CN113736919A - 一种核酸检测试剂盒及其使用方法 - Google Patents
一种核酸检测试剂盒及其使用方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113736919A CN113736919A CN202111072776.0A CN202111072776A CN113736919A CN 113736919 A CN113736919 A CN 113736919A CN 202111072776 A CN202111072776 A CN 202111072776A CN 113736919 A CN113736919 A CN 113736919A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- reagent
- nucleic acid
- test
- detection kit
- acid detection
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 85
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 68
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 68
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 68
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 11
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 79
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 28
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 27
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 24
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims abstract description 18
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims abstract description 9
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims abstract description 9
- 150000004043 trisaccharides Chemical class 0.000 claims abstract description 9
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 claims abstract description 8
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 claims abstract description 8
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 claims abstract description 8
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 claims abstract description 8
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 claims abstract description 8
- MCHZKGNHFPNZDP-UHFFFAOYSA-N 2-aminoethane-1,1,1-triol;hydrochloride Chemical compound Cl.NCC(O)(O)O MCHZKGNHFPNZDP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 claims description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 13
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 claims description 12
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 claims description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 6
- 241000713196 Influenza B virus Species 0.000 claims description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 5
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 claims description 4
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 4
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 claims description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 3
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L magnesium chloride Substances [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 2
