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Gegenstand
der Erfindung sind verbesserte Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen,
insbesondere von Hefe und Bakterien in Gemischen (z. B. Bier). Die
Herstellung von Nahrungsmitteln und Getränken, wie zum Beispiel Bier,
geht zur Gewährleistung
der Qualität
des Endproduktes mit dem Testen auf die Anwesenheit bestimmter Mikroorganismen
einher. Das Brauverfahren kann zum Beispiel das In-line-Testen einer Probe
mit einem Volumen von mindestens 25 ml und bevorzugt Probenvolumina
von zum Beispiel 250 ml alle paar Stunden erforderlich machen. Partikuläre Stoffe,
die Mikroorganismen einschließen
können,
nämlich Hefe
und Bakterien, müssen
dann von der Probe getrennt und anschließend zur Ermittlung der An- oder Abwesenheit
spezifischer Mikroorganismen getestet werden. Vorrichtungen, die
zum Erreichen desselben verwendet werden, schließen die Einweg-Vakuumfiltereinheit
von Bibby mit einem Flachfilter mit einem durchschnittlichen Porendurchmesser
von 0,45 μm
und die Filterhalter mit Aufnahmevorrichtungen von Nalgene ein, die
ein Flachfilter mit einem durchschnittlichen Porendurchmesser von
0,45 μm
oder 0,2 μm
aufweisen (siehe zum Beispiel den Merck Laboratory Produktbestellkatalog
1998, S. 482). Derartige Vorrichtungen ermöglichen die Filtration von
maximalen Probenvolumina von nur 100 ml, weisen eine flache Oberfläche von
50 cm2 auf und können aufgrund ihrer Komplexität beim Gebrauch
bis zu 30 Minuten zum Testen einer Probe in Anspruch nehmen. Sobald
ihr Maximalvolumen filtriert wurde, werden sie von partikulären Stoffen,
wie zum Beispiel von in der Probenflüssigkeit (z. B. in Lagerbier)
vorhandenen Proteinen blockiert, und jede nachfolgende Filtration würde Drücke in einer
Höhe erforderlich
machen, die zur Zelllyse führen,
wobei der Nachweis der Mikroorganismen verhindert und zu falschen
Ergebnissen führen
würde.
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Wie
anhand der Ergebnisse von den nachstehend detaillierten Experimenten
nachgewiesen wurde, nehmen die Vorrichtungen im Stand der Technik
weitgehend mehr Zeit zum Trennen und Nachweis von Mikroorganismen
aus einer Probe in Anspruch, als sie unter Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtungen und
Verfahren erforderlich ist. Außerdem
ist erfindungsgemäß die nachfolgende
Wiedergewinnung und folglich das Testen auf Mikroorganismen relativ
einfach und leicht, da die Mikroorganismen als ein ohne weiteres
beweglicher "Kuchen" (ein relativ nicht
zusammengedrückter
Block aus partikulären
Stoffen von niedriger Dichte) auf der Oberfläche von Membranen, mit minimalem
Eindringen in Membranzwischenräume,
vorhanden sind. Andere Vorrichtungen stellen im Vergleich dazu partikuläre Stoffe
wie ein hartes "Biskuit" (einen relativ stark zusammengedrückten Block
aus partikulären
Stoffen von hoher Dichte) auf einer Membranoberfläche dar,
wobei Mikroorganismen und andere partikuläre Stoffe die Membranzwischenräume blockieren
und in ihnen eingeschlossen werden. Dieses "Biskuit" ist schwer zu entfernen und schwer
zu verarbeiten, um es auf die Anwesenheit von Mikroorganismen testen
zu können.
Durch Verhinderung der Bildung eines dichten "Biskuits" sind die erfindungsgemäßen Vorrichtungen
außerdem
in der Lage, bei einem niedrigeren Druck zu arbeiten. Wenn sie bei
höheren
Drücken
betrieben werden, kann eine Lyse der Bakterien auftreten, die wiederum
zu inkorrekten Ergebnissen führt.
Ein hoher Druck kann auch eine Verformung der Bakterien verursachen,
wobei ihnen ermöglicht
wird, durch die Membran zu passieren und zu inkorrekten Ergebnissen
zu führen.
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Es
ist erfindungsgemäß ein Verfahren
zur Wiedergewinnung von Mikroorganismen aus einem Probengemisch
bereitgestellt, umfassend die Schritte von:
- i)
Passieren des genannten Probengemischs durch den Probeneinlass einer
Filtervorrichtung, umfassend eine Vielzahl von Hohlfaser-Filtermembranen,
die mit einem Detergens vorbehandelt wurden, wobei genannte Membranen
erste und zweite Enden, und eine Außenfläche und eine Innenfläche, die
ein Lumen definieren, aufweisen, wobei das erste Ende von jeder
der genannten Membranen offen ist und mit genanntem Probeneinlass
in Verbindung steht und der Fluss aus dem zweiten dergestalt eingeschränkt ist,
dass genanntes Probengemisch durch genannte Membranen filtriert
wird, wobei ein Filterkuchen in genanntem Lumen von genannten Membranen
zurückbleibt;
- ii) Resuspendieren von genanntem Filterkuchen in genannten Membranen;
und
- iii) Nachweis der Anwesenheit von jedweden Mikroorganismen in
genanntem Filterkuchen.
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Der
Resuspensionsschritt (ii) kann das Passieren einer Lösung aus
einem Lysiermittel durch das Lumen der genannten Membranen umfassen.
Dies kann zum Beispiel durch das Anbringen einer Spritze an einem
Ende der Vorrichtung und Passieren eines Lysierpuffers durch das
Lumen der Membranen erreicht werden, oder die Membranen können in
eine Lysierlösung
gelegt werden und die Lysierlösung
unter Verwendung einer an der Vorrichtung angebrachten Spritze in
die Lumina der Membranen aufgezogen werden.
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Der
Fluss aus genanntem zweitem Ende genannter Membranen ist dergestalt
eingeschränkt,
dass genanntes Probengemisch die genannte Filtervorrichtung ausschließlich durch
Filtration durch genannte Membranen verlässt.
