는 프라이머로부터 분리되고, 표지는 분리된 생성물 분획에서 검출된다.
유용한 검출가능한 표지로 작용할 수 있는 물질은 당업계에 공지되어 있고, 방사능 동위원소, 형광 물질, 화학발광 물질, 색소체, 및 직접 검출할 수는 없지만 그들의 표지된 형태의 특이적 결합 파트너, 예를 들어, 아비딘 및 항체와 각각 반응하여 쉽게 검출될 수 있는 비오틴 및 햅텐과 같은 리간드를 포함한다.
다른 접근 방법은 검출가능하게 표지된 핵산 프로브와 혼성화시키고, 생성된 표지된 혼성체를 통상의 방법으로 측정하여 증폭 산물을 검출한다. 특히, 산물은 화학발광 아크리디늄 에스테르 표지된 핵산 프로브를 표적 서열에 혼성화시키고, 비혼성화된 프로브 상에 존재하는 아크리디늄 에스테르를 선택적으로 가수분해시키고, 광도계 중 잔류 아크리디늄 에스테르로부터 생성된 화학발광을 측정함으로써 분석할 수 있다 (본 명세서에 참고 문헌으로 인용되어 있는 아놀드 등의 상기 문헌 PCT 출원 제US88/02746호, 아놀드 및 넬슨(Nelson) 등의 미국 특허 제5283174호 및 넬슨 등의 문헌 Non-Isotopic DNA Probe Technologies (Academic Press, 샌 디에고 소재 (KRICA, ed. 1992)) 참조).
D.보렐리아 rRNA 및 rDNA에 대한 올리고뉴클레오티드 혼성화 분석 프로브
본 출원서에 개시되고 청구된 올리고뉴클레오티드 혼성화 분석 프로브는 계통발생적으로 밀접하게 관련된 세균 종의 핵산 보다는 라임 질병 관련 보렐리아 rRNA 또는 rDNA 뉴클레오티드 서열을 함유하는 표적 핵산과 우선적으로 혼성화될 수 있다. 이 혼성화 분석 프로브들은 라임 질병 관련 보렐리아와 상기 계통발생적으로 밀접하게 관련된 종의 리보좀 RNA의 대응하는 영역의 뉴클레오티드 서열 비교를 기초로 하여 고안, 선별 및(또는) 선택하였다. 바람직한 실시 형태에서 이들 프로브는 보렐리아 헤름시의 핵산 보다는 라임 질병 관련 보렐리아의 핵산에 선택적으로 혼성화한다.
본 발명은 라임 질병 관련 보렐리아 또는 보렐리아 헤름시를 포함하는 보렐리아 종의 핵산에 선택적으로 혼성화하지만 밀접하게 관련된 미생물의 핵산에는 혼성화하지 않으며 하기 핵산 서열을 갖거나 이 서열에 대응하는 핵산 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함한다.
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서열 번호 12:,
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서열 번호 10:,
서열 번호 33:,
서열 번호 34:,
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서열 번호 25:,
서열 번호 26:,
서열 번호 22:,
서열 번호 30:,
서열 번호 31:, 및
서열 번호 32:.
라임 질병 관련 보렐리아의 핵산에 선택적으로 혼성화하는 올리고뉴클레오티드 프로브는 하기 핵산 서열을 갖거나 이 서열에 대응하는 핵산 서열을 포함한다.
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서열 번호 2:,
서열 번호 12:,
서열 번호 13:,
서열 번호 21:,
서열 번호 24:,
서열 번호 25:, 및
서열 번호 26:.
라임 질병 관련 보렐리아의 16S rRNA를 지향하는 이들 올리고뉴클레오티드 혼성화 분석 프로브의 바람직한 실시 형태는 하기 뉴클레오티드 서열을 갖거나 이 서열에 실질적으로 대응한다.
서열 번호 1:,
서열 번호 2:,
서열 번호 12:, 및
서열 번호 13:.
라임 질병 관련 보렐리아의 23S rRNA를 지향하는 이들 올리고뉴클레오티드 혼성화 분석 프로브의 바람직한 실시 형태는 하기 뉴클레오티드 서열을 갖거나 이 서열에 실질적으로 대응한다.
서열 번호 21:,
서열 번호 24:,
서열 번호 25:, 및
서열 번호 26:.
본 발명의 많은 올리고뉴클레오티드 혼성화 분석 프로브는 다른 계통발생적으로 밀접하게 관련된 세균 종 보다는 보렐리아 헤름시 rRNA 또는 rDNA 뉴클레오티드 서열을 포함하는 표적 핵산에 우선적으로 혼성화한다. 바람직한 실시 형태에서 이들 혼성화 분석 프로브는 다른 보렐리아 핵산으로부터 보렐리아 헤름시를 구별할 수 있다.
보렐리아 헤름시에서 유도된 핵산에 선택적으로 혼성화하는 본 발명의 혼성화 프로브는 하기 핵산 서열을 갖거나 이 서열에 대응하는 핵산 서열을 포함한다.
서열 번호 10:,
서열 번호 33:,
서열 번호 34:,
서열 번호 35:,
서열 번호 22:,
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보렐리아 헤름시의 16S rRNA를 지향하는 이들 올리고뉴클레오티드 혼성화 분석 프로브의 바람직한 실시 형태는 하기 뉴클레오티드 서열을 갖거나 이 서열에 실질적으로 대응한다.
서열 번호 10:,
서열 번호 33:,
서열 번호 34:, 및
서열 번호 35:.
보렐리아 헤름시의 23S rRNA를 지향하는 이들 올리고뉴클레오티드 혼성화 분석 프로브의 바람직한 실시 형태는 하기 뉴클레오티드 서열을 갖거나 이 서열에 실질적으로 대응한다.
서열 번호 22:,
서열 번호 30:,
서열 번호 31:, 및
서열 번호 32:.
본 발명의 올리고뉴클레오티드 혼성화 분석 프로브는 바람직하게는 방사능 동위원소, 형광성 또는 화학발광성 잔기와 같은 리포터 기, 프로브가 표적 서열과 혼성화되는 것을 검출 또는 확인하는데 사용될 수 있는 효소 또는 다른 리간드로 표지된다. 출원인은 화학발광성 아크리디늄 에스테르를 표지로 사용하는 것을 선호한다. 본 출원과 공동 소유권을 가지며 참고 문헌으로 인용된 아놀드 등의 미국 특허 제5185439호를 참조한다. 분석 프로브는 상보성 영역에서 수소 결합에 의해 두 가닥의 어닐링을 가능하게하는 적절한 혼성화 조건 하에서 표적 서열의 핵산을 함유하는 것으로 추정되는 시료와 혼합한다. 프로브도 하나 이상의 비표지된 헬퍼 올리고뉴클레오티드와 결합하여 표적 보렐리아 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산에 대한 결합을 용이하게 할 수 있다. 이어서, 프로브를 시료에 존재하는 표적 핵산에 혼성화시키고, 생성된 혼성체 이중가닥을 당업계에 공지된 다양한 기술, 예를 들어, 히드록시아파타이트 흡착 및 방사능 모니터링으로 분리 및 검출할 수 있다. 또한, 이 기술 중에 속한 것으로 비표지된 프로브 상에 존재하는 표지를 선택적으로 분해시킨 후, 잔류 혼성화된 프로브와 결합된 표지량을 측정하는 방법이 본 출원과 공동 소유권을 가지며 참고 문헌으로 인용된 아놀드 등의 미국 특허 제5283174호에 개시되어 있다. 이 후자의 기술은 현재 본 출원인에 의해 선호된다.
E.보렐리아 검출에 사용되는 헬퍼 올리고뉴클레오티드
특이 헬퍼 올리고뉴클레오티드를 사용하여 혼성화 분석 프로브와 표적 핵산의 혼성화를 용이하게 하였다. 헬퍼 올리고뉴클레오티드는 본 출원과 공동 소유권을 가지며 참고 문헌으로 인용된 호간 및 밀리만(Milliman)의 미국 특허 제5030557호에 기재되어 있다.
헬퍼 프로브는 혼성화 분석 프로브가 표적으로 하는 영역 근처에 위치하는 핵산 서열과 혼성화하도록 선택된다. 헬퍼 프로브의 혼성화는 표적 핵산의 2차 및 3차 구조를 변경시켜 혼성화 분석 프로브의 표적 핵산에 대한 혼성화를 용이하게 한다.
보렐리아 핵산의 특이적 검출을 용이하게 하기 위한 특이 헬퍼 올리고뉴클레오티드는 하기 뉴클레오티드 서열 중의 하나를 갖거나 이에 실질적으로 대응한다.
서열 번호 4:,
서열 번호 6:,
서열 번호 15:,
서열 번호 17:,
서열 번호 23:, 및
서열 번호 28:.
다른 실시 형태에서 보렐리아 핵산의 특이적 검출을 용이하게 하기 위한 특이 헬퍼 올리고뉴클레오티드는 하기 뉴클레오티드 서열 중의 하나를 갖거나 이에 실질적으로 대응한다.
서열 번호 3:,
서열 번호 5:,
서열 번호 14:,
서열 번호 16:,
서열 번호 27:, 및
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바람직한 실시 형태에서, 라임 질병 관련 보렐리아의 16S 리보좀 핵산을 지향하는 혼성화 분석 프로브는 하기 뉴클레오티드 서열을 갖거나 이 서열에 실질적으로 대응하는 헬퍼 올리고뉴클레오티드와 함께 프로브 혼합물로 사용된다.
서열 번호 3:,
서열 번호 4:,
서열 번호 5:,
서열 번호 6:,
서열 번호 14:,
서열 번호 15:,
서열 번호 16:, 및
서열 번호 17:.
가장 바람직한 실시 형태에서 라임 질병 관련 보렐리아 16S 리보좀 핵산을 지향하는 혼성화 프로브는 하기 서열 번호 2의 서열에 실질적으로 대응하고
서열 번호 2:,
하기 서열 번호 4, 6, 15 및 17의 뉴클레오티드 서열을 갖거나 이에 실질적으로 대응하는 헬퍼 올리고뉴클레오티드와 함께 프로브 혼합물로 사용된다.
서열 번호 4:
서열 번호 6:
서열 번호 15:, 및
서열 번호 17:.
가장 바람직한 실시 형태에서 라임 질병 관련 보렐리아 16S 리보좀 핵산을 지향하는 혼성화 프로브는 하기 서열 번호 1에 실질적으로 대응하고
서열 번호 1:,
하기 서열 번호 3, 5, 14 및 16의 뉴클레오티드 서열을 갖거나 이에 실질적으로 대응하는 헬퍼 올리고뉴클레오티드와 함께 프로브 혼합물로 사용된다.
서열 번호 3:,
서열 번호 5:,
서열 번호 14:, 및
서열 번호 16:.
바람직한 실시 형태에서 라임 질병 관련 보렐리아 23S 핵산을 지향하는 혼성화 프로브는 하기 서열 번호 23, 27, 28 및 29의 뉴클레오티드 서열을 갖거나 이에 실질적으로 대응하는 헬퍼 올리고뉴클레오티드와 함께 프로브 혼합물로 사용된다.
서열 번호 23:,
서열 번호 27:,
서열 번호 28:, 및
서열 번호 29:.
가장 바람직한 실시 형태에서 라임 질병 관련 보렐리아 23S 리보좀 핵산을 지향하는 혼성화 프로브는 하기 서열 번호 21에 실질적으로 대응하고
서열 번호 21:,
하기 서열 번호 23 및 28의 뉴클레오티드 서열을 갖거나 이에 실질적으로 대응하는 헬퍼 올리고뉴클레오티드와 함께 혼합하여 사용된다.
서열 번호 23:,
서열 번호 28:.
바람직한 실시 형태에서, 서열 번호 10 또는 33에 실질적으로 대응하는 보렐리아 헤름시 16S 리보좀 핵산을 지향하는 혼성화 분석 프로브는 하기 뉴클레오티드 서열을 갖거나 이 서열에 실질적으로 대응하는 헬퍼 올리고뉴클레오티드와 함께 프로브 혼합물로 사용된다.
서열 번호 5:,
서열 번호 6:,
서열 번호 16:, 및
서열 번호 17:.
가장 바람직한 실시 형태에서 보렐리아 헤름시 16S 리보좀 핵산을 지향하는 혼성화 프로브는 하기 서열 번호 10의 서열에 실질적으로 대응하고
서열 번호 10:
하기 서열 번호 6 및 17의 뉴클레오티드 서열을 갖거나 이에 실질적으로 대응하는 헬퍼 올리고뉴클레오티드와 함께 프로브 혼합물로 사용된다.
서열 번호 6:,
서열 번호 17:.
바람직한 실시 형태에서 보렐리아 헤름시 23S 리보좀 핵산을 지향하는 혼성화 프로브는 하기 서열 번호 23, 27, 28 및 29의 뉴클레오티드 서열을 갖거나 이에 실질적으로 대응하는 헬퍼 올리고뉴클레오티드와 함께 프로브 혼합물로 사용된다.
서열 번호 23:,
서열 번호 27:,
서열 번호 28:, 및
서열 번호 29:.
