CN117417988A - 一种检测待测样本中目标dna的方法、试剂盒以及检测装置 - Google Patents

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CN117417988A CN202311424621.8A CN202311424621A CN117417988A CN 117417988 A CN117417988 A CN 117417988A CN 202311424621 A CN202311424621 A CN 202311424621A CN 117417988 A CN117417988 A CN 117417988A
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Abstract

本申请实施例提供一种检测待测样本中目标DNA的方法、试剂盒以及检测装置。该方法包括：对所述待测样本进行非目标DNA定量；基于定量结果，得到所述待测样本中目标DNA含量的校正系数，并对所述待测样本进行均一化处理；利用经过所述均一化处理的待测样本进行检测。与现有技术相比，本申请具有以下有益效果的至少之一：避免非特异性扩增、可以排除非目标DNA对目标DNA检测结果的干扰、降低成本、提高结果的准确性。

Description

一种检测待测样本中目标DNA的方法、试剂盒以及检测装置
技术领域
本申请涉及基因检测技术领域，具体涉及一种检测待测样本中目标DNA的方法、试剂盒以及检测装置。
背景技术
基于靶向杂交捕获的测序流程中，通常采用多个样本同时进行杂交反应(多杂反应)，以达到节约成本的目的。在对人源唾液样本进行测序时，由于人源唾液样本中往往含有各种各样的微生物，在核酸提取过程中无法有效的清除掉微生物的DNA，无法控制用于测序的唾液样本中人源DNA的含量，所以在测序过程中存在测序数据量不均衡的问题，造成个别样本数据量过低，而无法得到准确的测序数据。
虽然现有技术中可以通常通过扩大数据量以保证多杂反应中各样本数据量的最低要求，但该方法的缺陷是无扩大数据量的标准值，成本高且无法保证各样本的数据量。另一种策略是在进行杂交捕获测序之前或者基因文库制备之前进行人源DNA定量，随后在杂交捕获前进行均一化处理。然而，由于人源DNA容易降解，降解后DNA不完整，稳定性不好，会导致测序波动，所以进行人源DNA定量时会导致测序波动较大，无法稳定保证多杂反应的测序数据产出。
因此，目前检测液体样本中人源DNA的方法以及靶向测序样本的制备仍有待改进。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明目的是提供一种检测待测样本中目标DNA的方法、试剂盒以及检测装置，以至少在一定程度上缓解甚至解决上述背景技术中提出的问题中的至少之一。
在本发明的一个方面，本发明提供了一种检测待测样本中目标DNA的方法，所述方法包括：对所述待测样本进行非目标DNA定量；基于定量结果，得到所述待测样本中目标DNA含量的校正系数，并对所述待测样本进行均一化处理；利用经过所述均一化处理的待测样本进行检测。
进一步地，所述方法进一步包括：进行所述均一化处理之前，利用经过所述非目标DNA定量处理的待测样本制备全基因组文库。
进一步地，所述制备全基因组文库之后，所述方法进一步包括：利用经过所述均一化处理的待测样本进行测序处理；所述测序处理包括靶向测序。
进一步地，所述待测样本包括液体样本、固体样本以及固液混合样本中的至少之一；所述液体样本包括唾液样本，所述均一化处理包括利用式(I)获得用于所述检测的待测样本含量A：
A＝B/(1-C) 式(I)
其中，
B为期望用于进行所述检测的待测样本中目标DNA含量，B不低于120ng，并且B×待测样本数目的值不高于4000ng；
C为所述非目标DNA定量获得的待测样本中非目标DNA的百分含量。
进一步地，所述方法进一步包括：对所述待测样本中非目标DNA进行定量是基于荧光定量非目标DNA标准曲线进行的，所述荧光定量非目标DNA标准曲线是利用所述特异性引物进行荧光定量PCR检测得到的。
更进一步地，所述荧光定量非目标DNA标准曲线的横坐标为非目标DNA浓度的lg值，纵坐标为荧光定量PCR反应的阈值循环数。
进一步地，对所述待测样本中非目标DNA含量进行测定的步骤包括：提取所述待测样本的总DNA，并且利用所述特异性引物对所述总DNA进行荧光定量PCR检测，并且将检测得到的阈值循环数代入所述标准曲线中，得到所述待测样本中非目标DNA含量。
进一步地，所述特异性引物靶向非目标DNA的保守区域。
在本发明的另一方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括对非目标DNA进行定量检测以及对目标DNA进行检测的试剂；所述试剂包括基因特异性引物，所述基因特异性引物是以非目标DNA的第一区域作为靶标序列的。
进一步地，所述非目标DNA包括细菌DNA；所述第一区域包括细菌DNA的保守区域。
更进一步地，所述第一区域包括细菌DNA的16srDNA中V2-V3保守区域。
