BR112020022762A2 - polinucleotídeos para a amplificação e detecção de chlamydia trachomatis - Google Patents

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Abstract

''POLINUCLEOTÍDEOS PARA A AMPLIFICAÇÃO E DETECÇÃO DE CHLAMYDIA TRACHOMATIS''. A invenção fornece métodos e composições para a detecção de Chlamydia trachomatis em uma amostra de teste. Sua presença ou ausência na amostra é determinada por métodos de teste baseados em ácidos nucleicos usando primers e/ou sondas e/ou molecular beacons (sondas de hibridização) que se ligam aos genes ribossomais 23S ou transcritos gênicos.

Description

POLINUCLEOTÍDEOS PARA A AMPLIFICAÇÃO E DETECÇÃO DE CHLAMYDIA TRACHOMATIS REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório US Nº 62/669,236, depositado em 9 de maio de 2018, e Pedido Não Provisório US Nº 15/976,733, depositado em 10 de maio de 2018, cujas divulgações estão incorporadas integralmente neste documento por referência.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIA
[0002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequência que foi enviada via EFS-Web e está incorporada integralmente, por meio deste, por referência. A referida cópia ASCII, criada em 8 de maio de 2019, está nomeada como TSM-045WO_CRF_sequencelisting.txt e tem 29.937 bytes de tamanho.
CAMPO DA INVENÇÃO
[0003] A presente invenção refere-se aos campos da biologia molecular e da química de ácidos nucleicos. A invenção fornece métodos e reagentes para detecção de patógenos, tais como Chlamydia trachomatis e, consequentemente, também se refere aos campos de diagnóstico e prognóstico médicos. Em particular, a invenção refere-se a polinucleotídeos e métodos para amplificação e detecção de Chlamydia trachomatis.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[0004] Há uma necessidade urgente para o desenvolvimento de uma plataforma de diagnóstico de ponto de atendimento (point of care, POC) rápida, acessível, integrada e automatizada ("sample-in answer-out") para infecções sexualmente transmissíveis (DSTs). A Organização Mundial de Saúde (OMS) estima que mais de 499 milhões de novos casos de DSTs curáveis, ou seja, aquelas causadas por Neisseria gonorrhoeae (NG), Chlamydia trachomatis (CT), Trichomonas vaginalis (TV) e Sífilis ocorrem a cada ano em todo o mundo em homens e mulheres com idade de 15 - 49 anos, causando morbidade e mortalidade significativas. Infecções gonocócicas e por clamídia não tratadas em mulheres na África subsaariana foram apontadas como a causa de até 85% da infertilidade entre mulheres que buscam intervenção para infertilidade.
[0005] C. trachomatis é responsável pela infecção sexualmente transmissível mais comum nos Estados Unidos. A clamídia pode causar uretrite em homens e doença inflamatória pélvica, gravidez ectópica e infertilidade em mulheres. As infecções assintomáticas são comuns tanto em homens quanto em mulheres, o que justifica triagens para prevenir a propagação da doença (conforme recomendado pelo CDC).
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0006] A Figura 1 identifica sequências polinucleotídicas marcadas, ou molecular beacons (sondas de hibridização), que são capazes de se ligar ao amplicon produzido a partir de cada conjunto de primer.
SUMÁRIO
[0007] A presente invenção abrange, em algumas modalidades, uma composição que compreende um conjunto de polinucleotídeos selecionados do grupo consistindo no Conjunto-1 ao Conjunto-81. Em algumas modalidades, a composição compreende ainda uma sonda. Em algumas modalidades, a sonda compreende um marcador. Em algumas modalidades, a sonda é um polinucleotídeo marcado. Em uma implementação preferida, o marcador é um fluoróforo, que preferencialmente está covalentemente ligado a um terminal do polinucleotídeo. Em uma modalidade particularmente preferida, a sonda ou polinucleotídeo é um molecular beacon compreendendo um fluoróforo, um supressor e um polinucleotídeo. Em uma modalidade, o fluoróforo é FAM e o supressor é BHQ1. Em uma implementação alternativa, o fluoróforo é ATTO 565 ou Alexa 594 e o supressor é BHQ1 ou BHQ2.
[0008] Em algumas implementações, a composição compreende um polinucleotídeo marcado compreendendo uma sequência selecionada do grupo consistindo nos nucleotídeos 5-34 da SEQ ID NO: 97, nucleotídeos 5-31 da SEQ ID NO: 98, nucleotídeos 3-31 da SEQ ID NO: 99, nucleotídeos 5-30 da SEQ ID NO: 100, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 101, nucleotídeos 6-30 da SEQ ID NO: 102, nucleotídeos 5-26 da SEQ ID NO: 103, nucleotídeos 4-27 da SEQ ID NO: 104, nucleotídeos 7-30 da SEQ ID NO: 105, nucleotídeos 5-27 da SEQ ID NO: 106, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 107, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 108, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 109, nucleotídeos 6-30 da SEQ ID NO: 110, nucleotídeos 8-31 da SEQ ID NO: 111, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 112, nucleotídeos 8-31 da SEQ ID NO: 113, nucleotídeos 5-29 da SEQ ID NO: 114, nucleotídeos 5-29 da SEQ ID NO: 115, nucleotídeos 4-28 da SEQ ID NO: 116, e nucleotídeos 5-30 da SEQ ID NO: 117, nucleotídeos 8-28 da SEQ ID NO: 118, nucleotídeos 8-30 da SEQ ID NO: 119, nucleotídeos 8-29 da SEQ ID NO: 120, nucleotídeos 4-33 da SEQ ID NO: 121, nucleotídeos 7-34 da SEQ ID NO: 122, nucleotídeos 9-34 da SEQ ID NO: 123, nucleotídeos 8-34 da SEQ ID NO: 124, nucleotídeos 6-28 da SEQ ID NO: 125, nucleotídeos 7-28 da SEQ ID NO: 126, nucleotídeos 3-27 da SEQ ID NO: 127, nucleotídeos 7-32 da SEQ ID NO: 128, nucleotídeos 4-27 da SEQ ID NO: 129, nucleotídeos 6-27 da SEQ ID NO: 130, e nucleotídeos 8-29 da SEQ ID NO: 131. Em outras implementações, o polinucleotídeo marcado pode compreender uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 97 a 131. Em certas implementações, a sequência do polinucleotídeo marcado é selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 97 a 131. Em outras modalidades, a sequência do polinucleotídeo marcado é selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 97 a 131.
[0009] Em algumas modalidades, o conjunto de polinucleotídeo é selecionado do grupo consistindo no Conjunto-12, Conjuntos 14-27, Conjunto-39, Conjuntos 41-54, Conjunto-66 e Conjuntos 68-81, e a composição compreende um polinucleotídeo marcado compreendendo uma sequência selecionada do grupo consistindo nos nucleotídeos 5-26 da SEQ ID NO: 103, nucleotídeos 4-27 da SEQ ID NO: 104, nucleotídeos 7-30 da SEQ ID NO: 105, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 107, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 108, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 109, nucleotídeos 8-31 da SEQ ID NO: 111, nucleotídeos 5-29 da SEQ ID NO: 114, nucleotídeos 5-29 da SEQ ID NO: 115, nucleotídeos 4-28 da SEQ ID NO: 116, nucleotídeos 5-30 da SEQ ID NO: 117, nucleotídeos 8-28 da SEQ ID NO: 118, nucleotídeos 8-30 da SEQ ID NO: 119, nucleotídeos 9-34 da SEQ ID NO: 123, nucleotídeos 8-34 da SEQ ID NO: 124, nucleotídeos 7-32 da SEQ ID NO: 128, e nucleotídeos 4-27 da SEQ ID NO: 129. Em algumas implementações, o polinucleotídeo marcado compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo na SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 128 e SEQ ID NO: 129. Em algumas implementações, a sequência do polinucleotídeo marcado é a SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ
ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 128 e SEQ ID NO: 129. Em uma implementação preferida, a sequência do polinucleotídeo marcado é a SEQ ID NO: 115, e o conjunto de polinucleotídeos é selecionado do grupo consistindo no Conjunto-20, Conjunto-24, Conjunto-47, Conjunto-51, Conjunto-74 e Conjunto-78. Ainda mais preferencialmente, o conjunto de polinucleotídeos é o Conjunto-20 ou Conjunto-24.
[0010] Em ainda outra modalidade, o conjunto de polinucleotídeos é selecionado do grupo consistindo nos Conjuntos 12-27, Conjuntos 39-54 e Conjuntos 66-81, e a composição compreende um polinucleotídeo marcado compreendendo uma sequência selecionada do grupo consistindo nos nucleotídeos 5-34 da SEQ ID NO: 97, nucleotídeos 5-31 da SEQ ID NO: 98, nucleotídeos 3-31 da SEQ ID NO: 99, nucleotídeos 5-30 da SEQ ID NO: 100, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 101, nucleotídeos 5-27 da SEQ ID NO: 106, nucleotídeos 6-30 da SEQ ID NO: 110, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 112, nucleotídeos 8-29 da SEQ ID NO: 120, nucleotídeos 4-33 da SEQ ID NO: 121, e nucleotídeos 7-34 da SEQ ID NO: 122. Mais particularmente, o polinucleotídeo marcado pode compreender uma sequência selecionada do grupo consistindo na SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121 e SEQ ID NO: 122. Em certas implementações, a sequência do polinucleotídeo marcado é selecionado do grupo consistindo na SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121 e SEQ ID NO: 122.
[0011] Em uma implementação, o conjunto de polinucleotídeos é selecionado do grupo consistindo no Conjunto-12, Conjuntos 14-18, Conjunto-20, Conjunto-24, Conjunto-27, Conjunto-39, Conjuntos 41-45, Conjunto-47, Conjunto- 51, Conjunto-54, Conjunto-66, Conjuntos 68-72, Conjunto 74, Conjunto-78 e Conjunto-81, e a composição compreende um polinucleotídeo marcado compreendendo uma sequência selecionada do grupo consistindo nos nucleotídeos 6-28 da SEQ ID NO: 125 e nucleotídeos 7-28 da SEQ ID NO: 126. Em certas implementações, o polinucleotídeo marcado compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo na SEQ ID NO: 125 e SEQ ID NO: 126. Em algumas modalidades, a sequência do polinucleotídeo marcado é a SEQ ID NO: 125 ou SEQ ID NO: 126.
[0012] Em outra implementação, o conjunto de polinucleotídeos é selecionado do grupo consistindo nos Conjuntos 14-27, Conjuntos 41-54 e Conjuntos 68-81, e a composição compreende um polinucleotídeo marcado compreendendo uma sequência selecionada do grupo consistindo nos nucleotídeos 8-31 da SEQ ID NO: 113 e nucleotídeos 3-27 da SEQ ID NO: 127. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo marcado compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo na SEQ ID NO: 113 e SEQ ID NO: 127. Em outras modalidades, a sequência do polinucleotídeo marcado é a SEQ ID NO: 113 ou SEQ ID NO: 127.
[0013] Em ainda outra modalidade, o conjunto de polinucleotídeos é selecionado do grupo consistindo nos Conjuntos 12-20, Conjuntos 22-27, Conjuntos 39-47, Conjuntos 49-54, Conjuntos 66-74 e Conjuntos 76-81, e a composição compreende um polinucleotídeo marcado compreendendo os nucleotídeos 6-27 da SEQ ID NO: 130. Em algumas implementações, o polinucleotídeo marcado compreende a SEQ ID NO: 130. Em outras modalidades, a sequência do polinucleotídeo marcado é a SEQ ID NO: 130.
[0014] Em uma implementação, o conjunto de polinucleotídeos é selecionado do grupo consistindo no Conjunto-13, Conjunto-40 e Conjunto-67, e a composição compreende um polinucleotídeo marcado compreendendo uma sequência selecionada do grupo consistindo nos nucleotídeos 6-30 da SEQ ID NO: 102 e nucleotídeos 8-29 da SEQ ID NO: 131. Em tal modalidade, o polinucleotídeo marcado pode compreender uma sequência selecionada do grupo consistindo na SEQ ID NO: 102 e SEQ ID NO: 131. Em outra modalidade, a sequência do polinucleotídeo marcado é a SEQ ID NO: 102 ou SEQ ID NO: 131.
[0015] Outro aspecto da invenção fornece molecular beacons que compreendem um fluoróforo, um supressor e um polinucleotídeo, em que o polinucleotídeo compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo nos nucleotídeos 5-34 da SEQ ID NO: 97, nucleotídeos 5-31 da SEQ ID NO: 98, nucleotídeos 3-31 da SEQ ID NO: 99, nucleotídeos 5-30 da SEQ ID NO: 100, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 101, nucleotídeos 6-30 da SEQ ID NO: 102,
nucleotídeos 5-26 da SEQ ID NO: 103, nucleotídeos 4-27 da SEQ ID NO: 104, nucleotídeos 7-30 da SEQ ID NO: 105, nucleotídeos 5-27 da SEQ ID NO: 106, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 107, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 108, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 109, nucleotídeos 6-30 da SEQ ID NO: 110, nucleotídeos 8-31 da SEQ ID NO: 111, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 112, nucleotídeos 8-31 da SEQ ID NO: 113, nucleotídeos 5-29 da SEQ ID NO: 114, nucleotídeos 5-29 da SEQ ID NO: 115, nucleotídeos 4-28 da SEQ ID NO: 116, nucleotídeos 5-30 da SEQ ID NO: 117, nucleotídeos 8-28 da SEQ ID NO: 118, nucleotídeos 8-30 da SEQ ID NO: 119 e nucleotídeos 8-29 da SEQ ID NO: 120.
[0016] Ainda outro aspecto da invenção fornece métodos de detecção de Chlamydia trachomatis em uma amostra de teste, com o método compreendendo (a) extração de ácido nucleico da amostra de teste, (b) amplificação de uma sequência alvo por reação do ácido nucleico extraído na etapa (a) com uma mistura de reação compreendendo uma DNA polimerase de deslocamento de fita e um conjunto de primer de sequência específica, em que o referido conjunto de primer de sequência específica é selecionado do grupo consistindo no Conjunto-1 ao Conjunto-81, e (c) detecção da presença ou ausência de um produto amplificado da etapa (b); em que a presença do referido produto de amplificação é indicativa da presença de Chlamydia trachomatis na amostra de teste. Em uma modalidade, a amplificação na etapa (b) da sequência alvo é realizada entre cerca de 60 °C e cerca de 67 °C por menos de 30 minutos. Preferencialmente, a etapa de amplificação é realizada por menos de quinze minutos, menos de dez minutos ou menos de seis minutos. Em algumas implementações, a mistura de reação compreende ainda uma transcriptase reversa. Em algumas implementações, a Chlamydia trachomatis está presente na amostra de teste numa concentração de ≤ 100 UFI/mL, ≤50 UFI/mL, ≤5 UFI/mL, ou até mesmo ≤2 UFI/mL. Em uma implementação, a Chlamydia trachomatis está presente na amostra de teste numa concentração de ≤ 5 UFI/ml e a etapa de amplificação é realizada por menos de 15 minutos. Em outra implementação, a Chlamydia trachomatis está presente na amostra de teste numa concentração de ≤ 10 UFI/ml e a etapa de amplificação é realizada por menos de seis minutos.
[0017] Em certas modalidades, a detecção da presença ou ausência do produto de amplificação compreende a hibridização do produto amplificado com uma sonda que compreende um polinucleotídeo ligado a um marcador. Em uma implementação preferida, o marcador é um fluoróforo, que preferencialmente está covalentemente ligado a um terminal do polinucleotídeo. Em uma modalidade particularmente preferida, a sonda ou polinucleotídeo é um molecular beacon compreendendo um fluoróforo, um supressor e um polinucleotídeo. Em uma modalidade, o fluoróforo é FAM e o supressor é BHQ1. Em uma implementação alternativa, o fluoróforo é ATTO 565 ou Alexa 594 e o supressor é BHQ1 ou BHQ2. Esse método pode ser praticado usando qualquer combinação de conjunto de primer e polinucleotídeo marcado, por exemplo, molecular beacon, descrito neste documento. A Figura 1 identifica sequências polinucleotídicas marcadas, ou molecular beacons, que são capazes de se ligar ao amplicon resultante de cada conjunto de primer e, portanto, são úteis na detecção da presença de Chlamydia trachomatis em uma amostra de teste.