바람직한 실시 형태에서 보렐리아 헤름시 23S 리보좀 핵산을 지향하는 혼성화 프로브는 하기 서열 번호 22에 실질적으로 대응하고
서열 번호 22:,
하기 서열 번호 23 및 28의 뉴클레오티드 서열을 갖거나 이에 실질적으로 대응하는 헬퍼 올리고뉴클레오티드와 함께 프로브 혼합물로 사용된다.
서열 번호 23:,
서열 번호 28:.
일반적으로 헬퍼 올리고뉴클레오티드는 엄격한 혼성화 조건 하에서 사용될 수 있으나, 그의 선택성에 있어서 반드시 종 특이성인 것은 아니다. 즉, 헬퍼 올리고뉴클레오티드에 대한 표적 뉴클레오티드 서열은 반드시 보렐리아 종에 유일한 것은 아니다.
F.핵산 조성물
다른 관련 특징에서 본 발명은 혼성화 분석 프로브와 이 프로브에 상보성인 핵산 서열 사이의 핵산 혼성체 (프로브:표적)를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 프로브와 표적 사이에 형성된 혼성체의 한 용도는 표적 서열의 존재를 검출하는 것이다. 예를 들면, 혼성체에 존재하는 아크리디늄 에스테르 (AE)는 알칼리 용액 중에서의 가수분해에 저항성인 반면에 단일 가닥 핵산에 존재하는 AE는 알칼리 용액 중에서 가수분해된다 [Arnold et al., 제목 Homogenous Protection Assay 유럽 특허 출원 제8830767.8호, 공개 제309230호 및 미국 특허 제5238174호]. 따라서, 비결합 AE-표지 프로브의 가수분해 후에 핵산 혼성체에 결합하여 잔류하는 아크리디늄 에스테르의 화학발광을 측정함으로써 표적 핵산의 존재를 검출할 수 있다.
또한, 본 발명은 증폭 올리고뉴클레오티드와 이에 실질적으로 상보성인 핵산 서열 사이의 핵산 혼성체 (프라이머:표적)를 포함하는 조성물을 제공한다. 프라이머와 표적 사이에 형성된 핵산 혼성체의 한 용도는 증폭 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 폴리머라제의 개시 부위를 제공하는 것이다. 예를 들면, 혼성체는 역전사효소, DNA 폴리머라제, 예를 들면 Taq 폴리머라제 또는 T4 DNA 폴리머라제 및 RNA 폴리머라제, 예를 들면 T7 폴리머라제, SP6 폴리머라제, T3 폴리머라제 등에 대한 개시 부위를 형성할 수 있다.
본 발명은 또한 헬퍼 올리고뉴클레오티드와 이에 실질적으로 상보성인 핵산 서열 사이의 핵산 혼성체 (헬퍼 올리고뉴클레오티드:표적)를 포함하는 조성물을 제공한다. 헬퍼 올리고뉴클레오티드와 표적 사이에 형성된 핵산 혼성체의 한 용도는 특정 핵산 서열을 혼성화에 가용하게 만드는 것이다. 예를 들면, 헬퍼 올리고뉴클레오티드와 그 표적 사이에 형성된 혼성체는 표적 서열에 혼성화할 수 있는 핵산 서열을 혼성화 프로브와의 혼성화에 가용하게 만들 수 있다. 헬퍼 올리고뉴클레오티드의 용도에 대한 자세한 설명은 호간 및 밀리만의 미국 특허 제5030557호에 기술되어 있다.
본 발명의 조성물은 보렐리아 핵산과 하기 핵산 서열 중의 하나 이상의 서열에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 사이에 형성된 핵산 혼성체를 포함하는, 보렐리아 핵산 검출용 조성물을 제공한다.
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서열 번호 48:,
서열 번호 49:, 및
서열 번호 50:.
본 발명의 바람직한 조성물은 보렐리아 핵산과 하기 핵산 서열 중의 하나 이상의 서열에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 사이에 형성된 핵산 혼성체를 포함하는, 라임 질병 관련 보렐리아 검출용 조성물을 제공한다.
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서열 번호 49:, 및
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본 발명의 바람직한 조성물은 보렐리아 핵산과 하기 핵산 서열 중의 하나 이상의 서열에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 사이에 형성된 핵산 혼성체를 포함하는, 라임 질병 관련 보렐리아 검출용 조성물을 제공한다.
서열 번호 1:,
서열 번호 2:,
서열 번호 21:,
서열 번호 7:,
서열 번호 9:,
서열 번호 18:,
서열 번호 19:, 및
서열 번호 20:.
또한, 본 발명은 보렐리아 핵산과 하기 서열 번호 7에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 사이에 형성된 핵산 혼성체를 포함하고,
서열 번호 7:,
또한, 하기 서열 번호 8 및 9 중의 하나 이상의 핵산 서열에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 갖는, 라임 질병 관련 보렐리아 검출용 조성물을 제공한다.
서열 번호 8:,
서열 번호 9:.
또한, 본 발명은 보렐리아 핵산과 하기 서열 번호 44에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 사이에 형성된 핵산 혼성체를 포함하고,
서열 번호 44:,
또한, 하기 서열 번호 45 또는 46 중의 하나 이상의 핵산 서열에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 갖는, 라임 질병 관련 보렐리아 검출용 조성물을 제공한다.
서열 번호 45:,
서열 번호 46:.
본 발명의 바람직한 조성물은 보렐리아 헤름시 핵산과 하기 핵산 서열 중의 하나 이상의 서열에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 사이에 형성된 핵산 혼성체를 포함하는, 보렐리아 헤름시 검출용 조성물을 제공한다.
서열 번호 10:,
서열 번호 33:,
서열 번호 34:,
서열 번호 35:,
서열 번호 7:,
서열 번호 11:,
서열 번호 22:,
서열 번호 30:,
서열 번호 31:,
서열 번호 32:,
서열 번호 18:,
서열 번호 19:,
서열 번호 48:, 및
서열 번호 49:.
본 발명의 보다 바람직한 조성물은 보렐리아 헤름시 핵산과 하기 핵산 서열 중의 하나 이상의 서열에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 사이에 형성된 핵산 혼성체를 포함하는, 라임 질병 관련 보렐리아 헤름시 검출용 조성물을 제공한다.
서열 번호 10:,
서열 번호 22:,
서열 번호 7:,
서열 번호 11:,
서열 번호 18:, 및
서열 번호 19:.
또한, 본 발명은 보렐리아 헤름시 핵산과 하기 서열 번호 8에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 사이에 형성된 핵산 혼성체를 포함하고,
서열 번호 8:,
또한, 하기 서열 번호 7 및 11 중의 하나 이상의 핵산 서열에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 갖는, 보렐리아 헤름시 검출용 조성물을 제공한다.
서열 번호 7:,
서열 번호 11:.
또한, 본 발명은 보렐리아 헤름시 핵산과 하기 서열 번호 45에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 사이에 형성된 핵산 혼성체를 포함하고,
서열 번호 45:,
또한, 하기 서열 번호 44 및 47 중의 하나 이상의 핵산 서열에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 갖는, 보렐리아 헤름시 검출용 조성물을 제공한다.
서열 번호 44:,
서열 번호 47:.
또한, 본 발명은 본 발명의 프로브 및 하기 핵산 서열 중의 하나 이상의 서열에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖는 하나 이상의 헬퍼 올리고뉴클레오티드를 포함하는 핵산 혼성체를 포함한다.
서열 번호 3:,
서열 번호 4:,
서열 번호 5:,
서열 번호 6:,
서열 번호 14:,
서열 번호 15:,
서열 번호 16:,
서열 번호 17:,
서열 번호 23:,
서열 번호 27:,
서열 번호 28:, 및
서열 번호 29:.
또한, 본 발명은 보렐리아 핵산과 서열 번호 7 및 44에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 사이에 형성된 핵산 혼성체를 포함하고,
서열 번호 7:,
서열 번호 44:,
또한, 서열 번호 8, 45, 9 및 46 중의 하나 이상의 핵산 서열에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 갖고,
서열 번호 8:,
서열 번호 45:,
서열 번호 9:, 및
서열 번호 46:,
임의로, 하기 서열 중의 하나에 실질적으로 대응하는 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 하나 이상 포함하는, 라임 질병 관련 보렐리아 검출용 조성물을 제공한다.
서열 번호 1:,
서열 번호 2:,
서열 번호 12:,
서열 번호 13:,
서열 번호 4:,
서열 번호 6:,
서열 번호 15:,
서열 번호 17:,
서열 번호 3:,
서열 번호 5:,
서열 번호 14:, 및
서열 번호 16:.
또한, 본 발명은 보렐리아 핵산과 서열 번호 18 및 48에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 사이에 형성된 핵산 혼성체를 포함하고,
서열 번호 18:,
서열 번호 48:,
또한, 서열 번호 19, 49, 20 및 50 중의 하나 이상의 핵산 서열에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 갖고,
서열 번호 19:,
서열 번호 49:,
서열 번호 20:, 및
서열 번호 50:,
임의로, 하기 서열 중의 하나에 실질적으로 대응하는 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 하나 이상 포함하는, 라임 질병 관련 보렐리아 검출용 조성물을 제공한다.
서열 번호 21:,
서열 번호 25:,
서열 번호 24:,
서열 번호 26:,
서열 번호 23:,
서열 번호 27:,
서열 번호 28:, 및
서열 번호 29:.
또한, 본 발명은 보렐리아 헤름시 핵산과 서열 번호 8 및 45에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 사이에 형성된 핵산 혼성체를 포함하고,
서열 번호 8:,
서열 번호 45:,
또한, 서열 번호 7, 44, 11 및 47 중의 하나 이상의 핵산 서열에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 갖고,
서열 번호 7:,
서열 번호 44:,
서열 번호 11:, 및
서열 번호 47:.
임의로, 하기 서열 중의 하나에 실질적으로 대응하는 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 하나 이상 포함하는, 보렐리아 헤름시 검출용 조성물을 제공한다.
서열 번호 10:,
서열 번호 33:,
서열 번호 34:,
서열 번호 35:,
서열 번호 5:,
서열 번호 6:,
서열 번호 16:, 및
서열 번호 17:.
또한, 본 발명은 보렐리아 헤름시 핵산과 서열 번호 18 및 48에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 사이에 형성된 핵산 혼성체를 포함하고,
서열 번호 18:,
서열 번호 48:,
또한, 서열 번호 19, 49, 20 및 50 중의 하나 이상의 핵산 서열에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 갖고,
서열 번호 19:,
서열 번호 49:,
서열 번호 20:, 및
서열 번호 50:,
임의로, 하기 서열 중의 하나에 실질적으로 대응하는 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 하나 이상 포함하는, 보렐리아 헤름시 검출용 조성물을 제공한다.
서열 번호 22:,
서열 번호 31:,
서열 번호 30:,
서열 번호 32:,
서열 번호 23:,
서열 번호 27:,
서열 번호 28:, 및
서열 번호 29:.
바람직한 실시 형태에서 본 발명은 또한 본 발명의 프로브 및 하기 서열 번호 4, 6 및 23의 핵산 서열 중의 하나 이상에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖는 헬퍼 올리고뉴클레오티드를 하나 이상 포함하는 핵산 혼성체를 제공한다.
서열 번호 4:,
서열 번호 6:, 및
서열 번호 23:.
또한, 본 발명은 보렐리아 핵산과 하기 서열 번호 8 또는 45의 핵산 서열에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 사이에 형성되는 핵산 혼성체를 포함하는 라임 질병 관련 보렐리아 검출용 조성물을 제공한다.
서열 번호 8:,
서열 번호 45:.
상기 서열에서, 19개의 3'쪽 뉴클레오티드는 대부분 나타낸 바와 같이 동일하다.
G.분석 방법
본 발명은 시료 내의 보렐리아 핵산의 존재를 분석하기 위한 다양한 방법을 제공한다. 당업계의 숙련가는 사용되는 분석 조건, 프로브 또는 프라이머가 사용되는 특정 분석 형태 및 시료의 공급원에 따라 상이할 것이라는 것을 이해할 것이다.
일반적으로, 본 발명은 엄격한 혼성화 분석 조건 하에 하기 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열에 실질적으로 대응하는 핵산을 갖는 보렐리아 표적 핵산에는 혼성화할 수 있지만 밀접하게 관련된 미생물의 핵산에는 혼성화하지 않는 핵산 혼성화 분석 프로브와 시료를 엄격한 혼성화 조건 하에서 접촉시켜 보렐리아 미생물의 존재를 검출하는 방법을 제공한다.
서열 번호 1:,
서열 번호 2:,
서열 번호 12:,
서열 번호 13:,
서열 번호 10:,
서열 번호 33:,
서열 번호 34:,
서열 번호 35:,
서열 번호 21:,
서열 번호 24:,
서열 번호 25:,
서열 번호 26:,
서열 번호 22:,
서열 번호 30:,
서열 번호 31:,
서열 번호 32:.