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Filtrationsvorrichtungen
und -verfahren aus dem Stand der Technik schließen die von GB 2135902,
EP 302949 , WO 94/00222, WO
84/00015,
US 5863501 ,
US 5814179 ,
US 4501793 , JP 4-135478 (WPI-Abstract 1992-205001),
JP 63-104615 (WPI-Abstract 1988-165566), JP 63-088007 (WPI-Abstract
1988-145060) und JP 61-133105 (WPI-Abstract 1986-200908) ein. Keine von
diesen offenbaren jedoch oder schlagen die erfindungsgemäßen Verfahren
vor, einschließlich
eines jeden der notwendigen Schritte, um die Ergebnisse zu erhalten,
zu deren Bereitstellung sie in der Lage sind. Der Stand der Technik
schlägt
insbesondere weder die Herbeiführung
eines Filterkuchens in der Form eines resuspendierbaren "Kuchens" anstelle eines festeren "Biskuits" vor, noch schlägt er das
Resuspendieren des Filterkuchens aus einem ersten Filtrationsschritt
als Teil eines sich anschließenden
Verarbeitungsschrittes vor. So offenbart JP 63-104615 zum Beispiel
eine Vorrichtung zum Trennen, z. B. von Viren aus Flüssigkeiten,
umfassend eine Vielzahl poröser
Hohlcellulosefasern, wobei ein Ende von ihnen in einen Füllstoff
eingebettet ist und der Atmosphäre
gegenüber
offen ist und wobei das andere Ende dicht verschlossen ist. Es schlägt jedoch
weder vor, dass die Membranen mit einem Detergens vorbehandelt werden
sollten, noch schlägt
es vor, dass Polypropylen-Membranen
verwendet werden sollten, noch liegt ein Hinweis vor, wie Mikroorganismen,
insbesondere Bakterien und Hefe ohne weiteres im Filterkuchen nachgewiesen
werden können
oder dass der Filterkuchen resuspendiert werden sollte.
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Ein
anderer relevanter Stand der Technik schließt
JP 07227297 ein.
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Der
Schritt zum Nachweis von Mikroorganismen kann jedwedes Nachweisverfahren
umfassen, das die gewünschten
Mikroorganismen nachweist. Ein einfacher allgemeiner Test auf Mikroorganismen
stellt zum Beispiel der nachstehend detaillierte ATP-Test dar, worin
jedwede Mikroorganismen lysiert werden und jegliches freigesetzte
ATP unter Verwendung eines Luziferase-Assays nachgewiesen wird.
Als Alternative können Mikroorganismus-spezifische
Antikörper
verwendet werden, oder der Filterkuchen könnte auf einen allgemeinen
Kulturnährboden
ausplattiert und das Wachstum von jedweden Mikroorganismus-Kolonien
nachgewiesen werden.
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Durch
Vorbehandlung der Membranen mit einem Detergens (zum Beispiel mittels
Spülen
eines Detergens durch sie hindurch und ihnen optional zu ermöglichen,
anschließend
zu trocknen) wurde festgestellt, dass die Fließrate des Gemisches durch die
Membranen sehr erheblich erhöht
ist. Dies trifft insbesondere zu, wenn man getrocknete, mit Detergens
behandelte Membranen mit trockenen unbehandelten Membranen vergleicht. Diese
erhöhte
Fließrate
gewährleistet,
dass Mikroorganismen ohne Auslösung
ihrer Lyse oder ihr Forcieren durch die Membranen gesammelt werden.
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Nützliche
Detergenzien schließen
nicht ionische Detergenzien, insbesondere Tween 20, insbesondere eine
Lösung
aus 20 % Tween 20 ein.
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Die
Verwendung einer Vielzahl von Hohlfaser-Filtermembranen stellt auch
eine relativ große
Oberfläche
(mindestens 3-mal so groß)
bereit, über
die Filtration stattfinden kann, im Vergleich zur Oberfläche, die
von einer einfachen Vorrichtung mit ähnlichen Gesamtabmessungen
(d. h. Größe) bereitgestellt
wird, die eine Flachmembran aufweist. Dies ermöglicht auch das Filtrieren
eines relativ großen
Probenvolumens, bevor eine Blockierung von Poren auftritt. Dies
ist besonders mit trüben
Proben (z. B. Stout) nützlich,
die große
Mengen partikulärer
Stoffe enthalten, die Flachfiltermembranen schnell blockieren können.
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Es
wurde auch festgestellt, dass die genaue Beschaffenheit des Filtermembranmaterials
wichtig ist – wobei
festgestellt wurde, dass im Handel erhältliche Polypropylen-Hohlfasermembranen,
die einen durchschnittlichen Porendurchmesser von 0,2 μm aufweisen,
die mit Detergens vorbehandelt wurden, viel größere Fließraten ermöglichen als z. B. Polysulfon-Membranen
mit einem durchschnittlichen Porendurchmesser von 0,2 μm, selbst
wenn sie ebenfalls mit Detergens vorbehandelt werden. In einer bevorzugten
erfindungsgemäßen Ausführungsform
kann die Hohlfasermembran folglich eine Polypropylen-Membran sein.
Selbstverständlich
können
auch andere Membranen verwendet werden, insbesondere die mit ähnlichen
physikalischen Merkmalen, wie zum Beispiel einer ähnlichen
Porenfläche
pro Flächeneinheit
der Membranoberfläche.
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Erfindungsgemäß verwendete
Hohlfasermembranen können
einen durchschnittlichen Porendurchmesser von 0,2 μm aufweisen.
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Es
ist erfindungsgemäß auch eine
Filtervorrichtung zum Trennen von Mikroorganismen aus einem Probengemisch
bereitgestellt, umfassend eine Vielzahl von Hohlfaser-Filtermembranen,
die mit einem Detergens vorbehandelt wurden, wobei jede Membran
eine Außenfläche und
eine Innenfläche,
die ein Lumen definieren, aufweist, wobei eines der Enden von jeder
Membran offen ist und mit einem Probeneinlass der Filtervorrichtung
in Verbindung steht und das andere Ende geschlossen ist.
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Die
Leichtigkeit des Testens auf Mikroorganismen unter Verwendung der
Verfahren und Vorrichtungen wurde durch die Geschwindigkeit der
Filtration ergänzt – wie aus
den nachstehenden experimentellen Ergebnissen hervorgeht, wird erfindungsgemäß die Wiedergewinnung
partikulärer
Stoffe aus einem gegebenen Volumen der Probenflüssigkeit in einem Bruchteil
der durch andere Vorrichtungen erforderlichen Zeit ermöglicht und
ist häufig
mindestens 10-mal so schnell.
