CN111500691A - 微生物高通量dna测序数据的质量控制标准品和质量控制方法 - Google Patents

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赵琳娜
崔生辉
张伟
刘娜
王学硕
路勇
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Abstract

本发明公开了微生物高通量DNA测序数据的质控标准品和质量控制方法。本发明的质控标准品是一段人工合成多核苷酸序列，核酸分子其大小为5Kb，分别由5个1Kb片段组成，这5个1Kb片段可以有A(5，5)种自由组合方式，采用重叠延伸PCR分子技术将其进行不同组合的连接。本发明的质量控制方法利用该质控标准品，能够实现对影响NGS检测结果的实验室管理、人员、检测实验和生物信息学分析等因素的质量控制，同时防止测序过程中因样本编号混淆带来的错误，提高测试的准确性，以更有效应用于利用高通量测序技术的各领域，能够有效的评估测序的稳定性和准确性，确保测序数据分析的可靠性。

Description

微生物高通量DNA测序数据的质量控制标准品和质量控制 方法
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种微生物高通量DNA测序数据的质控标准品和质量控制方法。
背景技术
高通量测序技术又称“下一代”测序(next-generation sequencing，NGS) 技术，可以一次性测定几十万甚至几百万条序列，是现今应用最广泛的测序技术。相对于传统的Sanger测序技术，高通量测序具有高速、高通量、低价格等优点。目前，高通量测序技术广泛应用于生物学研究、医学、环境、农业、食品安全等诸多领域，为在分子水平检测研究的整体状态提供了非常有力的工具。
高通量测序技术除了复杂的技术流程外，还具备的重要特点是实现测序数据的生物信息处理，通过信息分析将测序仪获得的原始数据转换成可以用于研究鉴定解读的核酸序列，因此测序数据的准确性，是否满足应用需求，这些均与不同基因测序平台和测序试剂在测序流程中可能存在内在偏好和“盲点”、测序技术的流程涉及到实验与数据处理中的多个方面、操作者的主观因素影响等因素密切相关，而当前高通量测序数据的质量参差不齐，结果分析的不确定性很大，成为影响下游数据分析的一个严重问题。
精准的测序结果是实现NGS检测应用价值的前提。目前国内甚至全球还没有建立统一规范化的NGS数据质控标准，因此，只有数据质量合格，才能保证后续数据分析的有效性和结果的可靠性。为确保基因测序的准确可靠，政府监管部门、基因检测企业和相关研究机构急需有关高通量测序基因序列的质控品，用于与基因序列相关的监管和质量控制。
现有的常规的质量控制品是从众所周知的样品(如大肠杆菌O157基因组)产生的DNA序列标准物质。但是，天然存在的样品作为控制的应用，可以表现出自身的变动，这是由于样品的单个碱基的突变。此外，这些常规的质量控制品在制备时，经常会导致不同的序列被引入样品序列中，由此在待测样品自身内产生噪音。
目前我国和世界上各实验室所用的NGS检测均为实验室自建试验，这意味着NGS检测在应用中具有非常大的灵活性，也意味着NGS检测应用具有较大的风险性和结果不确定性。这给NGS检测实验室的管理、人员培训和质量控制等(包括检测实验和生物信息学分析)带来巨大的压力。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种新型的可组合的已知人工多核苷酸序列组成的质控品，添加到实际检测样品中一起进行高通量基因测序检测，通过质控标准品的测序质量不仅能够反应出实际样品的测序质量，而且能够利用不同样品添加不同的质控标准品实现对大规模平行样品的唯一性标识，将样品和测序结果进行有效的一一对应。
为了实现上述目的，本发明提供技术方案如下:
本发明首先提供了一种微生物高通量DNA测序数据的质控标准品，其为一段人工合成的多核苷酸序列，核酸分子其大小为5Kb，分别由5个1Kb 片段组成，这5个1Kb片段可以有A(5，5)种自由组合方式，采用重叠延伸PCR分子技术将其进行不同组合的连接。其中，每个1Kb片段由ACG 三个碱基组成。
本发明还提供了一种微生物高通量DNA测序数据的质量控制方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、构建质控标准品；
S2、将构建好的具有一系列已知浓度和长度的不同序列的质控标准品加入样本中，均匀混合；
S3、进行高通量测序建库及生物信息学分析；
S4、依据不同质控标准品和样品分子读取次数的关系，确定样品的测序质量和准确性。
其中，步骤S1所述的质控标准品为一段人工合成的多核苷酸序列，核酸分子其大小为5Kb，分别由5个1Kb片段组成，这5个1Kb片段可以有A(5，5)种自由组合方式，采用重叠延伸PCR分子技术将其进行不同组合的连接。具体地，所述质控标准品的每个1Kb片段由ACG三个碱基组成。
步骤S1质控标准品的构建方法为：人工分别合成5个1Kb片段，每个片段由ACG三个碱基组成，将质控标准品序列与微生物基因组序列区分开；使用重叠延伸PCR法，即采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成重叠链，在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将5个1Kb片段进行重叠拼接成5Kb片段。
步骤S2和步骤S4中所述样本为固定的样本或者抽提后的核酸样本。
步骤S4中读取的次数为正常读数或者矫正后的读数。
本发明的质控标准品是一段人工合成多核苷酸序列，与已知的天然存在的基因组序列是能区分的，因此是外源参照物。本发明的质量控制方法利用该质控标准品，能够实现对影响NGS检测结果的实验室管理、人员、检测实验和生物信息学分析等因素的质量控制，同时防止测序过程中因样本编号混淆带来的错误，提高测试的准确性，以更有效应用于利用高通量测序技术的各领域，能够有效的评估测序的稳定性和准确性，确保测序数据分析的可靠性。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例提供的微生物高通量DNA测序数据的质控标准品的构建方法示意图。
图2为本发明实施例提供的重叠拼接片段的凝胶电泳结果图。
图3是本发明实施例提供的微生物高通量DNA测序数据的质量控制方法流程图。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合附图对本发明作进一步的详细介绍。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得到的。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的描述。
本发明实施例提供了微生物高通量DNA测序数据的质量控制方法，流程图如图3所示，具体过程如下：
1、质控标准品的构建，利用PCR和限制性内切酶等分子生物技术构建可进行任意A(5，5)种组合的长度为5Kb的人工合成的核酸片段，如图1所示，具体方法为：
1)人工分别合成5个1Kb片段，每个片段由ACG三个碱基组成，目的是将质控标准品序列与微生物基因组序列区分开。
2)使用重叠延伸PCR(gene splicing by overlap extension PCR，简称 OverlapPCR或SOE PCR)，即采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成重叠链，在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将5个1Kb片段进行重叠拼接成5Kb片段。
质控标准品的的片段重叠扩增结果如图2所示，其中M为Marker，1-5 为片段1-5,1+2为片段1和2重叠扩增后的融合产物，3+4为片段3和4重叠扩增后的融合产物。
2、将构建好的具有一系列已知浓度和长度的不同序列的核酸分子(质控标准品)加入固定的样本或者抽提后的核酸样本中，均匀混合。
3、进行建库测序并生物信息学分析。
4、分析过程中依据不同质控标准品和样品分子读取的次数(reads或者矫正后的reads)的关系、质控标准品测序数据的拼接质量等结果确定样品的测序质量和准确性。
以上只通过说明的方式描述了本发明的某些示范性实施例，毋庸置疑，对于本领域的普通技术人员，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以用各种不同的方式对所描述的实施例进行修正。因此，上述附图和描述在本质上是说明性的，不应理解为对本发明权利要求保护范围的限制。