라임 질병 관련 보렐리아의 존재를 검출하는 바람직한 방법은 엄격한 혼성화 분석 조건 하에 하기 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열에 실질적으로 대응하는 라임 질병 관련 보렐리아 표적 핵산 서열에는 혼성화할 수 있지만 보렐리아 헤름시와 같은 밀접하게 관련된 세균의 핵산 서열에는 혼성화하지 않는 핵산 혼성화 분석 프로브와 시료를 엄격한 혼성화 조건 하에서 접촉시키는 단계를 포함하는 단계를 포함한다.
서열 번호 1:,
서열 번호 2:,
서열 번호 12:,
서열 번호 13:,
서열 번호 21:,
서열 번호 24:,
서열 번호 25:,
서열 번호 26:.
라임 질병 관련 보렐리아의 존재를 검출하는 보다 바람직한 방법은 엄격한 혼성화 분석 조건 하에 하기 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열에 실질적으로 대응하는 라임 질병 관련 보렐리아 표적 핵산 서열에는 혼성화할 수 있지만 보렐리아 헤름시와 같은 밀접하게 관련된 세균의 핵산 서열에는 혼성화하지 않는 핵산 혼성화 분석 프로브와 시료를 엄격한 혼성화 조건 하에서 접촉시키는 단계를 포함하는 단계를 포함한다.
서열 번호 1:,
서열 번호 2:,
서열 번호 21:,
서열 번호 24:.
또한, 본 발명은 엄격한 혼성화 분석 조건 하에 하기 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열에 실질적으로 대응하는 보렐리아 16S 리보좀 표적 핵산 서열에는 혼성화할 수 있지만 밀접하게 관련된 세균의 핵산 서열에는 혼성화하지 않는 핵산 혼성화 분석 프로브와 시료를 엄격한 혼성화 조건 하에서 접촉시킴으로써 보렐리아 미생물의 존재를 검출하는 방법을 제공한다.
서열 번호 1:,
서열 번호 2:,
서열 번호 12:,
서열 번호 13:,
서열 번호 10:,
서열 번호 33:,
서열 번호 34:,
서열 번호 35:.
일반적으로, 본 발명은 엄격한 혼성화 분석 조건 하에 하기 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열에 실질적으로 대응하는 보렐리아 23S 리보좀 표적 핵산 서열에는 혼성화할 수 있지만 밀접하게 관련된 세균의 핵산 서열에는 혼성화하지 않는 핵산 혼성화 분석 프로브와 시료를 엄격한 혼성화 조건 하에서 접촉시킴으로써 보렐리아 미생물의 존재를 검출하는 방법을 제공한다.
서열 번호 21:,
서열 번호 24:,
서열 번호 25:,
서열 번호 26:,
서열 번호 22:,
서열 번호 30:,
서열 번호 31:,
서열 번호 32:.
본 발명은 엄격한 혼성화 분석 조건 하에 하기 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열에 실질적으로 대응하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 보렐리아 16S 리보좀 표적 핵산 서열에는 혼성화할 수 있지만 보렐리아 부르그도르페리 및 다른 라임 질병 관련 보렐리아와 같은 밀접하게 관련된 미생물의 핵산 서열에는 혼성화하지 않는 핵산 혼성화 분석 프로브와 시료를 엄격한 혼성화 조건 하에서 접촉시킴으로써 보렐리아 헤름시의 존재를 검출하는 방법을 제공한다.
서열 번호 10:,
서열 번호 33:,
서열 번호 34:,
서열 번호 35:.
본 발명은 엄격한 혼성화 분석 조건 하에 하기 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖는 보렐리아 23S 리보좀 표적 핵산 서열에는 혼성화할 수 있지만 보렐리아 부르그도르페리 및 다른 라임 질병 관련 보렐리아와 같은 밀접하게 관련된 미생물의 핵산 서열에는 혼성화하지 않는 핵산 혼성화 분석 프로브와 시료를 엄격한 혼성화 조건 하에서 접촉시킴으로써 보렐리아 헤름시의 존재를 검출하는 방법을 제공한다.
서열 번호 22:,
서열 번호 30:,
서열 번호 31:,
서열 번호 32:.
본 발명은 엄격한 혼성화 분석 조건 하에 하기 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖는 라임 질병 관련 보렐리아 16S 리보좀 표적 핵산 서열에는 혼성화할 수 있지만 밀접하게 관련된 미생물의 핵산 서열에는 혼성화하지 않는 핵산 혼성화 분석 프로브와 시료를 엄격한 혼성화 조건 하에서 접촉시킴으로써 라임 질병 관련 보렐리아 미생물의 존재를 검출하는 방법을 제공한다.
서열 번호 1:,
서열 번호 2:,
서열 번호 12:,
서열 번호 13:.
엄격한 혼성화 분석 조건 하에 하기 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖는 라임 질병 관련 보렐리아 16S 리보좀 표적 핵산 서열에는 혼성화할 수 있지만 밀접하게 관련된 미생물의 핵산 서열에는 혼성화하지 않는 핵산 혼성화 분석 프로브와 시료를 엄격한 혼성화 조건 하에서 접촉시킴으로써 라임 질병 관련 보렐리아 미생물의 존재를 검출하는 방법이 보다 바람직하다.
서열 번호 1:,
서열 번호 2:.
본 발명은 엄격한 혼성화 분석 조건 하에 하기 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖는 라임 질병 관련 보렐리아 23S 리보좀 표적 핵산 서열에는 혼성화할 수 있지만 밀접하게 관련된 미생물의 핵산 서열에는 혼성화하지 않는 핵산 혼성화 분석 프로브와 시료를 엄격한 혼성화 조건 하에서 접촉시킴으로써 라임 질병 관련 보렐리아 미생물의 존재를 검출하는 방법을 제공한다.
서열 번호 21:,
서열 번호 24:,
서열 번호 25:,
서열 번호 26:.
엄격한 혼성화 분석 조건 하에 하기 서열 번호 21의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖는 라임 질병 관련 보렐리아 23S 리보좀 표적 핵산 서열에는 혼성화할 수 있지만 밀접하게 관련된 미생물의 핵산 서열에는 혼성화하지 않는 핵산 혼성화 분석 프로브와 시료를 엄격한 혼성화 조건 하에서 접촉시킴으로써 라임 질병 관련 보렐리아 미생물의 존재를 검출하는 방법이 가장 바람직하다.
서열 번호 21:.
본 발명은 먼저 보렐리아 핵산의 일부를 증폭시킨 후, 임의로 본 발명의 혼성화 분석 프로브를 사용하여 본 발명의 프라이머에 의해 증폭된 특정 보렐리아 핵산을 분석함으로써 보렐리아 미생물을 검출하는 방법을 제공한다. 증폭된 핵산은 겔 전기영동을 포함한 많은 방법에 의해 검출할 수 있다.
바람직한 실시형태에서 본 발명은, RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 핵산 서열 또는 RNA 폴리머라제에 의한 신자의 개시를 증강시키는 서열을 임의로 갖고 하나 이상의 하기 서열에 결합하거나 그 서열을 통하여 신장시키는 증폭 올리고뉴클레오티드를 사용하여 보렐리아 핵산 서열을 먼저 증폭시킴으로써 보렐리아 핵산을 검출하는 방법을 포함한다.
서열 번호 7:,
서열 번호 8:.
서열 번호 9:,
서열 번호 11:,
서열 번호 18:,
서열 번호 19:,
서열 번호 20:.
상기 방법의 제1단계 후에는 임의로 엄격한 혼성화 조건 하에서 보렐리아 핵산에 특이적으로 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 혼성화 분석 프로브를 사용하여 증폭 단계에서 생성된 증폭 핵산을 검출하는 단계를 실시한다.
본 발명의 방법에 사용되는 증폭 올리고뉴클레오티드는 RNA 폴리머라제에 의해 인식되거나 또는 RNA 폴리머라제에 의한 개시 또는 신장을 증강시키는 핵산 서열을 임의로 가질 수 있다.
H. 진단 시스템
본 발명은 또한 키트 형태의 진단 시스템을 제공한다. 본 발명의 진단 시스템은 패키지 재료 내에 1회 이상의 분석에 충분한 양의 본 발명의 증폭 프라이머 및(또는) 혼성화 분석 프로브를 함유하는 키트를 포함할 수 있다. 일반적으로 키트는 또한 패키지된 프라이머 및(또는) 프로브의 사용에 대한 지시사항을 가질 것이다.
진단 시스템의 상이한 성분은 다양한 형태로 제공될 수 있다. 예를 들면, 필요한 효소, 뉴클레오티드 트리포스페이트, 프라이머 및 프로브는 동결건조된 시약으로서 제공할 수 있다. 이들 동결건조된 시약은 동결건조 전에 예비 혼합되어 재구성시에 분석에 사용하기 위해 준비된 각가의 성분과 적합한 비율로 완전히 혼합될 수 있다. 또한, 본 발명의 진단 시스템은 키트의 동결건조 시약의 재구성을 위한 재구성 시약을 함유할 수 있다. 바람직한 키트에서 효소, 뉴클레오티드, 트리포스페이트 및 효소에 필요한 코팩터는 재구성시에 본 발명의 방법에 사용하기 위한 적합한 시약을 형성하는 단일의 동결건조 시약으로서 제공된다. 상기 바람직한 키트에서 동력건조 프라이머도 제공될 수 있다. 다른 바람직한 키트에서 동결건조 프로브 시약도 제공된다.
일반적인 패키지 재료로는 본 발명의 혼성화 분석 프로브 또는 증폭 프라이머를 설정된 범위 내에 유지시킬 수 있는 고형 매트릭스, 예를 들면 유리, 플라스틱, 종이, 호일 등을 들 수 있다. 따라서, 예를 들면 패키지 재료로 제조된 패키지는 본 발명의 프라이머 또는 혼성화 분석 프로브를 마이크로그램 내지 밀리그램의 양으로 함유하는 유리 바이알일 수 있거나 또는 본 발명의 프로브 및(또는) 프라이머가 조작 고정되어, 즉 결합되어 본 발명의 검출 방법에 사용할 수 있도록 하는 마이크로타이터 플레이트 웰일 수 있다.
사용을 위한 지시사항으로는 일반적으로 상이한 시약을 설명하는 분명한 표현 및(또는) 예를 들면 시료의 양에 따라 사용되는 시약의 상대량일 수 있는 하나 이상의 분석 방법 변수를 들 수 있다. 또한, 보관, 기간, 온도 및 완충액 조건 등의 세부 내용도 포함될 수 있다.
본 발명은 본 발명 조성물의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 진단 시스템 또는 키트를 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 방법의 수행에 필요한 올리고뉴클레오티드를 포함하는 진단 시스템 및 키트를 제공한다.
본 발명은 하기 서열 중에서 선택되는 핵산 서열에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 진단 시스템 또는 키트를 제공한다.
서열 번호 1:,
서열 번호 2:,
서열 번호 12:,
서열 번호 13:,
서열 번호 21:,
서열 번호 24:,
서열 번호 25:,
서열 번호 26:.
본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드가 서열 번호 1 또는 12일 때
서열 번호 1:,
서열 번호 12:,
서열 번호 3, 5, 14, 16로 이루어지는 군 중에서 선택되거나
서열 번호 3:,
서열 번호 5:,
서열 번호 14:,
서열 번호 16:,
또는 상기 올리고뉴클레오티드 서열 번호 2 또는 13일 때
서열 번호 2:,
서열 번호 13:,
서열 번호 4, 6, 15, 17로 이루어지는 군 중에서 선택되거나
서열 번호 4:,
서열 번호 6:,
서열 번호 15:,
서열 번호 17:,
또는 상기 올리고뉴클레오티드가 서열 번호 21일 때
서열 번호 21:,
서열 번호 23 및 28로 이루어지는 군 중에서 선택되는
서열 번호 23:,
서열 번호 28:,
서열에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖는 하나 이상의 헬퍼 프로브를 임의로 갖는 진단계 또는 키트를 제공한다.
본 발명은 하기 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 핵산 서열에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖고, 임의로 RNA 폴리머라제에 인식되거나 RNA 폴리머라제에 의한 개시 또는 신장을 증강시키는 5' 서열을 갖는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 함유하는 진단 시스템 또는 키트를 제공한다.
서열 번호 7:,
서열 번호 8:.
서열 번호 9:,
서열 번호 11:,
서열 번호 18:,
서열 번호 19:,
서열 번호 20:.
본 발명은 상기 두 개의 올리고뉴클레오티드가 서열 번호 7, 8, 9 및 11일 때
서열 번호 7:,
서열 번호 8:.
서열 번호 9:,
서열 번호 11:,
서열 번호 1 및 2로 이루어지는 군 중에서 선택되거나
서열 번호 1:,
서열 번호 2:,
또는 상기 올리고뉴클레오티드 서열 번호 18, 19 및 20일 때
서열 번호 18:,
서열 번호 19:,
서열 번호 20:,
서열 번호 10, 21 및 22로 이루어지는 군 중에서 선택되는
서열 번호 10:,
서열 번호 21:,
서열 번호 22:,
핵산 서열에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 임의로 갖는 진단 시스템 또는 키트를 제공한다.
본 발명은 하기 서열에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 함유하는 진단 시스템 또는 키트를 제공한다.