进一步地，所述基因特异性引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物包括与SEQ ID No.1中示出的序列具有至少70％同一性的序列；所述下游引物包括与SEQ ID No.2中示出的序列具有至少70％同一性的序列。
进一步地，所述SEQ ID NO.1为5’-TACCGCGGCTGCTGGCA-3’。
进一步地，所述SEQ ID NO.2为5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’。
进一步地，对非目标DNA进行定量检测的试剂进一步包括探针或染料、阳性对照样品以及阴性对照样品；对目标DNA进行检测的试剂包括测序试剂。
更进一步地，所述阳性对照样品为非目标DNA标准品，所述阴性对照样品为无核酸酶水；所述非目标DNA标准品包括细菌DNA标准品；所述细菌DNA标准品包括大肠杆菌DNA标准品；所述测序试剂包括靶向测序试剂。
更进一步地，所述非目标DNA标准品包括细菌DNA标准品；所述细菌DNA标准品包括大肠杆菌DNA标准品。
在本发明的再一方面，本发明提供了一种检测装置，所述检测装置包括：
检测单元，所述检测单元包括第一类型DNA定量单元以及第二类型DNA定量单元，所述第一类型DNA定量单元包括上述试剂盒；
计算单元，所述计算单元基于第一类型DNA定量单元的定量结果，获得第二类型DNA样本校正结果；以及
控制单元，所述控制单元基于所述计算单元的校正结果，调整供给至所述第二类型DNA定量单元的样本含量。
进一步地，所述第一类型DNA定量单元检测的第一类型DNA包括非目标DNA，所述第二类型DNA定量单元检测的第二类型DNA包括目标DNA。
更进一步地，所述非目标DNA包括细菌DNA；
所述目标DNA包括人源DNA。
上述概述仅仅是为了说明书的目的，并不意图以任何方式进行限制。除上述描述的示意性的方面、实施方式和特征之外，通过参考附图和以下的详细描述，本申请进一步的方面、实施方式和特征将会是容易明白的。
附图说明
在附图中，除非另外规定，否则贯穿多个附图相同的附图标记表示相同或相似的部件或元素。这些附图不一定是按照比例绘制的。应该理解，这些附图仅描绘了根据本申请公开的一些实施方式，而不应将其视为是对本申请范围的限制。
图1为本发明一实施例的检测待测样本中目标DNA的方法的流程图；
图2为本发明一实施例的检测装置的结构示意图；
图3为本发明实施例1中标准品1-5的扩增曲线图谱；
图4为本发明实施例1中荧光定量细菌DNA标准曲线图；
图5为本发明实施例3中荧光定量细菌DNA标准曲线图。
附图说明：100-检测单元，110-第一类型DNA定量单元，120-第二类型DNA定量单元，200-计算单元，300-控制单元。
具体实施方式
为了更加清楚地理解本发明的技术特征、目的和有益效果，现对本发明的技术方案进行进一步的详细说明。在下文中，仅简单地描述了某些示例性实施例。正如本领域技术人员可认识到的那样，在不脱离本申请的精神或范围的情况下，可通过各种不同方式修改所描述的实施例。因此，附图和描述被认为本质上是示例性的而非限制性的。
在本发明的一个方面，本发明提供了一种检测待测样本中目标DNA的方法。参考图1，该方法包括：对待测样本进行非目标DNA定量；基于定量结果，得到待测样本中目标DNA含量的校正系数，并对待测样本进行均一化处理；利用经过均一化处理的待测样本进行检测。也即是说，该方法通过对待测样本中非目标DNA含量进行定量，并且在进行目标DNA检测之前，基于非目标DNA定量结果对待测样本中目标DNA含量进行均一化处理，使进行检测的待测样本中目标DNA含量基本相同，令检测结果更准确，并且减小各待测样本间数据量的差异，提高目标DNA的检测效率。
此外，在具体实施方式中，该方法可利用试剂盒进行，所用试剂盒可包括用于荧光定量PCR检测非目标DNA的试剂，例如包括针对非目标DNA的基因特异性引物。该基因特异性引物是以非目标DNA的第一区域作为靶标序列的。也即是说，该方法以非目标DNA的第一区域作为靶标序列对待测样本中非目标DNA含量进行定量，进一步提升检测结果的准确性。
本发明提出的方法在对待测样本中目标DNA进行检测时，可通过对非目标DNA进行准确的定量测量，提高目标DNA检测效率。针对非目标DNA进行定量的基因特异性引物具有较高的特异性，可尽可能避免非特异性扩增，排除非目标DNA对目标DNA检测结果的干扰，降低成本，提高结果的准确性。
在一些示例中，前述的非目标DNA和目标DNA的种类均不受特别的限制，具体地，目标DNA为用于最终进行检测的DNA，具体可根据实验目的而决定。而非目标DNA为用于间接反映目标DNA含量的DNA，可以为待测样本中自带的DNA或污染DNA，包括细菌DNA。当该非目标DNA为细菌DNA时，该第一区域可以为细菌DNA的保守区域，更具体地，可以为细菌的16srDNA中V2-V3保守区域。采用针对细菌的16srDNA中V2-V3保守区域的高特异性引物，可避免非特异性扩增，提高定量结果的准确性，可以在较大程度上排除细菌DNA对目标DNA检测结果的干扰，并降低成本。
根据本发明的实施例，本申请所提及的待测样本的种类不受特别的限制，可以为固体样本、液体样本、固液混合样本中的至少之一。
