CN107447015B - Illumina平台高通量测序文库定量标准物质的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种Illumina平台高通量测序文库定量标准物质的制备方法，将大肠杆菌基因组DNA经过超声波片断化，通过末端修复和接头连接，磁珠选择回收后可获得文库定量标准物质，再通过建立的染料数字PCR方法进行量值的确定。本发明提供了标准物质的制备方法，采用片段化的大肠杆菌基因组DNA作为文库定量标准物质，可以更好的模拟实际检测中样本的文库构建。本标准物质的定值方法准确度高，不依赖于DNA标准品，测量结果可溯源至个数，从而保证测量结果的可靠和可溯源。本标准物质可作为测量标准用于illumina平台高通量测序文库DNA的准确定量。

Description

Illumina平台高通量测序文库定量标准物质的制备方法

技术领域

本发明涉及基因检测领域，特别是涉及一种高通量测序文库定量标准物质的制备方法。

背景技术

基因测序技术和产业开始于1990年启动的人类基因组计划，是被全球生物科技界公认的对人类健康事业影响深远的基础性技术和效益外溢性极强的产业。具有超高测序通量的新一代DNA测序(Next generation sequencing,NGS)推动基因产业以超摩尔定律的速度迅猛发展。基因序列测量的准确性直接关系到人们对于生命活动的判断，例如癌症诊断、品种鉴定等。由于NGS一次能对几十万到几百万条DNA分子进行序列测序,使得对一个物种的基因组深度测序变得方便易行。

目前市场主流NGS测序仪包括Illumina和Life Technologies公司的测序平台，这两大测序平台文库的定量分析和质量评价对于获得高质量的核酸测序数据十分关键。如果过高的估计测序文库拷贝数，将不能获得足够的测序数据，导致降低数据产出；如果过低的估计测序文库拷贝数，将产生低质量的测序数据，甚至会导致测序失败。因此，要控制NGS测序文库的载入量，保证测序数据的质量，就需要在测序前对DNA测序文库进行定量分析。此外，为减少NGS运行成本，往往需要将不同测序文库等摩尔量合并为一份测序样品同时测序，这也以测序文库的准确定量分析为前提，这样才能保证不同文库的测序数据的可靠性。

目前国内尚无针对高通量测序文库定量标准物质的制备方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种Illumina平台高通量测序文库定量标准物质的制备方法。该方法获得的高通量测序文库定量标准物质量值准确度高，适用性强。

本发明首次建立了高通量测序文库定量标准物质的制备方法，达到了上述发明目的。

本发明的技术方案是：

(1)提取大肠杆菌的基因组DNA，采用超声波进行片断化。

(2)对片断化的DNA进行末端修复，接头连接，磁珠选择性回收可获得文库定量标准物质。

(3)采用染料法数字PCR进行摩尔浓度的确定。

其具体方法为：

步骤(1)中的大肠杆菌的基因组DNA，当被测样本为人基因组时，可替换为其他非人来源的基因组DNA；当被测样本为微生物时,可替换为其它非目标微生物或人源的基因组DNA。大肠杆菌的基因组DNA片断化的DNA长度大小为200bp左右，在连接接头后的长度为355bp左右。

超声破处理片断化的条件为：采用声波聚焦超声波破碎仪处理，强度：5，时间：2min，上样量为100μL，DNA浓度：10-50ng/μL，工作循环：10％，爆破/循环：200，温度：4℃；

所述的片断化是指采用超声波处理使其片断化，优选的实验条件为：采用声波聚焦超声波破碎仪处理，强度：5，时间：6min，上样量为100μL，DNA浓度：10-50ng/μL，工作循环：10％，爆破/循环：200，温度：4℃；

标准物质的定值方法为数字PCR方法，反应体系为：20μL反应体系：2×SYBR PCRmastermix 10μL，双向引物(10μM)0.4μL，DNA模板4μL，ddH₂O 5.6μL。