[0018] Ainda outro aspecto da invenção fornece kits que compreendem as composições compreendendo um conjunto de polinucleotídeos selecionados do grupo que consiste no Conjunto-1 ao Conjunto-81. Em algumas modalidades, o kit compreende ainda uma polimerase de deslocamento de fita e, opcionalmente, uma transcriptase reversa. Em certas modalidades, o kit compreende um molecular beacon compreendendo um fluoróforo, um supressor e um polinucleotídeo, em que o polinucleotídeo compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo nos nucleotídeos 5-34 da SEQ ID NO: 97, nucleotídeos 5-31 da SEQ ID NO: 98, nucleotídeos 3-31 da SEQ ID NO: 99, nucleotídeos 5-30 da SEQ ID NO: 100, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 101, nucleotídeos 6-30 da SEQ ID NO: 102, nucleotídeos 5-26 da SEQ ID NO: 103, nucleotídeos 4-27 da SEQ ID NO: 104, nucleotídeos 7-30 da SEQ ID NO: 105, nucleotídeos 5-27 da SEQ ID NO: 106, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 107, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 108, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 109, nucleotídeos 6-30 da SEQ ID NO: 110, nucleotídeos 8-31 da SEQ ID NO: 111, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 112, nucleotídeos 8-31 da SEQ ID NO: 113, nucleotídeos 5-29 da SEQ ID NO: 114, nucleotídeos 5-29 da SEQ ID NO: 115, nucleotídeos 4-28 da SEQ ID NO: 116, nucleotídeos 5-30 da SEQ ID NO: 117, nucleotídeos 8-28 da SEQ ID NO: 118, nucleotídeos 8-30 da SEQ ID NO: 119, nucleotídeos 8-29 da SEQ ID NO: 120, nucleotídeos 4-33 da SEQ ID NO: 121, nucleotídeos 7-34 da SEQ ID NO: 122,
nucleotídeos 9-34 da SEQ ID NO: 123, nucleotídeos 8-34 da SEQ ID NO: 124, nucleotídeos 6-28 da SEQ ID NO: 125, nucleotídeos 7-28 da SEQ ID NO: 126, nucleotídeos 3-27 da SEQ ID NO: 127, nucleotídeos 7-32 da SEQ ID NO: 128, nucleotídeos 4-27 da SEQ ID NO: 129, nucleotídeos 6-27 da SEQ ID NO: 130, e nucleotídeos 8-29 da SEQ ID NO: 131. A sequência polinucleotídica do molecular beacon pode compreender uma sequência selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NO: 97 a SEQ ID NO: 131. Em algumas modalidades, a sequência polinucleotídica do molecular beacon consiste em uma sequência selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NO: 97 a SEQ ID NO: 131. Em uma modalidade, a sequência polinucleotídica do molecular beacon consiste na SEQ ID NO: 115 e o conjunto de polinucleotídeos é o Conjunto-20 ou Conjunto-24.
[0019] Ainda outro aspecto da invenção fornece métodos de detecção de Chlamydia trachomatis em uma amostra de teste, com o método compreendendo (a) extração de ácido nucleico da amostra de teste, (b) amplificação de uma sequência alvo por reação do ácido nucleico extraído na etapa (a) por menos de dez minutos com uma mistura de reação compreendendo uma DNA polimerase de deslocamento de fita e um conjunto de primer de LAMP de sequência específica, e (c) detecção da presença ou ausência de um produto amplificado da etapa (b); em que a presença do referido produto de amplificação é indicativa da presença de Chlamydia trachomatis na amostra de teste. Em algumas implementações, a Chlamydia trachomatis está presente na amostra de teste numa concentração de ≤ 100 UFI/mL, ≤50 UFI/mL, ≤5 UFI/mL, ou até mesmo ≤2 UFI/mL. Em certas implementações, a etapa de amplificação compreende a reação do ácido nucleico extraído na etapa (a) com uma mistura de reação compreendendo uma DNA polimerase de deslocamento de fita e um conjunto de primer de sequência específica, em que o referido conjunto de primer de sequência específica é selecionado do grupo consistindo no Conjunto-1 ao Conjunto-81. Nessas implementações, a detecção da presença ou ausência do produto de amplificação pode compreender a hibridização do produto amplificado com um molecular beacon compreendendo uma sequência polinucleotídica selecionada do grupo consistindo na SEQ ID NO: 97 à SEQ ID NO: 131. Em algumas implementações, a detecção da presença ou ausência do produto de amplificação compreende a hibridização do produto amplificado com um molecular beacon compreendendo uma sequência polinucleotídica selecionada do grupo consistindo na SEQ ID NO: 99 à SEQ ID NO:
120.
[0020] Em algumas modalidades dos métodos descritos neste documento, a amostra de teste compreende um ou mais outros micro-organismos além de Chlamydia trachomatis, e em que a sequência alvo de Chlamydia trachomatis é preferencialmente amplificada em relação a uma sequência polinucleotídica do um ou mais outros micro-organismos.
[0021] Em algumas modalidades, a invenção fornece uma sequência de ácido nucleico de pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%%, pelo menos 99,1%, pelo menos 99,2%, pelo menos 99,3%, pelo menos 99,4%, pelo menos 99,5%, pelo menos 99,6%, pelo menos 99,7%, pelo menos 99,8% ou pelo menos 99,9% idêntica a qualquer uma das SEQ ID NOs 1-96 e métodos de uso dessas sequências de ácido nucleico para detectar Chlamydia trachomatis em uma amostra de teste. Em algumas modalidades, a invenção fornece uma sequência de ácido nucleico pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%%, pelo menos 99,1%, pelo menos 99,2%, pelo menos 99,3%, pelo menos 99,4%, pelo menos 99,5%, pelo menos 99,6%, pelo menos 99,7%, pelo menos 99,8% ou pelo menos 99,9% idêntica a qualquer uma do grupo consistindo nos nucleotídeos 3-31 da SEQ ID NO: 99, nucleotídeos 5-30 da SEQ ID NO: 100, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 101, nucleotídeos 6-30 da SEQ ID NO: 102, nucleotídeos 5-26 da SEQ ID NO: 103, nucleotídeos 4-27 da SEQ ID NO: 104, nucleotídeos 7-30 da SEQ ID NO: 105, nucleotídeos 5-27 da SEQ ID NO: 106, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 107, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 108, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 109, nucleotídeos 6-30 da SEQ ID NO: 110, nucleotídeos 8-31 da SEQ ID NO: 111, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 112, nucleotídeos 8-31 da SEQ ID NO: 113, nucleotídeos 5-29 da SEQ ID NO: 114, nucleotídeos 5-29 da SEQ ID NO: 115, nucleotídeos 4-28 da SEQ ID NO: 116, e nucleotídeos 5-30 da SEQ ID NO: 117 e métodos de uso dessas sequências de ácido nucleico para detectar Chlamydia trachomatis em uma amostra de teste.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0022] Detectar baixas concentrações de espécies (até algumas moléculas ou micro-organismos em uma amostra) é um desafio na medicina. A presente invenção refere-se à detecção seletiva de Chlamydia trachomatis. Em particular, com base em novas estratégias de detecção que utilizam amplificação de ácido nucleico, particularmente RT-LAMP, e detecção por molecular beacon, as infecções por Chlamydia podem ser diagnosticadas usando os métodos e reagentes descritos neste documento. O uso de RNA (RNA ribossômico (rRNA) ou RNA mensageiro) como regiões alvo fornece várias cópias do alvo por genoma de C. trachomatis. Nesse sentido, isso facilita a detecção de C. trachomatis em amostras que utilizam as abordagens descritas neste documento em relação às técnicas que têm como alvo o DNA genômico, mesmo quando presente em múltiplas cópias por genoma. Além disso, os reagentes de detecção de molecular beacon descritos neste documento fornecem especificidade adicional, deixando de se ligar, na maioria dos casos, ao DNA amplificado inespecífico, minimizando, desse modo, a ocorrência, por exemplo, de falsos positivos. Esta especificidade é ilustrada, inter alia, no Exemplo 4 fornecido abaixo. Muitas outras características da invenção também são descritas neste documento.
[0023] Conforme usado neste documento, "ácido nucleico" inclui DNA e RNA, incluindo DNA e RNA contendo nucleotídeos não padrão. Um "ácido nucleico" contém pelo menos um polinucleotídeo (uma "fita de ácido nucleico"). Um "ácido nucleico" pode ser de fita única ou fita dupla. O termo "ácido nucleico" refere-se a nucleotídeos e nucleosídeos que compõem, por exemplo, macromoléculas de ácido desoxirribonucleico (DNA) e macromoléculas de ácido ribonucleico (RNA). Os ácidos nucleicos mais comuns são o ácido desoxirribonucleico (DNA) e o ácido ribonucleico (RNA). Deve-se entender ainda que a presente invenção pode ser usada para sequências biológicas contendo nucleotídeos artificiais, tais como ácido nucleico peptídico (PNA), morfolino, ácido nucleico bloqueado (LNA), ácido nucleico de glicol (GNA) e ácido nucleico de treose (TNA), entre outros. Preferencialmente, os nucleotídeos artificiais são moléculas de ácido nucleico bloqueados, incluindo [alfa]-L-LNAs. Os LNAs compreendem análogos de ácido ribonucleico, em que o anel de ribose está "bloqueado" por uma ponte de metileno entre o 2′-oxigênio e o 4′-carbono—isto é, oligonucleotídeos, contendo pelo menos um monômero de LNA, ou seja, um nucleotídeo de 2′-O,4′-C-metileno-β-D- ribofuranosil. As bases de LNA formam pares de bases tipo Watson-Crick padrão, mas a configuração bloqueada aumenta a taxa e a estabilidade da reação de pareamento de bases (Jepsen et al., Oligonucleotides, 14, 130-146 (2004)).
[0024] Conforme usado neste documento, um "polinucleotídeo" refere-se a uma cadeia polimérica contendo dois ou mais nucleotídeos que contêm desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e/ou seus análogos, tais como aqueles contendo estruturas principais modificadas (por exemplo, ácidos nucleicos peptídicos (PNAs) ou fosforotioatos) ou bases modificadas. "Polinucleotídeos" incluem primers, oligonucleotídeos, fitas de ácido nucleico, etc. Um polinucleotídeo pode conter nucleotídeos padrão ou não padrão. Assim, o termo inclui mRNA, tRNA, rRNA, ribozimas, DNA, cDNA, ácidos nucleicos recombinantes, ácidos nucleicos ramificados, plasmídeos, vetores, sondas, primers, etc. Normalmente, um polinucleotídeo contém um 5′ fosforotioato em um terminal ("terminal 5′") e um grupo 3′ hidroxila no outro terminal ("terminal 3′") da cadeia. O nucleotídeo mais extremo em 5′ de um polinucleotídeo pode ser referido, neste documento, como o "nucleotídeo 5′ terminal" do polinucleotídeo. O nucleotídeo mais extremo em 3′ de um polinucleotídeo pode ser referido, neste documento, como o "nucleotídeo 3′ terminal" do polinucleotídeo. Quando o ácido nucleico da invenção assumir a forma de RNA, este pode ou não ter um 5' cap.
[0025] LAMP é um método de amplificação de ácido nucleico que se baseia na síntese de DNA de deslocamento de fita de autociclo realizada por uma Bst DNA polimerase, ou outras polimerases de deslocamento de fita. Os produtos amplificados são estruturas em haste-alça com várias sequências repetidas do alvo e têm múltiplas alças. O principal mérito deste método é que a desnaturação do modelo de DNA não é necessária e, assim, a reação LAMP pode ser realizada em condições isotérmicas (variando de 60 a 67 °C). A LAMP requer apenas uma enzima e quatro tipos de primers que reconhecem seis sítios de hibridização distintos na sequência alvo. A reação pode ser acelerada pela adição de dois primers adicionais. O método produz uma grande quantidade de produto amplificado, resultando em uma detecção mais fácil, como a detecção por julgamento visual da turbidez ou fluorescência da mistura de reação.
[0026] Em resumo, a reação é iniciada por anelamento e extensão de um par de primers 'formadores de alça' (primers internos forward e backward, FIP e BIP, respectivamente), seguido por anelamento e extensão de um par de primers flanqueadores (F3 e B3). A extensão desses primers resulta no deslocamento da fita dos elementos formadores de alça, que se dobram para formar estruturas em alça-hairpin terminais. Uma vez que essas estruturas-chave aparecem, o processo de amplificação se torna autossustentável e prossegue em temperatura constante de maneira contínua e exponencial (em vez de uma maneira cíclica, como a PCR) até todos os nucleotídeos (dATP, dTTP, dCTP e dGTP) na mistura de reação terem sido incorporados no DNA amplificado. Opcionalmente, um par adicional de primers pode ser incluído para acelerar a reação. Esses primers, denominados primers em alça, se hibridizam em alças terminais ligadas a primer não interno dos produtos em forma de haltere do primer interno.
[0027] O termo "primer", conforme usado neste documento, refere-se a um oligonucleotídeo que é capaz de atuar como um ponto de iniciação de síntese quando colocado em condições nas quais é induzida a síntese do produto de extensão do primer que é complementar a uma fita de ácido nucleico (modelo), isto é, na presença de nucleotídeos e um agente para polimerização, tal como DNA polimerase, e em uma temperatura e pH adequados.
[0028] O LAMP permite a amplificação de sequências de DNA alvo com maiores sensibilidade e especificidade do que a PCR, geralmente com tempos de reação abaixo de 30 minutos, o que é equivalente aos testes de PCR em tempo real mais rápidos. A sequência alvo que é amplificada tem normalmente 200-300 pares de bases (bp) de comprimento, e a reação depende do reconhecimento entre 120 bp e 160 bp desta sequência por vários primers simultaneamente durante o processo de amplificação. Este alto nível de rigorosidade torna a amplificação altamente específica, de modo que o aparecimento do DNA amplificado em uma reação ocorre apenas se a sequência alvo inteira estivesse inicialmente presente.
[0029] As aplicações de LAMP foram estendidas ainda para incluir a detecção de moléculas de RNA por adição da enzima Transcriptase Reversa (RT). Ao incluir a detecção de RNA, os tipos de alvos para os quais o LAMP pode ser aplicado também são expandidos e adicionam a capacidade de visar, adicionalmente, vírus baseados em RNA, importantes RNAs não codificadores regulatórios (sRNA, miRNA) e moléculas de RNA que têm sido associadas a determinadas doenças ou estados fisiológicos. A capacidade de detectar RNA também tem o potencial de aumentar a sensibilidade do ensaio, por exemplo, na escolha de alvos de RNA mensageiro (mRNA) ou RNA ribossômico (rRNA)
altamente expressos, estáveis e/ou abundantes. Esta fase preliminar de amplificação envolve a transcrição reversa de moléculas de RNA em DNA complementar (cDNA). O cDNA serve então como modelo para a DNA polimerase de deslocamento da fita. O uso de uma enzima RT termoestável (isto é, NEB RTx) permite que a reação seja concluída em uma única temperatura e em uma única etapa, mix de reação único.
[0030] Uma "sequência alvo", conforme usado neste documento, significa uma sequência de ácido nucleico de Chlamydia trachomatis, ou complemento desta, que é amplificada, detectada ou amplificada e detectada, usando um ou mais dos polinucleotídeos fornecidos neste documento. Além disso, embora o termo sequência alvo às vezes se refira a uma sequência de ácido nucleico de fita dupla, os versados na técnica reconhecerão que a sequência alvo também pode ser de fita simples, por exemplo, RNA. Pode ser selecionada uma sequência alvo que seja mais ou menos específica para um organismo em particular. Por exemplo, a sequência alvo pode ser específica para um gênero inteiro, para mais de um gênero, para uma espécie ou subespécie, sorogrupo, auxotipo, sorotipo, cepa, isolado ou outro subconjunto de organismos.