本申请提出的方法，由于采用了针对特定保守区域的基因特异性引物，可用于对待测样本中非目标DNA进行较为准确的定量分析。由此，可对待测样本中目标DNA的含量进行准确的均一化。用于对含有多种来源DNA的待测样本中目标DNA进行检测时，可排除非目标DNA对目标DNA的干扰，提高结果准确性。
为了方便理解，下面首先对该方法能够实现上述有益效果的原理进行简单说明：
本发明选用细菌的16sDNA V2-V3保守区域作为靶标序列进行荧光定量PCR检测。该区域相对于细菌的16sDNAV1-V9中其他保守区域的特异性更高。基于该区域设计的特异性引物特异性普遍高于针对其他区域设计的特异性引物，因此采用该区域为第一区域设计引物，可以在很大程度上避免对细菌DNA进行检测时出现其他非特异性扩增，提高了定量结果的准确性。并且，在基于16sDNAV2-V3保守区域设计的特异性引物中，选择唯一的特异性引物，进而可以进一步提高定量结果的准确性。根据本发明的实施例，用于对细菌DNA进行荧光定量的特异性引物包括由上游引物和下游引物组成的引物对。在具体实施方式中，所用上游引物和下游引物的序列不受特别的限制，只要可以特异性扩增16sDNAV2-V3保守区域即可。例如，上游引物包括与SEQ ID No.1中示出的序列具有至少70％同一性的序列，例如具有70％、75％、80％、85％、90％、95％以及100％同一性的序列；下游引物包括与SEQ IDNo.2中示出的序列具有至少70％同一性的序列，例如具有70％、75％、80％、85％、90％、95％以及100％同一性的序列。在一些具体实施方式中，所用上游引物序列可以与SEQ IDNO.1相同，所用下游引物序列可以与SEQ ID NO.2相同。其中，SEQ ID NO.1为5’-TACCGCGGCTGCTGGCA-3’；SEQ ID NO.2为5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’。发明人发现，采用上述组成的引物对具有更高的特异性。
根据本发明的实施例，在本发明的方法中，所用试剂盒中用于对非目标DNA进行定量的试剂中除上述基因特异性引物外，还进一步包括用于通过荧光定量PCR检测的其他试剂。例如，可以包括用于检测非目标DNA的探针或染料、阳性对照样品以及阴性对照样品。其中，探针的种类不受特别的限制，包括但不限于水解探针、分子信标、双重杂交探针、小凹槽结合剂(MGB)探针以及Amplifluor检测探针。在一些具体示例中，可以包括水解探针，例如Taq-Man探针。并且染料的种类也不受特别的限制，只要可以在结合双链DNA后能发出荧光即可，例如，可包括但不限于SYBRGreenI和EvaGreenTM。此外，阳性对照样品和阴性对照样品可用于与待测样本进行对比，避免出现假阳性或假阴性实验结果，增加实验结果的准确性。在具体实施方式中，阳性对照样品的种类不受特别的限制，只要其中非目标DNA含量已知即可，例如可以为非目标DNA标准品，并且优选地非目标DNA标准品包括细菌DNA标准品。非目标DNA标准品可用于配置成各种浓度的非目标DNA液体样本，作为待测样本的阳性对照。其中，非目标DNA标准品具体可以包括大肠杆菌DNA标准品。阴性对照样品的种类也不受特别的限制，只要其中不含有细菌DNA即可。例如，阴性对照样品中可以不含其他任何物种DNA，例如可以为无核酸酶水(例如，DEPC水)。此外，所用试剂盒中，对目标DNA进行检测的试剂的种类不受特别的限制，具体地可以包括用于对目标DNA进行检测分析的试剂，可根据检测分析方法来决定试剂的种类，例如可包括用于测序分析的测序试剂，并且所用测序试剂的种类可根据测序方法来决定，优选地包括靶向测序试剂。
根据本发明的实施例，本发明的方法是基于荧光定量PCR的原理对待测样本中非目标DNA的含量进行检测的。具体而言，荧光定量PCR指的是在PCR进行的同时，对其扩增过程进行监测，在PCR扩增过程中收集数据，并且在荧光定量PCR中，引入了荧光化学物质。随着反应的进行，反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。通过对扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测，可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图，最后通过标准曲线对待测样本进行定量分析。利用本发明的方法对待测样本进行的定量分析的具体方式不受特别限制，可包括绝对定量或相对定量中的至少之一，具体地，可根据实验目的决定定量方式。
具体而言，本发明的方法可以对含有多种来源DNA的待测样本中的非目标DNA进行绝对定量。由此可进一步基于非目标DNA定量结果间接地对样本中目标DNA含量进行定量分析，减少后续试验中非目标DNA对实验结果的干扰，也可通过上述荧光定量PCR的检测结果，对每个样本中目标DNA的含量进行均一化，使得用于后续实验分析的样本中目标DNA的含量基本相同。由于前面得到的非目标DNA含量是绝对定量得到的，因此该结果用于均衡后续试验中目标DNA的含量时，可以更好地提高实验结果的准确性。