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Es
wird erfindungsgemäß auch der
wichtige Vorteil zum Bereitstellen gleichbleibender Ergebnisse für eine gegebene
Probe bereitgestellt, selbst wenn ein sehr trübes Gemisch filtriert wird – es ist
ohne weiteres eine mindestens 99%ige Konsistenz zwischen verschiedenen
Ergebnissets zu erreichen. Dies Lässt sich vorteilhaft mit Ergebnissen
vergleichen, die unter Verwendung von Flachmembranen erhalten werden,
die relativ inkonsistent sein können.
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Die
Erfindung ist weiter aus der folgenden Beschreibung unter Bezugnahme
auf mehrere Figuren der beiliegenden Zeichnungen ersichtlich, die
lediglich mittels des Beispiels eine Form von Filtervorrichtung
zeigen.
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Von
den Figuren:
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zeigt 1 eine erste erfindungsgemäße Vorrichtung
und ihre Verwendung in einem Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen;
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zeigt 2 eine ATP-Standardkurve.
Die y-Achse stellt RLU (relative Lichteinheiten) und die x-Achse die
Mole ATP dar. Die ausgefüllten
Diamantformen zeigen ein Enzym (1:625) an, die ausgefüllten Quadrate zeigen
ein Enzym (1:9) an, und die ausgefüllten Dreiecke zeigen ein Enzym
(1:1) an;
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zeigt 3 Einschluss-Konzentrationskurven
für P.
damnosus. Die y-Achse stellt die RLU insgesamt und die x-Achse die
Zellzahlen dar. Die ausgefüllten
Diamanten stehen für
137099-1 und die ausgefüllten
Quadrate für
037099-1;
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zeigt 4 Einschluss-Standardkurven
für S.
carlsbergensis. Die y-Achse stellt die RLU insgesamt und die x-Achse
die Zellzahl dar. Die ausgefüllten
Quadrate stehen für
266099-1 und die ausgefüllten
Dreiecke für
097099-1;
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zeigt 5 Einschluss-Konzentrationskurven
für A.
pasteurianus. Die ausgefüllten
Diamanten stehen für
147099-1 und die ausgefüllten
Kreise für
027099-1;
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zeigt 6 eine zweite erfindungsgemäße Vorrichtung
und ihre Verwendung in einem Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen;
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zeigt 7 einen Schnitt durch eine
Endkappe und eine Ansicht einer Manschette;
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zeigt 8 den Nachweis von S. carlsbergensis
in filtrierten Bierproben unter Verwendung der zweiten Vorrichtung.
Die y-Achse stellt RLU und die x-Achse Zellen pro Assay dar;
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zeigt 9 den Nachweis von A. pasteurianus
in filtrierten Bierproben unter Verwendung der zweiten Vorrichtung.
Die y-Achse stellt RLU und die x-Achse Zellen pro Assay dar;
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zeigt 10 den Nachweis von P. damnosus
in filtrierten Bierproben unter Verwendung der zweiten Vorrichtung.
Die y-Achse stellt RLU und die x-Achse Zellen pro Assay dar;
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zeigt 11 [Lakune]
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Wie
aus 1 ersichtlich ist,
umfasst eine erste Filtervorrichtung 10 einen Probeneinlass 20 mit
einem Luer-Lock-Ansatz 21, kommunizierend mit 68 Polypropylen-Hohlfasermembranen 30 mit
einem durchschnittlichen Porendurchmesser von 0,2 μm. Die offenen
Enden von Membranen 30 sind in einen UV-härtbaren
Klebstoff 40 eingebettet, der sie am Ort festhält und ihnen
erlaubt, mit dem Probeneinlass 20 in Verbindung zu treten.
Die anderen Enden von Membranen 30 sind in einen UV-härtbaren
Klebstoff 41 eingebettet, der sie schließt. Die
Membranen 30 wurden mittels Spülen einer Lösung, bestehend aus 20 % Tween
20, durch sie hindurch und sie dann trocknen lassen, vorbehandelt.
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Bei
Verwendung wird Spritze 50, die das Probengemisch 60 hält, an einen
Probeneinlass 20 angeschlossen und das Probengemisch durch
Membranen 30 filtriert, wobei das Filtrat 70 und
Filterkuchen 71 bereitgestellt werden. Membranen 30 werden
dann in Resuspensionslösung 80 gegeben
und der Kolben 90 der Spritze 50 zurückgezogen,
wobei ein Fluss von Resuspensionslösung 80 in das Lumen
von Membranen 30 zum Resuspendieren von in Membranen 30 zurückgehaltenem
Filterkuchen 71 und ihr Aufziehen in die Spritze 50 veranlasst
wird.
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Sobald
der Filterkuchen 71 resuspendiert und in der Spritze 50 gesammelt
wurde, kann er anschließend
getestet werden. Wie in Tabelle 4 detailliert, wurden verschiedene
Filtervorrichtungen mit verschiedenen Membranlängen 30 hergestellt.
In einer spezifischen Ausführungsform
sind Membranen 30 insgesamt 55 mm lang, wovon 40 mm offen
und dazu fähig
sind, eine Oberfläche
bereitzustellen, über
welche die Filtration stattfinden kann. Membranen 30 stellen
eine Oberfläche
von insgesamt 51,2 cm2 bereit, über welche
die Filtration stattfinden kann.
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Die
zweite Filtervorrichtung 100 umfasst einen Probeneinlass 20 mit
einem Luer-Lock-Ansatz 21, kommunizierend mit 68 Propylen-Hohlfasermembranen 30 mit
einem durchschnittlichen Porendurchmesser von 0,2 μm. Am Probeneinlass 20 sind
die Enden von Membranen 30 in einen UV-härtbaren
Klebstoff eingebettet, der sie am Ort festhält und ihnen erlaubt, dann
mit dem Probeneinlass 20 in Verbindung zu stehen. Am Auslass 110 sind
die Enden von Membranen 30 in einen UV-härtbaren
Klebstoff eingebettet, der sie am Ort festhält und ihnen erlaubt, dann
mit dem Auslass 110 in Verbindung zu stehen, der durch
Stopfen 120 verschlossen ist. Die Membranen 30 wurden
mittels Spülen
einer Lösung,
bestehend aus 5 % Tween 20, durch sie hindurch und sie dann
trocknen lassen, vorbehandelt.