[0031] A velocidade, especificidade e sensibilidade das composições de primers/sonda e o método descritos neste documento resultam de vários aspectos. Exemplos de primers para uso nas composições e métodos de acordo com a presente invenção incluem: TABELA 1: Sequências de Primer Sequência ID Sequência (5′ para 3′) SEQ ID NO: 1 CGAAGGAATGACGGAGTA SEQ ID NO: 2 CGCCTTAGAATATTCATCTCG SEQ ID NO: 3 GCGACCTGATCTTATGTTAGCGCGATTGGAAGAGTCCGTA SEQ ID NO: 4 GAACCGATGGTGTGGAGCCCACCTGTGTCGGTT SEQ ID NO: 5 CTACTAACCGTTCTCATCGC SEQ ID NO: 6 CTGTTGATGGTGACCGTAC SEQ ID NO: 7 AAAACTATAGCGAAGGAATGACGGA SEQ ID NO: 8 TAATTTGCCGAGTTCCTTAACGAAAG SEQ ID NO: 9 CCCCGAAGATTCCCCTTGATCGCCGTAGAGCGATGAGAAC
GGTT SEQ ID NO: 10 GGTGTGGAGCGAGGCTTTCAAGAAATAATATTCATCTCGCC
CACCTGTG
Sequência ID Sequência (5′ para 3′) SEQ ID NO: 11 TGATCTTATGTTAGCGGATTTGCCTACT SEQ ID NO: 12 TTTCTAGCTGTTGATGGTGACCGT SEQ ID NO: 13 AACTATAGCGAAGGAATGACGGAG SEQ ID NO: 14 TAATTTGCCGAGTTCCTTAACGAAAG SEQ ID NO: 15 CCCCGAAGATTCCCCTTGATCGCCGTAGAGCGATGAGAAC
GGTT SEQ ID NO: 16 GGTGTGGAGCGAGGCTTTCAAGAAATAATATTCATCTCGCC
CACCTGTG SEQ ID NO: 17 TGATCTTATGTTAGCGGATTTGCCTACT SEQ ID NO:18 GTTGATGGTGACCGTACCAAAACC SEQ ID NO: 19 ATAGCGAAGGAATGACGGAGTAAG SEQ ID NO: 20 TAATTTGCCGAGTTCCTTAACGAAAG SEQ ID NO: 21 CCCCGAAGATTCCCCTTGATCGCCGTAGAGCGATGAGAAC
GGTT SEQ ID NO: 22 GGTGTGGAGCGAGGCTTTCAAGAAATAATATTCATCTCGCC
CACCTGTG SEQ ID NO: 23 GACCTGATCTTATGTTAGCGGATTTGC SEQ ID NO: 24 TTTCTAGCTGTTGATGGTGACCGT SEQ ID NO: 25 AGAAGCGAGTCCGGGAGAT SEQ ID NO: 26 CTGCTGAATACTACGCTCTCCTAC SEQ ID NO: 27 CCAACATTCCAACTGTCTTCGAATCATCACTCAGCCCAGAC
CGCCG SEQ ID NO: 28 GCGTAACAGCTCACCAATCGAGAATCATTGTCTTATCGACA
CACCCGC SEQ ID NO: 29 TTACCCACTTAGCATAAAATTAGGGACCTTAA SEQ ID NO: 30 ACGGGACTAAGCATAAAACCGACA SEQ ID NO: 31 AGAAGCGAGTCCGGGAGAT SEQ ID NO: 32 CCGGTACACCTTCTCTGCTG SEQ ID NO: 33 AAGCCAACATTCCAACTGTCTTCGAATCATCAGCCCAGACC
GCCG SEQ ID NO: 34 GCGTAACAGCTCACCAATCGAGAATCATTGTCTTATCGACA
CACCCGC SEQ ID NO: 35 TTACCCACTTAGCATAAAATTAGGGACCTTAA SEQ ID NO: 36 ACGGGACTAAGCATAAAACCGACA SEQ ID NO: 37 CACAGGTGGGCGAGATGAATAT SEQ ID NO: 38 CTGACATATCCCTTTAACCTTTTGGC SEQ ID NO: 39 ATAGTCACCCTAAAAGGCTCCCCTTATTCCAGGCGCGCGA
GATAACTTT
Sequência ID Sequência (5′ para 3′) SEQ ID NO: 40 AGAAATGGCCCAGGCGACTGTTTAGGCAGGCGTCACACCA
TATACT SEQ ID NO: 41 GGGATAATTTGCCGAGTTCCTTAACG SEQ ID NO: 42 AAAACACAGCACTATGCAAACCTCTAAG SEQ ID NO: 43 CACAGGTGGGCGAGATGAAT SEQ ID NO: 44 CTGACATATCCCTTTAACCTTTTGGC SEQ ID NO: 45 ATAGTCACCCTAAAAGGCTCCCCTTATTCCAGGCGCGCGA
GATAACTTT SEQ ID NO: 46 AGAAATGGCCCAGGCGACTGTTTAGGCAGGCGTCACACCA
TATACT SEQ ID NO: 47 GGGATAATTTGCCGAGTTCCTTAACG SEQ ID NO: 48 AAAACACAGCACTATGCAAACCTCTAAG SEQ ID NO: 49 ATTCGAAGACAGTTGGAATGT SEQ ID NO: 50 TATTATCGGCGCAATGATTCTCGAGGCTTAGAGGCAGCAAT
C SEQ ID NO: 51 GTGAGCTGTTACGCACTCT SEQ ID NO: 52 TCGTTACTTATGCCATGGATC SEQ ID NO: 53 TAAACGGGACTAAGCATAAAACCGACCTTCTCTGCTGAATA
CTACG SEQ ID NO: 54 GATAAGACACGCGGTAGGAG SEQ ID NO: 55 CTTACCAACGGAAATCAAACTC SEQ ID NO: 56 CACTTAGCATAAAATTAGGGACCTTAATCGGGGGGCTAAG
CTTCGT SEQ ID NO: 57 GCGGTCTGGGCTGTTC SEQ ID NO: 58 TATCGGCGCAATGATTCTC SEQ ID NO: 59 TGGGTAAGGAAGTGATGATTCGAAGGGTGAGCTGTTACGC
AC SEQ ID NO: 60 TGGCTTAGAGGCAGCAATC SEQ ID NO: 61 ATCGGCGCAATGATTCTCGATGGCTTAGAGGCAGCAATC SEQ ID NO: 62 CGTTACTTATGCCATGGATCT SEQ ID NO: 63 TAAGACACGCGGTAGGAGA SEQ ID NO: 64 GAAATCGAAGAGATTCCCTGTG SEQ ID NO: 65 GGTGTTGAGGTCGGTCTT SEQ ID NO: 66 TTATCCTCAATCCTACAACCCCGAGTAGCGGCGAGCGAAA
G SEQ ID NO: 67 GGATCAGGACTCCTAGTTGAACACACTCCTTTCGTCTACGG
GAC SEQ ID NO: 68 CCTTATCAGCTCGGTTTAGGC SEQ ID NO: 69 GGAAAGATGGATGATACAGGGTG
Sequência ID Sequência (5′ para 3′) SEQ ID NO: 70 GTTGTAGGATTGAGGATAAAGGATC SEQ ID NO: 71 TACTGGTTCACTATCGGTCATT SEQ ID NO: 72 TCGGTCTTTCTCTCCTTTCGTCTACTCCTAGTTGAACACATC
TGGAA SEQ ID NO: 73 CCTCAACACCTGAGTAGGACTAGACGCCTTGGAGAGTGGT
CTC SEQ ID NO: 74 GGACTATCACCCTGTATCATCCA SEQ ID NO: 75 CGTGAAACCTAGTCTGAATCTGG SEQ ID NO: 76 TATTCCCCTTTCGCTCGC SEQ ID NO: 77 GGCTATTCCCCTTTCGCTC SEQ ID NO: 78 TTAGGCTATTCCCCTTTCGC SEQ ID NO: 79 GCTATTCCCCTTTCGCTCGC SEQ ID NO: 80 GTTTAGGCTATTCCCCTTTC SEQ ID NO: 81 CTGAAACATCTTAGTAAGCAGAGG SEQ ID NO: 82 GTGTCTAGTCCTACTCAGGTG SEQ ID NO: 83 CCTACAACCCCGAGCCTTATCAAGAGATTCCCTGTGTAGC
G SEQ ID NO: 84 GGACTCCTAGTTGAACACATCTGGATTCTCTCCTTTCGTCT
ACGG SEQ ID NO: 85 GCTCGGTTTAGGCTATTCCC SEQ ID NO: 86 AAGATGGATGATACAGGGTGATAGT SEQ ID NO: 87 CGAACTGAAACATCTTAGTAAGCAG SEQ ID NO: 88 CTCCTTTCGTCTACGGGACTA SEQ ID NO: 89 ATCAGCTCGGTTTAGGCTATTCCCGAAAAGAAATCGAAGAG
ATTCCCTG SEQ ID NO: 90 GCTCGGGGTTGTAGGATTGAGGATACCTGTATCATCCATCT
TTCCAGAT SEQ ID NO: 91 CTTTCGCTCGCCGCTAC SEQ ID NO: 92 GGATCAGGACTCCTAGTTGAACAC SEQ ID NO: 93 CCTACAACCCCGAGCCTTATCAGAAAAGAAATCGAAGAGAT
TCCCTG SEQ ID NO: 94 ATCAGCTCGGTTTAGGCTATTCCCAGAGATTCCCTGTGTAG
CG SEQ ID NO: 95 GCTCGGGGTTGTAGGATTGAGGATATTCTCTCCTTTCGTCT
ACGG SEQ ID NO: 96 GCTCGGGGTTGTAGGATTGAGGATACTGTATCATCCATCTT
TCCAGATGT
[0032] A detecção dos produtos amplificados por LAMP pode ser realizada por meio de uma variedade de métodos. Numa modalidade preferida, a detecção do produto é conduzida adicionando-se uma sonda marcada com fluorescência ao mix de primer. O termo usado neste documento "sonda" refere-se a uma molécula de ácido nucleico de fita única que compreende uma porção ou porções que são complementares, ou substancialmente complementares, a uma sequência alvo. Em certas implementações, a sonda marcada com fluorescência é um molecular beacon.
[0033] Conforme usado neste documento, "molecular beacon" refere-se a uma sonda de oligonucleotídeo em forma de hairpin (grampo de cabelo) de fita única projetada para relatar a presença de ácidos nucleicos específicos em uma solução. Um molecular beacon consiste em quatro componentes; uma haste, uma alça em hairpin, fluoróforo marcado na extremidade e supressor marcado na extremidade oposta (Tyagi et al., (1998) Nature Biotechnology 16:49-53). Quando o beacon tipo hairpin não estiver ligado a um alvo, o fluoróforo e o supressor ficam próximos e a fluorescência é suprimida. Na presença de uma sequência nucleotídica alvo complementar, a haste do beacon se abre para se hibridizar no alvo. Isso separa o fluoróforo e o supressor, permitindo que o fluoróforo fique fluorescente. Alternativamente, molecular beacons também incluem fluoróforos que emitem na proximidade de um doador marcado na extremidade. "Molecular Beacons com Deslocamento de Comprimento de Onda" incorporam um fluoróforo de absorção ("harvester") que permite que o fluoróforo emita mais fortemente. Revisões atuais de molecular beacons incluem Wang et al., 2009, Angew Chem Int Ed Engl, 48(5):856-870; Cissell et al., 2009, Anal Bioanal Chem 393(1):125-35; Li et al., 2008, Biochem Biophys Res Comm 373(4):457-61; e Cady, 2009, Methods Mol Biol 554:367-79.
[0034] Em uma implementação, o molecular beacon compreende um fluoróforo, um supressor e um polinucleotídeo, em que o polinucleotídeo compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo nos nucleotídeos 5- 34 da SEQ ID NO: 97, nucleotídeos 5-31 da SEQ ID NO: 98, nucleotídeos 3-31 da SEQ ID NO: 99, nucleotídeos 5-30 da SEQ ID NO: 100, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 101, nucleotídeos 6-30 da SEQ ID NO: 102, nucleotídeos 5-26 da SEQ ID NO: 103, nucleotídeos 4-27 da SEQ ID NO: 104, nucleotídeos 7-30 da SEQ ID NO:
105, nucleotídeos 5-27 da SEQ ID NO: 106, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 107, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 108, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 109, nucleotídeos 6-30 da SEQ ID NO: 110, nucleotídeos 8-31 da SEQ ID NO: 111, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 112, nucleotídeos 8-31 da SEQ ID NO: 113, nucleotídeos 5-29 da SEQ ID NO: 114, nucleotídeos 5-29 da SEQ ID NO: 115, nucleotídeos 4-28 da SEQ ID NO: 116, nucleotídeos 5-30 da SEQ ID NO: 117, nucleotídeos 8-28 da SEQ ID NO: 118, nucleotídeos 8-30 da SEQ ID NO: 119, e nucleotídeos 8-29 da SEQ ID NO: 120. Em uma modalidade, o polinucleotídeo compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste da SEQ ID NO: 99 a SEQ ID NO: 120. Em outra modalidade, o polinucleotídeo consiste em uma sequência selecionada do grupo que consiste da SEQ ID NO: 99 a SEQ ID NO:
120. Os polinucleotídeos com as sequências descritas acima podem incluir um ou mais nucleosídeos não naturais ou ligações, tais como ácido nucleico peptídico (PNA), morfolino, ácido nucleico bloqueado (LNA), ácido nucleico de glicol (GNA) e ácido nucleico de treose (TNA), entre outros. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo do molecular beacon compreende de um a seis ácidos nucleicos bloqueados. Em uma modalidade preferida, o polinucleotídeo do molecular beacon compreende três ácidos nucleicos bloqueados. Em outra modalidade preferida, o polinucleotídeo do molecular beacon compreende quatro ácidos nucleicos bloqueados.
[0035] O molecular beacon é preferencialmente usado em uma composição compreendendo também um conjunto de primers de LAMP de sequência específica. Em uma implementação, o molecular beacon compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo nos nucleotídeos 5-34 da SEQ ID NO: 97, nucleotídeos 5-31 da SEQ ID NO: 98, nucleotídeos 3-31 da SEQ ID NO: 99, nucleotídeos 5-30 da SEQ ID NO: 100, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 101, nucleotídeos 6-30 da SEQ ID NO: 102, nucleotídeos 5-26 da SEQ ID NO: 103, nucleotídeos 4-27 da SEQ ID NO: 104, nucleotídeos 7-30 da SEQ ID NO: 105, nucleotídeos 5-27 da SEQ ID NO: 106, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 107, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 108, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 109, nucleotídeos 6-30 da SEQ ID NO: 110, nucleotídeos 8-31 da SEQ ID NO: 111, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 112, nucleotídeos 8-31 da SEQ ID NO: 113, nucleotídeos 5-29 da SEQ ID NO: 114, nucleotídeos 5-29 da SEQ ID NO: 115,
nucleotídeos 4-28 da SEQ ID NO: 116, nucleotídeos 5-30 da SEQ ID NO: 117, nucleotídeos 8-28 da SEQ ID NO: 118, nucleotídeos 8-30 da SEQ ID NO: 119, nucleotídeos 8-29 da SEQ ID NO: 120, nucleotídeos 4-33 da SEQ ID NO: 121, nucleotídeos 7-34 da SEQ ID NO: 122, nucleotídeos 9-34 da SEQ ID NO: 123, nucleotídeos 8-34 da SEQ ID NO: 124, nucleotídeos 6-28 da SEQ ID NO: 125, nucleotídeos 7-28 da SEQ ID NO: 126, nucleotídeos 3-27 da SEQ ID NO: 127, nucleotídeos 7-32 da SEQ ID NO: 128, nucleotídeos 4-27 da SEQ ID NO: 129, e nucleotídeos 6-27 da SEQ ID NO: 130. Nessa implementação, o molecular beacon pode compreender uma sequência selecionada do grupo que consiste da SEQ ID NO: 97 a SEQ ID NO: 130. Mais preferencialmente, a sequência polinucleotídica do molecular beacon consiste em uma sequência selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NO: 97 a SEQ ID NO: 130. Em uma implementação particularmente preferida, a sequência polinucleotídica do molecular beacon é a SEQ ID NO: 115.
[0036] Quando incluído em uma composição que compreende um conjunto de polinucleotídeos selecionados do grupo consistindo nos Conjuntos 12-27, Conjuntos 39-54 e Conjuntos 66-81, o molecular beacon compreende preferencialmente uma sequência selecionada do grupo consistindo nos nucleotídeos 5-34 da SEQ ID NO: 97, nucleotídeos 5-31 da SEQ ID NO: 98, nucleotídeos 3-31 da SEQ ID NO: 99, nucleotídeos 5-30 da SEQ ID NO: 100, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 101, nucleotídeos 5-27 da SEQ ID NO: 106, nucleotídeos 6-30 da SEQ ID NO: 110, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 112, nucleotídeos 8-29 da SEQ ID NO: 120, nucleotídeos 4-33 da SEQ ID NO: 121, e nucleotídeos 7-34 da SEQ ID NO: 122. Mais particularmente, o molecular beacon pode compreender uma sequência selecionada do grupo consistindo na SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121, e SEQ ID NO: 122. Em certas implementações, a sequência polinucleotídica do molecular beacon é selecionada do grupo consistindo na SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121 e SEQ ID NO:
122.