根据本发明的实施例，检测待测样本中目标DNA的方法进一步包括制作标准曲线的步骤，以及利用标准曲线对待测样本中非目标DNA含量进行测定的步骤。也即是说，在具体实施方式中，可首先利用特异性引物对非目标DNA含量已知的标准样品进行荧光定量PCR检测，制备得到非目标DNA浓度相对于阈值循环数变化的荧光定量非目标DNA标准曲线，而后基于荧光定量非目标DNA标准曲线对液体样本中非目标DNA进行定量。其中，所用特异性引物靶向非目标DNA的保守区域。并且在荧光定量非目标DNA标准曲线中，横坐标为非目标DNA浓度的lg值，纵坐标为荧光定量PCR反应的阈值循环数。
其中，在荧光定量PCR检测中，荧光信号与扩增片段DNA的丰度相成正相关，即扩增片段DNA丰度越高，荧光信号越强。在检测过程中，每个循环结束后，仪器会记录一次荧光值。将每个循环结束后的荧光值为纵坐标，循环数为横坐标绘成曲线，绘制得到的曲线是扩增曲线(Amplification plot)。在扩增曲线上设定一个阈值(Threshold line)，荧光值达到这个阈值时的循环数为阈值循环数(Ct值)，Ct值越小，说明目的DNA片段的起始浓度越高。在具体实施方式中，将浓度较高的样品进行梯度稀释，并对梯度稀释的样本分别进行荧光定量PCR，根据样本的相对浓度和其所对应的阈值循环数绘制的曲线称为荧光定量PCR标准曲线，所得荧光定量PCR标准曲线具有多方面作用，既可用于绝对定量中，也可用于相对定量中。其中，绝对定量标准曲线需要用已知浓度的标准品进行制作，而相对定量标准曲线可以用任何含有目的DNA分子的样本进行制作，不需要知道初始模板的浓度。
根据本发明的实施例，制作荧光定量非目标DNA标准曲线的步骤可以包括：向不含非目标DNA的液体样本基因组DNA中添加不同浓度梯度的非目标DNA，得到非目标DNA含量已知的多个模板。利用特异性引物对多个模板进行荧光定量PCR检测，并且根据检测结果得到非目标DNA含量与阈值循环数对应的荧光定量非目标DNA标准曲线。
对待测样本中非目标DNA含量进行测定的步骤可以包括：提取待测样本的总DNA，并且利用特异性引物对总DNA进行荧光定量PCR检测，并且将检测得到的阈值循环数代入上述制作得到的荧光定量非目标DNA标准曲线中，得到液体样本中非目标DNA含量。
在本申请中，提取待测样本的中总DNA的方法不受特别的限制，具体可根据待测样本的来源来选择提取方法，只要可以将DNA充分提取出来即可。例如在具体实施方式中，当待测样本来源于动物样本时，可利用下述方法中的至少之一提取DNA：异丙醇沉淀法、酚抽提法、甲酞胺裂解法、玻璃颗粒吸附法、盐析法以及三乙醇胺月桂基硫酸盐法；当待测样本来源于植物样本时，可利用下述方法中的至少之一提取DNA：十六烷基三乙基澳化按法(CTAB法)、SDS法以及高盐低pH法；当待测样本来源于微生物样本时，可利用下述方法中的至少之一提取DNA：煮沸法、SDS裂解法、碱裂解法以及Triton-溶菌酶裂解法。
根据本发明的实施例，在检测待测样本中目标DNA的方法中，在进行均一化处理之前，可进一步包括利用经过非目标DNA定量处理的待测样本制备全基因组文库的步骤。也即是说，可首先利用非目标DNA含量已知的待测样本进行全基因组文库制备，而后基于测定得到的非目标DNA定量结果对全基因组文库进行均一化处理。通过均一化处理计算得到目标DNA含量基本相同的样本含量，对经过均一化处理的全基因组文库进行测序处理。具体地，测序处理的具体方法不受特别的限制，例如包括但不限于靶向测序，例如杂交捕获测序。在具体实施方式中，全基因组文库制备以及靶向测序步骤的具体操作步骤也不受特别的限制，均可利用市售试剂盒进行，例如，基因组文库制备试剂盒可包括UniversalPlus DNALibrary Prep Kit for Illumina V2(ND627-1)、杂交捕获测序时即可包括人全外显子捕获试剂盒Twist Comprehensive Exome,96Reactions,Kit(货号102033)。
在一个具体实施例中，该方法可以利用经过非目标DNA定量处理的待测样本制备全基因组文库，根据非目标DNA定量结果对待测样本中目标DNA进行均一化处理，而后利用经过均一化处理的待测样本进行检测。例如，当待测样本为人源液体样本时，可以利用本发明的方法对人源液体样本进行细菌DNA定量处理，并利用人源液体样本制备全基因组文库，而后根据细菌DNA定量结果对人源液体样本中人源DNA进行均一化处理。最后，利用经过均一化处理的人源DNA样本进行检测。人源体液样本可以包括但不限于唾液样本。此外，该方法可用于包括但不限于检测人源液体样本中人源DNA，还可对其他含细菌的液体样本进行检测，例如，动物液体样本、植物组织样本、环境样本等，只要样本中含有至少两种不同来源的DNA即可。
根据本发明的实施例，均一化处理包括计算用于进行检测的待测样本含量，令每个待测样本中目标DNA含量相同。具体地，均一化处理包括利用下式Ⅰ计算得到用于检测的待测样本含量：
A＝B/(1-C) 式(I)；
在式(I)中，A为用于进行检测的待测样本含量(ng)；B为期望用于进行检测的待测样本中目标DNA含量(ng)；C为待测样本中非目标DNA的百分含量(％)。并且A、B、C的具体数值不受特别的限制，具体地，只要满足A大于0，B大于0，C大于等于0的条件即可。在具体实施方式中，B优选地不低于100ng，更优选地不低于120ng。此外，为了更好的对待测样本进行检测，更优选地令待测样本的数目与B的乘积不高于4000ng。利用式(I)对用于检测的待测样本含量进行计算，可以保证用于检测的各样本的检测数据量均衡、降低检测成本、提高检测准确性。