数字PCR方法的反应程序：95℃5min，95℃20s，60℃40s，45cycles，溶解曲线：95℃5s，65℃1min，95度连续采集信号。

标准物质是拷贝数浓度在10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³copy/μL的系列浓度梯度的标准物质。

本发明的illumina平台高通量测序文库定量标准物质采用数字PCR法进行定值，无需外标，定量结果可可溯源至个数，从而保证标准品量值的可靠和可溯源。本发明的高通量测序文库定量标准物质可以作为定量的标准，用于illumina平台高通量测序文库DNA的准确定量，提高了效率并降低检测质控成本。

具体的，本发明进行了如下研究工作：

1.对超声波处理大肠杆菌基因组DNA的条件进行了优化

采用声波聚焦样本处理仪，对处理强度(intensity)、处理时间等进行了优化(图1)。其中Sample 10、Sample 11、Sample 12处理强度均为5，时间分别为3min、4min、5min。由图可知，处理时间3min，处理强度为5时，所得到大肠杆菌基因组DNA片段分布范围为100～500bp，主峰在220bp，与illumina文库构建时的要求的长度相近。因此最终确定的处理条件为强度：5；时间3min；上样量100μL；Duty Cycle：10％，Cycle per Burst：200，温度：4℃。DNA浓度范围：10-50ng/μl。

2.对连接测序接头后文库DNA的片断范围进行了确认

采用芯片电泳方法对连接接头后的文库DNA片断范围进行了确认(见图2)，结果表明获得的文库DNA标准物质主带为355bp左右，分布范围为255bp至475bp左右。这与illumina平台高通量测序构建文库的大小相当。

3.验证了定值方法的特异性

以E.coli文库DNA为模板，使用上述PCR引物和扩增条件扩增后的得到的溶解曲线分析(如图3)为一单峰，Tm为80℃左右。而以其他非特异性DNA作为模板使用同一PCR引物和扩增条件进行扩增后得到的溶解曲线分析(如图4)不是单一的峰，因此可以很清楚的根据溶解曲线来判断该PCR方法具有良好的序列扩增特异性。

4.验证了不同数字PCR平台的一致性

分别采用芯片数字PCR和微滴数字PCR对所建立的文库定量标准物质定值方法的准确性和一致性进行验证。验证结果表明对同一标准物质测定时两种平台测量结果一致(图5)。

5.对标准物质的适用性进行了验证

对研制的系列梯度标准物质，采用实时荧光定量PCR方法验证了其扩增效率和线性(图6)。分别以五个水平的文库定量标准物质浓度的对数作横坐标，以PCR扩增的Ct值作纵坐标，进行线性拟合，其中斜率为-3.75，计算出扩增效率为85％，线性相关系数r＝0.997。表明5个浓度水平的标准物质线性良好，符合实际应用中作为荧光定量PCR方法的测量标准产生标准曲线。

本发明同现有技术相比，其创新点和优点是：

1、本发明首次采用染料法数字PCR对文库定量标准物质进行精确定量，同时采用荧光定量PCR方法对浓度梯度标准物质的线性进行了验证，证明了其适用性。

2、开创了文库定量标准物质的制备方法，找到了合适的超声波片断化基因组DNA的条件。

3、方法准确度高：采用数字PCR进行定量，不依赖于DNA标准品，因此测量结果可溯源至自然单位，从而保证测量结果的可靠和可溯源。

4、采用本方法制备的高通量测序文库定量标准物质，其中片断化的大肠杆菌基因组DNA文库模拟实际测序样本的DNA文库，具有文库DNA的代表性，可对待测文库DNA进行准确定量，还可显著区分于待测的人源样本，因此本发明的标准物质可以更准确的实现文库DNA的定量。