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Bei
Verwendung wird auf Stufe I (6)
ein Volumen von 100 ml Lagerbier 60 mittels peristaltischer Pumpe 130 bei
einer Rate von 100 ml/Minute durch den Schlauch 140 in
Vorrichtung 100 gepumpt. Wenn sich Vorrichtung 100 mit
Lagerbier 60 füllt,
veranlasst Stopfen 120, der den Auslass 110 blockiert,
dass die Poren in den Membranen 30 den einzigen Auslass
aus der Vorrichtung 100 darstellen, und das Lagerbier 60 deshalb durch
die Membranen 30 filtriert und das Filtrat im Abfallsammelgefäß 150 gesammelt
und entsorgt wird. Auf Stufe II werden 400 ml steriles Wasser 160 bei
187 ml/Minute durch den Schlauch 140 gepumpt, durch die Membranen 30 (wobei
der Stopfen 120 an Ort und Stelle bleibt) filtriert und
im Abfallgefäß 150 gesammelt
und entsorgt. Wenn das Passieren von Wasser 160 durch Vorrichtung 100 abgeschlossen
ist, wird Pumpe 130 weitere 10 Sekunden laufen lassen,
um Luft durch den Schlauch 140 und die Membranen 30 zu
pumpen, um übermäßige Flüssigkeit
aus den Membranen 30 zu entfernen. Pumpe 140 wird
dann abgestellt und die Vorrichtung 100 vom Schlauch 140 und
der Pumpe 130 getrennt. Auf Stufe III, wird der Stopfen
(d. h. die Endkappe) 120 entfernt, und die Vorrichtung 100 wird
auf einem reinen Gewebestück
(nicht gezeigt) zum Entfernen jeglicher überschüssiger Flüssigkeit 160 beklopft.
Die sterile 1-ml-Spritze 50, die 0,5 ml Lysierpuffer 160 (0,2
M NaOH) enthält,
wird dann am Probeneinlass 20 und der Bypassschlauch 165 am
Auslass 110 angebracht. Es wird ein Anfeuchtungs-/Lyseschritt durchgeführt, umfassend
das sorgfältige
Hinunterdrücken
des Kolbens 55 von Spritze 50, bis Flüssigkeit
(Lysierpuffer 160) im Bypassschlauch 165 sichtbar
ist, und dann Zurückziehen
des Kolbens 55, um den Lysierpuffer 160 zurück in die
Spritze 50 zu ziehen, wodurch die Membranen 30 wieder mit
Lysierpuffer 160 angefeuchtet werden. Der Anfeuchtungs-/Lyseschritt
wird noch weitere zwei Male durchgeführt. Die gesamte Flüssigkeit 160 wird
dann aus der Vorrichtung 100 mittels Halten der Vorrichtung 100 über ein
1,5 ml fassendes steriles Röhrchen 170 und
dreimaliges Hinunterdrücken
des Kolbens 55 entfernt. Auf Stufe IV wird der Bypassschlauch 165 von
der Vorrichtung 100 entfernt und die Endkappe 120 auf
die Vorrichtung 100 aufgesetzt. Der Kolben 55 wird
dann zum Sammeln des gesamten Eluats (einschließlich dem auf den Membranen)
zurückgezogen.
Das Eluat wird dann an Röhrchen 170 überführt. Dann
werden dem Röhrchen 170 9
Tropfen Neutralisationspuffer (0,2 M Tris-Phosphat) zugefügt. Danach
wird auf Röhrchen 170 ein Deckel
aufgesetzt und sein Inhalt wird durch 2- bis 3-maliges Umkehren
des Röhrchens 170 gemischt.
Auf Stufe V wird schließlich
an der Probe ein ATP-Assay unter Verwendung eines Biotrace Unilite
Luminometers und Sigma Biolumineszenz-Reagenzien durchgeführt.
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Experimente
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ATP-Assays
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Alle
ATP-Assays wurden unter Befolgung des Verfahrens der alkalischen
Denaturierung/Neutralisation durchgeführt.
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Man
gibt in einen sterilen Eppendorf 50 μl 2 M Natriumhydroxid, fügt 200 μl Probe zu
und mischt durch 2- bis 3-maliges Aufziehen in die Pipette. Man
fügt 50 μl 2 M Tris-Phosphatpuffer
zu und mischt durch Umkehren (Probenmischung).
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Man
gibt 100 μl
ATP-Assay-Mischung (Sigma-Aldrich Ltd) in der entsprechenden Verdünnung in
eine Küvette
(Uni-Lite-Küvette).
3 Minuten stehen lassen, und dann die Hintergrundlichtausstrahlung
in einem Luminometer (Uni-Lite) 35 Sekunden messen. Nachdem die
Hintergrundlichtausstrahlung bestimmt wurde, fügt man der Küvette 100 μl der Probenmischung
zu und liest 35 Sekunden ab. Der Unterschied zwischen den Hintergrund-
und den Probenablesungen ist auf die Anwesenheit von ATP in der
Probe zurückzuführen.
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Membraneinschluss
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25
ml Lagerbier enthaltend ca. 1 × 107 Zellen von S. carlsbergensis wurden mittels
Anschluss einer 25 ml fassenden Spritze an den Luer-Ansatz der Filtervorrichtung
durch jede Vorrichtung gegeben. Die Filtervorrichtung wurde dann
zur Entfernung von jedwedem Lagerbierüberschuss (Lagerbier übt eine
geringe Hemmwirkung auf den ATP-Assay aus) mit 10 ml Wasser gewaschen.
Der Membranbereich der Filtervorrichtung wurde dann in steriles
Wasser gegeben, es wurde eine Rückspülung des
Wassers durch die Vorrichtung erhalten, und jegliche eingeschlossenen
und im gesammelten Konzentrat vorliegenden Zellen wurden entfernt.
ATP-Assays wurden, wie vorstehend beschrieben, zur Bestimmung auf
das Vorliegen von mikrobiellem ATP im Filtrat und Konzentrat durchgeführt.
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Konsistenter
Einschluss
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1
ml einer 10-ml-Übernachtkultur
von S. carlsbergensis, A. pasteurianus oder P. damnosus wurden 24 ml
Lagerbier zugefügt,
und die gespickte Probe wurde dann, wie vorstehend beschrieben,
durch eine Filtervorrichtung gegeben. Die Wiedergewinnung (%) des
Mikroorganismus wurde im Konzentrat durch Vergleich der Proben vor
und nach der Filtration auf mikrobielle ATP-Spiegel bestimmt. Es
wurden insgesamt fünf
Vorrichtungen auf einen einzelnen Mikrobenstamm getestet und der
Varianzkoeffizient zwischen den Wiedergewinnungsspiegeln bestimmt.