Claims (8)

1.微生物高通量DNA测序数据的质控标准品，其特征在于，为一段人工合成的多核苷酸序列，核酸分子其大小为5Kb，分别由5个1Kb片段组成，这5个1Kb片段可以有A(5，5)种自由组合方式，采用重叠延伸PCR分子技术将其进行不同组合的连接。
2.根据权利要求1所述的微生物高通量DNA测序数据的质控标准品，其特征在于，每个1Kb片段由ACG三个碱基组成。
3.微生物高通量DNA测序数据的质量控制方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、构建质控标准品；
S2、将构建好的具有一系列已知浓度和长度的不同序列的质控标准品加入样本中，均匀混合；
S3、进行高通量测序建库及生物信息学分析；
S4、依据不同质控标准品和样品分子读取次数的关系，确定样品的测序质量和准确性。
4.根据权利要求3所述的微生物高通量DNA测序数据的质量控制方法，其特征在于，步骤S1所述的质控标准品为一段人工合成的多核苷酸序列，核酸分子其大小为5Kb，分别由5个1Kb片段组成，这5个1Kb片段可以有A(5，5)种自由组合方式，采用重叠延伸PCR分子技术将其进行不同组合的连接。
5.根据权利要求4所述的微生物高通量DNA测序数据的质量控制方法，其特征在于，所述质控标准品的每个1Kb片段由ACG三个碱基组成。
6.根据权利要求3-5任一项所述的微生物高通量DNA测序数据的质量控制方法，其特征在于，步骤S1质控标准品的构建方法为：人工分别合成5个1Kb片段，每个片段由ACG三个碱基组成，将质控标准品序列与微生物基因组序列区分开；使用重叠延伸PCR法，即采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成重叠链，在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将5个1Kb片段进行重叠拼接成5Kb片段。
7.根据权利要求3所述的微生物高通量DNA测序数据的质量控制方法，其特征在于，所述样本为固定的样本或者抽提后的核酸样本。
8.根据权利要求3所述的微生物高通量DNA测序数据的质量控制方法，其特征在于，步骤S4中读取的次数为正常读数或者矫正后的读数。
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