下面结合附图说明和具体实施例对本发明所述的Illumina平台高通量测序文库定量标准物质的制备方法作进一步说明。

附图说明

图1为超声波处理优化结果图；

图2为文库DNA片断分布图；

图3为特异性扩增溶解曲线；

图4为非特异性扩增溶解曲线；

图5为不同数字PCR平台的一致性比较；

图6为系列梯度标准物质的线性；

图7为超声波处理后的大肠杆菌基因组DNA片断分布图；

图8为KAPA标准品线性；

图9为NEB标准品的线性。

具体实施方式

实施例1

Illumina平台高通量测序文库定量标准物质的制备及定值

一、材料与方法：

1.大肠杆菌(E.coli)基因组DNA提取

将大肠杆菌菌株BL21(DE3)划线培养后，挑单菌落过夜液体培养，离心5000g，弃去上清液，收集菌体，利用康为世纪公司的通用基因组提取试剂盒(CW2298)进行基因组提取。

当被测样本为人基因组时，可替换为其他非人来源的基因组DNA；当被测样本为微生物时,可替换为其它非目标微生物或人源的基因组DNA。

2.随机打断

将上述提取纯化后的E.coli基因组DNA利用Covaris S220仪器随机打断大肠杆菌基因组DNA，处理条件为强度：5，时间：6min，上样量为100μL，DNA浓度：10-50ng/μL，工作循环：10％，爆破/循环：200，温度：4℃；

3.DNA文库构建

取500ng打断大肠杆菌基因组DNA采用康为公司NGS DNA快速建库试剂盒(CW2585)进行文库构建。末端修复、接头连接后进行磁珠选择回收，取10ng进行PCR富集(10个循环)，经DNA纯化后得到E.coliDNA文库。文DNA文库接头为120bp，文库结构如下：

5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT

[Target Sequence]

TGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’。参考序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；

4.标准物质的分装和保存

将上述制备的标准物质稀释到5个浓度后进行分装，每个单元200μL/管。I-NGS-A共分装了400管，对于I-NGS-B，C，D，E每个浓度共分装了200管。将分装的标准物质置于塑料盒中，每盒100管，保存于-70℃冰箱。

5.染料法数字PCR定值

采用数字PCR方法测定文库定量标准物质的拷贝数浓度，再通过公式(1)换算成摩尔浓度。扩增体系如表1。按照表中体系进行芯片数字PCR反应液的配制。

C_mol是摩尔浓度，C_copy是拷贝数浓度，A为阿伏加德罗常数。

芯片加样：首先对12x765芯片标记A1的一端孔内加入1ml的矿物油，然后将芯片放入加样器(IFC controller)，点击“prime”对芯片进行prime。待prime完成后，首先在12x765芯片样品孔的两端孔内加入10μL的无DNA水，然后将配制好的含有DNA模板的PCR反应液10μL加入到标记1-12的样品孔内，再将芯片转移至加样器，点击“load”进行样品的加入。待样品加样完成后将芯片转入BioMark数字PCR仪进行PCR扩增。扩增条件为：95℃5min，95℃20s，60℃40s，45cycles，

PCR扩增结束后采用Fluidigm的Digital PCR analysis软件进行分析处理。

表1.数字PCR扩增体系

Illumina	per tube	15replicates
			MIX with SYBR	5	75
ILLU-F/R(5uM)	0.2	3
			1X TE<sub>0.1</sub>	2.2	33
GE Loading	0.5	7.5
			ROX	0.1	1.5
DNA	2
			Total with DNA	10

二、实验结果

1.大肠杆菌基因组DNA纯化结果

采用1％琼脂糖凝胶电泳检测提取的大肠杆菌基因组DNA，经过检测发现提取的E.coli基因组DNA具有清晰主带，无较明显的弥散。

2.片断化处理结果

打断后利用琼脂糖凝胶电泳分析片段大小和片段分布。电泳结果如图7所示。经过打断后的E.coli基因组DNA片段分布在从200bp左右至2kb左右。

3.文库DNA片断分布

连接测序接头后的文库DNA片断分布范围如图2所示，主带为355bp左右，分布范围为255bp至475bp左右。文库DNA经过Qbit初步定量为18ng/ul。

4.PCR方法特异性

以E.coli文库DNA为模板使用上述PCR引物和扩增条件扩增后的得到的溶解曲线分析(如图3)为一单峰，Tm为80℃左右。而以其他非特异性DNA作为模板使用同一PCR引物和扩增条件进行扩增后得到的溶解曲线分析(如图4)不是单一的峰，因此可以很清楚的根据溶解曲线来判断该PCR方法具有良好的序列扩增特异性。