[0037] Quando incluído em uma composição que compreende um conjunto de polinucleotídeos selecionados do grupo consistindo no Conjunto-12, Conjuntos 14-18, Conjunto-20, Conjunto-24, Conjunto-27, Conjunto-39, Conjuntos 41-45, Conjunto-47, Conjunto-51, Conjunto-54, Conjunto-66, Conjuntos 68-72, Conjunto 74, Conjunto-78, e Conjunto-81, o molecular beacon compreende preferencialmente uma sequência selecionada do grupo consistindo nos nucleotídeos 6-28 da SEQ ID NO: 125 e nucleotídeos 7-28 da SEQ ID NO: 126. Em certas implementações, o molecular beacon pode compreender uma sequência polinucleotídica selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NO: 125 e SEQ ID NO: 126. Em algumas modalidades, a sequência polinucleotídica do molecular beacon é a SEQ ID NO: 125 ou SEQ ID NO: 126.
[0038] Quando usado em combinação com um conjunto de polinucleotídeos selecionados do grupo consistindo nos Conjuntos 14-27, Conjuntos 41-54 e Conjuntos 68-81, o molecular beacon compreende preferencialmente uma sequência polinucleotídica selecionada do grupo que consiste nos nucleotídeos 8- 31 da SEQ ID NO: 113 e nucleotídeos 3-27 da SEQ ID NO: 127. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo marcado do molecular beacon compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NO: 113 e SEQ ID NO:
127. Em outras modalidades, a sequência polinucleotídica do molecular beacon é a SEQ ID NO: 113 ou SEQ ID NO: 127.
[0039] Quando incluído em uma composição que compreende um conjunto de polinucleotídeos selecionados do grupo que consiste nos Conjuntos 12-20, Conjuntos 22-27, Conjuntos 39-47, Conjuntos 49-54, Conjuntos 66-74 e Conjuntos 76-81, o molecular beacon preferencialmente compreende os nucleotídeos 6-27 da SEQ ID NO: 130. Em algumas implementações, o molecular beacon compreende a SEQ ID NO: 130. Em outras modalidades, a sequência polinucleotídica do molecular beacon é a SEQ ID NO: 130.
[0040] Quando usado em combinação com um conjunto de polinucleotídeos selecionados do grupo que consiste no Conjunto-13, Conjunto-40 e Conjunto-67, o molecular beacon compreende preferencialmente uma sequência selecionada do grupo que consiste nos nucleotídeos 6-30 da SEQ ID NO: 102 e nucleotídeos 8-29 da SEQ ID NO: 131. Nessa modalidade, o molecular beacon pode compreender uma sequência selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NO: 102 e SEQ ID NO: 131. Em outra modalidade, a sequência polinucleotídica do molecular beacon é a SEQ ID NO: 102 ou SEQ ID NO: 131.
[0041] O termo "marcador", conforme usado neste documento, significa uma molécula ou fração com uma propriedade ou característica que é capaz de detecção e, opcionalmente, de quantificação. Um marcador pode ser diretamente detectável, como, por exemplo (e sem limitação), com radioisótopos, fluoróforos, quimioluminóforos, enzimas, partículas coloidais, micropartículas fluorescentes e similares; ou um marcador pode ser detectável indiretamente, como, por exemplo, com membros de ligação específica. Será entendido que os marcadores diretamente detectáveis podem exigir componentes adicionais, tais como, por exemplo, substratos, reagentes de ativação, frações de supressão, luz e similares para permitir a detecção e/ou quantificação do marcador. Quando marcadores indiretamente detectáveis são usados, eles são normalmente usados em combinação com um "conjugado". Um conjugado é normalmente um membro de ligação específica que foi ligado ou acoplado a um marcador diretamente detectável. As químicas de acoplamento para sintetizar um conjugado são bem conhecidas na técnica e podem incluir, por exemplo, qualquer meio químico e/ou meio físico que não destrua a propriedade de ligação específica do membro de ligação específica ou a propriedade detectável do marcador. Conforme usado neste documento, "membro de ligação específica" significa um membro de um par de ligação, isto é, duas moléculas diferentes em que uma das moléculas através, por exemplo, de meios químicos ou físicos se liga especificamente a outra molécula. Além de pares de ligação específica entre antígeno e anticorpo, outros pares de ligação específica incluem, mas não estão limitados a, avidina e biotina; haptenos e anticorpos específicos para haptenos; sequências nucleotídicas complementares; cofatores ou substratos enzimáticos e enzimas; e similares.
[0042] O molecular beacon pode ser composto de ácido nucleico apenas, tal como DNA ou RNA, ou pode ser composto de um conjugado de ácido nucleico peptídico (PNA). O fluoróforo pode ser qualquer corante orgânico fluorescente ou um ponto quântico único. A fração supressora, desejavelmente, suprime a luminescência do fluoróforo. Qualquer fração supressora adequada que suprima a luminescência do fluoróforo pode ser usada. Um fluoróforo pode ser qualquer marcador/corante fluorescente conhecido na técnica. Exemplos de marcadores fluorescentes adequados incluem, sem limitação, corantes Fam, Hex, Tet, Joe,
Rox, Tamra, Max, Edans, Cy, tal como Cy5, Fluoresceína, Cumarina, Eosina, Rodamina, Bodipy, Alexa, Cascade Blue, Yakima Yellow, Lucifer Yellow, Texas Red, e a família de corantes ATTO. Um supressor pode ser qualquer supressor na técnica. Exemplos de supressores incluem, sem limitação, Dabcyl, Dark Quencher, Eclipse Dark Quencher, ElleQuencher, Tamra, BHQ e QSY (todos são marcas registradas). Os versados na técnica saberiam quais combinações de corante/supressor seriam adequadas ao se projetar uma sonda. Em uma modalidade exemplar, a fluoresceína (FAM) é usada em conjunto com Blackhole Quencher™ (BHQ™)(Novato, Calif.). A ligação do molecular beacon ao produto amplificado pode então ser avaliada visualmente, diretamente. Alternativamente, o nível de fluorescência pode ser medido por espectroscopia para melhorar a sensibilidade.
[0043] Uma variedade de fornecedores comerciais produzem molecular beacons padrão e sob encomenda, incluindo Abingdon Health (UK; www.abingdonhealth.com), Attostar (US, MN; www.attostar.com), Biolegio (NLD; www.biolegio.com), Biomers.net (DEU; www.biomers.net), Biosearch Technologies (US, CA; www.biosearchtech.com), Eurogentec (BEL; www.eurogentec.com), Gene Link (US, NY; www.genelink.com) Integrated DNA Technologies (US, IA; www.idtdna.com), Isogen Life Science (NLD; www.isogen-lifescience.com), Midland Certified Reagent (US, TX; www.oligos.com), Eurofins (DEU; www.eurofinsgenomics.eu), Sigma-Aldrich (US, TX; www.sigmaaldrich.com), Thermo Scientific (US, MA; www.thermoscientific.com), TIB MOLBIOL (DEU; www.tib-molbiol.de), TriLink Bio Technologies (US, CA; www.trilinkbiotech.com). Uma variedade de kits, que utilizam molecular beacons, também estão comercialmente disponíveis, tais como SentinelTM Molecular Beacon Allelic Discrimination Kits da Stratagene (La Jolla, Calif.) e vários kits da Eurogentec SA (Belgium, eurogentec.com) e Isogen Bioscience BV (The Netherlands, isogen.com).
[0044] As sondas de oligonucleotídeos e primers da invenção são opcionalmente preparados usando essencialmente qualquer prática conhecida na técnica. Em certas modalidades, por exemplo, as sondas de oligonucleotídeos e primers descritos neste documento são sintetizados quimicamente usando essencialmente qualquer método de síntese de ácido nucleico, incluindo, por exemplo, de acordo com o método de fosforamidita triéster de fase sólida descrito por Beaucage and Caruthers (1981), Tetrahedron Letts. 22(20):1859-1862, que está incorporado por referência, ou outra prática de síntese conhecida na técnica, por exemplo, usando um sintetizador automatizado, conforme descrito em Needham-VanDevanter et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12:6159-6168, que está incorporado por referência. Uma grande variedade de equipamentos está disponível comercialmente para a síntese automatizada de oligonucleotídeos. Abordagens de síntese de multinucleotídeos (por exemplo, síntese de trinucleotídeos, etc.) também são opcionalmente utilizadas. Além disso, os ácidos nucleicos dos primers descritos neste documento incluem, opcionalmente, várias modificações. Para maior ilustração, os primers também são opcionalmente modificados para melhorar a especificidade de reações de amplificação, conforme descrito, por exemplo, na Patente US Nº 6,001,611, emitida em 14 de dezembro de 1999, que está incorporada por referência. Os primers e sondas também podem ser sintetizados com várias outras modificações, conforme descrito neste documento ou como de outra forma conhecido na técnica.
[0045] Além disso, essencialmente qualquer ácido nucleico (e praticamente qualquer ácido nucleico marcado, seja padrão ou não) pode ser encomendado de forma padrão ou sob medida de qualquer variedade de fontes comerciais, tais como Integrated DNA Technologies, the Midland Certified Reagent Company, Eurofins, Biosearch Technologies, Sigma Aldrich e muitas outras.
[0046] As amostras de teste são geralmente derivadas ou isoladas de sujeitos, normalmente mamíferos, mais normalmente humanos, suspeitos de ter uma infecção por Chlamydia. Exemplos de amostra ou espécimes incluem sangue, plasma, soro, urina, fluido sinovial, fluido seminal, plasma seminal, fluido prostático, fluido vaginal, fluido cervical, fluido uterino, raspados cervicais, líquido amniótico, raspados anais, muco, escarro, tecido e similares. Essencialmente, qualquer técnica para adquirir essas amostras é opcionalmente utilizada, incluindo, por exemplo, raspagem, punção venosa, swab, biópsia ou outras técnicas conhecidas na técnica.
[0047] O termo "amostra de teste", conforme usado neste documento, significa uma amostra tirada de u organismo ou fluido biológico que é suspeito de conter ou conter potencialmente uma sequência alvo. A amostra de teste pode ser tirada de qualquer fonte biológica, tal como, por exemplo, tecido, sangue, saliva,
escarro, muco, suor, urina, swabs uretrais, swabs cervicais, swabs vaginais, swabs urogenitais ou anais, swabs conjuntivais, fluido do cristalino ocular, líquido cefalorraquidiano, leite, fluido de ascites, fluido sinovial, fluido peritoneal, fluido amniótico, caldos de fermentação, culturas celulares, misturas de reação química e similares. A amostra de teste pode ser usada (i) diretamente conforme obtida da fonte ou (ii) após um pré-tratamento para modificar o caráter da amostra. Assim, a amostra de teste pode ser pré-tratada antes do uso, por exemplo, preparando o plasma ou soro do sangue, rompendo células ou partículas virais, preparando líquidos de materiais sólidos, diluindo fluidos viscosos, filtrando líquidos, destilando líquidos, concentrando líquidos, inativando componentes interferentes, adicionando reagentes, purificando ácidos nucleicos e similares.
[0048] Vantajosamente, a invenção permite a detecção rápida e confiável de Chlamydia trachomatis em uma amostra clínica, tal como uma amostra de urina.
[0049] Para ilustrar ainda mais, antes de analisar os ácidos nucleicos alvo descritos neste documento, esses ácidos nucleicos podem ser purificados ou isolados das amostras que incluem normalmente misturas complexas de diferentes componentes. As células nas amostras coletadas são normalmente lisadas para liberar o conteúdo celular. Por exemplo, C. trachomatis e outras células na amostra específica podem ser lisadas por contato com várias enzimas, produtos químicos e/ou lisadas por outras abordagens conhecidas na técnica, que degradam, por exemplo, as paredes celulares bacterianas. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos são analisados diretamente no lisado celular. Em outras modalidades, os ácidos nucleicos são ainda purificados ou extraídos dos lisados celulares antes da detecção. Essencialmente, quaisquer métodos de extração de ácido nucleico podem ser usados para purificar ácidos nucleicos nas amostras utilizadas nos métodos da presente invenção. Exemplos de técnicas que podem ser usadas para purificar ácidos nucleicos incluem, por exemplo, cromatografia de afinidade, hibridização em sondas imobilizadas em suportes sólidos, extração líquido-líquido, (por exemplo, extração com fenol-clorofórmio, etc.), precipitação (por exemplo, usando etanol, etc.), extração em papel-filtro, extração com reagentes formadores de micela (por exemplo, cetil-trimetil-amônio-brometo, etc.), ligação a corantes intercalantes imobilizados (por exemplo, brometo de etídio, acridina, etc.), adsorção em sílica-gel ou terra diatômica, adsorção em partículas de vidro ou partículas de organossilano em condições caotrópicas, e/ou similares. O processamento de amostra também é descrito, por exemplo, na Patente US Nº 5,155,018, 6,383,393 e 5,234,809, que estão incorporadas por referência.
[0050] Uma amostra de teste pode, opcionalmente, ter sido tratada e/ou purificada de acordo com qualquer prática conhecida por versados na técnica, para melhorar a eficiência da amplificação e/ou precisão qualitativa e/ou precisão quantitativa. A amostra pode, assim, exclusiva, ou essencialmente, consistir em ácidos nucleicos, sejam eles obtidos por purificação, isolamento ou por síntese química. Estão disponíveis, para os versados na técnica, meios para isolar ou purificar ácidos nucleicos a partir de uma amostra de teste, tais como DNA, por exemplo, para isolar ou purificar DNA de raspados cervicais (por exemplo, QIAamp- DNA Mini-Kit; Qiagen, Hilden, Alemanha). EXEMPLOS: Exemplo 1: Seleção de alvo e desenho de sonda de primer
[0051] Considerando o nível constitutivo e elevado de expressão dos genes ribossomais em células bacterianas, esses genes foram escolhidos como alvos para o ensaio de amplificação, especificamente os genes 16S e 23S.
[0052] As sequências de genes 16S e 23S para múltiplos sorovares de C. trachomatis, espécies intimamente relacionadas, tais como Chlamydophila pneumoniae e Chlamydia psittaci, e para outras espécies comumente encontradas na urina ou fluido vaginal, foram recuperadas do banco de dados NCBI. As sequências foram alinhadas usando Clustal omega (Sievers, et al. 2011. Molecular Systems Biology 7:539) e regiões com bases específicas exclusivas para a espécie C. trachomatis foram identificadas. Os primers de amplificação mediada por alça foram desenhados usando LAMP designer (Premier Biosoft). Para maior especificidade, molecular beacons ou sondas direcionadas aos produtos amplificados foram desenhados manualmente ou usando o Beacon designer (Premier Biosoft). Conjuntos de primers desenhados e beacons foram analisados adicionalmente quanto à especificidade usando BLAST contra o genoma humano e o banco de dados de nucleotídeos do NCBI. Vários conjuntos de primers e sondas foram desenhados e triados quanto à velocidade de reação.