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Das
häufigste
und schnellste Verfahren zur Bestimmung der mikrobiellen Kontamination
stellt die Messung des zellulären
ATP dar. Dies macht den Abbau der Zellmembran/-wand (Zelllyse) zur
Freisetzung des in der Zelle vorliegenden ATP erforderlich. Das
freigesetzte ATP kann dann unter Verwendung einer Enzymreaktion
bestimmt werden, die ein Substrat (Luziferin) und ATP in eine Anzahl
von Produkten, einschließlich
Licht umwandelt. Die Lichtmenge kann anschließend unter Verwendung eines
Standard-Luminometers gemessen werden.
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Eine
Anzahl an ATP-Tests, die auf dem vorstehenden Prinzip beruhen, sind
im Handel erhältlich.
Das ATP-Biolumineszenz-Assay-Kit (Sigma-Aldrich, Poole) enthielt
keine Puffer, die die Zelllyse anregten. Es sollte zur Kenntnis
genommen werden, dass sich die Bedingungen für die Zellmembranlyse in Abhängigkeit
vom Zelltyp unterscheiden. Die vorliegende Studie konzentriert sich
auf Zelltypen, die während
der Herstellungsstufen im Bier gefunden wurden. Bei diesen handelt
es sich um zwei Bakterienstämme,
Acetobacter pasteurianus und Pedicoccus damnosus und einen Hefestamm
Saccharomyces carlsbergensis. Der Hefestamm kann sich unterscheiden,
da es sich bei diesem um den Starter-Stamm zum Auslösen der
Fermentation handelt. Die meisten Brauereien verwenden einen Starter-Stamm
aus der Saccharomyces-Familie, und folglich kann dieser Stamm in
den Tests verwendet werden.
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Zelllyseverfahren
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Hitzedenaturierung:
Die Probe wurde 10 Minuten gekocht, abkühlen lassen, und vor Durchführung des ATP-Tests
wurde ihr pH eingestellt. Einige Zellen sind hitzebeständig.
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Alkalische
Denaturierung. Eine starke Base, wie zum Beispiel Natriumhydroxid,
kann Zellen lysieren. Enzyme, wie zum Beispiel die im ATP-Assay
verwendete Luziferase, funktionieren dicht am neutralen pH. Deshalb
muss vor dem ATP-Test eine pH-Einstellung der Probe durchgeführt werden.
Die Basenkonzentration kann den Grad der Zelllyse bestimmen.
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Zellkultur-Lysierreagenz:
Ein veröffentlichtes
Verfahren zur Zelllyse.
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Alkalische
Denaturierung/saure Neutralisation: Zelllyse wird unter Verwendung
von Natriumhydroxid (optimiert bei 2 M), gefolgt von sofortiger
Neutralisation des Natriumhydroxids unter Verwendung eines sauren Puffers
erreicht, wobei die Probe direkt im ATP-Test ohne Funktionsverlust
für das
Enzym verwendet werden kann.
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Die
Ergebnisse der verschiedenen Lyseverfahren sind in Tabelle 1 ersichtlich
und zeigen, dass das entwickelte alkalische Denaturierungs-/saure
Neutralisationsverfahren zur Zelllyse aller Organismen fähig ist, ohne
dass die Zellen vor dem Testen aus dem Wachstumsmedium entfernt
werden müssen.
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ATP-Standardkurve
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Zur
Bestimmung der Empfindlichkeit des ATP-Assays wurde für einen
ATP-Standard im Bereich von 10–7 bis 10–6 Molen
ATP eine Konzentrationskurve bestimmt. Die Ergebnisse sind in 2 ersichtlich.
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Wenn
die Proben unter Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtungen getestet
werden, kann die gegebene RLU mit der ATP-Standardkurve verglichen
werden, und die Anzahl der vorliegenden Zellen in einer gegebenen
Probe kann bestimmt werden. Eine einzelne Hefezelle enthält ca. 10–14 Mole
ATP, wohingegen in einer Bakterienzelle 100-mal weniger ATP vorliegt.
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Membraneinschluss
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Membranen
von unterschiedlicher chemischer Zusammensetzung und Molekülgrößen-Cutoff
wurden zur Herstellung von erfindungsgemäßen Vorrichtungen verwendet
und wurden unter ähnlichen
Bedingungen auf ihre Fähigkeit
beim Einschluss der an der Studie beteiligten Mikroorganismen untersucht.
Eine Anzahl von Formaten der Vorrichtung wurde unter Verwendung
von Polypropylen-Membranen mit verschiedenen Porendurchmessern/Molekulargewichts-Cutoffs
getestet. Die Erfinder haben ein Format und einen Membrantyp identifiziert,
die zum Einschluss fähig
sind und bei niedrigem Druck arbeiten, wodurch sie eine Zellschädigung während der
Probenapplikation vermeiden. Die in den Experimenten verwendeten
Vorrichtungen des Y-Typs (siehe Tabelle 2) sind den erfindungsgemäßen ähnlich,
die einen Probeneinlass 20, einen Luer-Ansatz 21, Membranen 30 und
UV-härtbaren
Klebstoff 40 aufweisen. Sie weichen jedoch von den erfindungsgemäßen Vorrichtungen
insofern ab, dass jede Membran 30 in einer Schleifenbildung,
wobei jedes Ende offen ist, vorliegt und in UV-härtbaren Klebstoff 40 eingebettet
und dazu fähig
ist, mit dem Probeneinlass 20 in Verbindung zu stehen.
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Es
wurde gezeigt, dass die Konfiguration der Membran in der Vorrichtung
eine wichtige Rolle bei der Fähigkeit
zum Einschluss aller der in der Studie verwendeten Organismen spielt.
Je kleiner das Molekulargewicht der Membran, um so größer ist
der erforderliche Druck, um die Passage der Probe durch die Vorrichtung zu
erlauben. Der erhöhte
Druck schien die Zellstruktur dergestalt zu ändern, dass die Zellen durch
die Membran (filtriert) passierten und nicht eingeschlossen wurden.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 ersichtlich.
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Konsistenter
Einschluss
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Es
wurden Studien zur Gewährleistung
durchgeführt,
dass der Einschluss von Mikroorganismen durch die Filtervorrichtung
konsistent war. Für
jeden Test wurden fünf
Vorrichtungen auf ihre Fähigkeit
getestet, jeden der Mikroorganismen einschließen und die eingeschlossenen
Gesamtzellen anhand des ATP-Assays bestimmen zu können. Die
Ergebnisse sind in Tabelle 3 ersichtlich.