- 125000000647 trehalose group Chemical group 0.000 claims description 2
- BITMAWRCWSHCRW-PFQJHCPISA-N Raffinose Pentahydrate Chemical group O.O.O.O.O.O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 BITMAWRCWSHCRW-PFQJHCPISA-N 0.000 claims 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 12
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 description 6
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 6
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 6
- 210000003300 oropharynx Anatomy 0.000 description 5
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 3
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 3
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000221787 Erysiphe Species 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 208000037798 influenza B Diseases 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N Betaine Natural products C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QWIZNVHXZXRPDR-UHFFFAOYSA-N D-melezitose Natural products O1C(CO)C(O)C(O)C(O)C1OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O QWIZNVHXZXRPDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701076 Macacine alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-O N,N,N-trimethylglycinium Chemical compound C[N+](C)(C)CC(O)=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 description 1
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 description 1
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 1
- 229910001437 manganese ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- -1 melezitose pentahydrate Chemical class 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical group O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 1
- 230000001932 seasonal effect Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种核酸检测试剂盒及其使用方法，包括第一试剂；所述第一试剂中包括：无核酸酶超纯水，引物探针mix，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐10～100mM，一价阳离子20～120mM，二价阳离子1～10mM，牛血清白蛋白0.05～1mg/ml，脱氧核糖核苷三磷酸0.1～0.8mM，氨基乙酸2～30mM，天然糖0.05～0.5M，三糖质量浓度5～20％，MMLV酶10～100U/test，Taq酶1～5U/test，UNG酶0.1～1U/test。本发明通过对检测试剂中的各组分及其用量进行筛选优化，得到了一种扩增效率和检测灵敏度均显著提高的检测试剂盒，并且该试剂盒可兼容多种不同核酸的检测，可常温运输，常温储存，操作简单，具有极高的市场应用价值。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种核酸检测试剂盒及其使用方法。
背景技术
病毒检测是各国不可或缺的重要软实力，世界各地对疾病诊断的完成速度、检验窗口期、检验灵敏度以及大量检验涉及到的运输及储存问题均有较高要求。
酶联免疫法(ELISA Enzyme-Linked Immunosorbnent assay)是临床上较为常用的检测方式，此方法对待检病毒载量要求较高，往往存在窗口期，容易导致漏检或错过最佳诊疗时间。近年来，核酸检测技术由于其灵敏度高、特异性好，且检测时间短，已经慢慢普及并为直接检测病毒提供了新的方法，目前应用于临床检测的常见核酸检测技术包括荧光PCR、反向斑点杂交技术、液相芯片技术、恒温扩增技术、微流控芯片技术、测序技术等，具体技术原理在这里不作赘述。理论上讲，只要样本有一个拷贝的目的靶标存在，PCR检测体系就能识别到，核酸平台的普及解决了免疫学检测的“窗口期”问题，极大地提高了诊疗系统判读效率，一些高敏试剂盒对用药后效果监测也起到很有效的辅助作用，目前已经越来越被行业重视并广泛采用。