5.标准物质定值

对五个标准物质分别抽取4管，每管测定3次重复，采用荧光染料法数字PCR方法进行定值，由数字PCR方法直接测定的结果单位为copy/μL，再除以阿佛加德罗常数(6.02×10²³)换算成摩尔浓度(mol/μL)，最后经过单位转换后得到pmol/L(pM)，最后换算得到结果见表2-6。首先对数据进行正态分布检验，然后通过Grubbs’s和Dixon’s检验剔除离群值。经过检验五组定值结果数据均符合正太分布，均不存在可疑值。因此取所有测定结果的算术平均值作为标准物质的量值。经过计算，对五个浓度水平的标准物质的量值分别为57.79pM、6.14pM、0.68pM、0.0627pM、0.0721pM。

表2.文库定量标准物质Level1定值结果(pM)

表3.文库定量标准物质Level2定值结果(pM)

表4.文库定量标准物质Level3定值结果(pM)

表5.文库定量标准物质Level4定值结果(pM)

表6.文库定量标准物质Level5定值结果(pM)

实施例2高通量测序文库定量标准物质适用性验证

一、材料与方法：

1.文库定量标准物质

5个水平的文库定量标准物质，由中国计量科学研究院研制。

2.文库定量试剂盒

文库定量试剂盒，分别购置KAPA公司和NEB公司。

3.荧光定量PCR测定标准物质线性

采用Roche480荧光定量PCR仪，分别测定KAPA公司和Qiagen公司的定量标准品。PCR扩增体系20μL：2×SYBR PCR mastermix 10μL，双向引物(10μM)0.4μL，DNA模板4μL，ddH₂O 5.6μL。PCR反应程序：95℃5min，95℃20s，60℃40s，45cycles，溶解曲线：95℃5s，65℃1min，95度连续采集信号。

二、结果分析

1、文库定量标准物质的线性和扩增效率

对研制的系列梯度标准物质，采用实时荧光定量PCR方法验证了其扩增效率和线性。扩增曲线见图6，分别以五个水平的文库定量标准物质浓度的对数作横坐标，以PCR扩增的Ct值作纵坐标，进行线性拟合，其中斜率为-3.75，计算出扩增效率为85％，线性相关系数r＝0.999。表明5个浓度水平的标准物质线性良好，符合实际应用中作为荧光定量PCR方法的测量标准产生标准曲线。

2、KAPA定量标准品的线性和扩增效率

对KAPA的文库定量标准品，采用实时荧光定量PCR方法验证了其扩增效率和线性。扩增曲线见图8，分别以五个水平的文库定量标准品浓度的对数作横坐标，以PCR扩增的Ct值作纵坐标，进行线性拟合，其中斜率为-3.46，计算出扩增效率为95％，线性相关系数r＝0.999。表明5个浓度水平的标准品线性良好，据了解，KAPA的文库定量标准品为单一长度的DNA片段，而实际测定过程中测定的是一个片断长度在一定范围内的多种DNA片段的混合物，单一长度的DNA片段与荧光染料结合效率必然与多个长度不一的DNA片段混合物与荧光染料结合的效率不同，因此以单一片DNA段作为标准，产生标准曲线对片段长度不唯一的文库DNA进行定量，准确性存在一定的问题，而且该标准品的定值方法为紫外吸收法，此方法受到很多在OD260nm处有吸收的物质的干扰，很难准确进行定量。