서열 번호 7:,
서열 번호 8:. 및
서열 번호 1:, 또는
서열 번호 2:.
본 발명은 하기 서열에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 함유하는 진단 시스템 또는 키트를 제공한다.
서열 번호 7:,
서열 번호 9:, 및
서열 번호 1:, 또는
서열 번호 2:.
본 발명은 하기 서열에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 함유하는 진단 시스템 또는 키트를 제공한다.
서열 번호 11:,
서열 번호 8:. 및
서열 번호 10:, 또는
서열 번호 33:.
본 발명은 하기 서열에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 함유하는 진단 시스템 또는 키트를 제공한다.
서열 번호 18:,
서열 번호 19:,
서열 번호 21:, 또는
서열 번호 24:.
본 발명은 하기 서열에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 함유하는 진단 시스템 또는 키트를 제공한다.
서열 번호 18:,
서열 번호 20:,
서열 번호 21:, 또는
서열 번호 24:.
실시예
실시예는 본 발명의 상이한 특징 및 실시형태를 예시하고자 제공되는 것으로서 어떤 방식으로도 본 발명의 내용을 제한하려는 것은 아니다.
보렐리아 부르그도르페리를 포함하여 라임 질병 관련 보렐리아에 특이적인 프로브를 문헌에서 결정된 16S 및 23S rRNA 서열로부터 동정하였다. 계통발생적으로 가까운 이웃인 비. 헤름시, 비. 투리카태, 비. 안세리나 및 비. 코리아세애의 핵산 서열을 사용하여 비. 부르그도르페리의 핵산 서열과 비교하여 가변 영역을 확인하였다.
비. 부르그도르페리 서열을 지향하는 혼성화 분석 프로브인 서열 번호 1, 2 및 21의 서열과 비. 헤름시 서열을 지향하는 혼성화 분석 프로브인 서열 번호 10 및 22의 서열은 하기 실시예에서 기술된다.
프로브는 문헌 [아놀드 등의 상기 문헌, Non-Nucleotide Linking Teagents Oor Nucleotide Probes]에 기재된 바와 같이 비뉴클레오티드 링커를 사용하여 합성한 후 문헌 [아놀드 등의 상기 문헌, 미국 특허 제5185439호]에 기재된 바와 같이 화학발광성 아크리디늄 에스테르로 표지시켰다. 라임 질병 관련 보렐리아에 대한 프로브의 반응성 및 특이성은 문헌 [아놀드 등의 상기 문헌, Homogenous Protection Assay 및 아놀드 등, Clin. Chem. 35:1588 (1989) (본 명세서에 참고로 포함됨)]에 기재된 바와 같은 균질 분석 방식을 사용하여 입증하였다. 그 결과는 광도계에 의해 검출되는 양성자의 측정치인 상대 광 단위 (RLU)로 표시하였다. 프로브를 세포 파쇄액의 핵산 또는 표적 증폭 반응의 생성물과 혼성화시켰다. 하기 실시예는 보렐리아 부르그도르페리를 포함하여 라임 질병 관련 보렐리아를 표적으로 하는 혼성화 분석 프로브 및 증폭 올리고뉴클레오티드 및 혼성화 및 증폭/혼성화 분석에 있어서의 이들의 용도를 기술한다.
실시예 1
16S rRNA를 표적으로 하는 프로브를 사용한 라임 질병 관련 보렐리아의 검출
본 실시예는 비. 헤름시 핵산이 아니라 비. 부르그도르페리로부터의 라임 질병 관련 보렐리아 핵산을 직접 검출하는 라임 질병 관련 보렐리아 16S rRNA를 표적으로 하는 프로브의 능력을 입증한다. 프로브 용액은 서열 번호 1의 서열로 합성되고 아크리디늄 에스테르로 표지된 프로브 및 서열 번호 3 및 5의 서열을 갖는 대응하는 비표지된 헬퍼 올리고뉴클레오티드를 함유하였다. 서열 번호 1로 구성되는 프로브의 표적 서열은 라임 질병 관련 보렐리아 군을 대표하는 균주에서 확인하여 선별하였고, 따라서 이 프로브는 라임 질병 관련 아종 또는 종 3개 모두 (VS461, 비. 부르그도르페리 센수 스트릭투 (sensu strictu) 및 비. 가리니 (garinii)를 검출할 것으로 예상되었다.
비. 부르그도르페리, 비. 헤름시 및 이. 콜리 (E. coli) 16S 서열 영역의 배열은 하기 서열로 표시되고, 여기서 점은 서열의 유사성을 나타낸다.
하기 실험에서 파쇄 세포에서 방출된 핵산을 직접 분석하였다. 파쇄액의 제조 방법의 일례는 본 명세서에 참고로 포함된 머피 등의 유럽 특허 출원 공개 제288618호에 기재되어 있다. 각 세포 파쇄액 50 μl 및 100 mM 숙신산리튬 (pH5), 2% (w/v) 리튬 라우릴 술페이트, 1.2 M 염화리튬, 20 mM 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 20 mM 에틸렌글리콜 비스 (베타-아미노에틸에테르) N,N,N',N' 테트라아세트산 (EGTA)를 함유하는 프로브 용액 50 μl을 혼합하여 60℃에서 20분 동안 배양한 후 0.15 M 사붕산나트륨 (pH 8.5) 0.3 ml, 1% 트리톤 (등록상표) X-100을 첨가하고 60℃에서 15분 동안 배양하였다. 반응물을 냉각시키고, 1 mM 아질산 중의 0.1% 과산화수소 및 1 N 수산화나트륨 용액 순으로 자동 주입한 후에 광도계를 사용하여 혼성화된 아크리디늄 에스테르 표지 프로브로부터의 화학발광 잔류량을 측정하였다. 그 결과를 상대 광 단위 또는 RLU로 나타내었다. 서열 번호 58 내지 63을 포함하는 헬퍼 올리고뉴클레오티드와 모든 세균/효모용 프로브의 혼합물을 세균 핵산의 존재를 입증하기 위한 대조군으로 사용하였다. 호간 등의 상기 문헌 [제목 Nucleic Acid Probes for Detection and/or Quantitation of Non-Viral Organisms]에는 적합한 모든 세균/효모용 프로브 혼합물의 예가 기재되어 있다. 데이터는 프로브가 라임 질병 관련 보렐리아 종인 보렐리아 부르그도르페리에 혼성화하고 이 종을 그의 밀접한 계통발생적 친척인 보렐리아 헤름시로부터 구별하였음을 보여주었다.
| RLU | ||
| 프로브 | 서열 번호 1 | 모든 세균 |
| 유기체 | ||
| 비. 부르그도르페리 | 811,712 | 1,187,345 |
| 795,818 | 1,183,434 | |
| 비. 헤름시 | 1,033 | 2,067,782 |
| 959 | 2,085,881 | |
| 표적 무첨가 | 907 | 2,074 |
| 902 | 2,071 |
실시예 2
증폭 후에 올리고뉴클레오티드 프로브와의 혼성화를 사용한 보렐리아 유기체의 검출
소수의 보렐리아 유기체의 검출은 혼성화에 의한 분석 전에 rRNA 또는 rDNA의 증폭에 의해 강화시킬 수 있다. 본 실험에서 약 30,000 유기체로부터 정제된 비. 부르그도르페리 DNA는 비. 부르그도르페리 rRNA 서열에 상보성이거나 상동성인 올리고뉴클레오티드로 증폭시킬 수 있다. 한 증폭 올리고뉴클레오티드는 5' 말단에서의 서열 번호 43의 T7 프로모터 서열 및 3' 말단에서의 서열 번호 7의 서열을 사용하여 합성된 프로모터-프라이머로 구성되었고 (이후, 프로모터-프라이머는 그의 표적 결합 영역의 서열 번호에 의해 확인됨), 제2의 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 8 또는 9의 프라이머로 구성되었다. 증폭 혼합물은 최종 용량 100 μl 중에 50 mM 트리스 HCl (pH 8.5), 40 mM 아세트산칼륨, 6 mM GTP, 6 mM ATP, 2.5 mM UTP, 2.5 mM CTP, 0.2 mM dATP, 0.2 mM dTTP, 0.2 mM dCTP, 0.2 mM dGTP, 17.5 mM MgCl2, 10 mM 디티오트레이톨, 10% (v/v) 글리세롤, 2 mM 스페르미딘, 서열 번호 7의 프로모터-프라이머 30 pmol, 및 서열 번호 8 또는 9의 프라이머 30 pmol을 포함하였다. 혼합물을 95℃로 8분 동안 가열한 후 42℃로 냉각시켜 MMLV 역전사 효소 (RT) 900 단위 및 T7 RNA 폴리머라제 400 단위를 첨가하였다. 42℃에서 2시간 동안 배양한 후, 증폭 반응물 20 μl를 서열 번호 3 또는 5의 비표지된 헬퍼 및 서열 번호 1의 아크리디늄 에스테르 표지된 프로브와 혼성화시켜 분석하였다. 2회 반응의 결과를 기록하였다.
| 프라이머 서열 번호 | 7/8 | 7/9 |
| RLU | 128,140 | 888,579 |
| 72,397 | 388,515 | |
상기 데이터는 보렐리아 RNA에 상보성인 서열 번호 1의 프로브를 사용하여 rRNA 서열을 직접 검출하거나 증폭 반응 생성물을 검출할 수 있음을 보여준다. 이러한 결과는 서열 번호 7 (5' 말단에 서열 번호 43을 추가로 포함함) 및 서열 번호 8 또는 9를 갖는 프라이머 세트가 비. 부르그도르페리 핵산을 증폭할 수 있음을 입증한다. 또한, 서열 번호 9는 보다 효과적인 음성 센스 프라이머인 것으로 보인다.
실시예 3
16S rRNA 서열에 혼성화하는 프라이머를 사용한 보렐리아 핵산의 증폭
본 실시예에서는 보렐리아 핵산을 16S rRNA 서열에 상보성이거나 상동성인 프라이머를 사용하여 증폭하였다. 비. 부르그도르페리 또는 비. 헤름시 세포의 파쇄액을 RNA의 보존 영역을 지향하는 프로브와 혼성화시켜 정량하였다. RNA를 희석하고 5' 말단에 서열 번호 43의 서열을 갖는 서열 번호 8의 프로모터-프라이머 30 pmol 및 서열 번호 7의 프라이머 30 pmol을 함유하는 반응 혼합물에 첨가하였다. 최종 반응 조건은 100 mM 트리스 HCl (pH 8.5), 35 mM 염화칼륨, 4 mM GTP, 4 mM ATP, 4 mM UTP, 4 mM CTP, 0.2 mM dATP, 0.2 mM dTTP, 0.2 mM dCTP, 0.2 mM dGTP, 20 mM MgCl2, 10 mM 디티오트레이톨, 10% 글리세롤, 2 mM 스페르미딘이었다. 혼합물을 95℃로 5분 동안 가열한 후 42℃로 냉각시켜 MMLV RT 800 단위 및 T7 RNA 폴리머라제 400 단위를 첨가하였다. 42℃에서 배양한 후, 반응물 10 μl를 서열 번호 2의 서열로 합성된 프로브 및 서열 번호 4 및 6의 비표지된 헬퍼 프로브를 사용하여 15 mM 알드리티올의 존재 하에 실시예 1에서와 같이 혼성화시켜 분석하였다. 그 결과는 프라이머가 보렐리아 부르그도르페리 핵산을 연속적으로 증폭하여 소량의 보렐리아 rRNA의 검출을 가능하게 했음을 보여준다. 과량의 비. 헤름시 핵산의 존재 하에서도 유의한 교차 반응은 발생하지 않았다. 3회 반응의 결과를 기록하였다.
| 비. 부르그도르페리 rRNA (2 x 10) | 비. 헤름시 rRNA (3 x 10) | (0 몰) | |
| RLU | 194,434 | 548 | 514 |
| 217,828 | 626 | 610 | |
| 319,662 | 646 |
실시예 4
혼성화 분석 프로브 2 및 10을 사용한 보렐리아의 증폭 및 검출
본 실시예에서 실시예 3과 같이 증폭을 실시하되, 서열 번호 8의 프로모터-프라이머 (서열 번호 43의 5' 프로모터 서열을 보유) 및 서열 번호 11의 프라이머를 사용하고 서열 번호 10의 프로브를 사용하였다. 본 실시예에 사용된 아크리디늄 에스테르 표지 프로브 및 비표지 헬퍼 프로브를 표에 나타내었다. 그 결과는 상기 프라이머가 비. 부르그도르페리 및 비. 헤름시 rRNA 서열을 모두 증폭시킬 수 있고 프로브가 개시된 분석계에서 상기 2개의 유기체를 구분한다는 것을 보여준다.