在本发明的另一方面，本发明提供了一种试剂盒。该试剂盒中包括用于定量检测非目标DNA以及用于检测目标DNA的试剂，具体包括对非目标DNA进行定量检测的试剂，以及对目标DNA进行检测的试剂，以对待测样本中的目标DNA含量进行定量检测。该试剂盒具有可准确检测混合样品中非目标DNA含量的优点，可提高混合样品中其他类型目标DNA含量检测的准确性。并且，采用基因特异性引物可以有效避免非特异性扩增，非目标DNA含量检测准确度高。
本发明的试剂盒中的试剂可以与本发明中前述检测待测样本中目标DNA的方法中所用试剂相同。
此外，在具体实施方式中，该试剂盒的用途不受特别的限制，可用于包括但不限于对待测样本中的非目标DNA含量进行检测，也可用于通过检测得到的非目标DNA含量计算出其他DNA的含量，例如，当对含人源DNA的液体样本(例如，人源唾液样本)中人源DNA含量进行检测时，可通过本发明的试剂盒对人源唾液样本中非目标DNA含量进行测定，以避免非目标DNA影响人源DNA的检测结果。
在本发明的再一方面，本发明提供了一种检测装置。参考图2，该装置包括：检测单元100、计算单元200以及控制单元300。其中检测单元100包括彼此相连的第一类型DNA定量单元110以及第二类型DNA定量单元120，并且第一类型DNA定量单元110包括本发明的试剂盒；计算单元200与第一类型DNA定量单元110相连，并且基于第一类型DNA定量单元110的定量结果，获得第二类型DNA样本校正结果；控制单元300与计算单元200、第一类型DNA定量单元110以及第二类型DNA定量单元120分别相连，并且基于计算单元200的校正结果，调整供给至第二类型DNA定量单元120的样本含量。
根据本发明的实施例，第一类型DNA定量单元检测的第一类型DNA包括非目标DNA，第二类型DNA定量单元检测的第二类型DNA包括目标DNA。其中，非目标DNA的种类不受特别的限制，优选地包括细菌DNA；目标DNA的种类也不受特别的限制，优选地包括人源DNA。也即是说，本发明的检测装置基于第一类型DNA定量单元的定量结果对第二类型DNA样本进行校正，并调整供给至第二类型DNA定量单元的第二类型DNA样本含量，减小了第二类型DNA定量单元中第二类型DNA样本的差异性，提高了检测结果的准确性。
实施例
下面通过具体实施例对本发明提出的方法进行详细说明。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用的试剂如无特别说明均为可商购的试剂。
实施例1
本实施例利用大肠杆菌DNA标准品制作荧光定量细菌DNA标准曲线。
1.标准品制备：大肠杆菌基因组DNA购买自Sigma Aldrich(E.coli,strain B,Cat.No.D4889)，稀释至5ng/μL、1ng/μL、0.2ng/μL、40pg/μL、8pg/μL，分别标记为标准品1、标准品2、标准品3、标准品4、标准品5。
2.引物：引物设计模板序列选择16s rDNA序列的V2与V3区域，引物序列如下表1所示：
表1引物序列
名称 序列(5’-3’)
上游引物 TACCGCGGCTGCTGGCA
下游引物 ACTCCTACGGGAGGCAGCA
引物在上海生工科技合成，按照合成管上提示体积添加TE Buffer进行引物溶解，将上游引物与下游引物按1:1混合形成引物混合物，浓度稀释至10μM。
3.荧光定量细菌DNA标准曲线制作：标准品1-5均按照如下表2配制反应体系，其中，每个标准品均设置3个重复。
表2荧光定量PCR反应体系
组分 体积 浓度
PowerUp SYBR Green Master Mix(2X) 10 1X
引物混合物 1 10μM
超纯水 4 /
标准品 5 /
总体积 20 /
4.配制完成以上反应体系，立即放入荧光定量PCR仪中，进行如下表3中的反应程序：
表3荧光定量PCR反应程序
反应完成后，提取仪器数据，标准品1-5的扩增曲线如图3所示。图中纵坐标为荧光信号强度，横坐标为循环数。可以明显看出，随着PCR反应的进行，荧光信号强度随着扩增循环逐渐增强，并且扩增曲线是呈现出“S”型，具有特征性的指数增长期、线性增长期和平台期三个阶段。对标准品1-5的浓度和各标准品的阈值循环数之间的关系进行计算，结果如图4所示。生成的荧光定量细菌DNA标准曲线为y＝-3.3113x+28.315(R2＝1)，其中，y为阈值循环数，x为细菌DNA浓度的log值。
实施例2
本实施例利用市售大肠杆菌基因组DNA标准品以及人细胞系DNA制备得到细菌DNA含量不同的测试标本，对所得测试标本中大肠杆菌基因组DNA含量进行检测。
1.测试标本制备：人细胞系DNA购买自菁良基因，大肠杆菌基因组DNA购买自SigmaAldrich(E.coli,strain B,Cat.No.D4889)，将人细胞系DNA与大肠杆菌基因组DNA按比例混合配制成细菌占比为1％、10％、20％、50％的测试标本，其中细菌百分比1％时，配制总DNA量为10ng时，则人源DNA含量9.9ng，大肠杆菌含量0.1ng；细菌百分比为10％时，人源DNA含量9ng，大肠杆菌含量1ng；细菌百分比为20％时，人源DNA含量8ng，大肠杆菌含量2ng；细菌百分比为50％时，人源DNA含量5ng，大肠杆菌含量5ng。