3、NEB定量标准品的线性和扩增效率

对NEB的文库定量标准品，采用实时荧光定量PCR方法验证了其扩增效率和线性。扩增曲线见图9，分别以4个水平的文库定量标准品浓度的对数作横坐标，以PCR扩增的Ct值作纵坐标，进行线性拟合，其中斜率为-3.39，计算出扩增效率为97％，线性相关系数r＝0.999。表明4个浓度水平的标准物质线性良好，符合实际应用中作为荧光定量PCR方法的测量标准产生标准曲线。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 中国计量科学研究院

<120> Illumina平台高通量测序文库定量标准物质的制备方法

<130> ss171-237

<141> 2017-09-04

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58

<210> 2

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgatcggaag agcacacgtc tgaactccag tcacnnnnnn atctcgtatg ccgtcttctg 60

cttg 64

Claims (12)

1.一种Illumina平台高通量测序文库定量标准物质的制备方法，包括以下步骤：

（1）提取大肠杆菌的基因组DNA，采用超声波进行片断化；

（2）对片断化的DNA进行末端修复，接头连接，磁珠选择性回收可获得文库定量标准物质；其中，主带为355bp左右，分布范围为255bp至475bp；

（3）采用染料法数字PCR进行摩尔浓度的确定。

2.根据权利要求1所述的Illumina平台高通量测序文库定量标准物质的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中，片断化的DNA长度大小为200bp左右。

3.根据权利要求1所述的Illumina平台高通量测序文库定量标准物质的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中，所确定磁珠回收的片断大小为355bp左右。

4.根据权利要求1或2所述的Illumina平台高通量测序文库定量标准物质的制备方法，其特征在于：超声破处理片断化的条件为：采用声波聚焦超声波破碎仪处理，强度：5，时间：2min，上样量为100 μL，DNA浓度：10-50 ng/μL，工作循环：10%，爆破/循环：200，温度：4℃。

5.根据权利要求1所述的Illumina平台高通量测序文库定量标准物质的制备方法，其特征在于：步骤（3）所述的方法为数字PCR方法，反应体系为：20μL反应体系：2×SYBR PCRmastermix 10 μL，双向引物（10μM）0.4μL，DNA模板4μL，ddH₂O 5.6 μL。

6.根据权利要求1所述的Illumina平台高通量测序文库定量标准物质的制备方法，其特征在于：步骤（3）中的PCR反应程序：95℃ 5 min，95℃20s，60℃40s，45 cycles，溶解曲线：95℃5s，65℃ 1min，95度连续采集信号。

7.根据权利要求1-3、5-6任一项所述的Illumina平台高通量测序文库定量标准物质的制备方法，其特征在于：步骤（1）中的大肠杆菌的基因组DNA，当被测样本为人基因组时，可替换为其他非人来源的基因组DNA；当被测样本为微生物时,可替换为其它非目标微生物或人源的基因组DNA。

8.根据权利要求4所述的Illumina平台高通量测序文库定量标准物质的制备方法，其特征在于：步骤（1）中的大肠杆菌的基因组DNA，当被测样本为人基因组时，可替换为其他非人来源的基因组DNA；当被测样本为微生物时,可替换为其它非目标微生物或人源的基因组DNA。

9.根据权利要求1-3、5-6任一项所述的Illumina平台高通量测序文库定量标准物质的制备方法，其特征在于：所述的标准物质是稀释至拷贝数浓度在10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³copy/μL。

10.根据权利要求4所述的Illumina平台高通量测序文库定量标准物质的制备方法，其特征在于：所述的标准物质是稀释至拷贝数浓度在10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³copy/μL。

11.根据权利要求7所述的Illumina平台高通量测序文库定量标准物质的制备方法，其特征在于：所述的标准物质是稀释至拷贝数浓度在10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³copy/μL。

12.根据权利要求8所述的Illumina平台高通量测序文库定量标准物质的制备方法，其特征在于：所述的标准物质是稀释至拷贝数浓度在10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³copy/μL。

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