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Einschluss-Konzentrationskurve
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Die
Analyse zehnfacher Verdünnungen
einer Übernachtkultur
von jedem Organismus ermöglichte
die Bestimmung der Zellzahl, die mittels dieser Vorrichtung eingeschlossen
werden kann. Jeder Organismus wurde zur Bestimmung der genauen Zellzahl
von jeder Verdünnung
auf das geeignete Wachstumsmedium ausplattiert. Die Ergebnisse sind
in den 3–5 ersichtlich.
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Alle
Datenpunkte wurden unter Verwendung von Dreifach-Vorrichtungen getestet
und der ATP-Test an jeder Probe in Zweifachbestimmung durchgeführt. Die
Daten wurden zur Entfernung der Wirkungen von freiem ATP bereinigt.
Die Zunahmen des RLU-Outputs kann an Proben mit niedrigeren Konzentrationen
nachgewiesen werden. Dies ist darauf zurückzuführen, dass die Enzymverdünnung zum
Erhalt einer Steigerung der Empfindlichkeit verändert wurde.
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Kontaminantennachweis/Quantifizierung
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Es
wurden Tests zur Bestimmung durchgeführt, ob 2,5 Liter Lagerbier
durch die Vorrichtung mit 68 Membranen mit einer Gesamtoberfläche von
51,2 cm2 filtriert werden können. Es
wurde an Dreifach-Vorrichtungen gezeigt, dass dieses Volumen ohne
jedwede Blockierung der Membran durch das Filter passiert. Die Verminderung
der Oberfläche
der Vorrichtung wurde zur Bestimmung des Volumens von nicht kontaminiertem Lagerbier,
das filtriert werden konnte, durchgeführt. Die Anzahl von Membranen
pro Vorrichtung wurde konstant gehalten und die Gesamtlänge verändert. Drei
Vorrichtungen von jeder Größe wurden
getestet, und die Ergebnisse sind in Tabelle 4 ersichtlich. Die
Applikation der Lagerbier-Probe wurde terminiert, als der Druck für sie zu
groß wurde,
um durch die Vorrichtung zu passieren.
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Zusätzliche Experimente wurden
wie folgt durchgeführt
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Es
wurden Filtrationsvorrichtungen, wie durch die zweite Filtrationsvorrichtung
(6) erläutert, verwendet.
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Apparat
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- 1. Polypropylen-Hohlfasermembranen mit einem durchschnittlichen
Porendurchmesser von 0,2 μm
(vorbehandelt mit 5 % Tween 20).
- 2. Loctite (RTM) 21 halbautomatischer Regler, der einen
handgehaltenen Applikator und einen Fußschalter mit einer Druckeinstellung
auf 0,2 bar und einem Digital-Output auf 35,0 inkorporiert.
- 3. Bondmatic 850 UV-Lichtquelle mit Zeiteinstellung auf 40 Sekunden.
- 4. Manschette (7, 200)
(Polycarbonatstab) mit einem Innendurchmesser von 7,0 mm und einem
Außendurchmesser
von 12,4 mm.
- 5. Y-förmige
Endkappen (7, 210),
hergestellt aus 2 mm Polymer-Polypropylen mit einem weiten Ende
(Innendurchmesser 12,4 mm) zur Aufnahme von Manschetten und einem
engen Ende (Innendurchmesser 4,1 mm) zum Anschluss für einen
Luer-Spritzenansatz.
-
Die
Filtrationsvorrichtungen wurden wie folgt hergestellt:
- 1. Reinigen aller Arbeitsflächen
mit IPA (Isopropylalkohol).
- 2. Ein Bündel,
bestehend aus einer geeigneten Anzahl von Längen der Polypropylen-Hohlfasermembranen nehmen
und eine Vielzahl von Manschetten um das Bündel herum platzieren.
- 3. An einer Position ca. 30 mm vom Ende des Bündels von
Hohlfasermembranen wird die Düse
des Klebstoff-Applikators in die Mitte des Membranbündels gebracht
und der Klebstoff dergestalt aufgebracht, dass er durch das Membranbündel penetriert,
und die Düse
wird dergestalt manipuliert, dass der Klebstoff auf alle Membranen
im Bereich aufgebracht wird. Klebstoff wird zusätzlich auf die Außenseite
des Bündels
an dieser Position aufgebracht. Eine Manschette wird dann über die
Membranen an dieser Position gestreift und dergestalt rotiert, dass
sie den Klebstoff kontaktiert.
- 4. Den mit Klebstoff bedeckten Abschnitt des Bündels zum
Härten
des Klebstoffs unter die UV-Lichtquelle bringen.
- 5. Klebstoff, wie in Schritt 3 (vorstehend) erläutert, an
einer Position ca. 30 mm entlang dem Bündel von der vorherigen Manschette
aufbringen. Die ersten und dann die zweiten Manschetten dergestalt über den
Klebstoff streifen und rotieren, dass sie einander kontaktieren
und sie dann um 1–2
mm trennen, und Schritt 4 wiederholen.
- 6. Schritt 5 wiederholen, bis sich auf der gesamten
Membranlänge
Manschetten befinden.
- 7. Die Fasern in den Zwischenräumen von 1–2 mm zwischen den Manschettenpaaren
beschneiden, um eine Vielzahl von Hohlfaservorrichtungen zu erhalten,
wobei die Fasern an jedem Ende offene Lumen aufweisen und an ihrer
Außenseite
an jedem Ende mit einer Manschette fest verschlossen sind.
- 8. Die Vorrichtungen über
Nacht bei 55 °C
zum Entfernen jedweder verbleibender Klebstoffmonomere inkubieren.
- 9. Eine der Vorrichtungen und ein Endkappenpaar nehmen, den
Loctite Primer 770 auf den Innenrand der Endkappen und
um die Außenseite
der Vorrichtungsmanschetten herum aufbringen. Ca. 1 Minute ruhen lassen,
dann Loctite Sofortklebstoff 403 um die Außenseite
von jeder Manschette herum aufbringen und die Endkappen fest über die
Manschetten drücken,
bis sie bondiert sind.