2.测试标本中细菌DNA含量检测：细菌占比为1％、10％、20％、50％的测试标本均按照如下表4配制反应体系，其中，每个测试标本均设置3个重复。
表4荧光定量PCR反应体系
组分 体积 浓度
PowerUp SYBR Green Master Mix(2X) 10 1X
引物混合物 1 10μM
超纯水 4 /
测试标本 5 /
总体积 20 /
3.配制完成以上反应体系，立即放入荧光定量PCR仪中，进行如下表5中的反应程序：
表5荧光定量PCR反应程序
反应完成，提取仪器数据，将所得阈值循环数值代入实施例1中得到的荧光定量细菌DNA标准曲线中，计算得到各测试标本中实测细菌DNA浓度，并利用细菌DNA浓度计算得到细菌含量百分比。细菌含量百分比的理论值与实际测试值如下表6所示，并对理论值与实际测试值进行T检验，计算得到p值为0.128，大于0.05，表示差异性不显著。也即是说，理论值与实际测试值之间不存在显著性差异，实际测试值与理论值基本一致。
表6细菌含量百分比
实施例3
本实施例利用本发明的方法，采用市售大肠杆菌基因组DNA标准品以及人细胞系DNA制备得到细菌DNA含量不同的人源基因组DNA样本，采用荧光定量PCR的方法对人源基因组DNA样本进行细菌含量测定，具体包括人源基因组DNA样本制备、引物设计、标准曲线制作以及测试样本中细菌DNA含量计算，均一化杂交捕获样本投入量。
1.人源基因组DNA样本制备：人细胞系DNA购买自菁良基因，大肠杆菌基因组DNA购买自Sigma Aldrich(E.coli,strain B,Cat.No.D4889)，将人细胞系DNA与大肠杆菌基因组DNA配制为8个细菌比例为5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％的人源基因组DNA样本，编号分别为DNA样本1、DNA样本2、DNA样本3、DNA样本4、DNA样本5、DNA样本6、DNA样本7以及DNA样本8。
2.引物：引物设计模板序列以及处理方法均与实施例1相同，将上游引物与下游引物按1:1混合形成引物混合物，浓度稀释至10μM。
3.荧光定量细菌DNA标准曲线制作：DNA样本1-8均按照如下表7配制反应体系，其中，每个标准品均设置3个重复。
表7荧光定量PCR反应体系
组分 体积 浓度
PowerUp SYBR Green Master Mix(2X) 10 1X
引物混合物 1 10μM
超纯水 4 /
DNA样本 5 /
总体积 20 /
配制完成以上反应体系，立即放入荧光定量PCR仪中，进行如下表8中的反应程序：
表8荧光定量PCR反应程序
反应完成，提取仪器数据，对DNA样本1-8的浓度和各DNA样本的阈值循环数之间的关系进行计算，如图5所示，生成荧光定量细菌DNA标准曲线y＝-3.3349x+28.396(R2＝0.9993)，y为阈值循环数，x为细菌DNA浓度的log值。
4.采用诺唯赞建库试剂盒Universal Plus DNALibrary Prep Kit forIllumina V2(ND627-1)进行基因组文库制备，具体流程如下：
4.1将末端修复混合液(End Prep Mix4)解冻后颠倒混匀，于灭菌管中配制按照如下表9中的试剂体系，单独配置DNA样本1-8的反应试剂：
表9反应体系
组分 体积(μL)
DNA样本 50
End Prep Mix4 15
总计 65
轻轻吹打混匀并短暂离心，将装有DNA样本1-8的反应试剂的灭菌管放入PCR仪中进行如下表10中所示的反应程序：
表10反应程序
温度 时间
热盖100℃ On
20℃ 15min
65℃ 15min
4℃ Hold
4.2待上述反应完成后，立即配制如下表11中的反应体系：
表11反应体系
轻轻吹打混匀并短暂离心，放入PCR仪中进行如下表12中的反应程序：
表12反应程序
温度 时间
热盖100℃ On
20℃ 15min
4℃ Hold
4.3连接产物纯化，向上述连接产物中加入60μL诺唯赞纯化磁珠，充分混匀后室温静置5min，放置于磁力架约5min使磁珠完全吸附且溶液澄清，小心去除上清；加入200μL新配制的80％乙醇进行漂洗，室温孵育30-60s，小心去除上清，重复一次，待磁珠干燥后，加入22μL超纯水洗脱，室温放置3min后置于磁力架，待溶液澄清后吸取20μL上清液待用。
4.4产物扩增，将PCR引物、VAHTS HiFi扩增液解冻后颠倒混匀，于灭菌管中配制如下表13中的反应体系：
表13反应体系
组分 体积(μL)
上一步产物 20
VAHTS HiFi扩增液 25
PCR引物 5
总计 50
轻轻吹打混匀并短暂离心，放入PCR仪中进行如下表14中的反应程序：
表14反应程序
/>
4.5连接产物纯化，向上述连接产物中加入50μL诺唯赞纯化磁珠，充分混匀后室温静置5min，放置于磁力架约5min使磁珠完全吸附且溶液澄清，小心去除上清；加入200μL新配制的80％乙醇进行漂洗，室温孵育30-60s，小心去除上清，重复一次，待磁珠干燥后，加入26μL超纯水洗脱，室温放置3min后置于磁力架，待溶液澄清后吸取25μL上清液待用。