| 프로브 헬퍼 | 서열 번호 2 (RLU) 서열 번호 4 및 6 | 서열 번호 10 (RLU) 서열 번호 6 |
| 비. 부르그도르페리 rRNA 2x10-20몰 | 899,521 | 1,963 |
| 912,706 | 1,800 | |
| 919,681 | 1,809 | |
| 비. 헤름시 rRNA 3x10-18몰 | 2,783 | 1,335,183 |
| 2,322 | 1,328,290 | |
| 2,125 | 1,368,581 | |
| rRNA 0몰 | 1,619 | 1,137 |
| 1,596 | 1,347 | |
| 1,373 | 1,174 |
실시예 5
23S rRNA를 지향하는 프로브를 사용한 보렐리아의 검출
비. 부르그도르페리 23S rRNA 서열은 문헌 [J. Clin. Microbiol 30:3082 (1992) 및 J Bacteriol. 174:3766-3774 (1992)]에 발표되었다. 보렐리아 23S rRNA 서열을 지향하는 특이 프라이머 및 프로브를 고안하기 위해 밀접하게 관련된 유기체의 서열이 필요하였다. 보렐리아 헤름시, 보렐리아 코리아세애 및 보렐리아 투리카태를 수일 동안 BSK H 브로쓰 (시그마) 중에서 성장시키고 펠렛화시켜 50 mM 트리스 HCl (pH 8.0) 중에 재현탁시켰다. 트리스 HCl (pH 8.0)로 평형화된 페놀 중에서 파쇄시킨 후 DNA를 제조하였다. 최종 생성물을 에탄올 침전에 의해 단리하였다. 23S rRNA의 5' 및 3' 부분을, 폴리머라제 연쇄 반응 및 AmpliTaq 폴리머라제 (퍼킨-엘머사)를 사용하여 보렐리아 종의 보존 영역 또는 비. 부르그도르페리 특정 서열을 지향하는 프로브를 사용하여 증폭하였다.35S-dNTP 혼입법을 사용하고 프로메가사 (fmol 키트) 또는 뉴 잉글랜드 바이오랩스사 (Circuvent 키트)에서 시판하는 키트를 사용하여 정제된 증폭 서열을 분석하였다. 수득 서열을 발표된 보렐리아 부르그도르페리 서열 (Gen-Bank 기탁 번호 M88330, J. Clin. Microbiol. 3:3082 (1992) 및 M93664 J. Bacteriol., 174:3766-74 (1992))과 비교하였다.
비. 헤름시 및 비. 투리카태와 상이한 비. 부르그도르페리의 특정 서열을 선택하여 23S 프로브를 고안하였다. 이 영역은 이. 콜리, 비. 헤름시 및 비. 투리카태가 이 영역에서 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖고 비. 부르그도르페리 RNA와 염기 4개 상이한 1478-1500에 대응한다. 제 1프로브는 비. 부르그도르페리 (서열 번호 21)에 고안되었고 제2 프로브는 비. 헤름시/비. 투리카태 (서열 번호 22)에 고안되었다. rRNA 서열은 다음과 같다:
증폭 효율 및 프로브 특이성을 입증하기 위해 다음과 같은 실험을 실시하였다. 10 mM N-아세틸-L-시스테인, 2 mM EDTA, 40 mM 트리스 HCl (pH 8)을 함유하는 용액 0.75 ml 중에 세포 7 ml을 재현탁시키고 60℃에서 5분 동안 가열하여 비. 부르그도르페리, 균주 N40 및 비. 투리카태의 배양액으로부터 파쇄액을 제조하였다. 각 시료 내의 핵산의 양을 정량하기 위해 실시예 1에서 기술한 바와 같이 상이량의 시료 및 보렐리아 23S rRNA의 보존 영역을 지향하는 프로브로 혼성화시켰다. 수득한 값을 공지의 표준 물질을 사용하여 얻은 결과와 비교하였다.
비. 부르그도르페리 또는 비. 투리카태 파쇄액 중의 핵산의 공지량을 5' 프로모터 서열 (서열 번호 43) 및 서열 번호 19 또는 서열 번호 20의 3' 표적 혼성화 영역으로 합성된 프로모터-프라이머 30 pmol 및 서열 번호 18의 프라이머를 함유하는 반응물 100 μl 중에서 증폭시켰다. 파쇄액을 적당한 농도로 물 중에 희석시키고 프라이머 및 프로모터-프라이머를 함유하는 용액에 첨가하여 95℃로 15분 동안 가열한 후 45℃로 5분 동안 냉각시켰다. 몰로니 무린 백혈병 바이러스 역전사효소 (MMLV RT) 900 단위 및 T7 RNA 폴리머라제 400 단위를 첨가하였다. 최종 증폭 혼합물은 50 mM 트리스 HCl (pH 8.5), 35 mM 염화칼륨, 4 mM GTP, 4 mM ATP, 4 mM UTP, 4 mM CTP, 1 mM dATP, 1 mM dTTP, 1 mM dCTP, 1 mM dGTP, 20 mM MgCl2, 20 mM N-아세틸-L-시스테인 및 5% 글리세롤을 포함하였다. 42℃에서 2시간 동안 배양한 후, 전체 증폭 반응물 100 μl를 서열 번호 21의 아크리디늄 에스테르 표지 프로브로 혼성화시켜 분석하였다.
혼성화는 0.05 M 숙신산리튬 (pH 5), 0.6 M LiCl, 1% (w/v) 리튬 라우릴 술페이트, 10 mM EDTA, 10 mM EGTA를 함유하는 용액 200 μl 중에서 60℃에서 10분 동안 실시한 후 0.15 M 사붕산나트륨 (pH 8.5) 300 μl, 1% 트리톤 (등록상표) X-100을 첨가하였다. 이 혼합물을 60℃에서 10분 동안 배양한 후 실온으로 냉각시켰다. 각 튜브 내의 잔류 화학발광을 1 mM 아질산 및 0.1% 과산화수소 그리고 1 N 수산화나트륨을 함유하는 용액 순서의 자동 주입기를 구비한 젠-프로브 리더 (등록상표) I 광도계를 사용하여 측정하였다. 그 결과를 RLU로 나타내었다.
| 표적 | 프라이머(서열 번호 18/19) | 프라이머(서열 번호 18/20) |
| 비. 부르그도르페리 rRNA 3 x 10-20몰 | 33,366 | 211,867 |
| 비. 부르그도르페리 rRNA 6 x 10-21몰 | 15,115 | 57,029 |
| 비. 투리카태 rRNA3 x 10-20몰 | 3,676 | 2,260 |
| 비. 투리카태 rRNA3 x 10-21몰 | 2,215 | 2,297 |
| rRNA 0 몰 | 2,408 | 2,324 |
다른 실험에서는 서열 번호 19의 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 프라이머로서 사용하였다. 서열 번호 18과 19, 및 서열 번호 23과 19의 프라이머는 비. 부르그도르페리 균주 B31과 BN40 모두의 rRNA 서열을 증폭하는 것으로 밝혀졌다 (데이터 제시되지 않음).
실시예 6
23S rRNA를 지향하는 혼성화 분석 프로브를 사용한 보렐리아 헤름시의 특이적 검출
본 실시예에서 프로브의 비. 헤름시에 대한 특이성을 입증하였다. 비. 부르그도르페리, 비. 헤름시 및 비. 투리카태는 23S rRNA 핵산 수준에서 매우 밀접하게 연관되어 있다. 비. 부르그도르페리 23S rRNA 프로브와 동일한 23S rRNA 영역에서 비. 헤름시와 비. 투리카태 모두를 검출할 수 있는 프로브를 고안하였다. 비. 부르그도르페리 또는 비. 헤름시/비. 투리카태 서열을 포함하는 2개의 합성 표적을 함성하여 각각의 표적을 55℃에서 15분 동안 혼성화시키는 것을 제외하고 상기한 바오 같은 조건 하에 서열 번호 22의 프로브와 혼성화시켰다. 0.15 M 사붕산나트륨 (pH 8.5), 1% 트리톤 (등록상표) X-100을 포함하는 용액 300 μl를 첨가한 후 반응물을 55℃에서 5분 동안 배양하였다. 시료를 상기한 바와 같이 광도계로 판독하였다. 그 결과는 프로브가 비. 헤름시 서열을 비. 부르그도르페리 서열로부터 구분할 수 있음을 보여준다.
| 표적 서열 | 합성 DNA 표적의 양 | 서열 번호 22 프로브 사용시의 RLU |
| 비. 헤름시 | 10-11몰 | 890,609 |
| 비. 헤름시 | 10-12몰 | 852,419 |
| 비. 헤름시 | 10-13몰 | 885,979 |
| 비. 헤름시 | 10-14몰 | 511,419 |
| 비. 부르그도르페리 | 10-11몰 | 2,684 |
| 비. 부르그도르페리 | 10-12몰 | 1,911 |
| 비. 부르그도르페리 | 10-13몰 | 808 |
실시예 7
23S rRNA 혼성화 분석 프로브를 사용한 보렐리아의 증폭 및 검출
다음으로, 비. 투리카태 핵산의 증폭 및 검출을 입증하였다. 비. 투리카태 세포 파쇄액을 본 실시예에서 프로브의 비. 헤름시에 대한 특이성을 입증하였다. 5' 서열 (서열 번호 43) 및 서열 번호 19의 3' 표적 혼성화 영역을 갖는 프로모터-프라이머 30 pmol 및 서열 번호 18의 서열로 합성된 프라이머 30 pmol을 사용하여 비. 투리카태 세포 파쇄액을 증폭시켰다. 전체 증폭 반응물을 서열 번호 23의 비표지 헬퍼 프로브 2.5 pmol의 존재 하에 55℃에서 15분 동안 서열 번호 22의 프로브와 혼성화시킨 후 55℃에서 5분 동안 배양하고 0.15 M 사붕산나트륨 (pH 8.5), 1% 트리톤 (등록상표) X-100을 첨가하고 광도계로 판독하였다. 비. 헤름시와 동일한 신호가 예상되는데, 그 이유는 두 유기체의 서열이 23S rRNA의 상기 영역에서 동일하기 때문이다.
| 표적 | rRNA 표적의 양 | 서열 번호 22 프로브 사용시의 RLU |
| 비. 투리카태 | 1.2 x 10-19몰 | 240,607 |
| 비. 투리카태 | 6 x 10-20몰 | 133,812 |
| 비. 투리카태 | 3 x 10-20몰 | 20,345 |
| 비. 투리카태 | 6 x 10-21몰 | 14,968 |
| 표적 무첨가 | 0 몰 | 751 |
실시예 8
혈액에서 발견되는 미생물의 존재 하의 보렐리아의 특이적 증폭 및 특이적 검출
서열 번호 18의 프라이머 및 3' 말단에 서열 번호 20의 서열을 갖는 프로모터-프라이머를 사용하여 혈액 단리물에서 발견될 것으로 예상되는 유기체 패널로부터 제조된 세포 파쇄물을 증폭하였다. 각 세포 파쇄물로부터 3 x 10-19몰의 rRNA를 서열 번호 21의 뉴클레오티드 서열 (표 8) 또는 서열 번호 22의 뉴클레오티드 서열 (데이타 비표시)을 사용하여 합성된 프로브로 시험하였다. 비-보렐리아 종에서는 어느 프로브와도 교차 반응이 관찰되지 않았다. 서열 번호 22 서열의 프로브는 비. 투리카태 배양액과 강한 신호 (2,000,000 RLU 초과)를 보여 비. 투리카태 세포의 존재를 확인할 수 있었다. 서열 번호 21을 사용한 검출 결과는 하기 표에 나타내었다.
| RLU | ||
| 프로브 | 서열 번호 21 | |
| 유기체 | ATCC NO. | |
| 박테로이데스 프라길리스(Bacteroides fragilis) | 23745 | 3,4063,525 |
| 비. 부르그도르페리 | 1,529,0401,335,897 | |
| 비. 투리카태 | 35209 | 3,5733,524 |
| 비. 코리아세애 | 43381 | 3,4574,100 |
| 이. 콜리 | 25922 | 5,0914,504 |
| 해모필루스 인플루엔재(Haemophilus influenzae) | 19418 | 4,7373,531 |
| 클렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae) | 23357 | 4,5103,853 |
| 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) | 25933 | 3,8934,170 |
| 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) | 25330 | 4,2814,335 |
| 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) | 25923 | 3,0883,646 |
| 스타필로코쿠스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis) | 12228 | 4,7223,141 |
| 스트렙토코쿠스 미티스(Streptococcus mitis) | 9811 | 3,0593,171 |
| 스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) | 6306 | 3,0813,038 |
상기 데이터를 통하여 본 명세서에서 개시되고 특허 청구되는 신규의 증폭 올리고뉴클레오티드 및 프로브가 보렐리아 rRNA 서열을 증폭시킬 수 있고 라임 질병 관련 보렐리아인 보렐리아 부르그도르페리를 다른 세균 및 보렐리아 속의 구성원으로부터 구별할 수 있음을 확인할 수 있다.