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Experimente
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Zunächst wurden
die Ergebnisse der vorstehenden Tests unter Verwendung der erfindungsgemäßen zweiten
Vorrichtung (6) unter
Befolgung der Testanleitungen (nachstehend) validiert, und die Nachweisgrenze
für Saccharomyces
carlsbergensis betrug 30–100
Zellen pro Assay, für
Acetobacter pasteurianus betrug sie 10.000–20.000 Zellen pro Assay und
für Pediococcus
damnosus betrug sie > 1000
Zellen pro Assay. Die Fähigkeit
des Systems zum Filtrieren großer
Flüssigkeitsvolumina
demonstriert sein besonderes Potenzial zum Testen des Hygienestatus
des endgültigen
CIP-(Cleaning-in-place)-Spülwassers.
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Der
Test wurde zweitens zur Erhöhung
seiner Empfindlichkeit auf mikrobielle Kontamination von Bieren
geringgradig modifiziert. Dies wurde durch eine In-Filter-Kultur von kleinen
Zahlen eingeschlossener Mikroorganismen aus filtrierten Bierproben
erreicht. Nach einer 24-stündigen
Inkubationsperiode war der Nachweis von 1 Zelle pro ml des filtrierten
Biers möglich.
Dieses Ergebnis ist mindestens so gut wie und das System bequemer
zu verwenden als andere auf ATP basierende Nachweissysteme, die
derzeit erhältlich
sind. Das erfindungsgemäße System
besitzt außerdem
den Vorteil, dass es zum Filtrieren größerer Biervolumina (und eine Fähigkeit
zum Filtrieren von Stout) im Vergleich zur konventionellen Flachbettmembranfiltration
fähig ist,
was in einer erhöhten
Nachweisgrenze resultiert. Eine ähnliche
Empfindlichkeit kann auch ohne die Notwendigkeit einer In-Filter-Kultivierung
(oder mit kürzeren
Kulturperioden) durch die Verwendung von im Stand der Technik bekannten
Adenylatkinase-Nachweistests erreicht werden.
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Die
Tests zeigen insbesondere, dass erfindungsgemäße Verwendungen Cleaning-in-Place-Tests (CIP-Tests)
für Herstellungsverfahren
in den Brauerei-, Pharma-, Erfrischungsgetränke- und Molkereiindustrien
einschließen.
Außerdem
ist die vorliegende Erfindung auch insbesondere für Bier-
(einschließlich
Bitterbieren, Lagerbieren und Stouts) und Apfelwein-Kontaminationstests
geeignet.
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Hier
wurde die Wirkung des Inkubierens der Filtervorrichtungen, die kleine
Zellzahlen enthalten, vor Durchführung
des ATP-Tests, in einer Bouillonkultur untersucht. Für die Zwecke
dieser Studie wurde ein anderer Organismus, Lactobacillus brevis
(BSO 464) verwendet. Dieser Organismus wurde gewählt, da er zuvor bereits verbreitet
für zahlreiche
ATP-Nachweisversuche verwendet wurde, die Ergebnisse können auf
diese Weise leicht mit den von anderen Systemen erhaltenen verglichen
werden.
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BSO
464 wurde in MRS-Bouillon bis zum Erreichen der stationären Phase
gezüchtet.
Nach der Durchführung
einer mikroskopischen Zellzählung
wurden angemessene Verdünnungen
in sterilem deionisiertem Wasser durchgeführt, um ca. 100 Zellen pro
ml zu geben. 1 ml dieser Kultur wurde zum Inokulieren von 99 ml Lagerbier
verwendet, dies wurde für
jede Lagerbier-Probe in Dreifachbestimmung durchgeführt. Nicht
inokulierte Lagerbier-Kontrollen wurden auch mitlaufen lassen. Zum
Kontrollieren der Inokulationsspiegel wurden Plattenzählungen
durchgeführt.
Jedes Lagerbier wurde wie nachstehend beschrieben filtriert und
die Testanleitungen bis Schritt 7 befolgt.
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Nach
diesem Schritt wurde die Vorrichtung vom Schlauch entfernt, und
eine sterile Spritze wurde zum Befüllen der Innenseite der Mikrofasern
mit MRS-Bouillon verwendet. Die Spritze wurde entfernt und eine
zweite sterile Endkappe auf dieses Ende der Vorrichtung platziert,
um jedwede eingeschlossenen Organismen in der Vorrichtung zurückzuhalten.
Die gesamte Vorrichtung wurde dann für variierende Inkubationszeiten
in 20 ml MRS-Bouillon eingetaucht. Nach der Inkubation wurde die
Vorrichtung sorgfältig
aus der Bouillon entfernt und eine der Endkappen entfernt. Unter
Verwendung einer Spritze wurden dann 10 ml steriles deionisiertes Wasser
durch die Vorrichtung gegeben und in einem Abfallbehälter gesammelt.
Dann wurde zur Entfernung überschüssiger Flüssigkeit
aus der Membran unter Verwendung der Spritze Luft in die Vorrichtung
gespritzt. Danach erfolgte ab Schritt 9 die Befolgung der
protokollgemäßen Testanleitungen
(nachstehend).
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Testanleitungen
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- 1. Herausnahme der Vorrichtung und des Schlauchs aus dem
fest verschlossenen Beutel.
- 2. Den Schlauch an ein geeignetes Pumpensystem anbringen, das
bei 187 ml/Minute oder 220 U/min (Schlauch mit einem Innendurchmesser
von 3,2 mm und einem Außendurchmesser
von 6,4 mm) laufen kann.
- 3. Ein Abfallsammelgefäß unter
die Vorrichtung stellen.
- 4. Die Pumpe auf 100 ml/Minute oder 117 U/min einstellen.
- 5. 100 ml Lagerbier (maximal kann 1 Liter durchgeleitet werden)
durchleiten und das Filtrat in den Abfallbehälter laufen lassen.
- 6. Die Pumpeneinstellung auf 187 ml/Minute oder 220 U/min einstellen,
und übermäßiges Lagerbier
durch Filtrieren von 400 ml sterilem (destilliertem) Wasser aus
der Vorrichtung waschen.
- 7. Wenn das Waschen mit Wasser abgeschlossen ist, zur Entfernung überschüssiger Flüssigkeit
aus der Membran 10 Sekunden Luft durch den Schlauch leiten.
- 8. Die Pumpe abschalten, und die Vorrichtung und den Schlauch
von der Pumpe entfernen.
- 9. Entfernen der Endkappe von der Vorrichtung. Die Vorrichtung
zum Entfernen jedweder überschüssiger Flüssigkeit
auf einem reinen Gewebestück
beklopfen.