5.杂交捕获选择Twist Bioscience试剂盒进行(人全外显子捕获试剂盒，货号102033)
6.样本均一化处理，计算投入量：杂交捕获反应分2组进行，反应1：1-8号文库投入187.5ng；反应2样本根据细菌含量占比按公式投入，投入量＝187.5(1-细菌百分比)，即1-8号样本分别投入197ng、208ng、220ng、234ng、250ng、267ng、288ng、312ng。2个反应后续流程均按照试剂盒标准SOP进行操作。
7上机测序，采用illumina Novaseq6000平台进行测序，设置测序量时期望值是4G，反应1和反应2样本数据量的理论值均为32G，测序结果得到反应1和2样本数据量实际测量值分别为48.4G和32.1G。
8.实验结果数据分析：杂交捕获前进行人源DNA均一化，有效均衡上机测序数据量，对反应1样本的数据量进行T检验，计算得到p值为0.04，小于0.05，表示差异性显著，也即是说，杂交捕获前未进行人源DNA计算(未排除细菌含量占比，统一投入187.5ng)，数据产出与理论值差距较大。而对反应2样本的数据量进行T检验，计算得到p值为0.36，大于0.05，表示差异性不显著，也即是说，数据产出与理论值差距较小。反应1和反应2样本的理论数据量和测序数据量的统计结果如下表15所示。
表15反应1和反应2样本数据量统计结果
/>
实施例4
本实施例利用本发明的方法，对人类唾液样本中人源DNA进行检测。采用荧光定量PCR的方法对人源唾液样本进行细菌含量测定，具体包括唾液样本采集、唾液样本DNA提取、唾液样本中细菌含量测定、全基因组文库制备、均一化杂交捕获样本投入量。
1.唾液样本采集：采集16名健康志愿者的唾液样本，令每位志愿者使用漱口水进行漱口，等待半小时后，向唾液DNA保存管(品牌：康为世纪，货号：CW2667S)中轻轻吐入唾液至直至达到1mL刻度线高度，采集完成后上下颠倒10次唾液DNA保存管。
2.唾液样本DNA提取：唾液样本DNA提取采用美基生物的SafPure Saliva DNA Kit(货号：D3134-01)，具体流程包括：
1)转移1mL唾液至2mL离心管中，并加入20μL蛋白酶K至样本中，颠倒混匀60℃水浴30-60分钟，孵育完成，放置于冰上静置3分钟；
2)加入300μL Buffer PPS，涡旋30s，冰上孵育10分钟，随后16000xg离心3分钟；
3)取900μL异丙醇至新的1.5mL离心管中，将上一步产物转移至异丙醇离心管中，颠倒混匀30-50次，室温孵育5分钟，16000xg离心5分钟，随后小心倒弃上清液；
4)重复步骤3一次；
5)室温干燥10分钟，加入50μL TE Buffer，室温轻轻振荡充分溶解DNA。
3.唾液样本中细菌含量测定：细菌含量测定的反应体系以及反应程序均与实施例3相同，唾液样本分别标记为唾液样本1-唾液样本16，样本浓度均稀释至2ng/μL，将测定得到的阈值循环数代入到实施例3中的标准曲线中，计算出唾液样本1-唾液样本16中的细菌含量如下表16所示：
表16细菌含量百分比
4.全基因组文库制备：采用诺唯赞建库试剂盒Universal Plus DNALibrary Prep Kit for Illumina V2(ND627-1)进行基因组文库制备，具体流程与实施例3相同，文库编号Lib1-16，对应唾液样本1-唾液样本16
5.杂交捕获选择Twist Bioscience试剂盒进行(人全外显子捕获试剂盒，货号102033)
6.样本均一化处理，计算投入量：杂交捕获反应分2组进行，反应3：Lib1-8号文库投入187.5ng；反应4中样本根据细菌含量占比按公式投入，投入量＝187.5(1-细菌百分比)，即Lib9-16号样本分别投入228ng、253ng、288ng、317ng、250ng、240ng、210ng、206ng。2个反应后续流程均按照试剂盒标准SOP进行操作。
7.上机测序，采用illumina Novaseq6000平台进行测序，设置测序量时期望值是4G，反应1和反应2样本数据量的理论值均为32G，测序结果得到反应3和4样本数据量实际测量值分别为52.8G和32.4G。
8.实验结果数据分析：杂交捕获前进行人源DNA均一化，有效均衡上机测序数据量，对反应3样本的数据量进行T检验，计算得到p值为0.03，小于0.05，表示差异性显著，也即是说，杂交捕获前未进行人源DNA计算(未排除细菌含量占比，统一投入187.5ng)，数据产出与理论值差距较大。而对反应4样本的数据量进行T检验，计算得到p值为0.35，大于0.05，表示差异性不显著，也即是说，数据产出与理论值差距较小。反应3和反应4样本的理论数据量和测序数据量的统计结果如下表17所示。
表17反应3和反应4样本数据量统计结果
总的来说，本发明提出的检测待测样本中目标DNA的方法、试剂盒以及检测装置，通过以细菌的16sDNAV2-V3保守区域作为靶标序列进行荧光定量PCR检测，设计并选择唯一的特异性引物，避免在对细菌DNA进行检测时出现其他非特异性扩增，提高了定量结果的准确性，可以间接地对待测样本中目标DNA含量进行定量，减少后续试验中细菌DNA对实验结果的干扰，也可通过计算使得用于后续试验的每个样本中目标DNA的含量均衡，提高实验结果的准确性。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (13)