[0053] Os conjuntos de primer da invenção estão resumidos na Tabela 2, que incluem, no mínimo, um primer forward interno (FIP) e um primer backward interno (BIP). Adicionalmente, os conjuntos de primer normalmente também incluem pelo menos dois primers adicionais selecionados dentre o primer forward externo (F3), primer backward externo (B3), primer forward de alça (LF) e primer backward de alça (LB). TABELA 2: Conjuntos de Primer de LAMP Conjunto F3 B3 FIP BIP LF LB Conjunto- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID 1 NO: 1 NO: 2 NO: 3 4 NO: 5 NO: 6 Conjunto- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID 2 NO: 7 NO: 8 NO: 9 10 NO: 11 NO: 12 Conjunto- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID 3 NO: 13 NO: 14 NO: 15 16 NO: 17 NO: 18 Conjunto- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID 4 NO: 19 NO: 20 NO: 21 22 NO: 23 NO: 24 Conjunto- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID 5 NO: 25 NO: 26 NO: 27 28 NO: 29 NO: 30 Conjunto- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID 6 NO: 31 NO: 32 NO: 33 34 NO: 35 NO: 36 Conjunto- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID 7 NO: 37 NO: 38 NO: 39 40 NO: 41 NO: 42 Conjunto- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID 8 NO: 43 NO: 44 NO: 45 46 NO: 47 NO: 48 Conjunto- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID 9 NO: 49 NO: 52 NO: 50 53 NO: 51 NO: 54 Conjunto- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID 10 NO: 55 NO: 58 NO: 56 59 NO: 57 NO: 60 Conjunto- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID 11 NO: 49 NO: 62 NO: 61 53 NO: 51 NO: 63 Conjunto- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID 12 NO: 64 NO: 65 NO: 66 67 NO: 68 NO: 69 Conjunto- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID 13 NO: 70 NO: 71 NO: 72 73 NO: 74 NO: 75 Conjunto- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID 14 NO: 81 NO: 82 NO: 83 84 NO: 76 NO: 86 Conjunto- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID 15 NO: 81 NO: 82 NO: 83 84 NO: 77 NO: 86 Conjunto- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID 16 NO: 81 NO: 82 NO: 83 84 NO: 78 NO: 86 Conjunto- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID 17 NO: 81 NO: 82 NO: 83 84 NO: 79 NO: 86 Conjunto- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID 18 NO: 81 NO: 82 NO: 83 84 NO: 80 NO: 86 Conjunto- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID 19 NO: 87 NO: 82 NO: 89 84 NO: 91 NO: 86 Conjunto- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID 20 NO: 81 NO: 82 NO: 83 84 NO: 85 NO: 86 Conjunto- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID 21 NO: 87 NO: 88 NO: 89 90 NO: 91 NO: 92 Conjunto- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID 22 NO: 87 NO: 82 NO: 89 84 NO: 76 NO: 86
Conjunto F3 B3 FIP BIP LF LB Conjunto- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID 23 NO: 87 NO: 82 NO: 93 84 NO: 76 NO: 86 Conjunto- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID 24 NO: 87 NO: 82 NO: 94 84 NO: 76 NO: 86 Conjunto- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID 25 NO: 87 NO: 82 NO: 89 95 NO: 91 NO: 92 Conjunto- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID 26 NO: 87 NO: 82 NO: 93 95 NO: 76 NO: 92 Conjunto- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: SEQ ID SEQ ID 27 NO: 87 NO: 82 NO: 94 95 NO: 76 NO: 92 Conjunto- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: --- --- 28 NO: 1 NO: 2 NO: 3 4 Conjunto- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: --- --- 29 NO: 7 NO: 8 NO: 9 10 Conjunto- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: --- --- 30 NO: 13 NO: 14 NO: 15 16 Conjunto- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: --- --- 31 NO: 19 NO: 20 NO: 21 22 Conjunto- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: --- --- 32 NO: 25 NO: 26 NO: 27 28 Conjunto- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: --- --- 33 NO: 31 NO: 32 NO: 33 34 Conjunto- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: --- --- 34 NO: 37 NO: 38 NO: 39 40 Conjunto- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: --- --- 35 NO: 43 NO: 44 NO: 45 46 Conjunto- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: --- --- 36 NO: 49 NO: 52 NO: 50 53 Conjunto- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: --- --- 37 NO: 55 NO: 58 NO: 56 59 Conjunto- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: --- --- 38 NO: 49 NO: 62 NO: 61 53 Conjunto- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: --- --- 39 NO: 64 NO: 65 NO: 66 67 Conjunto- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: --- --- 40 NO: 70 NO: 71 NO: 72 73 Conjunto- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: --- --- 41 NO: 81 NO: 82 NO: 83 84 Conjunto- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: --- --- 42 NO: 81 NO: 82 NO: 83 84 Conjunto- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: --- --- 43 NO: 81 NO: 82 NO: 83 84 Conjunto- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: --- --- 44 NO: 81 NO: 82 NO: 83 84 Conjunto- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: --- --- 45 NO: 81 NO: 82 NO: 83 84 Conjunto- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: --- --- 46 NO: 87 NO: 82 NO: 89 84 Conjunto- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: --- --- 47 NO: 81 NO: 82 NO: 83 84 Conjunto- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: --- --- 48 NO: 87 NO: 88 NO: 89 90
Conjunto F3 B3 FIP BIP LF LB Conjunto- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: --- --- 49 NO: 87 NO: 82 NO: 89 84 Conjunto- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: --- --- 50 NO: 87 NO: 82 NO: 93 84 Conjunto- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: --- --- 51 NO: 87 NO: 82 NO: 94 84 Conjunto- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: --- --- 52 NO: 87 NO: 82 NO: 89 95 Conjunto- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: --- --- 53 NO: 87 NO: 82 NO: 93 95 Conjunto- SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: --- --- 54 NO: 87 NO: 82 NO: 94 95 Conjunto- --- --- SEQ ID SEQ ID NO: --- --- 55 NO: 3 4 Conjunto- --- --- SEQ ID SEQ ID NO: --- --- 56 NO: 9 10 Conjunto- --- --- SEQ ID SEQ ID NO: --- --- 57 NO: 15 16 Conjunto- --- --- SEQ ID SEQ ID NO: --- --- 58 NO: 21 22 Conjunto- --- --- SEQ ID SEQ ID NO: --- --- 59 NO: 27 28 Conjunto- --- --- SEQ ID SEQ ID NO: --- --- 60 NO: 33 34 Conjunto- --- --- SEQ ID SEQ ID NO: --- --- 61 NO: 39 40 Conjunto- --- --- SEQ ID SEQ ID NO: --- --- 62 NO: 45 46 Conjunto- --- --- SEQ ID SEQ ID NO: --- --- 63 NO: 50 53 Conjunto- --- --- SEQ ID SEQ ID NO: --- --- 64 NO: 56 59 Conjunto- --- --- SEQ ID SEQ ID NO: --- --- 65 NO: 61 53 Conjunto- --- --- SEQ ID SEQ ID NO: --- --- 66 NO: 66 67 Conjunto- --- --- SEQ ID SEQ ID NO: --- --- 67 NO: 72 73 Conjunto- --- --- SEQ ID SEQ ID NO: --- --- 68 NO: 83 84 Conjunto- --- --- SEQ ID SEQ ID NO: --- --- 69 NO: 83 84 Conjunto- --- --- SEQ ID SEQ ID NO: --- --- 70 NO: 83 84 Conjunto- --- --- SEQ ID SEQ ID NO: --- --- 71 NO: 83 84 Conjunto- --- --- SEQ ID SEQ ID NO: --- --- 72 NO: 83 84 Conjunto- --- --- SEQ ID SEQ ID NO: --- --- 73 NO: 89 84 Conjunto- --- --- SEQ ID SEQ ID NO: --- --- 74 NO: 83 84
Conjunto F3 B3 FIP BIP LF LB Conjunto- --- --- SEQ ID SEQ ID NO: --- --- 75 NO: 89 90 Conjunto- --- --- SEQ ID SEQ ID NO: --- --- 76 NO: 89 84 Conjunto- --- --- SEQ ID SEQ ID NO: --- --- 77 NO: 93 84 Conjunto- --- --- SEQ ID SEQ ID NO: --- --- 78 NO: 94 84 Conjunto- --- --- SEQ ID SEQ ID NO: --- --- 79 NO: 89 95 Conjunto- --- --- SEQ ID SEQ ID NO: --- --- 80 NO: 93 95 Conjunto- --- --- SEQ ID SEQ ID NO: --- --- 81 NO: 94 95 Exemplo 2: Cinética da reação de amplificação
[0054] Uma matriz de urina negativa foi contaminada com C. trachomatis titulada (cepa Z054, D-UW3 (Zeptometrix) ou ATCC sorovar D cepa VR-885) em duas concentrações diferentes (103 UFI/mL e 10 UFI/mL). Os ácidos nucleicos foram extraídos usando métodos de extração padrão e a amostra foi amplificada usando conjuntos de primers de LAMP conforme descrito na Tabela 2. O corante YoProTM (Life Technologies; coloração de ácido nucleico por carbocianina verde fluorescente) foi usado para a detecção do produto amplificado. Neste exemplo, uma reação de 25 µl continha Tampão de Amplificação Isotérmico 1X (New England Biolabs) complementado com 4,8 mM ou 6 mM MgCl2, 1,4 mM ou 1,6 mM dNTP, 200nM corante YO-PRO-1 (Life Technologies), primers (0,2 µM de F3 e B3, quando presentes; 1,6 µM de FIP e BIP; 0,4-0,8 µM de LF e LB, quando presentes), 8 ou 12 unidades de Bst2 polimerase (New England Biolabs), 7,5 unidades de RTx Warmstart (transcriptase reversa; New England Biolabs), e o ácido nucleico extraído (como modelo) ou água (como nenhum controle do modelo). As reações foram incubadas a 63° ou 65°C e a cinética foi monitorada usando um Roche real- time Lightcycler96 (Roche).
[0055] Este exemplo mostra que usando este conjunto de primers e o método de amplificação mediada por alça, uma cinética de amplificação rápida é alcançada. Os resultados estão resumidos na Tabela 3, na qual o Tempo para Positivar (Tp) foi calculado pelo instrumento. NT indica concentrações não testadas. Os resultados são classificados pelo tempo para positivar (NT significa “não testado” e “sem classificação” indica que nenhuma amplificação foi detectada).
TABELA 3: Tempo para Positivar com Detecção por Corante Tp Tp 10 primers 3 NTC 10 UFI/mL UFI/mL Conjunto-1 6,1 7,8 25,12 Conjunto-2 8,6 10,8 36,81 Conjunto-3 6,6 9,1 28,59 Conjunto-4 8,2 19,8 36,77 Conjunto-5 7,9 11,1 31,42 Conjunto-6 8,8 12,2 38,28 Conjunto-7 11,0 14,4 21,05 Conjunto-8 10,9 14,2 19,86 Conjunto-9 NT 7,0 42,89 Conjunto-10 NT 6,8 32,68 Conjunto-11 NT 11,0 27,34 Conjunto-12 4,1 6,54 48,03 Conjunto-13 7,3 10,13 46,55 Conjunto-14 4,4 5,18 29,24 Conjunto-15 4,6 5,21 20,34 Conjunto-16 4,6 5,40 43,24 Conjunto-17 4,5 5,36 23,37 Conjunto-18 3,9 6,00 23,78 Exemplo 3: Efeito da localização do design do beacon sobre a cinética do ensaio
[0056] As reações de amplificação contendo alguns dos conjuntos de primers acima e o corante intercalante resultaram na detecção de um produto de amplificação ao usar água ou extração negativa de urina ou o DNA de espécies estreitamente relacionadas, tais como C. pneumoniae ou C. psittaci como modelos em frequências variando entre 0% e 75% do tempo (Tabela 4), dentro de intervalos variáveis de nossa janela de corte para o tempo de ensaio. Os resultados são classificados pelo tempo para positivar (“sem classificação” indica que nenhuma amplificação foi detectada). TABELA 4: Reatividade Cruzada - Detecção por Corante Conjunto de NTC (água) DNA de C. DNA de C. Primer pneumoniae psittaci 1 de 1 de Conjunto-9 42,9 15,2 NT -- 2 1 1 de 1 de Conjunto-10 32,7 9,4 NT -- 2 1 1 de 1 de Conjunto-11 27,3 18,0 NT -- 2 1
[0057] Para maior especificidade, molecular beacons foram projetados ao longo desses conjuntos de primers para garantir que apenas o sinal do alvo de C. trachomatis fosse detectado (sequências listadas na tabela 5). Cada molecular beacon foi projetado com modificações de 5′ fluoróforo/3′ supressor (6- Carboxifluoresceína (FAM) e Black Hole Quencher 1 (BHQ1)) incluídas para proporcionar detecção fluorescente específica do alvo. TABELA 5: Sequências de Sonda Sequência ID Fluoróforo Supressor Sequência (5' para 3')
ID CGCGCACATCTGGAAAGATGGATG SEQ ID NO: MB1 FAM BHQ1 ATACAGGGTGCGCG 97 CGTCCAGGACTCCTAGTTGAACACA SEQ ID NO: MB2 FAM BHQ1 TCTGGACG 98 CCGGATCAGGACTCCTAGTTGAACA SEQ ID NO: MB3 FAM BHQ1 CATCTGATCCGG 99 CGGCCAGGACTCCTAGTTGAACAC SEQ ID NO: MB4 FAM BHQ1 ATCTGGCCG 100 CGTCCGGATCAGGACTCCTAGTTGA SEQ ID NO: MB5 FAM BHQ1 ACACCGGACG 101 CTCGCCACGTGAAACCTAGTCTGAA SEQ ID NO: MB6 FAM BHQ1 TCTGGCGAG 102 CCGTGGATGATACAGGGTGATAGT SEQ ID NO: MB7 FAM BHQ1 CCACGG 103 CGTGGGATGATACAGGGTGATAGT SEQ ID NO: MB8 FAM BHQ1 CCCACG 104 CGGCTCGAGATTCCCTGTGTAGCG SEQ ID NO: MB9 FAM BHQ1 GCGAGCCG 105 MB1 CGCCAGGATCAGGACTCCTAGTTG SEQ ID NO: FAM BHQ1 0 AACCTGGCG 106 MB1 CACCGGGATGATACAGGGTGATAG SEQ ID NO: FAM BHQ1 1 TCCCGGTC 107 MB1 CACCGGGATGATACAGGGTGATAG SEQ ID NO: FAM BHQ1 2 TCCCGGTG 108 MB1 TCGCGGGATGATACAGGGTGATAG SEQ ID NO: FAM BHQ1 3 TCCCGCGG 109 MB1 CAGCGGGATCAGGACTCCTAGTTG SEQ ID NO: FAM BHQ1 4 AACCCGCTG 110 MB1 CACGCTCGAGATTCCCTGTGTAGCG SEQ ID NO: FAM BHQ1 5 GCGAGCGTG 111 MB1 CAGGCGGATCAGGACTCCTAGTTG SEQ ID NO: FAM BHQ1 6 AACACCGCCTG 112 MB1 CAGCGACAGAAATCGAAGAGATTC SEQ ID NO: FAM BHQ1 7 CCTGTGTCGCTG 113 MB1 CACGGGATGATACAGGGTGATAGT SEQ ID NO: FAM BHQ1 8 CCCGTC 114 MB1 CACGGGATGATACAGGGTGATAGT SEQ ID NO: FAM BHQ1 9 CCCGTG 115 MB2 FAM BHQ1 CACGATGGATGATACAGGGTGATA SEQ ID NO:
Sequência ID Fluoróforo Supressor Sequência (5' para 3')
ID 0 GTCCATCGTG 116 MB2 CACCGATGGATGATACAGGGTGAT SEQ ID NO: FAM BHQ1 1 AGTCCCATCGGTG 117 MB2 CGCGATCGAGGATAAAGGATCAGG SEQ ID NO: FAM BHQ1 2 ACTCGATCGCG 118 MB2 CGCGATCATTGAGGATAAAGGATCA SEQ ID NO: FAM BHQ1 3 GGACTGATCGCG 119 MB2 CGCGATCCTCCTAGTTGAACACATC SEQ ID NO: FAM BHQ1 4 TGGAGATCGCG 120 MB2 CGCGATCAGGACTCCTAGTTGAACA SEQ ID NO: FAM BHQ1 5 CATCTGGATCGCG 121 MB2 CGCGACTCAGGACTCCTAGTTGAAC SEQ ID NO: FAM BHQ1 6 ACATCTGGAGTCGCG 122 MB2 CGCGATCCGGATAAAGGATCAGGA SEQ ID NO: FAM BHQ1 7 CTCCTAGTTGGGATCGCG 123 MB2 CGCGAGTAGGATTGAGGATAAAGG SEQ ID NO: FAM BHQ1 8 ATCAGGACTCGCG 124 MB2 CGCGATCCCTGTGTAGCGGCGAGC SEQ ID NO: FAM BHQ1 9 GAGATCGCG 125 MB3 CGCGATCCTGTGTAGCGGCGAGCG SEQ ID NO: FAM BHQ1 0 AAAGATCGCG 126 MB3 CGGCTCGGGGTTGTAGGATTGAGG SEQ ID NO: FAM BHQ1 1 ATACGAGCCG 127 MB3 CCGGAGCCTACAACCCCGAGCCTT SEQ ID NO: FAM BHQ1 2 ATCAGCTCCGG 128 MB3 GCGCAGCTCGGTTTAGGCTATTCCC SEQ ID NO: FAM BHQ1 3 CTGCGCG 129 MB3 CGCGGTCTCTCCTTTCGTCTACGGG SEQ ID NO: FAM BHQ1 4 ACCGCG 130 MB3 CGCAGTGAGAGAAAGACCGACCTC SEQ ID NO: FAM BHQ1 5 AACACTGCG 131
[0058] Uma matriz de urina negativa foi contaminada com C. trachomatis titulada (cepa Z054, D-UW3 (Zeptometrix) ou ATCC sorovar D cepa VR-885) em duas concentrações diferentes (103 UFI/mL e 10 UFI/mL). Os ácidos nucleicos foram extraídos usando métodos de extração padrão e a amostra foi amplificada usando um conjunto de primer de LAMP (conforme a Tabela 2) e um dos molecular beacons (conforme a Tabela 4) foi usado para a detecção do produto amplificado. Neste exemplo, uma reação de 25 µl continha Tampão de Amplificação Isotérmico 1X (New England Biolabs) complementado com 4,8 mM ou 6 mM MgCl 2, 1,4 mM ou 1,6 mM dNTP, 200nM molecular beacon (Sigma-Aldrich), primers (0,2 µM de F3 e B3, se presentes; 1,6 µM ou 2 µM de FIP e BIP; 0,4-0,8 µM de LF e LB, se presentes), 8 ou 12 unidades de Bst2 polimerase (New England Biolabs), 7,5 unidades de RTx Warmstart (transcriptase reversa; New England Biolabs), e o ácido nucleico extraído (como modelo) ou água (como nenhum controle do modelo). As reações foram incubadas a 63°C e a cinética foi monitorada usando um Roche real-time Lightcycler96 (Roche). O tempo para positivar para cada combinação de primer-sonda está relatado na Tabela 6. Os resultados são classificados pelo tempo para positivar (Tp) a partir do início da reação da seguinte forma: "NT" indica que esta combinação não foi testada e "sem classificação" indica que nenhuma amplificação foi detectada.