随着核酸技术的普及，专业人员已经不再满足于常规的检测条件，对核酸检测技术各方面的升级也成为了时下研究的热点课题，目前常规核酸提取试剂经过市场的检验，大致存在以下共性问题：1)检测时间过长，至少需要1h-1.5h；2)灵敏度普遍不够高，一般在500copy/ml以上；3)试剂需要冷链运输；4)试剂储存条件一般为-20℃以下，存在反复冻融性能衰减或失效的问题；5)试剂开封后仍需技术人员分液至单管检测，操作步骤相对繁琐。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种核酸检测试剂盒，通过对检测试剂各组分及其用量进行筛选优化，得到了一种扩增效率和检测灵敏度均显著提高的检测试剂盒，并且该试剂盒可兼容多种不同核酸的检测，可常温运输，常温储存，操作简单，具有极高的市场应用价值。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
本发明提供了一种核酸检测试剂盒，包括：第一试剂；
所述第一试剂中包括：无核酸酶超纯水，引物探针mix，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐10～100mM，一价阳离子20～120mM，二价阳离子1～10mM，牛血清白蛋白0.05～1mg/ml，脱氧核糖核苷三磷酸0.1～0.8mM，氨基乙酸2～30mM，天然糖0.05～0.5M，三糖质量浓度5～20％，MMLV酶10～100U/test，Taq酶1～5U/test，UNG酶0.1～1U/test。
进一步地，所述第一试剂中包括：无核酸酶超纯水，引物探针mix，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐20～50mM，一价阳离子40～80mM，二价阳离子2～6mM，牛血清白蛋白0.05～0.2mg/ml，脱氧核糖核苷三磷酸0.15～0.3mM，氨基乙酸0.8～1.3mM，天然糖0.05～0.15M，三糖质量浓度6～15％，MMLV酶40～100U/test，Taq酶2～4U/test，UNG酶0.15～0.3U/test。
进一步地，所述第一试剂中包括：无核酸酶超纯水，引物探针mix，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐40mM，一价阳离子60mM，二价阳离子4mM，牛血清白蛋白0.10mg/ml，脱氧核糖核苷三磷酸0.2mM，氨基乙酸1mM，天然糖0.1M，三糖质量浓度10％，MMLV酶80U/test，Taq酶3.2U/test，UNG酶0.2U/test。
进一步地，所述一价阳离子为KCl，所述二价阳离子为MgCl2，所述天然糖为海藻糖，所述三糖为蜜三糖五水。
进一步地，所述核酸检测试剂盒中还包括：第二试剂、第三试剂和第四试剂；
其中所述第二试剂为阳性质控试剂，包括：目的核酸和TE缓冲液；
所述第三试剂为阴性质控试剂，包括：10～100mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液；
所述第四试剂为复溶剂，包括：50～200mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液。
进一步地，所述第二试剂中包括：1×104～1×106copy/mL的目的核酸。优选为1×105copy/mL。
进一步地，所述第二试剂中TE缓冲液中EDTA浓度为0.05～0.5mM，优选为0.1mM
进一步地，所述第三试剂和第四试剂中三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液的pH值为8.5。
进一步地，所述第三试剂中的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐浓度为10～50mM，优选为10mM。
进一步地，所述第四试剂中三羟甲基氨基甲烷盐酸盐浓度为50-80mM，优选为50mM。
进一步地，所述第一试剂、第二试剂、第三试剂和第四试剂中还包括DMSO、甜菜碱、锰离子、TMAC、甲酰胺和甘油中的一种或多种。
本发明还提供了上述核酸检测试剂盒在制备新型冠状病毒，或甲型流感病毒，或乙型流感病毒核酸检测试剂盒中的应用。
本发明还提供了上述核酸检测试剂盒的使用方法，所述方法包括：
将第四试剂和第二试剂混合，震荡充分，得到阳性质控品；将第三试剂作为阴性质控品；接着将待测核酸样本、阳性质控品和阴性质控品依次加入96孔板中，并分别加入预分装好的第一试剂中，混匀，设置反应程序，进行荧光定量PCR扩增反应。
进一步地，所述反应程序包括：
(1)40-60℃，保持3-15min；优选为50℃，保持5min；
(2)80-100℃，保持30-5min；优选为95℃，保持1min
(3)80-120℃，保持1-10s接着50-72℃保持10-50s；循环40-45次；优选为95℃保持3s接着60℃保持15s，循环42次。
(4)30-50℃，保持10-30min。优选为37℃保持15min。
进一步地，所述第一试剂与待测核酸样本的体积比为1：1-2，优选为1:1.25。
进一步地，所述第二试剂与第四试剂的体积比为1:50-100，优选为1:80。
进一步地，所述第三试剂的体积为1-2mL，优选为1.8mL。
进一步地，所述第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂体积比为1:(0.8-1.2)：(60-100)：(50-100)，优选为1:1:80:90。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明所述的核酸检测试剂盒在运输及储存方面具有极大优势，可于常温进行运输储存，彻底摆脱了冷链，并释放了目标客户的冷藏储备空间，避免了传统试剂需要在-20℃冷链运输并长期储存的局限性以及会存在反复冻融，受到断电温度波动等影响的缺陷，因此更具市场使用价值。