실시예 9
16S 리보좀 프로브를 사용한 보렐리아의 증폭 및 특이적 검출
16S 리보좀 핵산에 특이적인 서열 번호 1의 혼성화 분석 프로브를 사용하여 보렐리아의 존재를 검출하고 히 혼성화 분석 프로브가 혈액에서 일반적으로 발견되는 다른 유기체와 교차반응하지 않는다는 것을 측정하였다. 혼성화 프로브는 서열 번호 3 및 5의 헬퍼 올리고뉴클레오티드의 존재 하에 세포 파쇄액 내의 보렐리아 핵산과 혼성화하였다. 실시예 1에서 기술한 직접 혼성화 방식을 사용하여 분석을 실시하였다. 리보좀 RNA의 존재는 시료를 모든 세균용 프로브 및 서열 번호 58, 59, 60 및 61의 헬퍼 올리고뉴클레오티드, 또는 진균용 프로브 및 서열 번호 62 및 63의 헬퍼 프로브와 혼성화시켜 각 시료에서 확인하였다. 이 분석에서 30,000 상대 광 단위 (RLU) 보다 큰 값은 양성인 것으로 간주하였다. 이 분석의 결과를 표 9에 나타내었다.
| RLU | ||||
| 유기체 | ATCC NO. | 모든 미생물용 프로브 | 진균용 프로브 | 보렐리아프로브서열 번호 1 |
| 박테로이데스 프라길리스 | 23745 | 3,187,827 | 미측정 | 2,930 |
| 보렐리아 가리니 | 미측정 | 미측정 | 677,715 | |
| 칸디다 알비칸스(Candida albicans) | 18804 | 4,600 | 653,049 | 709 |
| 이. 콜리 | 25922 | 2,939,817 | 미측정 | 5,593 |
| 해모필루아 인플루엔재(Haemophilua influenzae) | 19418 | 3,390,520 | 미측정 | 2,141 |
| 클렙시엘라 뉴모니애 | 23357 | 2,990,461 | 미측정 | 5,587 |
| 프로테우스 미라빌리스 | 25933 | 2,690,623 | 미측정 | 14,167 |
| 슈도모나스 아에루기노사 | 25330 | 3,294,884 | 미측정 | 4,853 |
| 스타필로코쿠스 아우레우스 | 25923 | 2,074,506 | 미측정 | 15,565 |
| 스타필로코쿠스 에피더미디스 | 12228 | 966,143 | 미측정 | 1,210 |
| 스트렙토코쿠스 미티스 | 9811 | 3,501,310 | 미측정 | 482 |
| 스트렙토코쿠스 뉴모니애 | 6306 | 3,573,357 | 미측정 | 481 |
실시예 10
3개의 상이한 계통발생적 군으로부터 라임 질병 관련 보렐리아의 증폭 및 검출
문헌에 공개된 서열은 상이한 라임 질병 관련 보렐리아 중에서 서열 번호 2의 프로브의 표적으로 작용하는 rRNA 서열의 보존을 나타낸다. 하기 데이터는 본 발명의 프라이머 및 프로브가 2 이상의 지역에서의 단리물의 증폭 및 검출에 유용함을 입증하고 이는 라임 질병 관련 보렐리아의 3개의 계통발생적 그룹화를 나타낸다. 배양액 약 15 ml의 세포를 30 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 1 mM EDTA, 1 mM EGTA 및 3% (w/v) 리튬 라우릴 술페이트를 함유하는 용액 0.1 ml 중에 재현탁시켜 비. 부르그도르페리 균주 N40 (군 I), 비. 가리니 균주 IP-90 (러시아 단리물) 및 균주 014A (NBS16) (군 II) 및 비. 아프젤리 (afzelii) 균주 IP-3 (러시아 단리물) 및 균주 09A (AEA1, 스웨덴 단리물)의 배양액으로부터 파쇄물을 제조하였다. 각 파쇄물 내의 핵산의 양을 정량하기 위해 상이량의 파쇄물 및 23S rRNA의 보존 영역을 지향하는 프로브로 혼성화시켰다. 수득한 값을 공지의 표준 물질을 사용하여 얻은 결과와 비교하였다. 비. 부르그도르페리, 비. 가리니 및 비. 아프젤리 파쇄액 중의 핵산의 공지량 (rRNA 약 3 x 10-19몰)을 비. 부르그도르페리 16S rRNA에 상보성인 서열 번호 8의 3' 표적 혼성화 영역을 갖는 프라이머 및 서열 번호 11의 서열의 rRNA와 동일한 센스를 갖는 프라이머 50 pmol 및 50 mM 트리스 HCl (pH 8), 25 mM KCl, AmpliTaq 폴리머라제 (퍼킨-엘머) 2.5 단위를 포함하는 폴리머라제 연쇄 반응으로 증폭하였다. 반을물을 95℃로 2분 동안 가열한 후 55℃ 1분, 72℃ 1분, 95℃ 0.5분의 싸이클을 35회 반복한 후 분석시까지 45℃로 냉각시켰다. 아가로스 겔 분석은 모든 3개의 계통발생적 군으로부터의 핵산이 에티듐 브로마이드 염색에 의해 검출가능한 175 염기쌍 단편을 생성시킨다는 것을 보여주었다. 56℃에서 비. 아프젤리 균주 09A 핵산을 포함하는 시료의 아크리디늄 에스테르 표지 프로브 (서열 번호 2)에 대한 혼성화는 이 프로브를 사용할 때 양성 신호 (배경의 19배 이상)를 보였다. 비. 부르그도르페리, 비. 가리니, 균주 IP-90 또는 비. 아프젤리니 IP-3 핵산을 포함하는 시료는 60℃에서 혼성화되었을 때 배경의 178배 이상의 신호를 나타내었다. 비. 아프젤리 098 균주는 다른 단리물보다 낮은 혼성화 신호를 나타냈지만 배경 상에서 분명하게 검출되었다.
실시예 11.
56℃에서 라임 질병 관련 보렐리아의 특이적 증폭 및 검출
본 실시예에서 서열 번호 8의 서열로 합성된 프로모터-프라이머 및 서열 번호 11의 프라이머 30 pmol을 함유하는 반응물 100 μl을 사용하였다. 파쇄액을 적당한 농도로 물 중에 희석시키고 프라이머 및 프로모터-프라이머를 함유하는 용액에 첨가하여 95℃로 15분 동안 가열한 후 45℃로 5분 동안 냉각시켰다. 몰로니 무린 백혈병 바이러스 역전사효소 (MMLV RT) 900 단위 및 T7 RNA 폴리머라제 400 단위를 첨가하였다. 최종 증폭 혼합물은 50 mM 트리스 HCl (pH 8.5), 35 mM 염화칼륨, 4 mM GTP, 4 mM ATP, 4 mM UTP, 4 mM CTP, 1 mM dATP, 1 mM dTTP, 1 mM dCTP, 1 mM dGTP, 20 mM MgCl2, 20 mM N-아세틸-L-시스테인 및 5% 글리세롤을 포함하였다. 42℃에서 2시간 동안 배양한 후, 전체 증폭 반응물 100 μl를 서열 번호 4 및 6의 비표지 헬퍼와 함께 서열 번호 2의 아크리디늄 에스테르 표지 프로브 및 서열 번호 4 및 6 또는 서열 번호 10의 비표지 헬퍼 프로브와 혼성화시켜 분석하였다. 혼성화는 0.05 M 숙신산리튬 (pH 5), 0.6 M LiCl, 1% (w/v) 리튬 라우릴 술페이트, 10 mM EDTA, 10 mM EGTA를 함유하는 용액 200 μl 중에서 56℃에서 15분 동안 실시한 후 0.15 M 사붕산나트륨 (pH 8.5) 300 μl, 1% 트리톤 (등록상표) X-100을 첨가하였다. 이 혼합물을 56℃에서 15분 동안 배양한 후 실온으로 냉각시켰다. 1 mM 아질산 및 0.1% 과산화수소 그리고 1 N 수산화나트륨을 함유하는 용액 순서의 자동 주입기를 구비한 젠-프로브 리더 (등록상표) I 광도계를 사용하여 각 튜브 내의 화학발광 잔류량을 측정하였다. 그 결과를 RLU로 나타내었다.
이 데이터는 서열 번호 2 프로브의 56℃에서의 혼성화가 비. 부르그도르페리와 비. 헤름시를 분명하게 식별할 수 있음을 보여준다.
| RLU | ||
| 프로브: 서열 번호 2 | 프로브: 서열 번호 10 | |
| 헬퍼 프로브:서열 번호 4 및 6 | 헬퍼 프로브:서열 번호 4 및 6 | |
| 표적 | ||
| 비. 부르그도르페리 | 1,2834401,250,3671,237,904 | 7,2264,8766,194 |
| 비. 헤름시 | 4,9326,1214,805 | 3,091,8643,135,6573,149,342 |
실시예 12
프로모터 서열을 포함하는 증폭 프라이머를 사용한 보렐리아 핵산의 증폭
또한, 프라이머 없이 프로모터-프라이머만을 사용하는 방식으로 증폭 올리고뉴클레오티드 및 프로브를 사용할 수도 있다. 이러한 방식은 국제출원 번호 제WO93/22461호에 기재되어 있다. 3' 말단에서 표적 상보성 서열 (서열 번호 8)에 공유결합된 T7 RNA 폴리머라제 프로모터 서열 (서열 번호 43)을 5' 말단에 포함하는 2개의 프라이머를 각각 합성하였다. 유리 3' OH기를 갖는 제1 프로모터-프라이머를 합성하여 반응물 100 μl 당 4 pmol로 사용하였다. 3' 말단에 알칸 디올을 갖는 제2 프로모터-프라이머를 합성하여 반응물 100 μl 당 26 pmol로 사용하였다. 보렐리아 파쇄액을 적당한 농도로 물 중에 희석시키고 프로모터-프라이머를 함유하는 용액에 첨가하여 95℃로 5분 동안 가열한 후 45℃로 15분 동안 냉각시켰다. 몰로니 무린 백혈병 바이러스 역전사효소 (MMLV RT) 900 단위 및 T7 RNA 폴리머라제 400 단위를 첨가하였다. 최종 증폭 혼합물은 50 mM 트리스 HCl (pH 8.5), 35 mM 염화칼륨, 4 mM GTP, 4 mM ATP, 4 mM UTP, 4 mM CTP, 1 mM dATP, 1 mM dTTP, 1 mM dCTP, 1 mM dGTP, 20 mM MgCl2, 20 mM N-아세틸-L-시스테인 및 5% 글리세롤을 포함하였다. 42℃에서 3.5시간 동안 배양한 후, 증폭 반응물 30 μl를 서열 번호 2의 아크리디늄 에스테르 표지 프로브 및 서열 번호 4 및 6의 비표지 헬퍼 프로브와 혼성화시켜 분석하였다. 혼성화는 0.05 M 숙신산리튬 (pH 5), 0.6 M LiCl, 1% (w/v) 리튬 라우릴 술페이트, 10 mM EDTA, 10 mM EGTA를 함유하는 용액 200 μl 중에서 60℃에서 15분 동안 실시한 후 0.15 M 나트륨 300 μl를 60℃에서 15분 동안 첨가하고 실온으로 냉각시켰다. 젠-프로브 리더 (등록상표) I 광도계를 사용하여 각 튜브 내의 화학발광 잔류량을 분석하였다. 표 11은 동일한 조건 하에 동일한 프로모터 서열 (서열 번호 43) 및 3' 표적 상보성 영역 (서열 번호 9)를 포함하는 프로모터-프라이머 한쌍을 사용하여 생성된 데이터도 나타낸다. 유리 3' OH기를 갖는 프로모터-프라이머 4 pmol 및 3' 알칸 디올을 갖는 동일한 합성 프로모터-프라이머 26 pmol을 반응물 100 μl당 사용하였다.
| RLU | |||
| 프로모터-프라이머 | 서열 번호 8 | 서열 번호 9 | |
| rRNA 몰수 | |||
| 7 x 10-20mole | 127,0471,685,8901,631,427 | 1,391,8601,199,380905,384 | |
| 3 x 10-20mole | 1,561,8241,329,922702,994 | 1,606,2561,502,4251,518,290 | |
| 2 x 10-20mole | 693,532262,589476,310 | 1,557,769327,9391,370173 | |
| 0 | 4,1155,241 | 4,2792,642 |
다른 실시형태는 하기 특허청구의 범위 내에 나타낸다.