- 10. An einem Ende der Vorrichtung ein Stück Bypassschlauch anbringen
und am anderen Ende eine 1 ml fassende sterile Spritze mit 0,5 ml
Lysierpuffer (0,2 M NaOH) anschließen.
- 11. Den Spritzenkolben vorsichtig hinunterdrücken, bis Flüssigkeit
im Bypassschlauch sichtbar ist. Den Kolben zurückziehen, um den Lysierpuffer
zurück
in die Spritze zu ziehen, wodurch die Membranen mit dem Lysierpuffer
erneut angefeuchtet werden.
- 12. Schritt 11 zweimal wiederholen.
- 13. Alle Flüssigkeit
aus der Vorrichtung entfernen, indem die Vorrichtung über ein
1,5 ml fassendes steriles Röhrchen
gehalten und der Spritzenkolben dreimal hinuntergedrückt wird.
- 14. Den Bypassschlauch entfernen und die Endkappe auf die Vorrichtung
aufsetzen. Den Spritzenkolben zurückziehen, um das gesamte Eluat
(einschließlich
des Eluats auf den Membranen) zu sammeln und es in das 1,5 ml fassende
Röhrchen
zu geben.
- 15. Dem Röhrchen
mit dem Eluat sofort 9 Tropfen Neutralisationspuffer (0,2 M Tris-Phosphat)
zufügen.
Den Deckel des Röhrchens
wieder aufsetzen und es zum vorsichtigen Mischen 2- bis 3-mal umkehren.
- 16. Durchführen
eines ATP-Assays an der Probe unter Verwendung eines Biotrace UniLite-Luminometers
und Sigma Biolumineszenz-Reagenzien (ATP-Assay), wobei der ATP-Assay
wie nachstehend durchgeführt
wird.
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ATP-Assay
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- 1. In eine reine UniLite-Küvette 50 μl ATP-Assay-Mischung geben.
- 2. 3 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
- 3. UniLite HoldTight auf die Küvette platzieren und sie in
das Luminometer geben, den Deckel schließen, und die Messtaste drücken. Nach
10 Sekunden Verzögerung
misst die Maschine 35 Sekunden die Lichtausstrahlung.
- 4. Auf dem Bildschirm wird ein Ausdruck der RLU für die Assay-Mischung
allein angezeigt und ein Ausdruck bereitgestellt. Hierbei handelt
es sich um die Hintergrundablesung des Assays, die nicht größer als
30 RLU sein sollte. Eine höhere
Ablesung zeigt eine Kontamination an.
- 5. Die Küvette
aus der Probenkammer entfernen und der Küvette 100 μl der Eluatprobe zufügen. Durch
vorsichtiges Schütteln
mischen und die Küvette
in die Probenkammer zurückbringen.
- 6. Die Probenkammer schließen,
und die Messtaste drücken.
Die Lichtausstrahlung wird auf dem Bildschirm angezeigt und gedruckt.
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Ergebnisse
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1. Validierung früherer Ergebnisse
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Tabelle
5 und 8 zeigen, dass
ca. 30 Hefezellen pro Assay (oder 300 Zellen pro filtrierte Bierprobe) unter
Verwendung dieses Systems leicht nachgewiesen werden können. Dies
bedeutet, dass 30 Hefezellen pro Assay einen RLU-Output geben, der
leicht von dem unterschieden werden kann, der von nicht inokulierten Lagerbier-Proben
erhalten wird.
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Tabelle
6 und 9 zeigen, dass
3000 Zellen von A. pasteurianus pro Assay eine mittlere Lichtausstrahlung
geben, die weit größer als
der Hintergrundspiegel ist. Die (zuverlässige) Nachweisgrenze des Assays
scheint bei 10000–20000
Zellen von A. pasteurianus pro Assay zu liegen.
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Tabelle
7 und 10 zeigen, dass
150 Zellen von P. damnosus pro Assay eine mittlere Lichtausstrahlung
geben, die größer als
der Hintergrundspiegel ist. Die zuverlässige Nachweisgrenze des Assays
scheint bei > 1000
Zellen von P. damnosus pro Assay zu liegen.
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2. Verbessertes
System
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Tabelle
8 und 11 zeigen die
Wirkung der In-Filter-Anreicherungskultur auf die Nachweiszeit für niedrige
Zahlen von Lactobacillus brevis in filtriertem Bier unter Verwendung
der erfindungsgemäßen zweiten Vorrichtung.
Die Ergebnisse zeigen, dass eine 24-stündige In-Filter-Anreicherung,
die der Filtration folgt, den Nachweis von 160 Zellen von L. brevis
unter Verwendung des Tests und der Vorrichtung gemäss der Erfindung ermöglicht.
Um niedrige Zahlen gestresster Organismen nachzuweisen, kann es
wünschenswert
sein, dass die Anreicherungsstufe 30–40 Stunden dauert.
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Diskussion
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Bei
der Durchführung
einer In-Filter-Anreicherungskultur war nach einer 24-stündigen Inkubation
der Nachweis von ca. 1 Zelle von L. brevis pro ml filtriertem Bier
möglich
(was < 1 Bakterienzelle
pro Assay in einer Ausgangsprobe entspricht). Es würde in einer "realen" Situation jedoch
empfohlen, dass die Anreicherung vor der Durchführung des Tests 30–40 Stunden
dauert, um niedrige Zahlen gestresster Organismen nachweisen zu
können.
Dieses Ergebnis ist mindestens genauso gut und das System leichter
zu verwenden als andere auf ATP-basierende Nachweissysteme, die
derzeit erhältlich
sind. Das erfindungsgemäße System
besitzt außerdem
den Vorteil, dass es im Vergleich zur konventionellen Flachbettmembranfiltration
zum Filtrieren größerer Biervolumina
fähig ist
(und eine Fähigkeit
zum Filtrieren von Stout besitzt), was zu einer erhöhten Nachweisgrenze
führt.
Darüber
hinaus bedeutet das Design der Vorrichtung, dass die Probe und die
Extraktionsstufen in der Filtervorrichtung enthalten sind, wodurch
die Durchführung
des auf ATP basierenden Nachweises erleichtert wird.
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Tabelle
5 Nachweis von Saccharomyces carlsbergensis in filtrierten Bierproben
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Tabelle
6 Nachweis von Acetobacter pasteurianus in filtrierten Bierproben
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Tabelle
7 Nachweis von Pediococcus damnosus in filtrierten Bierproben
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