(2)本发明所述的核酸检测试剂盒在扩增效率上具有高的性价比，一般快速试剂盒都是在牺牲检测灵敏度的前提下进行妥协的，本发明的试剂盒克服了这个矛盾点，在配套influenza A/B Vrius和新型冠状病毒nCoV-2019体系时，灵敏度均可达100copy/mL；同时扩增总时间压缩在40分钟之内，远低于市面上常见的1-2小时。
(3)本发明所述的核酸检测试剂盒通过大量市场调研、实验筛查及关键物料的选择、调整，在使用舒适性上、运输、存储条件上均做出了突破，具有通用性好，运输及储存条件更方便，扩增效率高，操作简易，重复率、稳定性好的优点，具有极大的市场应用前景。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1核酸检测试剂盒在新型冠状病毒检测中的应用
为研究本发明试剂盒的检测效果，选择本发明试剂盒与明德生物科技股份有限公司生产的新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(鄂械注准20203400212)进行比较，对武汉同济医院提供的58例新型冠状病毒痰液确诊阳性样本进行检测。样本情况特别说明：由于样本获取困难，检测使用的为回顾性样本，部分样本经过了多次反复冻融，临床单位老师告知会有核酸出现降解、拷贝数很低导致检测不出的情况，由于情况的特殊性，愿意多送我们8例样本(原50例增至58例)。
(1)试剂组成
本发明所述核酸检测试剂盒由第一试剂、第二试剂、第三试剂、第四试剂组成。其中：
第一试剂组成如下：无核酸酶超纯水，引物探针mix，40mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)，60mM的KCl，4mM的MgCl2，0.10mg/ml的牛血清白蛋白(BSA)，0.2mM的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)，1mM的氨基乙酸(甘氨酸)，0.1M的海藻糖，质量浓度10％的蜜三糖五水，80U/test的MMLV酶，3.2U/test的Taq酶，0.2U/test的UNG酶；
第二试剂组成如下：1x105copy/mL假新型冠状病毒，含0.1mM EDTA的TE缓冲液；
第三试剂组成如下：Tris-HCl溶液，浓度为10mM，pH 8.5；
第四试剂组成如下：Tris-HCl溶液，浓度为50mM，pH 8.5。
鄂械注准20203400212的新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒的组成及使用方法详见说明书。
可采用本领域常规设计的新型冠状病毒引物探针进行检测，其中本实施例所采用的引物探针包括：
| 引物探针名称 | 中文名称 | 序列(5’to 3’) |
| NG-F1 | N基因上游引物 | CCCTGTCGTGTTTACACTTAA |
| NG-R1 | N基因下游引物 | ACGATTGTGTCACAGCTGA |
| Ng-FAM | N基因探针 | CCGTCTGCGGTATGTTCAAGGTTATGG |
| ORF1AB-F2 | ORF1AB基因上游引物 | GATTACAAACAGCTGCTCGCAAA |
| ORF1AB-R2 | ORF1AB基因下游引物 | TGCCAAGTCGCGACATTC |
| ORF1AB-HTP3 | ORF1AB基因探针 | CCTACCCGCTTCAGCGTTCTTC |
| RNaseP-F1 | RNaseP基因上游引物 | AGATTGTGACCTGCGAGCG |
| RNaseP-R1 | RNaseP基因下游引物 | GAGTCCGTGTCTCCACAAGT |
| RNaseP-RTP1 | RNaseP基因探针 | TTCTGACCTGAAGTTCCTGCGCG |
(2)核酸检测
对武汉市同济医院提供的58例新型冠状病毒nCoV-2019核酸样本进行检测。由于相关法规要求，新型冠状病毒nCoV-2019临床确诊阳性样本的核酸提取实验由同济医院相关技术人员完成，使用的提取试剂盒为西安天隆科技有限公司的核酸提取纯化试剂盒(陕西械备20210028)。
分别使用本发明试剂盒反应液及新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(鄂械注准20203400212)反应液与提取后的核酸进行混合，使用荧光定量PCR对反应试剂进行检测。
其中本发明所述核酸检测试剂盒中第一试剂与待测核酸样本按照体积比1:1.25混合，鄂械注准20203400212的新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒按照说明书的操作将反应液与提取后的核酸进行混合。
其中荧光定量PCR反应程序如下表所示：
检测结果如表1和表2所示：
表1检测结果比较
表2临床试验数据汇总
根据表1和表2的检测结果可以看出，由于新型冠状病毒为RNA核酸病毒，反复冻融导致核酸降解，大部分阳性确诊样本的病毒载量已经不高了，部分样本已经完全降解。同时可以看出，使用本发明试剂盒进行检测时的检出率更高，有7例未检出，而新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(鄂械注准20203400212)有12例未检出，包含本发明试剂盒未检出的7例样本。由于核酸降解的原因，侧面证明本发明试剂盒拥有更高的灵敏度。
实施例2试剂盒对新型冠状病毒的最低检出限
为验证本发明所述试剂盒的最低检出限即灵敏度，设计以下实验进行研究：
1)用新型冠状病毒口咽、痰液阴性样本梯度稀释新型冠状病毒2019-nCoV至检测限浓度100拷贝/mL；
2)取3个批次试剂盒，每个批次试剂检测20次，统计3个批次试剂检测结果，验证试剂盒对该100拷贝/mL检测限的样本检出能力。