TABELA 6: Tempo para Positivar com Detecção por Sonda 10 NTC Primers Beacon 103 UFI/mL UFI/mL sem Conjunto-12 MB1 5,6 7,6 classificação sem Conjunto-12 MB2 4,8 6,7 classificação sem Conjunto-12 MB3 5,2 7,2 classificação sem Conjunto-12 MB4 6,3 8,4 classificação sem Conjunto-12 MB5 5,6 7,4 classificação sem Conjunto-13 MB2 14,6 20,9 classificação sem Conjunto-13 MB6 8,9 11.2 classificação sem Conjunto-14 MB11 4,8 6,7 classificação sem Conjunto-14 MB12 5,2 6,7 classificação sem Conjunto-14 MB13 5,1 6,9 classificação sem Conjunto-14 MB15 5,5 7,0 classificação sem Conjunto-14 MB18 4,8 6,5 classificação sem Conjunto-14 MB19 5,8 7,3 classificação sem Conjunto-14 MB2 4,9 6,5 classificação sem Conjunto-14 MB7 4,8 6,3 classificação sem Conjunto-14 MB8 4,9 6,7 classificação sem Conjunto-14 MB9 5,2 7,0 classificação
10 NTC Primers Beacon 103 UFI/mL UFI/mL sem Conjunto-15 MB2 4,4 6,4 classificação sem Conjunto-16 MB2 4,2 7,4 classificação sem Conjunto-17 MB2 4,3 6,0 classificação sem Conjunto-18 MB2 4,8 6,6 classificação sem Conjunto-19 MB11 6,0 8,0 classificação sem Conjunto-19 MB12 5,9 7,9 classificação sem Conjunto-19 MB13 5,9 8,0 classificação sem Conjunto-19 MB18 5,6 7,4 classificação sem Conjunto-19 MB19 6,6 8,7 classificação sem Conjunto-19 MB2 4,7 6,6 classificação sem Conjunto-19 MB20 5,7 7,7 classificação sem Conjunto-19 MB21 5,7 7,6 classificação Conjunto-20 sem MB11 5,2 7,3 classificação Conjunto-20 sem MB12 5,2 6,7 classificação Conjunto-20 sem MB13 4,9 6,7 classificação Conjunto-20 sem MB15 5,1 7,2 classificação Conjunto-20 sem MB18 4,7 6,7 classificação Conjunto-20 sem MB19 5,5 7,3 classificação Conjunto-20 sem MB20 5,6 7,2 classificação Conjunto-20 sem MB21 5,1 7,2 classificação Conjunto-20 sem MB3 5,8 7,7 classificação Conjunto-20 MB4 5,0 6,7 32,7 Conjunto-20 sem MB7 5,0 6,8 classificação Conjunto-20 sem MB8 5,0 6,9 classificação Conjunto-20 sem MB9 4,9 7,1 classificação Conjunto-21 MB10 6,8 8,5 sem
10 NTC Primers Beacon 103 UFI/mL UFI/mL classificação sem Conjunto-21 MB14 6,7 8,9 classificação sem Conjunto-21 MB16 6,4 8,4 classificação sem Conjunto-21 MB17 2,7 3,5 classificação sem Conjunto-21 MB3 8,2 10,3 classificação sem Conjunto-21 MB4 6,9 8,9 classificação sem Conjunto-22 MB19 7,3 9,3 classificação sem Conjunto-23 MB19 11,8 14,8 classificação sem Conjunto-24 MB19 6,5 8,4 classificação sem Conjunto-24 MB20 6,3 8,3 classificação sem Conjunto-24 MB21 5,9 8,1 classificação sem Conjunto-25 MB19 7,3 9,7 classificação sem Conjunto-25 MB20 7,6 10,0 classificação sem Conjunto-25 MB21 7,2 8,4 classificação Conjunto-26 MB19 19,0 25,5 41,4 sem Conjunto-27 MB19 7,9 10,0 classificação sem Conjunto-76 MB19 17,3 NT classificação sem Conjunto-78 MB19 12,2 NT classificação sem Conjunto-79 MB19 28,6 NT classificação sem Conjunto-81 MB19 22,1 NT classificação
[0059] O uso de Molecular Beacons para detecção resultou em um ligeiro aumento no Tp da reação, no entanto, o aumento significativo na especificidade do ensaio gerou um dilema razoável, nenhuma amplificação foi observada na amostra de água ou DNA a partir de uma espécie relacionada próxima dentro do período de teste de 45 min (vide o Exemplo 4, Tabela 7). Exemplo 4: Teste de Especificidade
[0060] Uma matriz de urina negativa foi contaminada com C. trachomatis titulada ou com organismos comumente associados a infecções sexualmente transmissíveis (por exemplo, Neisseria gonorrhoeae) ou espécies estreitamente relacionadas a C. trachomatis (C. pneumonia ou C. psittaci). As linhagens bacterianas foram diluídas em série em PBS antes da adição à matriz de urina na concentração desejada. Os ácidos nucleicos extraídos ou DNAs correspondentes das espécies de teste foram usados como modelos nas reações de RT-LAMP contendo os primers de LAMP e a sonda tipo molecular beacon, de acordo com os métodos descritos no Exemplo 3, acima. NT indica reações não testadas. TABELA 7: Reatividade Cruzada - Detecção por Sonda 103 10 C. N. Primers Beacon C. psittaci NTC UFI/mL UFI/mL pneumoniae gonorrhoeae Conjunto- MB2 4,4 6,2 13,5 13,2 20,2 19,6 14 Conjunto- MB11 NT 6,7 18,6 14,4 32,1 23,3 14 Conjunto- MB2 4,7 7,0 22,5 23,5 21,8 21,1 20 Conjunto- MB11 NT 6,7 26,4 27,1 27,8 20,4 20 Conjunto- MB2 sem sem sem sem 6,6 8,6 21 classificação classificação classificação classificação Conjunto- sem sem sem sem MB19 NT 8,1 19 classificação classificação classificação classificação Conjunto- sem sem MB19 NT 7,8 33,4 28,6 20 classificação classificação Conjunto- sem sem MB19 NT 7,3 20,1 14,9 14 classificação classificação
[0061] Este exemplo mostra que o ensaio CT23S e sua formulação de reação podem ser projetados para serem altamente específicos, limitando a reatividade cruzada com sequências de organismos estreitamente relacionados e aqueles comumente associados a infecções sexualmente transmissíveis. Exemplo 5: Teste de Sensibilidade
[0062] Um padrão molecular de RNA foi diluído em várias concentrações para avaliar a sensibilidade das combinações indicadas de conjunto de primer/molecular beacon (Tabela 8). Os padrões foram diluídos em série com 0,1mg/mL RNA carreador Poli A em PBS (Sigma) e usados como modelo para a amplificação em reações de RTLAMP. As concentrações finais nas reações foram de 40, 8 ou 4 cópias/uL. As condições de reação foram equivalentes às descritas acima no Exemplo 3. O sinal de amplificação foi obtido com concentrações tão baixas quanto 4 cópias/uL (vide a Tabela 8). TABELA 8: Sensibilidade com LAMP e Molecular Beacon
Conjunto de Primer Beacon 40 cópias/uL 8 cópias/uL 4 cópias/uL Conjunto-14 MB2 6,5 7,6 12,3 Conjunto-20 MB2 6,5 7,8 9,9

Claims (104)

REIVINDICAÇÕES
1. Composição caracterizada pelo fato de que compreende um conjunto de polinucleotídeo selecionado do grupo consistindo no Conjunto-20, Conjunto-24, Conjunto-47, Conjunto-51, Conjunto-74 e Conjunto-78.
2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende ainda uma sonda.
3. Composição, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a sonda é um polinucleotídeo marcado.
4. Composição, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo marcado compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo nos nucleotídeos 5-34 da SEQ ID NO: 97, nucleotídeos 5-31 da SEQ ID NO: 98, nucleotídeos 3-31 da SEQ ID NO: 99, nucleotídeos 5-30 da SEQ ID NO: 100, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 101, nucleotídeos 5-26 da SEQ ID NO: 103, nucleotídeos 4-27 da SEQ ID NO: 104, nucleotídeos 7-30 da SEQ ID NO: 105, nucleotídeos 5-27 da SEQ ID NO: 106, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 107, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 108, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 109, nucleotídeos 6-30 da SEQ ID NO: 110, nucleotídeos 8-31 da SEQ ID NO: 111, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 112, nucleotídeos 8-31 da SEQ ID NO: 113, nucleotídeos 5-29 da SEQ ID NO: 114, nucleotídeos 5-29 da SEQ ID NO: 115, nucleotídeos 4-28 da SEQ ID NO: 116, nucleotídeos 5-30 da SEQ ID NO: 117, nucleotídeos 8-28 da SEQ ID NO: 118, nucleotídeos 8-30 da SEQ ID NO: 119, nucleotídeos 8-29 da SEQ ID NO: 120, nucleotídeos 4-33 da SEQ ID NO: 121, nucleotídeos 7-34 da SEQ ID NO: 122, nucleotídeos 9-34 da SEQ ID NO: 123, nucleotídeos 8-34 da SEQ ID NO: 124, nucleotídeos 6-28 da SEQ ID NO: 125, nucleotídeos 7-28 da SEQ ID NO: 126, nucleotídeos 3-27 da SEQ ID NO: 127, nucleotídeos 7-32 da SEQ ID NO: 128, nucleotídeos 4-27 da SEQ ID NO: 129, e nucleotídeos 6-27 da SEQ ID NO: 130.
5. Composição, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a sonda é um molecular beacon (sonda de hibridização) que compreende um fluoróforo, um supressor e um polinucleotídeo.
6. Composição, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o molecular beacon compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo nos nucleotídeos 5-34 da SEQ ID NO: 97, nucleotídeos 5-31 da SEQ
ID NO: 98, nucleotídeos 3-31 da SEQ ID NO: 99, nucleotídeos 5-30 da SEQ ID NO: 100, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 101, nucleotídeos 5-26 da SEQ ID NO: 103, nucleotídeos 4-27 da SEQ ID NO: 104, nucleotídeos 7-30 da SEQ ID NO: 105, nucleotídeos 5-27 da SEQ ID NO: 106, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 107, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 108, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 109, nucleotídeos 6-30 da SEQ ID NO: 110, nucleotídeos 8-31 da SEQ ID NO: 111, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 112, nucleotídeos 8-31 da SEQ ID NO: 113, nucleotídeos 5-29 da SEQ ID NO: 114, nucleotídeos 5-29 da SEQ ID NO: 115, nucleotídeos 4-28 da SEQ ID NO: 116, nucleotídeos 5-30 da SEQ ID NO: 117, nucleotídeos 8-28 da SEQ ID NO: 118, nucleotídeos 8-30 da SEQ ID NO: 119, nucleotídeos 8-29 da SEQ ID NO: 120, nucleotídeos 4-33 da SEQ ID NO: 121, nucleotídeos 7-34 da SEQ ID NO: 122, nucleotídeos 9-34 da SEQ ID NO: 123, nucleotídeos 8-34 da SEQ ID NO: 124, nucleotídeos 6-28 da SEQ ID NO: 125, nucleotídeos 7-28 da SEQ ID NO: 126, nucleotídeos 3-27 da SEQ ID NO: 127, nucleotídeos 7-32 da SEQ ID NO: 128, nucleotídeos 4-27 da SEQ ID NO: 129, e nucleotídeos 6-27 da SEQ ID NO: 130.
7. Composição, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o molecular beacon compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 97-101 e 103-130.
8. Composição, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a sequência polinucleotídica consiste na SEQ ID NO: 115.
9. Molecular beacon caracterizado pelo fato de que compreende um fluoróforo, um supressor e um polinucleotídeo, em que o polinucleotídeo compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo nos nucleotídeos 5- 34 da SEQ ID NO: 97, nucleotídeos 5-31 da SEQ ID NO: 98, nucleotídeos 3-31 da SEQ ID NO: 99, nucleotídeos 5-30 da SEQ ID NO: 100, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 101, nucleotídeos 5-26 da SEQ ID NO: 103, nucleotídeos 4-27 da SEQ ID NO: 104, nucleotídeos 7-30 da SEQ ID NO: 105, nucleotídeos 5-27 da SEQ ID NO: 106, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 107, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 108, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 109, nucleotídeos 6-30 da SEQ ID NO: 110, nucleotídeos 8-31 da SEQ ID NO: 111, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 112, nucleotídeos 8-31 da SEQ ID NO: 113, nucleotídeos 5-29 da SEQ ID NO: 114, nucleotídeos 5-29 da SEQ ID NO: 115, nucleotídeos 4-28 da SEQ ID NO: 116,
nucleotídeos 5-30 da SEQ ID NO: 117, nucleotídeos 8-28 da SEQ ID NO: 118, nucleotídeos 8-30 da SEQ ID NO: 119, nucleotídeos 8-29 da SEQ ID NO: 120, nucleotídeos 4-33 da SEQ ID NO: 121, nucleotídeos 7-34 da SEQ ID NO: 122, nucleotídeos 9-34 da SEQ ID NO: 123, nucleotídeos 8-34 da SEQ ID NO: 124, nucleotídeos 6-28 da SEQ ID NO: 125, nucleotídeos 7-28 da SEQ ID NO: 126, nucleotídeos 3-27 da SEQ ID NO: 127, nucleotídeos 7-32 da SEQ ID NO: 128, nucleotídeos 4-27 da SEQ ID NO: 129, e nucleotídeos 6-27 da SEQ ID NO: 130.
10. Molecular beacon, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 97-101 e 103-130.
11. Composição, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a sequência polinucleotídica consiste na SEQ ID NO: 115.
12. Molecular beacon, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o fluoróforo é FAM e o supressor é BHQ1.
13. Método de detecção de Chlamydia trachomatis em uma amostra de teste, sendo o método caracterizado pelo fato de que compreende: (a) extrair o ácido nucleico da amostra de teste; (b) amplificar uma sequência alvo por reação do ácido nucleico extraído na etapa (a) com uma mistura de reação compreendendo uma DNA polimerase de deslocamento de fita e um conjunto de primer de sequência específica, em que o referido conjunto de primer de sequência específica é selecionado do grupo consistindo no Conjunto-20, Conjunto-24, Conjunto-47, Conjunto-51, Conjunto-74 e Conjunto-78; e (c) detectar a presença ou ausência de um produto amplificado da etapa (b); em que a presença do referido produto de amplificação é indicativa da presença de Chlamydia trachomatis na amostra de teste.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a amplificação na etapa (b) da sequência alvo é realizada entre cerca de 60°C e cerca de 67°C por menos de quinze minutos.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a etapa de amplificação é realizada por menos de dez minutos.
16. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a mistura de reação compreende ainda uma transcriptase reversa.
17. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a detecção da presença ou ausência do produto de amplificação compreende a hibridização do produto amplificado com uma sonda que compreende um polinucleotídeo ligado a um marcador.
18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo marcado compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo nos nucleotídeos 5-34 da SEQ ID NO: 97, nucleotídeos 5-31 da SEQ ID NO: 98, nucleotídeos 3-31 da SEQ ID NO: 99, nucleotídeos 5-30 da SEQ ID NO: 100, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 101, nucleotídeos 5-26 da SEQ ID NO: 103, nucleotídeos 4-27 da SEQ ID NO: 104, nucleotídeos 7-30 da SEQ ID NO: 105, nucleotídeos 5-27 da SEQ ID NO: 106, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 107, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 108, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 109, nucleotídeos 6-30 da SEQ ID NO: 110, nucleotídeos 8-31 da SEQ ID NO: 111, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 112, nucleotídeos 8-31 da SEQ ID NO: 113, nucleotídeos 5-29 da SEQ ID NO: 114, nucleotídeos 5-29 da SEQ ID NO: 115, nucleotídeos 4-28 da SEQ ID NO: 116, nucleotídeos 5-30 da SEQ ID NO: 117, nucleotídeos 8-28 da SEQ ID NO: 118, nucleotídeos 8-30 da SEQ ID NO: 119, nucleotídeos 8-29 da SEQ ID NO: 120, nucleotídeos 4-33 da SEQ ID NO: 121, nucleotídeos 7-34 da SEQ ID NO: 122, nucleotídeos 9-34 da SEQ ID NO: 123, nucleotídeos 8-34 da SEQ ID NO: 124, nucleotídeos 6-28 da SEQ ID NO: 125, nucleotídeos 7-28 da SEQ ID NO: 126, nucleotídeos 3-27 da SEQ ID NO: 127, nucleotídeos 7-32 da SEQ ID NO: 128, nucleotídeos 4-27 da SEQ ID NO: 129, e nucleotídeos 6-27 da SEQ ID NO: 130.
19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo marcado compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 97-101 e 103-130.
20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a sequência do polinucleotídeo marcado é SEQ ID NO: 115.
21. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a Chlamydia trachomatis está presente na amostra de teste numa concentração de ≤ 100 UFI/mL.
22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a Chlamydia trachomatis está presente na amostra de teste numa concentração de ≤ 5 UFI/ml e a etapa de amplificação é realizada por menos de 15 minutos.
23. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a Chlamydia trachomatis está presente na amostra de teste numa concentração de ≤ 10 UFI/ml e a etapa de amplificação é realizada por menos de seis minutos.
24. Kit caracterizado pelo fato de que compreende uma composição de acordo com a reivindicação 1.
25. Kit, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma polimerase de deslocamento de fita.
26. Kit, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um molecular beacon compreendendo um fluoróforo, um supressor e um polinucleotídeo, em que o polinucleotídeo consiste em uma sequência selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 97-101 e 103-130.
27. Kit, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo consiste na SEQ ID NO: 115.
28. Método de detecção de Chlamydia trachomatis em uma amostra de teste, sendo o método caracterizado pelo fato de que compreende: (a) extrair o ácido nucleico da amostra de teste; (b) amplificar uma sequência alvo por reação do ácido nucleico extraído na etapa (a) por menos de dez minutos com uma mistura de reação compreendendo uma DNA polimerase de deslocamento de fita e um conjunto de primer de LAMP de sequência específica selecionado do grupo consistindo no Conjunto-20 e Conjunto-24; e (c) detectar a presença ou ausência de um produto amplificado da etapa (b); em que a presença do referido produto de amplificação é indicativa da presença de Chlamydia trachomatis na amostra de teste.
29. Método, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a detecção da presença ou ausência do produto de amplificação compreende a hibridização do produto amplificado com num beacon molecular compreendendo uma sequência polinucleotídica selecionada do grupo consistindo nos nucleotídeos 5-34 da SEQ ID NO: 97, nucleotídeos 5-31 da SEQ ID NO: 98, nucleotídeos 3-31 da SEQ ID NO: 99, nucleotídeos 5-30 da SEQ ID NO: 100,
nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 101, nucleotídeos 5-26 da SEQ ID NO: 103, nucleotídeos 4-27 da SEQ ID NO: 104, nucleotídeos 7-30 da SEQ ID NO: 105, nucleotídeos 5-27 da SEQ ID NO: 106, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 107, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 108, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 109, nucleotídeos 6-30 da SEQ ID NO: 110, nucleotídeos 8-31 da SEQ ID NO: 111, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 112, nucleotídeos 8-31 da SEQ ID NO: 113, nucleotídeos 5-29 da SEQ ID NO: 114, nucleotídeos 5-29 da SEQ ID NO: 115, nucleotídeos 4-28 da SEQ ID NO: 116, nucleotídeos 5-30 da SEQ ID NO: 117, nucleotídeos 8-28 da SEQ ID NO: 118, nucleotídeos 8-30 da SEQ ID NO: 119, nucleotídeos 8-29 da SEQ ID NO: 120, nucleotídeos 4-33 da SEQ ID NO: 121, nucleotídeos 7-34 da SEQ ID NO: 122, nucleotídeos 9-34 da SEQ ID NO: 123, nucleotídeos 8-34 da SEQ ID NO: 124, nucleotídeos 6-28 da SEQ ID NO: 125, nucleotídeos 7-28 da SEQ ID NO: 126, nucleotídeos 3-27 da SEQ ID NO: 127, nucleotídeos 7-32 da SEQ ID NO: 128, nucleotídeos 4-27 da SEQ ID NO: 129, e nucleotídeos 6-27 da SEQ ID NO: 130.
30. Método, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a detecção da presença ou ausência do produto de amplificação compreende a hibridização do produto amplificado com um molecular beacon compreendendo uma sequência polinucleotídica selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 97-101 e 103-130.
31. Composição caracterizada pelo fato de que compreende um conjunto de polinucleotídeos selecionados do grupo consistindo no Conjunto-1 a Conjunto-81.
32. Composição, de acordo com a reivindicação 31, caracterizada pelo fato de que compreende ainda uma sonda.
33. Composição, de acordo com a reivindicação 32, caracterizada pelo fato de que a sonda compreende um marcador.
34. Composição, de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de que a sonda é um polinucleotídeo marcado.
35. Composição, de acordo com a reivindicação 34, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo marcado compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo nos nucleotídeos 5-34 da SEQ ID NO: 97, nucleotídeos 5-31 da SEQ ID NO: 98, nucleotídeos 3-31 da SEQ ID NO: 99, nucleotídeos 5-30 da SEQ
ID NO: 100, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 101, nucleotídeos 6-30 da SEQ ID NO: 102, nucleotídeos 5-26 da SEQ ID NO: 103, nucleotídeos 4-27 da SEQ ID NO: 104, nucleotídeos 7-30 da SEQ ID NO: 105, nucleotídeos 5-27 da SEQ ID NO: 106, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 107, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 108, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 109, nucleotídeos 6-30 da SEQ ID NO: 110, nucleotídeos 8-31 da SEQ ID NO: 111, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 112, nucleotídeos 8-31 da SEQ ID NO: 113, nucleotídeos 5-29 da SEQ ID NO: 114, nucleotídeos 5-29 da SEQ ID NO: 115, nucleotídeos 4-28 da SEQ ID NO: 116, e nucleotídeos 5-30 da SEQ ID NO: 117, nucleotídeos 8-28 da SEQ ID NO: 118, nucleotídeos 8-30 da SEQ ID NO: 119, nucleotídeos 8-29 da SEQ ID NO: 120, nucleotídeos 4-33 da SEQ ID NO: 121, nucleotídeos 7-34 da SEQ ID NO: 122, nucleotídeos 9-34 da SEQ ID NO: 123, nucleotídeos 8-34 da SEQ ID NO: 124, nucleotídeos 6-28 da SEQ ID NO: 125, nucleotídeos 7-28 da SEQ ID NO: 126, nucleotídeos 3-27 da SEQ ID NO: 127, nucleotídeos 7-32 da SEQ ID NO: 128, nucleotídeos 4-27 da SEQ ID NO: 129, nucleotídeos 6-27 da SEQ ID NO: 130, e nucleotídeos 8-29 da SEQ ID NO: 131.
36. Composição, de acordo com a reivindicação 34, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo marcado compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 97 a 131.
37. Composição, de acordo com a reivindicação 34, caracterizada pelo fato de que o marcador é um fluoróforo.
38. Composição, de acordo com a reivindicação 37, caracterizada pelo fato de que o fluoróforo está covalentemente ligado a um terminal do polinucleotídeo.
39. Composição, de acordo com a reivindicação 31, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um polinucleotídeo marcado compreendendo uma sequência selecionada do grupo consistindo nos nucleotídeos 5-26 da SEQ ID NO: 103, nucleotídeos 4-27 da SEQ ID NO: 104, nucleotídeos 7-30 da SEQ ID NO: 105, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 107, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 108, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 109, nucleotídeos 8-31 da SEQ ID NO: 111, nucleotídeos 5-29 da SEQ ID NO: 114, nucleotídeos 5-29 da SEQ ID NO: 115, nucleotídeos 4-28 da SEQ ID NO: 116, nucleotídeos 5-30 da SEQ ID NO: 117, nucleotídeos 8-28 da SEQ ID NO: 118, nucleotídeos 8-30 da SEQ ID NO: 119,
nucleotídeos 9-34 da SEQ ID NO: 123, nucleotídeos 8-34 da SEQ ID NO: 124, nucleotídeos 7-32 da SEQ ID NO: 128, e nucleotídeos 4-27 da SEQ ID NO: 129, e em que o conjunto de polinucleotídeos é selecionado do grupo consistindo no Conjunto-12, Conjuntos 14-27, Conjunto-39, Conjuntos 41-54, Conjunto-66 e Conjuntos 68-81.
40. Composição, de acordo com a reivindicação 39, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo marcado compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo na SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 128 e SEQ ID NO: 129.
41. Composição, de acordo com a reivindicação 40, caracterizada pelo fato de que a sequência do polinucleotídeo marcado é SEQ ID NO: 115, e o conjunto de polinucleotídeos é selecionado do grupo consistindo no Conjunto-20, Conjunto-24, Conjunto-47, Conjunto-51, Conjunto-74 e Conjunto-78.
42. Composição, de acordo com a reivindicação 41, caracterizada pelo fato de que o conjunto de polinucleotídeos é Conjunto-20 ou Conjunto-24.
43. Composição, de acordo com a reivindicação 31, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um polinucleotídeo marcado compreendendo uma sequência selecionada do grupo consistindo nos nucleotídeos 5-34 da SEQ ID NO: 97, nucleotídeos 5-31 da SEQ ID NO: 98, nucleotídeos 3-31 da SEQ ID NO: 99, nucleotídeos 5-30 da SEQ ID NO: 100, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 101, nucleotídeos 5-27 da SEQ ID NO: 106, nucleotídeos 6-30 da SEQ ID NO: 110, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 112, nucleotídeos 8-29 da SEQ ID NO: 120, nucleotídeos 4-33 da SEQ ID NO: 121, e nucleotídeos 7-34 da SEQ ID NO: 122, e em que o conjunto de polinucleotídeos é selecionado do grupo consistindo nos Conjuntos 12-27, Conjuntos 39-54 e Conjuntos 66-81.
44. Composição, de acordo com a reivindicação 43, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo marcado compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo na SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121 e SEQ ID NO: 122.
45. Composição, de acordo com a reivindicação 31, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um polinucleotídeo marcado compreendendo uma sequência selecionada do grupo consistindo nos nucleotídeos 6-28 da SEQ ID NO: 125 e nucleotídeos 7-28 da SEQ ID NO: 126, e em que o conjunto de polinucleotídeos é selecionado do grupo consistindo no Conjunto-12, Conjuntos 14- 18, Conjunto-20, Conjunto-24, Conjunto-27, Conjunto-39, Conjuntos 41-45, Conjunto-47, Conjunto-51, Conjunto-54, Conjunto-66, Conjuntos 68-72, Conjunto 74, Conjunto-78 e Conjunto-81.
46. Composição, de acordo com a reivindicação 45, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo marcado compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo na SEQ ID NO: 125 e SEQ ID NO: 126.
47. Composição, de acordo com a reivindicação 31, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um polinucleotídeo marcado compreendendo uma sequência selecionada do grupo consistindo nos nucleotídeos 8-31 da SEQ ID NO: 113 e nucleotídeos 3-27 da SEQ ID NO: 127, e em que o conjunto de polinucleotídeos é selecionado do grupo consistindo nos Conjuntos 14-27, Conjuntos 41-54 e Conjuntos 68-81.
48. Composição, de acordo com a reivindicação 47, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo marcado compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo na SEQ ID NO: 113 e SEQ ID NO: 127.
49. Composição, de acordo com a reivindicação 31, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um polinucleotídeo marcado compreendendo os nucleotídeos 6-27 da SEQ ID NO: 130, e em que o conjunto de polinucleotídeos é selecionado do grupo consistindo nos Conjuntos 12-20, Conjuntos 22-27, Conjuntos 39-47, Conjuntos 49-54, Conjuntos 66-74 e Conjuntos 76-81.
50. Composição, de acordo com a reivindicação 49, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo marcado compreende a SEQ ID NO: 130.
51. Composição, de acordo com a reivindicação 31, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um polinucleotídeo marcado compreendendo uma sequência selecionada do grupo consistindo nos nucleotídeos 6-30 da SEQ ID NO: 102 e nucleotídeos 8-29 da SEQ ID NO: 131, e em que o conjunto de polinucleotídeos é selecionado do grupo consistindo no Conjunto-13, Conjunto-40 e Conjunto-67.
52. Composição, de acordo com a reivindicação 51, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo na SEQ ID NO: 102 e SEQ ID NO: 131.
53. Composição, de acordo com a reivindicação 52, caracterizada pelo fato de que a sonda é um molecular beacon que compreende um fluoróforo, um supressor e um polinucleotídeo.
54. Composição, de acordo com a reivindicação 53, caracterizada pelo fato de que o molecular beacon compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo nos nucleotídeos 5-34 da SEQ ID NO: 97, nucleotídeos 5-31 da SEQ ID NO: 98, nucleotídeos 3-31 da SEQ ID NO: 99, nucleotídeos 5-30 da SEQ ID NO: 100, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 101, nucleotídeos 6-30 da SEQ ID NO: 102, nucleotídeos 5-26 da SEQ ID NO: 103, nucleotídeos 4-27 da SEQ ID NO: 104, nucleotídeos 7-30 da SEQ ID NO: 105, nucleotídeos 5-27 da SEQ ID NO: 106, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 107, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 108, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 109, nucleotídeos 6-30 da SEQ ID NO: 110, nucleotídeos 8-31 da SEQ ID NO: 111, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 112, nucleotídeos 8-31 da SEQ ID NO: 113, nucleotídeos 5-29 da SEQ ID NO: 114, nucleotídeos 5-29 da SEQ ID NO: 115, nucleotídeos 4-28 da SEQ ID NO: 116, nucleotídeos 5-30 da SEQ ID NO: 117, nucleotídeos 8-28 da SEQ ID NO: 118, nucleotídeos 8-30 da SEQ ID NO: 119, nucleotídeos 8-29 da SEQ ID NO: 120, nucleotídeos 4-33 da SEQ ID NO: 121, nucleotídeos 7-34 da SEQ ID NO: 122, nucleotídeos 9-34 da SEQ ID NO: 123, nucleotídeos 8-34 da SEQ ID NO: 124, nucleotídeos 6-28 da SEQ ID NO: 125, nucleotídeos 7-28 da SEQ ID NO: 126, nucleotídeos 3-27 da SEQ ID NO: 127, nucleotídeos 7-32 da SEQ ID NO: 128, nucleotídeos 4-27 da SEQ ID NO: 129, e nucleotídeos 6-27 da SEQ ID NO: 130.
55. Composição, de acordo com a reivindicação 54, caracterizada pelo fato de que o molecular beacon compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo na SEQ ID NO: 97 a SEQ ID NO: 130.