〈서열표〉
(1) 일반적 정보 :
(i) 출원인: 젠-프로브 인코포레이티드
(ii) 발명의 명칭: 라임 질병 관련 보렐리아에 대한 핵산 증폭 올리고뉴클레오티드 및 프로브
(iii) 서열수: 63
(iv) 통신 주소:
(A) 수신인: 리온 엔드 리온 (Lyon Lyon)
(B) 거리: 웨스트 피프쓰 스트리트 633 수트 4700
(C) 도시: 로스 엔젤레스
(D) 주: 캘리포니아주
(E) 국가: 미국
(F) 우편번호: 90071-2066
(G) 전화번호: (213) 489-0440
(H) 팩스: (213) 955-0440
(I) 텔렉스: 67-3510
(v) 컴퓨터 판독 형태
(A) 매체 유형: 플로피 디스켓
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환형
(C) 작동 시스템: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: 패턴트인 릴리스 #1.0, 버전 #1.30 (EPO)
(2) 서열번호 1에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 21 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 1:
(2) 서열번호 2에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 21 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 2:
(2) 서열번호 3에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 28 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 3:
(2) 서열번호 4에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 28 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 4:
(2) 서열번호 5에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 36 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 5:
(2) 서열번호 6에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 36 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 6:
(2) 서열번호 7에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 29 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 7:
(2) 서열번호 8에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 39 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 8:
(2) 서열번호 9에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 36 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 9:
(2) 서열번호 10에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 21 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 10:
(2) 서열번호 11에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 29 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 11:
(2) 서열번호 12에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 21 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 12:
(2) 서열번호 13에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 21 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 13:
(2) 서열번호 14에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 28 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 14:
(2) 서열번호 15에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 28 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 15:
(2) 서열번호 16에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 36 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 16:
(2) 서열번호 17에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 36 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 17:
(2) 서열번호 18에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 28 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 18:
(2) 서열번호 19에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 24 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 19:
(2) 서열번호 20에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 24 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 20:
(2) 서열번호 21에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 26 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 21:
(2) 서열번호 22에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 26 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 22:
(2) 서열번호 23에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 27 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 23:
(2) 서열번호 24에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 26 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 24:
(2) 서열번호 25에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 26 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 25:
(2) 서열번호 26에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 26 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 26:
(2) 서열번호 27에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 27 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 27:
(2) 서열번호 28에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 27 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 28:
(2) 서열번호 29에 대한 정보:
(i) 열 특징:
(A) 길이: 27 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 29:
(2) 서열번호 30에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 26 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 30:
(2) 서열번호 31에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 26 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 31:
(2) 서열번호 32에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 26 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 32:
(2) 서열번호 33에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 28 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 33:
(2) 서열번호 34에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 21 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 34:
(2) 서열번호 35에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 21 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 35:
(2) 서열번호 36에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 29 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 36:
(2) 서열번호 37에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 39 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 37:
(2) 서열번호 38에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 36 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 38:
(2) 서열번호 39에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 29 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 39:
(2) 서열번호 40에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 28 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 40:
(2) 서열번호 41에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 24 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 41:
(2) 서열번호 42에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 24 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 42:
(2) 서열번호 43에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 27 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 43:
(2) 서열번호 44에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 29 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 44:
(2) 서열번호 45에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 39 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 45:
(2) 서열번호 46에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 36 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 46:
(2) 서열번호 47에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 29 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 47:
(2) 서열번호 48에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 28 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 48:
(2) 서열번호 49에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 24 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 49:
(2) 서열번호 50에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 24 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 50:
(2) 서열번호 51에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 29 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 51:
(2) 서열번호 52에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 39 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 52:
(2) 서열번호 53에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 36 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 53:
(2) 서열번호 54에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 29 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 54:
(2) 서열번호 55에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 28 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 55:
(2) 서열번호 56에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 24 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 56:
(2) 서열번호 57에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 24 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 57:
(2) 서열번호 58에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 35 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 58:
(2) 서열번호 59에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 36 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 59:
(2) 서열번호 60에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 32 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 60:
(2) 서열번호 61에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 30 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 61:
(2) 서열번호 62에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 30 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 62:
(2) 서열번호 63에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 46 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: DNA (게놈)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 63:
Claims (60)
- 엄격한 혼성화 분석 조건 하에서 하기 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열에 실질적으로 대응하는 보렐리아 (Borrelia) 핵산 서열의 적어도 일부에 혼성화하는 길이 10 내지 100 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드 프로브로 이루어지는, 보렐리아 속 구성원 검출용 혼성화 분석 프로브.서열 번호 1:,서열 번호 2:,서열 번호 12:,서열 번호 13:,서열 번호 10:,서열 번호 33:,서열 번호 34:,서열 번호 35:,서열 번호 21:,서열 번호 24:,서열 번호 25:,서열 번호 26:,서열 번호 22:,서열 번호 30:,서열 번호 31:, 및서열 번호 32:.
- 제1항에 있어서, 상기 프로브가 상기 엄격한 혼성화 조건 하에서 계통발생적으로 밀접하게 관련된 미생물의 핵산에는 혼성화하지 않고 보렐리아 핵산 서열에 우선적으로 혼성화하는 것인 핵산 혼성화 분석 프로브.
- 하기 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 프로브에 실질적으로 대응하는, 엄격한 혼성화 분석 조건 하에서의 보렐리아 속 구성원 검출용 핵산 혼성화 분석 프로브.서열 번호 1:,서열 번호 2:,서열 번호 10:,서열 번호 33:,서열 번호 21:,서열 번호 24:,서열 번호 22:, 및서열 번호 30:.
- 제1항의 올리고뉴클레오티드 및 하나 이상의 헬퍼 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프로브 믹스.
- 제4항에 있어서, 상기 헬퍼 올리고뉴클레오티드가 하기 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖는 길이 10 내지 100 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드로서 엄격한 혼성화 조건 하에서 보렐리아 핵산 서열에 혼성화하는 것인 프로브 믹스.서열 번호 3:,서열 번호 4:,서열 번호 5:,서열 번호 6:,서열 번호 14:,서열 번호 15:,서열 번호 16:,서열 번호 17:,서열 번호 23:, 및서열 번호 28:.
- 제4항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 하기 서열에 실질적으로 대응하는 뉴클레오티드 서열을 갖고,서열 번호 2:,상기 헬퍼 올리고뉴클레오티드가 하기 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 핵산 서열에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드인 프로브 믹스.서열 번호 4:, 및서열 번호 6:.
- 제4항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 하기 서열에 실질적으로 대응하는 뉴클레오티드 서열을 갖고,서열 번호 1:,상기 헬퍼 올리고뉴클레오티드가 하기 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 핵산 서열에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드인 프로브 믹스.서열 번호 3:, 및서열 번호 5:.
- 제4항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 하기 서열에 실질적으로 대응하는 뉴클레오티드 서열을 갖고,서열 번호 10:,상기 헬퍼 올리고뉴클레오티드가 하기 핵산 서열에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드인 프로브 믹스.서열 번호 6:.
- 제4항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 하기 서열에 실질적으로 대응하는 뉴클레오티드 서열을 갖고,서열 번호 21:, 또는서열 번호 22:,상기 헬퍼 올리고뉴클레오티드가 하기 핵산 서열에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드인 프로브 믹스.서열 번호 23:.
- 엄격한 혼성화 조건 하에서 보렐리아 헤름시 (Borrelia hermsii)에 존재하는 핵산 서열에는 혼성화하지 않고 하기 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열에 실질적으로 대응하는 라임 질병 관련 보렐리아 핵산 서열에 우선적으로 혼성화하는 길이 10 내지 100 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드 프로브로 이루어지는, 라임 질병 관련 보렐리아 검출용 혼성화 분석 프로브.서열 번호 1:,서열 번호 2:,서열 번호 12:, 및서열 번호 13:.
- 하기 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 프로브에 실질적으로 대응하는, 엄격한 혼성화 분석 조건 하에서의 라임 질병 관련 보렐리아 검출용 핵산 혼성화 분석 프로브.서열 번호 1:, 및서열 번호 2:.
- 제10항의 올리고뉴클레오티드 및 하나 이상의 헬퍼 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프로브 믹스.
- 제12항에 있어서, 상기 프로브가 하기 서열에 실질적으로 대응하는 뉴클레오티드 서열을 갖고,서열 번호 1:, 또는서열 번호 12:,상기 헬퍼 올리고뉴클레오티드가 하기 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖는 길이 10 내지 100 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드로서 엄격한 혼성화 조건 하에서 라임 질병 관련 보렐리아 핵산 서열에 혼성화하는 것인 프로브 믹스.서열 번호 3:,서열 번호 5:,서열 번호 14:,서열 번호 16:.
- 제12항에 있어서, 상기 프로브가 하기 서열에 실질적으로 대응하는 뉴클레오티드 서열을 갖고,서열 번호 2:, 또는서열 번호 13:,상기 헬퍼 올리고뉴클레오티드가 하기 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖는 길이 10 내지 100 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드로서 엄격한 혼성화 조건 하에서 라임 질병 관련 보렐리아 핵산 서열에 혼성화하는 것인 프로브 믹스.서열 번호 4:,서열 번호 6:,서열 번호 15:,서열 번호 17:.
- 엄격한 혼성화 조건 하에서 보렐리아 헤름시에 존재하는 핵산 서열에는 혼성화하지 않고 하기 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열에 실질적으로 대응하는 라임 질병 관련 보렐리아 핵산 서열에 우선적으로 혼성화하는 길이 10 내지 100 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드 프로브로 이루어지는, 라임 질병 관련 보렐리아 검출용 혼성화 분석 프로브.서열 번호 21:,서열 번호 24:,서열 번호 25:, 및서열 번호 26:.
- 제15항의 올리고뉴클레오티드 및 하나 이상의 헬퍼 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프로브 믹스.
- 제16항에 있어서, 상기 프로브가 하기 서열에 실질적으로 대응하는 뉴클레오티드 서열을 갖고,서열 번호 21:, 또는서열 번호 25:,상기 헬퍼 올리고뉴클레오티드가 하기 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖는 길이 10 내지 100 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드로서 엄격한 혼성화 조건 하에서 라임 질병 관련 보렐리아 핵산 서열에 혼성화하는 것인 프로브 믹스.서열 번호 23:, 및서열 번호 28:.
- 보렐리아 핵산과 하기 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 핵산 서열에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 사이에 형성된 핵산 혼성체를 포함하는, 보렐리아 속의 구성원 검출용 조성물.서열 번호 1:,서열 번호 2:,서열 번호 12:,서열 번호 13:,서열 번호 10:,서열 번호 21:,서열 번호 24:,서열 번호 33:,서열 번호 34:,서열 번호 35:,서열 번호 25:,서열 번호 26:,서열 번호 22:,서열 번호 30:,서열 번호 31:, 및서열 번호 32:.
- 보렐리아 핵산과 하기 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 핵산 서열에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 사이에 형성된 핵산 혼성체를 포함하는, 보렐리아 핵산 증폭용 조성물.서열 번호 7:,서열 번호 9:,서열 번호 11:,서열 번호 18:,서열 번호 19:,서열 번호 20:,서열 번호 44:,서열 번호 46:,서열 번호 47:,서열 번호 48:,서열 번호 49:, 및서열 번호 50:.
- 보렐리아 핵산과 하기 핵산 서열에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 사이에 형성된 핵산 혼성체를 포함하고,서열 번호 8:.추가로 하기 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 핵산 서열에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물.서열 번호 7:, 및서열 번호 11:.
- 제18항에 있어서, 추가로 헬퍼 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물.
- 보렐리아 핵산과 하기 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 핵산 서열에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 사이에 형성된 핵산 혼성체를 포함하는, 라임 질병 관련 보렐리아 검출용 조성물.서열 번호 1:,서열 번호 2:,서열 번호 21:,서열 번호 24:,서열 번호 12:,서열 번호 13:,서열 번호 25:, 및서열 번호 26:.
- 엄격한 혼성화 분석 조건 하에서 하기 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열에 실질적으로 대응하는 라임 질병 관련 보렐리아 16S 표적 핵산 서열에는 혼성화할 수 있지만 보렐리아 헤름시의 핵산 서열에는 혼성화하지 않는 핵산 혼성화 분석 프로브와 시료를 엄격한 혼성화 조건 하에서 접촉시키는 단계로 이루어지는, 라임 질병 관련 보렐리아 존재의 검출 방법.서열 번호 1:,서열 번호 2:,서열 번호 12:, 및서열 번호 13:.
- 엄격한 혼성화 분석 조건 하에서 하기 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열에 실질적으로 대응하는 라임 질병 관련 보렐리아 23S 표적 핵산 서열에는 혼성화할 수 있지만 보렐리아 헤름시의 핵산 서열에는 혼성화하지 않는 핵산 혼성화 분석 프로브와 시료를 엄격한 혼성화 조건 하에서 접촉시키는 단계로 이루어지는, 라임 질병 관련 보렐리아 존재의 검출 방법.서열 번호 21:,서열 번호 24:,서열 번호 25:, 및서열 번호 26:.
- a) 하나 이상의 하기 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 대응하는 핵산 서열에 결합하거나 이 핵산 서열을 통하여 서열을 신장시키는 하나 이상의 증폭 올리고뉴클레오티드를 사용하여 보렐리아 핵산을 증폭시키는 것으로 이루어지며, 상기 증폭 올리고뉴클레오티드는 RNA 폴리머라제에 의해 인식되거나 RNA 폴리머라제에 의한 개시 또는 신장을 증강시키는 핵산 서열을 임의로 갖는 것인 시료 내의 보렐리아 핵산의 수를 증가시키는 방법.서열 번호 36:,서열 번호 38:,서열 번호 39:,서열 번호 40:,서열 번호 41:,서열 번호 42:,서열 번호 27:,서열 번호 51:,서열 번호 53:,서열 번호 54:,서열 번호 55:,서열 번호 56:,서열 번호 57:, 및서열 번호 29:.