检测结果如表3所示，用三个批次的试剂盒检测新冠阴性的口咽、痰液样本稀释到100copies/mL的假病毒，阳性检出率均不低于90％。表明试剂盒的灵敏度符合要求。
表3灵敏度检测结果
实施例3试剂盒的精密度检测
为验证本发明试剂盒批内，批间，日内，日间的检测一致性，设计如下实验对本发明所述核酸检测试剂盒的精密度进行检测:
1)用新型冠状病毒口咽、痰液阴性样本梯度稀释Ng质粒和ORF1ab野生型质粒至3000拷贝/mL(中阳性)和1000拷贝/mL(弱阳性)；
2)用1个批次试剂盒，检测口咽、痰液3000拷贝/mL(中阳性)和1000拷贝/mL(弱阳性)样本以及口咽、痰液阴性样本，每个样本检测20次，统计分析检测结果的精密度。
结果如表4所示，结果显示试剂盒检测不同类型样本20次的精密度良好，阳性精密度CT值变异系数(CV，％)不大于5％，阴性符合率100％。
表4精密度检查结果
实施例4核酸检测试剂盒在甲型/乙型流感病毒检测中的应用
为验证本发明试剂盒的通用型，使用本发明所述核酸检测试剂盒分别匹配本领域常规设计的甲型流感病毒及乙型流感病毒引物探针，形成扩增体系，对阴阳性符合率及灵敏度进行检测。
本实施例使用的样本为中检院提供，甲型流感病毒拥有5个主要亚型，分别为H1N12009、H1N1季节性流感、H3N2、H5N1、H7N9；乙型流感病毒拥有2个亚型，分别为Yamagata及Victoria。对这两类共7种样本进行梯度稀释后，使用ddPCR进行定值。得到7种拷贝数为137copies/mL的核酸样本。
对7种137copies/mL的核酸样本进行检测，每种亚型样本做8次重复，检测结果如表5所示，结果显示，本发明的试剂盒对于甲型流感病毒及乙型流感病毒均具有高检测灵敏度，对于100copy左右各亚型样本均能全部检出。证明本发明试剂盒具有高兼容性，可广泛适用于多种不同的核酸检测体系。
表5甲型/乙型流感病毒检测结果
实施例5核酸检测试剂盒常温运输、储存稳定性研究
为验证所述核酸检测试剂盒常温运输及储存的稳定性，进行以下实验：
1)将27盒本发明所述核酸检测试剂盒至于52℃恒温摇床上放置7天，模拟在高温度下运输。
2)将27盒试剂取出后放在2-28℃避光储存，分为三批，分配至A、B、C三组中，A组为52℃恒温摇床放置7天后全性能检验所用试剂，B组2-28℃(如4℃)避光储存6个月，C组2-28℃(如4℃)避光储存9个月。每组共9盒试剂，包括3盒第一批次、3盒第二批次与3盒第三批次。
3)分组完成后，立即取出A组所有试剂，依次完成三个批次试剂盒各分析性能的检验，进行0个月的模拟高温运输后稳定性研究。
4)6个月后取出B组所有试剂，依次完成三个批次试剂盒各分析性能的检验，进行6个月的模拟高温运输后实时稳定性研究。
5)9个月后取出C组所有试剂，依次完成三个批次试剂盒各分析性能的检验，进行9个月的拟高温运输后实时稳定性研究。
其中运输后0个月实时稳定性研究结果如表6所示，运输后6个月实时稳定性研究结果如表7所示，运输后9个月实时稳定性研究结果如表8所示。
表6运输后0个月实时稳定性结果
表7运输后6个月实时稳定性结果
表8运输后9个月实时稳定性结果
结果显示，三个批次的试剂盒于52℃恒温摇床上放置7天模拟高温运输条件后，其各项性能仍符合要求，然后于2-28℃避光长期储存6-9个月，其性能也符合要求，即说明本发明所述核酸检测试剂盒具有优异的常温稳定性，可于常温进行运输和长期储存，从而避免了传统试剂需要在-20℃冷链运输并长期储存的局限性以及会存在反复冻融，受到断电温度波动等影响的缺陷，因此更具市场使用价值。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种核酸检测试剂盒，其特征在于，所述核酸检测试剂盒中包括：第一试剂；
所述第一试剂中包括：无核酸酶超纯水，引物探针mix，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐10～100mM，一价阳离子20～120mM，二价阳离子1～10mM，牛血清白蛋白0.05～1mg/ml，脱氧核糖核苷三磷酸0.1～0.8mM，氨基乙酸2～30mM，天然糖0.05～0.5M，三糖质量浓度5～20％，MMLV酶10～100U/test，Taq酶1～5U/test，UNG酶0.1～1U/test。
2.根据权利要求1所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述第一试剂中包括：无核酸酶超纯水，引物探针mix，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐20～50mM，一价阳离子40～80mM，二价阳离子2～6mM，牛血清白蛋白0.05～0.2mg/ml，脱氧核糖核苷三磷酸0.15～0.3mM，氨基乙酸0.8～1.3mM，天然糖0.05～0.15M，三糖质量浓度6～15％，MMLV酶40～100U/test，Taq酶2～4U/test，UNG酶0.15～0.3U/test。
3.根据权利要求1所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述第一试剂中包括：无核酸酶超纯水，引物探针mix，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐40mM，一价阳离子60mM，二价阳离子4mM，牛血清白蛋白0.10mg/ml，脱氧核糖核苷三磷酸0.2mM，氨基乙酸1mM，天然糖0.1M，三糖质量浓度10％，MMLV酶80U/test，Taq酶3.2U/test，UNG酶0.2U/test。
4.根据权利要求1-3任一项所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述一价阳离子为KCl，所述二价阳离子为MgCl2，所述天然糖为海藻糖，所述三糖为蜜三糖五水。
5.根据权利要求1所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述核酸检测试剂盒中还包括：第二试剂、第三试剂和第四试剂；