56. Composição, de acordo com a reivindicação 55, caracterizada pelo fato de que a sequência polinucleotídica consiste na SEQ ID NO: 115.
57. Molecular beacon caracterizado pelo fato de que compreende um fluoróforo, um supressor e um polinucleotídeo, em que o polinucleotídeo compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo nos nucleotídeos 5- 34 da SEQ ID NO: 97, nucleotídeos 5-31 da SEQ ID NO: 98, nucleotídeos 3-31 da
SEQ ID NO: 99, nucleotídeos 5-30 da SEQ ID NO: 100, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 101, nucleotídeos 6-30 da SEQ ID NO: 102, nucleotídeos 5-26 da SEQ ID NO: 103, nucleotídeos 4-27 da SEQ ID NO: 104, nucleotídeos 7-30 da SEQ ID NO: 105, nucleotídeos 5-27 da SEQ ID NO: 106, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 107, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 108, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 109, nucleotídeos 6-30 da SEQ ID NO: 110, nucleotídeos 8-31 da SEQ ID NO: 111, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 112, nucleotídeos 8-31 da SEQ ID NO: 113, nucleotídeos 5-29 da SEQ ID NO: 114, nucleotídeos 5-29 da SEQ ID NO: 115, nucleotídeos 4-28 da SEQ ID NO: 116, nucleotídeos 5-30 da SEQ ID NO: 117, nucleotídeos 8-28 da SEQ ID NO: 118, nucleotídeos 8-30 da SEQ ID NO: 119, e nucleotídeos 8-29 da SEQ ID NO: 120.
58. Molecular beacon, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo na SEQ ID NO: 99 a SEQ ID NO: 120.
59. Molecular beacon, de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo consiste numa sequência selecionada do grupo consistindo na SEQ ID NO: 99 a SEQ ID NO: 120.
60. Molecular beacon, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que o fluoróforo é FAM e o supressor é BHQ1.
61. Molecular beacon, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que o fluoróforo é ATTO 565 ou Alexa 594 e o supressor é BHQ1 ou BHQ2.
62. Método de detecção de Chlamydia trachomatis em uma amostra de teste, sendo o método caracterizado pelo fato de que compreende: (a) extrair o ácido nucleico da amostra de teste; (b) amplificar uma sequência alvo por reação do ácido nucleico extraído na etapa (a) com uma mistura de reação compreendendo uma DNA polimerase de deslocamento de fita e um conjunto de primer de sequência específica, em que o referido conjunto de primer de sequência específica é selecionado do grupo consistindo no Conjunto-1 ao Conjunto-81; e (c) detectar a presença ou ausência de um produto amplificado da etapa (b); em que a presença do referido produto de amplificação é indicativa da presença de Chlamydia trachomatis na amostra de teste.
63. Método, de acordo com a reivindicação 62, caracterizado pelo fato de que a amplificação na etapa (b) da sequência alvo é realizada entre cerca de 60°C e cerca de 67°C por menos de 30 minutos.
64. Método, de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato deque a etapa de amplificação é realizada por menos de quinze minutos.
65. Método, de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato de que a etapa de amplificação é realizada por menos de dez minutos.
66. Método, de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo fato de que a etapa de amplificação é realizada por menos de seis minutos.
67. Método, de acordo com a reivindicação 62, caracterizado pelo fato de que a mistura de reação compreende ainda uma transcriptase reversa.
68. Método, de acordo com a reivindicação 62, caracterizado pelo fato de que a detecção da presença ou ausência do produto de amplificação compreende a hibridização do produto amplificado com uma sonda que compreende um polinucleotídeo ligado a um marcador.
69. Método, de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que o marcador é um fluoróforo.
70. Método, de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo fato de que o fluoróforo está covalentemente ligado a um terminal do polinucleotídeo.
71. Método, de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo marcado compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo nos nucleotídeos 5-34 da SEQ ID NO: 97, nucleotídeos 5-31 da SEQ ID NO: 98, nucleotídeos 3-31 da SEQ ID NO: 99, nucleotídeos 5-30 da SEQ ID NO: 100, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 101, nucleotídeos 6-30 da SEQ ID NO: 102, nucleotídeos 5-26 da SEQ ID NO: 103, nucleotídeos 4-27 da SEQ ID NO: 104, nucleotídeos 7-30 da SEQ ID NO: 105, nucleotídeos 5-27 da SEQ ID NO: 106, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 107, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 108, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 109, nucleotídeos 6-30 da SEQ ID NO: 110, nucleotídeos 8-31 da SEQ ID NO: 111, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 112, nucleotídeos 8-31 da SEQ ID NO: 113, nucleotídeos 5-29 da SEQ ID NO: 114, nucleotídeos 5-29 da SEQ ID NO: 115, nucleotídeos 4-28 da SEQ ID NO: 116, nucleotídeos 5-30 da SEQ ID NO: 117, nucleotídeos 8-28 da SEQ ID NO: 118, nucleotídeos 8-30 da SEQ ID NO: 119, nucleotídeos 8-29 da SEQ ID NO: 120,
nucleotídeos 4-33 da SEQ ID NO: 121, nucleotídeos 7-34 da SEQ ID NO: 122, nucleotídeos 9-34 da SEQ ID NO: 123, nucleotídeos 8-34 da SEQ ID NO: 124, nucleotídeos 6-28 da SEQ ID NO: 125, nucleotídeos 7-28 da SEQ ID NO: 126, nucleotídeos 3-27 da SEQ ID NO: 127, nucleotídeos 7-32 da SEQ ID NO: 128, nucleotídeos 4-27 da SEQ ID NO: 129, nucleotídeos 6-27 da SEQ ID NO: 130, e nucleotídeos 8-29 da SEQ ID NO: 131.
72. Método, de acordo com a reivindicação 71, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo marcado compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 97 a 130.
73. Método, de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo marcado compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo nos nucleotídeos 5-26 da SEQ ID NO: 103, nucleotídeos 4-27 da SEQ ID NO: 104, nucleotídeos 7-30 da SEQ ID NO: 105, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 107, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 108, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 109, nucleotídeos 8-31 da SEQ ID NO: 111, nucleotídeos 5-29 da SEQ ID NO: 114, nucleotídeos 5-29 da SEQ ID NO: 115, nucleotídeos 4-28 da SEQ ID NO: 116, nucleotídeos 5-30 da SEQ ID NO: 117, nucleotídeos 8-28 da SEQ ID NO: 118, nucleotídeos 8-30 da SEQ ID NO: 119, nucleotídeos 9-34 da SEQ ID NO: 123, nucleotídeos 8-34 da SEQ ID NO: 124, nucleotídeos 7-32 da SEQ ID NO: 128, e nucleotídeos 4-27 da SEQ ID NO: 129, e em que o conjunto de primer de sequência específica é selecionado do grupo consistindo no Conjunto-12, Conjuntos 14-27, Conjunto-39, Conjuntos 41-54, Conjunto-66 e Conjuntos 68-81.
74. Método, de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo marcado compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo na SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 128 e SEQ ID NO: 129
75. Método, de acordo com a reivindicação 74, caracterizado pelo fato de que a sequência do polinucleotídeo marcado é SEQ ID NO: 115, e o conjunto de primer de sequência específica é selecionado do grupo consistindo no Conjunto- 20, Conjunto-24, Conjunto-47, Conjunto-51, Conjunto-74 e Conjunto-78.
76. Método, de acordo com a reivindicação 75, caracterizado pelo fato de que o conjunto de primer de sequência específica é o Conjunto-20 ou Conjunto-
24.
77. Método, de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo marcado compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo nos nucleotídeos 5-34 da SEQ ID NO: 97, nucleotídeos 5-31 da SEQ ID NO: 98, nucleotídeos 3-31 da SEQ ID NO: 99, nucleotídeos 5-30 da SEQ ID NO: 100, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 101, nucleotídeos 5-27 da SEQ ID NO: 106, nucleotídeos 6-30 da SEQ ID NO: 110, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 112, nucleotídeos 8-29 da SEQ ID NO: 120, nucleotídeos 4-33 da SEQ ID NO: 121, e nucleotídeos 7-34 da SEQ ID NO: 122, e em que o conjunto de primer de sequência específica é selecionado do grupo consistindo nos Conjuntos 12-27, Conjuntos 39-54 e Conjuntos 66-81.
78. Método, de acordo com a reivindicação 77, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo marcado compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo na SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121 e SEQ ID NO: 122
79. Método, de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo marcado compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo nos nucleotídeos 6-28 da SEQ ID NO: 125 e nucleotídeos 7-28 da SEQ ID NO: 126, e em que o conjunto de primer de sequência específica é selecionado do grupo consistindo no Conjunto-12, Conjuntos 14-18, Conjunto-20, Conjunto-24, Conjunto-27, Conjunto-39, Conjuntos 41-45, Conjunto-47, Conjunto- 51, Conjunto-54, Conjunto-66, Conjuntos 68-72, Conjunto 74, Conjunto-78 e Conjunto-81.
80. Método, de acordo com a reivindicação 79, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo marcado compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo na SEQ ID NO: 125 e SEQ ID NO: 126.
81. Método, de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo marcado compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo nos nucleotídeos 8-31 da SEQ ID NO: 113 e nucleotídeos 3-27 da SEQ ID NO: 127, e em que o conjunto de primer de sequência específica é selecionado do grupo consistindo nos Conjuntos 14-27, Conjuntos 41-54 e
Conjuntos 68-81.
82. Método, de acordo com a reivindicação 81, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo marcado compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo na SEQ ID NO: 113 e SEQ ID NO: 127.
83. Método, de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo marcado compreende os nucleotídeos 6-27 da SEQ ID NO: 130, e em que o conjunto de primer de sequência específica é selecionado do grupo consistindo nos Conjuntos 12-20, Conjuntos 22-27, Conjuntos 39- 47, Conjuntos 49-54, Conjuntos 66-74 e Conjuntos 76-81.
84. Método, de acordo com a reivindicação 83, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo marcado compreende a SEQ ID NO: 130.
85. Método, de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo marcado compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo nos nucleotídeos 6-30 da SEQ ID NO: 102 e nucleotídeos 8-29 da SEQ ID NO: 131, e em que o conjunto de primer de sequência específica é selecionado do grupo consistindo no Conjunto-13, Conjunto-40 e Conjunto-67.
86. Método, de acordo com a reivindicação 85, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo na SEQ ID NO: 102 e SEQ ID NO: 131.
87. Método, de acordo com a reivindicação 62, caracterizado pelo fato de que a Chlamydia trachomatis está presente na amostra de teste numa concentração de ≤ 100 UFI/mL.
88. Método, de acordo com a reivindicação 87, caracterizado pelo fato de que a Chlamydia trachomatis está presente na amostra de teste numa concentração de ≤ 50 UFI/mL.
89. Método, de acordo com a reivindicação 88, caracterizado pelo fato de que a Chlamydia trachomatis está presente na amostra de teste numa concentração de ≤ 5 UFI/mL.
90. Método, de acordo com a reivindicação 89, caracterizado pelo fato de que a Chlamydia trachomatis está presente na amostra de teste numa concentração de ≤ 2 UFI/mL.
91. Método, de acordo com a reivindicação 87, caracterizado pelo fato de que a Chlamydia trachomatis está presente na amostra de teste numa concentração de ≤ 5 UFI/ml e a etapa de amplificação é realizada por menos de 15 minutos.
92. Método, de acordo com a reivindicação 87, caracterizado pelo fato de que a Chlamydia trachomatis está presente na amostra de teste numa concentração de ≤ 10 UFI/ml e a etapa de amplificação é realizada por menos de seis minutos.
93. Kit caracterizado pelo fato de que compreende uma composição de acordo com a reivindicação 31.
94. Kit, de acordo com a reivindicação 93, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma polimerase de deslocamento de fita.
95. Kit, de acordo com a reivindicação 94, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um molecular beacon compreendendo um fluoróforo, um supressor e um polinucleotídeo, em que o polinucleotídeo compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo nos nucleotídeos 5-34 da SEQ ID NO: 97, nucleotídeos 5-31 da SEQ ID NO: 98, nucleotídeos 3-31 da SEQ ID NO: 99, nucleotídeos 5-30 da SEQ ID NO: 100, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 101, nucleotídeos 6-30 da SEQ ID NO: 102, nucleotídeos 5-26 da SEQ ID NO: 103, nucleotídeos 4-27 da SEQ ID NO: 104, nucleotídeos 7-30 da SEQ ID NO: 105, nucleotídeos 5-27 da SEQ ID NO: 106, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 107, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 108, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 109, nucleotídeos 6-30 da SEQ ID NO: 110, nucleotídeos 8-31 da SEQ ID NO: 111, nucleotídeos 6-29 da SEQ ID NO: 112, nucleotídeos 8-31 da SEQ ID NO: 113, nucleotídeos 5-29 da SEQ ID NO: 114, nucleotídeos 5-29 da SEQ ID NO: 115, nucleotídeos 4-28 da SEQ ID NO: 116, nucleotídeos 5-30 da SEQ ID NO: 117, nucleotídeos 8-28 da SEQ ID NO: 118, nucleotídeos 8-30 da SEQ ID NO: 119, nucleotídeos 8-29 da SEQ ID NO: 120, nucleotídeos 4-33 da SEQ ID NO: 121, nucleotídeos 7-34 da SEQ ID NO: 122, nucleotídeos 9-34 da SEQ ID NO: 123, nucleotídeos 8-34 da SEQ ID NO: 124, nucleotídeos 6-28 da SEQ ID NO: 125, nucleotídeos 7-28 da SEQ ID NO: 126, nucleotídeos 3-27 da SEQ ID NO: 127, nucleotídeos 7-32 da SEQ ID NO: 128, nucleotídeos 4-27 da SEQ ID NO: 129, nucleotídeos 6-27 da SEQ ID NO: 130, e nucleotídeos 8-29 da SEQ ID NO: 131.
96. Kit, de acordo com a reivindicação 95, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo na
SEQ ID NO: 97 a SEQ ID NO: 131.
97. Kit, de acordo com a reivindicação 96, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo consiste em uma sequência selecionada do grupo consistindo na SEQ ID NO: 97 à SEQ ID NO: 131.
98. Kit, de acordo com a reivindicação 97, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo consiste na SEQ ID NO: 115 e o conjunto de polinucleotídeos é o Conjunto-20 ou Conjunto-24.
99. Método de detecção de Chlamydia trachomatis em uma amostra de teste, sendo o método caracterizado pelo fato de que compreende: (a) extrair o ácido nucleico da amostra de teste; (b) amplificar uma sequência alvo por reação do ácido nucleico extraído na etapa (a) por menos de dez minutos com uma mistura de reação compreendendo uma DNA polimerase de deslocamento de fita e um conjunto de primer de LAMP de sequência específica; e (c) detectar a presença ou ausência de um produto amplificado da etapa (b); em que a presença do referido produto de amplificação é indicativa da presença de Chlamydia trachomatis na amostra de teste.
100. Método, de acordo com a reivindicação 99, caracterizado pelo fato de que a Chlamydia trachomatis está presente na amostra de teste numa concentração de ≤ 100 UFI/mL.
101. Método, de acordo com a reivindicação 100, caracterizado pelo fato de que a Chlamydia trachomatis está presente na amostra de teste numa concentração de ≤ 10 UFI/mL.
102. Método, de acordo com a reivindicação 99, caracterizado pelo fato de que a etapa de amplificação compreende a reação do ácido nucleico extraído na etapa (a) com uma mistura de reação compreendendo uma DNA polimerase de deslocamento de fita e um conjunto de primer de sequência específica, em que o referido conjunto de primer de sequência específica é selecionado do grupo consistindo no Conjunto-1 ao Conjunto-81.
103. Método, de acordo com a reivindicação 102, caracterizado pelo fato de que a detecção da presença ou ausência do produto de amplificação compreende a hibridização do produto amplificado com um molecular beacon compreendendo uma sequência polinucleotídica selecionada do grupo consistindo na SEQ ID NO: 97 à SEQ ID NO: 131.
104. Método, de acordo com a reivindicação 102, caracterizado pelo fato de que a detecção da presença ou ausência do produto de amplificação compreende a hibridização do produto amplificado com um molecular beacon compreendendo uma sequência polinucleotídica selecionada do grupo consistindo na SEQ ID NO: 99 à SEQ ID NO: 120.
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