1.一种检测待测样本中目标DNA的方法，其特征在于，所述方法包括：
对所述待测样本进行非目标DNA定量；
基于定量结果，得到所述待测样本中目标DNA含量的校正系数，并对所述待测样本进行均一化处理；
利用经过所述均一化处理的待测样本进行检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括：
进行所述均一化处理之前，利用经过所述非目标DNA定量处理的待测样本制备全基因组文库。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述制备全基因组文库之后，所述方法进一步包括：
利用经过所述均一化处理的待测样本进行测序处理；
所述测序处理包括靶向测序。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测样本包括液体样本、固体样本以及固液混合样本中的至少之一；
所述液体样本包括唾液样本，所述均一化处理包括利用式(I)获得用于所述检测的待测样本含量A：
A＝B/(1-C) 式(I)
其中，
B为期望用于进行所述检测的待测样本中目标DNA含量，B不低于120ng，并且B×待测样本数目的值不高于4000ng；
C为所述非目标DNA定量获得的待测样本中非目标DNA的百分含量。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括：
对所述待测样本中非目标DNA进行定量是基于荧光定量非目标DNA标准曲线进行的，所述荧光定量非目标DNA标准曲线是利用特异性引物进行荧光定量PCR检测得到的，
所述荧光定量非目标DNA标准曲线的横坐标为非目标DNA浓度的lg值，纵坐标为荧光定量PCR反应的阈值循环数；
对所述待测样本中非目标DNA含量进行测定的步骤包括：提取所述待测样本的总DNA，并且利用特异性引物对所述总DNA进行荧光定量PCR检测，并且将检测得到的阈值循环数代入所述标准曲线中，得到所述待测样本中非目标DNA含量。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述特异性引物靶向非目标DNA的保守区域。
7.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括对非目标DNA进行定量检测以及对目标DNA进行检测的试剂；
所述试剂包括基因特异性引物，所述基因特异性引物是以非目标DNA的第一区域作为靶标序列的。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述非目标DNA包括细菌DNA；
所述第一区域包括细菌DNA的保守区域。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述第一区域包括细菌DNA的16srDNA中V2-V3保守区域。
10.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述基因特异性引物包括上游引物和下游引物，
所述上游引物包括与SEQ ID No.1中示出的序列具有至少70％同一性的序列；
所述下游引物包括与SEQ ID No.2中示出的序列具有至少70％同一性的序列；
其中，所述SEQ ID NO.1为5’-TACCGCGGCTGCTGGCA-3’；
所述SEQ ID NO.2为5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’。
11.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，
对非目标DNA进行定量检测的试剂进一步包括探针或染料、阳性对照样品以及阴性对照样品；
对目标DNA进行检测的试剂包括测序试剂；
其中，所述阳性对照样品为非目标DNA标准品，所述阴性对照样品为无核酸酶水；
所述非目标DNA标准品包括细菌DNA标准品；
所述细菌DNA标准品包括大肠杆菌DNA标准品；
所述测序试剂包括靶向测序试剂。
12.一种检测装置，其特征在于，所述检测装置包括：
检测单元，所述检测单元包括第一类型DNA定量单元以及第二类型DNA定量单元，所述第一类型DNA定量单元包括权利要求11所述的试剂盒；
计算单元，所述计算单元基于第一类型DNA定量单元的定量结果，获得第二类型DNA样本校正结果；以及
控制单元，所述控制单元基于所述计算单元的校正结果，调整供给至所述第二类型DNA定量单元的样本含量。
13.根据权利要求12所述的检测装置，其特征在于，所述第一类型DNA定量单元检测的第一类型DNA包括非目标DNA，所述第二类型DNA定量单元检测的第二类型DNA包括目标DNA；
其中，所述非目标DNA包括细菌DNA；
所述目标DNA包括人源DNA。
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