其中所述第二试剂为阳性质控试剂，包括：目的核酸和TE缓冲液；
所述第三试剂为阴性质控试剂，包括：10～100mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液；
所述第四试剂为复溶剂，包括：50～200mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液。
6.根据权利要求5所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述第二试剂中包括：1×104～1×106copy/mL的目的核酸。
7.根据权利要求5所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述第三试剂和第四试剂中三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液的pH值为8.5。
8.如权利要求1-7任一项所述的核酸检测试剂盒在制备新型冠状病毒，或甲型流感病毒，或乙型流感病毒核酸检测试剂盒中的应用。
9.如权利要求1-7任一项所述的核酸检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述方法包括：
将第四试剂和第二试剂混合，震荡充分，得到阳性质控品；将第三试剂作为阴性质控品；接着将待测核酸样本、阳性质控品和阴性质控品依次加入96孔板中，并分别加入预分装好的第一试剂中，混匀，设置反应程序，进行荧光定量PCR扩增反应。
10.根据权利要求9所述的使用方法，其特征在于，所述反应程序包括：
(1)40-60℃，保持3-15min；
(2)80-100℃，保持30-5min；
(3)80-120℃，保持1-10s接着50-72℃保持10-50s；循环40-45次；
(4)30-50℃，保持10-30min。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111072776.0A CN113736919A (zh) | 2021-09-14 | 2021-09-14 | 一种核酸检测试剂盒及其使用方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111072776.0A CN113736919A (zh) | 2021-09-14 | 2021-09-14 | 一种核酸检测试剂盒及其使用方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113736919A true CN113736919A (zh) | 2021-12-03 |
Family
ID=78738590
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111072776.0A Pending CN113736919A (zh) | 2021-09-14 | 2021-09-14 | 一种核酸检测试剂盒及其使用方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113736919A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114540542A (zh) * | 2021-12-10 | 2022-05-27 | 山东博弘基因科技有限公司 | 一种分析灵敏度高的乙肝病毒核酸检测试剂盒 |
Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101128604A (zh) * | 2005-02-28 | 2008-02-20 | 生物探索公司 | 用于进行涉及核酸分子的直接酶反应的方法 |
| US20080050737A1 (en) * | 2006-05-23 | 2008-02-28 | Boaz Arieli | Ambient Temperature Stable Kits for Molecular Diagnostics |
| CN101492744A (zh) * | 2009-03-10 | 2009-07-29 | 上海浩源生物科技有限公司 | Pcr反应中的非竞争性内对照系统 |
| CN106566893A (zh) * | 2016-09-29 | 2017-04-19 | 辽宁耳康基因技术有限公司 | 一种检测猪肉中病毒的方法和试剂盒 |
| CN107002064A (zh) * | 2014-12-19 | 2017-08-01 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 稳定的反应混合物 |
| CN112725535A (zh) * | 2021-02-03 | 2021-04-30 | 无锡中德美联生物技术有限公司 | 同时检测全长与截短的HBV pgRNA荧光定量PCR试剂盒及其应用 |
| CN112725527A (zh) * | 2020-12-27 | 2021-04-30 | 青岛巴特菲科技发展有限公司 | SARS-CoV-2全预混冻干荧光PCR检测试剂盒及其方法 |
| CN112760415A (zh) * | 2020-12-27 | 2021-05-07 | 青岛巴特菲科技发展有限公司 | 新型冠状病毒、甲型和乙型流感病毒全预混冻干多重荧光pcr检测试剂盒及其检测方法 |
| CN112831551A (zh) * | 2021-01-22 | 2021-05-25 | 武汉明德生物科技股份有限公司 | 一种全预混rt-pcr反应体系及其应用 |
-
2021
- 2021-09-14 CN CN202111072776.0A patent/CN113736919A/zh active Pending
Patent Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101128604A (zh) * | 2005-02-28 | 2008-02-20 | 生物探索公司 | 用于进行涉及核酸分子的直接酶反应的方法 |