- 제25항에 있어서, b) 엄격한 혼성화 조건 하에서 보렐리아 핵산에 특이적으로 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 혼성화 분석 프로브를 사용하여 증폭된 핵산을 검출하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 하기 서열의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 대응하는 핵산 서열에 결합하거나 이 핵산 서열을 통하여 서열을 신장시키는 하나 이상의 증폭 올리고뉴클레오티드,서열 번호 36:, 및서열 번호 51:,및 하기 서열 중의 하나에 실질적으로 대응하는 핵산 서열에 결합하거나 이 핵산 서열을 통하여 서열을 신장시키는 제2 증폭 올리고뉴클레오티드서열 번호 37:,서열 번호 52:,서열 번호 38:, 및서열 번호 53:를 사용하여 보렐리아 핵산을 증폭시키는 것으로 이루어지며, 상기 증폭 올리고뉴클레오티드 중의 하나는 RNA 폴리머라제에 의해 인식되거나 RNA 폴리머라제에 의한 개시 또는 신장을 증강시키는 핵산 서열을 임의로 갖는 것인 시료 내의 보렐리아 핵산의 증폭 방법.
- 제27항에 있어서, b) 엄격한 혼성화 조건 하에서 보렐리아 핵산에 특이적으로 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 혼성화 분석 프로브를 사용하여 증폭된 핵산을 검출하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 하기 뉴클레오티드 서열 중의 하나에 실질적으로 대응하는 핵산 서열에 결합하거나 이 핵산 서열을 통하여 서열을 신장시키는 하나 이상의 증폭 올리고뉴클레오티드,서열 번호 36:,서열 번호 51:,서열 번호 39:,서열 번호 54:,및 하기 서열에 실질적으로 대응하는 핵산 서열에 결합하거나 이 핵산 서열을 통하여 서열을 신장시키는 제2 증폭 올리고뉴클레오티드서열 번호 37:,서열 번호 52:를 사용하여 보렐리아 핵산을 증폭시키는 것으로 이루어지며, 상기 증폭 올리고뉴클레오티드 중의 하나는 RNA 폴리머라제에 의해 인식되거나 RNA 폴리머라제에 의한 개시 또는 신장을 증가시키는 핵산 서열을 임의로 갖는 것인 시료 내의 보렐리아 핵산의 증폭 방법.
- 제29항에 있어서, b) 엄격한 혼성화 조건 하에서 보렐리아 핵산에 특이적으로 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 혼성화 분석 프로브를 사용하여 증폭된 핵산을 검출하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 하기 서열의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 대응하는 핵산 서열에 결합하거나 이 핵산 서열을 통하여 서열을 신장시키는 하나 이상의 증폭 올리고뉴클레오티드,서열 번호 48:, 및서열 번호 55:,및 하기 서열에 실질적으로 대응하는 핵산 서열에 결합하거나 이 핵산 서열을 통하여 서열을 신장시키는 제2 증폭 올리고뉴클레오티드서열 번호 41:, 또는서열 번호 56:, 및서열 번호 42:, 또는서열 번호 57:를 사용하여 보렐리아 핵산을 증폭시키는 것으로 이루어지며, 상기 증폭 올리고뉴클레오티드 중의 하나는 RNA 폴리머라제에 의해 인식되거나 RNA 폴리머라제에 의한 개시 또는 신장을 증가시키는 핵산 서열을 임의로 갖는 것인 시료 내의 보렐리아 핵산의 수를 증가시키는 방법.
- 제31항에 있어서, b) 엄격한 혼성화 조건 하에서 보렐리아 핵산에 특이적으로 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 혼성화 분석 프로브를 사용하여 증폭된 핵산을 검출하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제31항에 있어서, 상기 보렐리아 핵산이 라임 질병 관련 보렐리아 또는 보렐리아 헤름시 핵산인 방법.
- 제31항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 혼성화 분석 프로브가 하기 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖는 것인 방법.서열 번호 21:,서열 번호 24:,서열 번호 25:,서열 번호 26:,서열 번호 22:,서열 번호 30:,서열 번호 31:, 및서열 번호 32:.
- 하기 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열에 실질적으로 대응하는 서열을 갖는 증폭 올리고뉴클레오티드.서열 번호 7:,서열 번호 9:,서열 번호 11:,서열 번호 18:,서열 번호 19:,서열 번호 20:,서열 번호 23:,서열 번호 28:,서열 번호 44:,서열 번호 46:,서열 번호 47:,서열 번호 48:,서열 번호 49:, 및서열 번호 50:.
- 하기 서열의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 대응하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 증폭 올리고뉴클레오티드.서열 번호 8:. 또는서열 번호 45:.상기 서열에서, 19개의 3'쪽 뉴클레오티드의 대부분은 나타낸 바와 같이 동일하다.
- 제35항 또는 36항에 있어서, RNA 폴리머라제에 의해 인식되거나 또는 RNA 폴리머라제에 의한 개시 또는 신장을 증강시키는 5' 서열을 추가로 포함하는 올리고뉴클레오티드.
- 보렐리아 핵산과 제36항 또는 37항의 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 사이에 형성된 핵산 혼성체를 포함하는, 보렐리아 핵산 증폭용 조성물.
- 하기 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 핵산 서열에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 하나 이상 포함하는 키트.서열 번호 1:,서열 번호 2:,서열 번호 12:,서열 번호 13:,서열 번호 21:,서열 번호 24:,서열 번호 25:, 및서열 번호 26:.
- 제39항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 하기 서열일 때서열 번호 1:, 또는서열 번호 12:,하기 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열,서열 번호 3:,서열 번호 5:,서열 번호 14:, 및서열 번호 16:,또는, 상기 올리고뉴클레오티드가 하기 서열일 때서열 번호 2:, 또는서열 번호 13:,하기 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열,서열 번호 4:,서열 번호 6:,서열 번호 15:, 및서열 번호 17:,또는, 상기 올리고뉴클레오티드가 서열일 때서열 번호 21:, 또는서열 번호 25:,하기 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열서열 번호 23:, 및서열 번호 28:에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖는 하나 이상의 헬퍼 프로브를 갖는 키트.
- 하기 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 핵산 서열에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖고 임의로 RNA 폴리머라제에 인식되거나 RNA 폴리머라제에 의한 개시 또는 신장을 증강시키는 5' 서열을 갖는 2개의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 키트.서열 번호 7:,서열 번호 8:.서열 번호 9:,서열 번호 11:,서열 번호 18:,서열 번호 19:, 및서열 번호 20:.
- 제41항에 있어서, 상기 두 개의 올리고뉴클레오티드가 하기 서열로 이루어지는 군 중에서 선택될 때서열 번호 7:,서열 번호 8:.서열 번호 9:,서열 번호 11:,하기 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 핵산 서열,서열 번호 1:,서열 번호 2:,서열 번호 10:,또는, 상기 올리고뉴클레오티드가 하기 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 핵산 서열일 때서열 번호 18:,서열 번호 19:,서열 번호 20:,하기 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 핵산 서열서열 번호 21:,서열 번호 22:,에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함하는 키트.
- 하기 서열에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 키트.서열 번호 7:,서열 번호 8:. 및서열 번호 1:, 또는서열 번호 2:.
- 하기 서열에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 키트.서열 번호 7:,서열 번호 9:, 및서열 번호 1:, 또는서열 번호 2:.
- 하기 서열에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 키트.서열 번호 8:. 및서열 번호 45:.상기 서열에서, 19개의 3'쪽 뉴클레오티드의 대부분은 나타낸 바와 같이 동일하다.
- 하기 서열에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 키트.서열 번호 11:,서열 번호 8:. 및서열 번호 10:, 또는서열 번호 33:.
- 하기 서열에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 키트.서열 번호 18:,서열 번호 19:, 및서열 번호 21:, 또는서열 번호 24:, 또는서열 번호 22:, 또는서열 번호 31:.
- 하기 서열에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 키트.서열 번호 18:,서열 번호 20:, 및서열 번호 21:, 또는서열 번호 24:, 또는서열 번호 22:, 또는서열 번호 31:.
- 엄격한 혼성화 조건 하에서 보렐리아 부르그도르페리 (Borrelia burgdorferi)에 존재하는 핵산 서열에는 혼성화하지 않고 하기 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열에 실질적으로 대응하는 보렐리아 헤름시 핵산 서열에 우선적으로 혼성화하는 길이 10 내지 100 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드 프로브로 이루어지는, 보렐리아 헤름시 검출용 혼성화 분석 프로브.서열 번호 10:,서열 번호 33:,서열 번호 34:, 및서열 번호 35:.
- 제49항의 혼성화 분석 프로브 및 하나 이상의 헬퍼 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프로브 믹스.
- 제50항에 있어서, 상기 프로브가 하기 서열에 실질적으로 대응하는 뉴클레오티드 서열을 갖고,서열 번호 10:, 또는서열 번호 34:,상기 헬퍼 올리고뉴클레오티드가 하기 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖는 길이 10 내지 100 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드로서 엄격한 혼성화 조건 하에서 보렐리아 헤름시 핵산 서열에 혼성화하는 것인 프로브 믹스.서열 번호 6:, 및서열 번호 17:.
- 엄격한 혼성화 조건 하에서 보렐리아 부르그도르페리에 존재하는 핵산 서열에는 혼성화하지 않고 하기 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열에 실질적으로 대응하는 보렐리아 헤름시 핵산 서열에 우선적으로 혼성화하는 길이 10 내지 100 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드 프로브로 이루어지는, 보렐리아 헤름시 검출용 혼성화 분석 프로브.서열 번호 22:,서열 번호 30:,서열 번호 31:, 및서열 번호 32:.
- 제52항의 올리고뉴클레오티드 및 하나 이상의 헬퍼 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프로브 믹스.
- 제53항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 하기 서열에 실질적으로 대응하는 뉴클레오티드 서열을 갖고,서열 번호 22:, 또는서열 번호 31:,상기 헬퍼 올리고뉴클레오티드가 하기 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖는 길이 10 내지 100 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드로서 엄격한 혼성화 조건 하에서 보렐리아 헤름시 핵산 서열에 혼성화하는 것인 프로브 믹스.서열 번호 23:, 및서열 번호 28:.
- 엄격한 혼성화 분석 조건 하에서 하기 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열에 실질적으로 대응하는 보렐리아 헤름시 표적 핵산 서열에는 혼성화하지만 보렐리아 부르그도르페리의 핵산 서열에는 혼성화하지 않는 핵산 혼성화 분석 프로브와 시료를 엄격한 혼성화 조건 하에서 접촉시키는 단계로 이루어지는, 보렐리아 헤름시 존재의 검출 방법.서열 번호 10:,서열 번호 33:,서열 번호 34:, 및서열 번호 35:.
- 엄격한 혼성화 분석 조건 하에서 하기 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열에 실질적으로 대응하는 보렐리아 헤름시 표적 핵산 서열에는 혼성화하지만 보렐리아 부르그도르페리의 핵산 서열에는 혼성화하지 않는 핵산 혼성화 분석 프로브와 시료를 엄격한 혼성화 조건 하에서 접촉시키는 단계로 이루어지는, 보렐리아 헤름시 존재의 검출 방법.서열 번호 22:,서열 번호 30:,서열 번호 31:, 및서열 번호 32:.
- 보렐리아 헤름시 핵산과 하기 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 핵산 서열에 실질적으로 대응하는 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 사이에 형성된 핵산 혼성체를 포함하는 조성물.서열 번호 10:,서열 번호 33:,서열 번호 34:,서열 번호 35:.서열 번호 22:,서열 번호 30:,서열 번호 31:, 및서열 번호 32:.
- 제57항에 있어서, 추가로 하나 이상의 헬퍼 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물.
- 제58항에 있어서, 하기 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열에 실질적으로 대응하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함하고,서열 번호 7:, 또는서열 번호 44:, 및서열 번호 8:. 또는서열 번호 45:, 및서열 번호 11:, 또는서열 번호 47:,상기 헬퍼 올리고뉴클레오티드가 하기 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 핵산 서열에 실질적으로 대응하는 올리고뉴클레오티드인 조성물.서열 번호 6:, 및서열 번호 17:.
- 제58항에 있어서, 하기 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 서열에 실질적으로 대응하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함하고,서열 번호 18:, 또는서열 번호 48:, 및서열 번호 19:, 또는서열 번호 49:, 및서열 번호 20:, 또는서열 번호 50:,상기 헬퍼 올리고뉴클레오티드가 하기 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 핵산 서열에 실질적으로 대응하는 올리고뉴클레오티드인 조성물.서열 번호 23:, 및서열 번호 28:.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US37491395A | 1995-01-18 | 1995-01-18 | |
| US8/374,913 | 1995-01-18 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR19980701522A true KR19980701522A (ko) | 1998-05-15 |
Family
ID=66175078
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1019970704913A KR19980701522A (ko) | 1995-01-18 | 1996-01-18 | 라임 질병 관련 보렐리아에 대한 핵산 증폭 올리고뉴클레오티드 및 프로브(Nucleic Acid Amplification Oligonucleotides and Probes to Lyme Disease Associated Borrelia) |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR19980701522A (ko) |
-
1996
- 1996-01-18 KR KR1019970704913A patent/KR19980701522A/ko not_active Application Discontinuation
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
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