| US20080050737A1 (en) * | 2006-05-23 | 2008-02-28 | Boaz Arieli | Ambient Temperature Stable Kits for Molecular Diagnostics |
| CN101492744A (zh) * | 2009-03-10 | 2009-07-29 | 上海浩源生物科技有限公司 | Pcr反应中的非竞争性内对照系统 |
| CN107002064A (zh) * | 2014-12-19 | 2017-08-01 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 稳定的反应混合物 |
| CN106566893A (zh) * | 2016-09-29 | 2017-04-19 | 辽宁耳康基因技术有限公司 | 一种检测猪肉中病毒的方法和试剂盒 |
| CN112725527A (zh) * | 2020-12-27 | 2021-04-30 | 青岛巴特菲科技发展有限公司 | SARS-CoV-2全预混冻干荧光PCR检测试剂盒及其方法 |
| CN112760415A (zh) * | 2020-12-27 | 2021-05-07 | 青岛巴特菲科技发展有限公司 | 新型冠状病毒、甲型和乙型流感病毒全预混冻干多重荧光pcr检测试剂盒及其检测方法 |
| CN112831551A (zh) * | 2021-01-22 | 2021-05-25 | 武汉明德生物科技股份有限公司 | 一种全预混rt-pcr反应体系及其应用 |
| CN112725535A (zh) * | 2021-02-03 | 2021-04-30 | 无锡中德美联生物技术有限公司 | 同时检测全长与截短的HBV pgRNA荧光定量PCR试剂盒及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 方亮主编: "《全国高等医药院校药学类第四轮规划教材 药剂学》", vol. 3, 中国医药科技出版社, pages: 508 - 509 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114540542A (zh) * | 2021-12-10 | 2022-05-27 | 山东博弘基因科技有限公司 | 一种分析灵敏度高的乙肝病毒核酸检测试剂盒 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111235313A (zh) | 一种快速检测新型冠状病毒的CRISPR-Cas13方法 | |
| CN103397107B (zh) | 牛病毒性腹泻病毒荧光定量rt-pcr检测试剂盒 | |
| CN109778321B (zh) | 一种用于宏基因组测序的建库方法、试剂盒和测序方法 | |
| Thi et al. | Screening for SARS-CoV-2 infections with colorimetric RT-LAMP and LAMP sequencing | |
| CN110218819A (zh) | 一种检测猪呼吸道疫病病原的高通量微流控芯片及检测方法 | |
| CN106191311A (zh) | 一种快速检测豚鼠LCMV、SV、PVM、Reo‑3病毒的多重液相基因芯片方法及试剂 | |
| CN112725475A (zh) | 一种结核分枝杆菌检测引物和探针组合物、试剂盒及应用 | |
| CN113736919A (zh) | 一种核酸检测试剂盒及其使用方法 | |
| CN108546779A (zh) | 牛轮状病毒的rpa-侧流层析检测引物、探针及试剂盒 | |
| CN113444773B (zh) | 一种基于液相芯片检测蜱虫病原体核酸的方法及试剂盒 | |
| CN101089195A (zh) | 用于检测硫酸盐还原菌的引物和荧光探针 | |
| CN107630097A (zh) | 一种快速检测泌尿生殖道感染常见病原体的引物组及试剂盒 | |
| CN111254224A (zh) | 一种定量检测人类嗜t淋巴细胞病毒前病毒的方法 | |
| CN113249441B (zh) | 用于血流感染病原微生物检测的参考品及其制备方法 | |
| CN102994650A (zh) | 一种基于毛细电泳的致脑炎病毒多重基因检测方法 | |
| CN102367494B (zh) | 用于鼠源rna病毒多重实时荧光pcr检测的引物、探针及其试剂盒 | |
| CN110592277A (zh) | 一种用于大麦条纹花叶病毒微流控芯片快速检测的引物组及其快速检测方法 | |
| CN113801963B (zh) | 一种检测冠状病毒的引物探针组合、试剂盒及方法 | |
| CN109971886A (zh) | 一种用于检测cpv核酸的试剂盒、rpa引物对、探针及方法 | |
| CN115725784A (zh) | 检测呼吸道感染相关的病原体的试剂盒及方法 | |
| CN101086021A (zh) | 用于检测硫酸盐还原菌的引物和荧光探针 | |
| CN115094122A (zh) | 一种基于RPA-CRISPR-Cas12a可视化检测鸭疫里氏杆菌的试剂盒及应用 | |
| KR101886274B1 (ko) | 메르스 코로나 바이러스의 검출용 조성물 및 이를 포함하는 메르스 코로나바이러스 검출방법 및 키트 | |
| CN111575403A (zh) | 一种检测rna病毒核酸的高通量数字pcr试剂盒及检测方法 | |
| CN112176101A (zh) | 一种离心式微流控芯片结合环介导等温扩增技术用于猪细小病毒检测的试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |