BR112013012967A2 - processo e dispositivo para concentração de micro-organismos - Google Patents

Abstract

PROCESSO E DISPOSITIVO PARA CONCENTRAÇÃO DE MICRO-ORGANISMOS. A presente invenção refere-se a um processo para a captura ou concentração de micro-organismos para detecção ou teste que compreende (a) fornecer um dispositivo de concentração que compreende (1) uma matriz de não tecido fibroso poroso e (2) uma pluralidade de partículas de pelo menos um agente de concentração que compreende um silicato de metal, sendo que as partículas são embutidas na matriz de não tecido fibroso poroso, (b) fornecer uma amostra que compreende pelo menos um analito celular alvo, (c) colocar em contato o dispositivo de concentração com a amostra, de modo que pelo menos uma porção de pelo menos um analito celular alvo é ligada a ou capturada pelo dispositivo de concentração, e (d) detectar a presença de pelo menos um analito celular alvo ligado.

Description

“PROCESSO E DISPOSITIVO PARA CONCENTRAÇÃO DE MICRO-ORGANISMOS” Pp Campo da Invenção .. A presente invenção refere-se a processos para capturar ou concentrar micro- " organismos de modo que permaneçam viáveis para detecção ou teste. Em outros aspectos, esta invenção refere-se também a dispositivos de concentração (e kits de diagnóstico que compreendem os dispositivos) para uso na execução de tais processos e a métodos de preparação dos dispositivos. Antecedentes As doenças causadas por alimentos e infecções adquiridas em hospitais resultantes da contaminação por micro-organismos são uma preocupação em vários locais ao redor do mundo. Assim, é frequentemente desejável ou necessário realizar testes para se detectar a presença de bactérias ou outros micro-organismos em várias amostras, sejam clínicas, ambientais ou outras, para se determinar a identidade e/ou a quantidade dos micro-organismos presentes. O DNA bacteriano ou RNA bacteriano, por exemplo, podem ser analisados para se —avaliara presença ou ausência de uma espécie particular de bactérias mesmo na presença de outras espécies de bactérias. A capacidade de detectar a presença de uma bactéria Í s específica, entretanto, depende, pelo menos em parte, da concentração da bactéria na amostra sendo analisada. As amostras de bactérias podem ser colocadas em placas ou a submetidas a um processo de cultura para aumentar a quantidade de bactérias na amostra para garantirum nível adequado de detecção, mas a etapa de cultura frequentemente exige um tempo substancial e, portanto, pode atrasar significativamente os resultados da avaliação.

A concentração das bactérias na amostra pode reduzir o tempo de cultura ou mesmo eliminar a necessidade de tal etapa. Assim, foram desenvolvidos métodos para isolar (e por meio disso concentrar) determinadas cepas bacterianas utilizando-se anticorpos específicos paraa cepa (por exemplo, sob a forma de partículas magnéticas ou não magnéticas revestidas com anticorpos). Tais métodos, entretanto, tendem a serem caros e ainda um pouco mais lentos que o desejado para pelo menos algumas aplicações de diagnóstico.

Também têm sido utilizados métodos de concentração que não são específicos para cepas (por exemplo, para se obter uma avaliação mais genérica dos micro- organismos presentes em uma amostra). Após a concentração de uma população mista de micro-organismos, a presença de determinadas cepas pode ser determinada, se desejado, utilizando-se sondas para cepas específicas. A concentração ou captura não específica de micro-organismos tem sido realizada através de métodos baseados em interações entre carboidratos e proteína lectina. Suportes revestidos com quitosano têm sido usados como dispositivos de captura não específica, e substâncias (por exemplo, carboidratos, vitaminas, compostos quelantes de ferro, e sideróforos) que servem como nutrientes para micro-organismos também têm sido descritas

É “como ligandos úteis para permitir a captura não específica de micro-organismos. é Vários materiais inorgânicos (por exemplo, hidróxi apatita e hidróxidos metálicos) têm " sido usados não especificamente para ligar e concentrar bactérias. Os métodos de : concentração físicos (por exemplo, filtragem, cromatografia, centrifugação e deposição gravitacional) também têm sido utilizados para captura não específica, com e/ou sem o uso de agentes de ligação inorgânicos. Tais métodos de concentração não específica têm variado em velocidade (pelo menos alguns procedimentos de realização de testes em alimentos ainda exigem pelo menos incubação de um dia para outro como uma etapa primária de enriquecimento de culturas), custo (pelo menos alguns exigem equipamentos caros, materiais elou técnicos treinados), requisitos de amostras (por exemplo, limitações de natureza e/ou volume de amostras), requisitos de espaço, facilidade de uso (pelo menos alguns exigem processos complicados de múltiplas etapas), adequabilidade para uso no local e/ou eficácia. Sumário Com isso, reconhecemos que há uma necessidade urgente por processos que permitam detectar rapidamente micro-organismos patogênicos. Esses processos serão de preferência não apenas rápidos, mas também de baixo custo, simples (sem envolver 7 equipamentos ou procedimentos complexos), e/ou eficazes sob uma variedade de condições (por exemplo, com vários tipos de matrizes de amostra e/ou micro-organismos - patogênicos, várias cargas de micro-organismo e vários volumes de amostra).

Brevemente, em um aspecto, esta invenção fornece um processo para concentrar não especificamente as cepas de micro-organismos (por exemplo, cepas de bactérias, fungos, leveduras, protozoários, vírus (incluindo vírus não envelopados e vírus envelopados), e endósporos bacterianos) presentes em uma amostra, de modo que os micro-organismos permaneçam viáveis com o propósito de detecção ou teste de uma ou —maisdascepas.O processo compreende (a) fornecer um dispositivo de concentração que compreende (1) uma matriz de não tecido fibroso poroso e (2) uma pluralidade de partículas de pelo menos um agente de concentração que compreende um silicato de metal, as partículas sendo embutidas na matriz de não tecido fibroso poroso, (b) fornecer uma amostra (de preferência, sob a forma de um fluido) que compreende pelo menos um —analito celular alvo (por exemplo, pelo menos uma cepa de micro-organismo), (c) colocar em contato o dispositivo de concentração com a amostra (de preferência, passando-se a amostra através do dispositivo de concentração) de modo que pelo menos uma porção do pelo menos um analito celular alvo é ligado ao ou capturado pelo disposítivo de concentração, e (d) detectar a presença de pelo menos um analito celular alvo ligado.

O processo pode compreender, opcionalmente, separação do dispositivo de concentração da amostra elou enriquecimento cultural do pelo menos um analito celular alvo ligado (por exemplo, por incubação do dispositivo de concentração separado em um

Ee “meio de cultura geral ou específico ao micro-organismo, . que. depende se um. -. enriquecimento do micro-organismo ou geral! ou seletivo é desejado) e/ou isolamento ou ú separação dos analitos celulares alvo capturados (por exemplo, micro-organismos ou um : ou mais componentes dos mesmos) a partir de um dispositivo de concentração depois de contatocom a amostra (por exemplo, ao se passar um agente de eluição ou um agente de lise através do dispositivo de concentração). Se for desejado, entretanto, a detecção do analito celular alvo (por exemplo, métodos à base de cultura, de microscopia/formação de imagens, de genética, à base de luminescência, ou de detecção imunológica) pode ser, em geral, executada na presença do dispositivo de concentração.

O processo da invenção não tem como alvo um analito celular específico (por exemplo, uma cepa de micro-organismo específica). Ao invés disso, descobriu-se que um dispositivo de concentração que compreende certos materiais inorgânicos relativamente baratos embutidos em uma matriz de não tecido fibroso poroso podem ser surpreendentemente eficazes Na captura de uma variedade de micro-organismos (e surpreendentemente eficazes no isolamento ou separação dos micro-organismos capturados através de eluição, em relação a dispositivos correspondentes sem o material - inorgânico). Tais dispositivos podem ser usados para concentrar as cepas de micro- organismos presentes em uma amostra (por exemplo, uma amostra de alimento) de maneira - não específica para cepas, de modo que uma ou mais das cepas de micro-organismos (de preferência, uma ou mais cepas de bactérias) podem ser testadas mais fácil e rapidamente.

O processo da invenção é relativamente simples e de baixo custo (sem exigir equipamentos complexos ou materiais de cepas específicos e caros) e pode ser relativamente rápido (em modalidades preferenciais, capturando pelo menos cerca de 70 por cento (com mais preferência, pelo menos cerca de 80 por cento, com a máxima preferência, pelo menos cerca de 90 por cento) dos micro-organismos presentes em uma amostra fluída relativamente homogênea em menos que cerca de 10 minutos, em relação a uma amostra de controle correspondente que não tem contato com o dispositivo de concentração). Em contraste com o uso de agentes de concentração de particulado sozinhos, o processo pode ser surpreendentemente eficaz na captura de micro- — organismos com tempos de contato relativamente curtos com a amostra (por exemplo, tão curtos quanto 20 segundos) e sem a necessidade de uma etapa de deposição.

O processo da invenção também é surpreendentemente “favorável para testes”. À detecção pode ser geralmente afetada na presença do dispositivo de concentração sem interferência significativa com o teste (por exemplo, sem erros de detecção resultantes da absorção de reagentes de teste pelo dispositivo de concentração ou resultantes da lixiviação dos inibidores de teste a partir do dispositivo de concentração). Isto permite que a concentração e detecção sejam executadas rapidamente (por exemplo, tão rapidamente sis “quanto 10 minutos ou menos) no ambiente de amostragem... ssa ; : Além disso, o processo pode ser eficaz com uma variedade de micro-organismos E é (incluindo patógenos como bactérias gram-positivas e gram-negativas) e com uma variedade de t amostras (matrizes de amostras diferentes e, ao contrário de pelo menos alguns métodos da técnica anterior, mesmo amostras com baixo teor e/ou grandes volumes de micro-organismos). Dessa forma, pelo menos algumas modalidades do processo da presente invenção podem satisfazer a urgente necessidade acima citada de processos simples e de baixo custo de detecção rápida de micro-organismos patogênicos sob uma variedade de condições. O processo da invenção pode ser especialmente vantajoso para concentrar os micro-organismos presentes em amostras de alimento (por exemplo, amostras de alimento contendo — particulados, especialmente aquelas que compreendem particulados relativamente grossos), uma vez que o dispositivo de concentração usado no processo pode apresentar pelo menos uma resistência um tanto quanto maior à obstrução do que pelo menos alguns dispositivos de filtração como filtros micrométricos absolutos. Isso pode facilitaro processamento mais completo de amostras (que é essencial para eliminar testes negativos falsos na realização de testes com alimentos) e o manuseio de amostras de . volume relativamente grande (por exemplo, sob condições no campo). Um processo para concentração preferencial compreende * (a) fornecer um dispositivo de concentração que compreende “20 (1) uma matriz de não tecido fibroso poroso que compreende (i) pelo menos uma fibra fibrilada e (ii) pelo menos um aglutinante polimérico, e (2) uma pluralidade de partículas de pelo menos um agente de concentração que compreende pelo menos um silicato de metal amorfo e esferoidizado, as partículas sendo embutidas na matriz de não tecido fibroso poroso, (b) fornecer uma amostra em fluido que compreende pelo menos um analito celular alvo, e (c) passar à amostra em fluido através do dispositivo de concentração, de tal maneira que pelo menos uma porção do pelo menos um analito celular alvo é ligada ao ou capturada pelo dispositivo de concentração.

Em outro aspecto, a invenção também fornece um dispositivo de concentração que compreende (a) uma matriz de não tecido fibroso poroso, e (b) uma pluralidade de partículas de pelo menos um agente de concentração que compreende um silicato de metal amorfo e esferoidizado, sendo que as partículas são embutidas na matriz de não tecido fibroso poroso. À invenção também fornece um kit de diagnóstico para uso na — execuçãodo processo de concentração da invenção, o kit compreendendo (a) pelo menos um dispositivo de concentração da invenção, e (b) pelo menos um recipiente de teste ou | reagente de teste para uso na execução do processo de concentração descrito acima.

5/42 | ' Â Em ainda outro aspecto, a invenção apresenta um processo para a preparação de . um dispositivo de concentração que compreende (a) fornecer uma pluralidade de fibras, = (b) fornecer uma pluralidade de partículas de pelo menos um agente de concentração que . compreende um silicato de metal amortfo e esferoidizado, e (c) formar pelo menos uma porçãoda pluralidade de fibras em uma matriz de não tecido fibroso poroso que tem pelo menos uma porção da pluralidade de partículas embutidas na mesma. Em ainda outro aspecto, à invenção também fornece um meio filtrante que compreende (a) uma matriz de não tecido fibroso poroso, e (b) uma pluralidade de partículas de pelo menos um agente de concentração que compreende um silicato de metal amorfo e esferoidizado, sendo que as partículas são embutidas na matriz de não tecido fibroso poroso. Descrição Detalhada Na descrição detalhada a seguir, vários conjuntos de intervalos numéricos (por exemplo, do número de átomos de carbono em uma porção particular, da quantidade de um componente particular ou similares) são descritos, €, dentro de cada conjunto, qualquer limite inferior de uma faixa pode ser equiparado com qualquer limite superior de uma faixa. Tais intervalos numéricos também devem incluir todos os números contidos na . faixa (por exemplo, 1a5 inclui 1, 1,5,2, 2,75, 3, 3,80, 4,5,€ assim por diante). Para uso na presente invenção, o termo “ejou” significa um OU todos os z elementos/características mencionados, ou uma combinação de quaisquer dois ou mais dos elementos/características mencionados.

As palavras “preferencial” e “de preferência” referem-se a modalidades da invenção que podem proporcionar certos benefícios, sob certas circunstâncias. Entretanto, outras modalidades podem também ser preferenciais sob as mesmas ou outras circunstâncias. Além disso, a recitação de uma ou mais modalidades preferenciais não implica no desuso de outras — modalidades e não tema intenção de excluir outras modalidades do escopo da invenção.

O termo “compreende” e as variações do mesmo não têm um significado limitador onde tais termos aparecem na descrição e nas reivindicações.

Para uso na presente invenção, “um”, “uma”, “o”, “a”, “pelo menos um”, “pelo menos uma”, “um ou mais” e “uma ou mais” são usados de maneira intercambiável.

A seção de “Sumário da Invenção” acima não se destina a descrever cada modalidade ou todas as implementações da presente invenção. À descrição detalhada a seguir descreve mais particularmente as modalidades ilustrativas. Ao longo da descrição detalhada, é fornecida orientação através de listas de exemplos, sendo que tais exemplos podem ser usados em várias combinações. Em cada instância, uma lista recitada funciona —apenascomo um grupo representativo e não deve ser interpretada como uma lista exclusiva. Definições Conforme usado nesse pedido de patente:

j É “Oo termo “aramída” significa uma poliamida aromática, . : O termo “analito celular” significa um analito de origem celular (ou seja, um micro- organismo ou um componente do mesmo (por exemplo, uma célula ou um componente celular : como ácido desoxirribonucleico (DNA) ou ácido ribonucleico (RNA), proteínas, nucleotídeos como adenosina trifosfato (ATP), e similares, e combinações dos mesmos), referências a um micro-organismo ou cepa de micro-organismo ao longo deste relatório descritivo têm como objetivo serem aplicadas de modo mais genérico a qualquer analito celular), O termo “agente de concentração” significa um materia! ou composição que liga analitos celulares (de preferência, que tem uma eficiência de captura ou ligação de analito celular de pelo menos cerca de 60 por cento, com mais preferência, pelo menos cerca de 70 por cento, com mais preferência ainda, pelo menos cerca de 80 por cento, com a máxima preferência, pelo menos cerca de 90 por cento), O termo “dispositivo de cultura” significa um disposítivo que pode ser usado para propagar micro-organismos sob condições que permitirão que pelo menos uma divisão celular ocorra (de preferência, dispositivos de cultura incluem um alojamento para reduzir ou minimizar a possibilidade de contaminação acidental e/ou uma fonte de nutrientes para - sustentar o crescimento de micro-organismos), O termo “detecção” significa a identificação de um analito celular (por exemplo, « pelo menos um componente de um micro-organismo alvo, que determina, deste modo, que omicro-organismo alvo está presente),

O termo “embutido” (em relação a partículas do agente de concentração em uma matriz de não tecido fibroso) significa que as partículas estão aprisionadas na matriz de não tecido fibroso (e, de preferência, distribuídas dentro da mesma), ao invés de serem meramente espalhadas em sua superfície,

O termo “fibrilado” (em relação a fibras ou material fibroso) significa tratado (por exemplo, por pulsação) de uma maneira que forma fibrilas ou ramificações fixadas a um cabo principal da fibra,

O termo “matriz de não tecido fibroso” significa uma manta ou meio, exceto um tecido de trama ou de malha, que compreende fibras interdispostas (por exemplo, uma manta que compreende fibras que são interdispostas por extrusão em blocos com passagem de ar quente em alta velocidade, fiação contínua, ou outras técnicas de deposição a ar, cardação, deposição a úmido, ou similares),

O termo “detecção genética” significa a identificação de um componente de material genético como DNA ou RNA derivado de um micro-organismo-alvo, O termo “detecção imunológica” significa a identificação de um material antígeno como uma proteína ou um proteoglicano derivado de um micro-organismo-alvo, O termo “micro-organismo” significa qualquer célula ou partícula que tem material

7/42 À ess. genético adequado para análise ou detecção (incluindo; por-exemplo, bactérias, leveduras, E . vírus e endósporos bacterianos), O termo “cepa de micro-organismo” signífica um tipo particular de micro- : organismo que é distinguível através de um método de detecção (por exemplo, micro- organismos de diferentes gêneros, de diferentes espécies dentro de um gênero, ou de diferentes grupos isolados dentro de uma espécie), O termo “para-aramida” significa uma poliamida aromática que tem suas ligações amida ligadas a aneis de benzeno substituído (por exemplo, alqui!- substituído) ou não substituído em uma para-relação (ligada a números de carbono um e quatro), O termo “amostra” significa uma substância ou material que é coletado (por exemplo, para ser analisado), O termo “matriz de amostra” significa os componentes de uma amostra, exceto os analitos celulares, O termo “analito celular alvo” significa qualquer analito celular que se deseja detectar, O termo “micro-organismo-alvo” significa qualquer micro-organismo que se deseja detectar, e . O termo “poro permeável" (em referência a uma matriz porosa) signífica um poro que compreende uma passagem ou canal (com entrada e saída separadas) através da matriz. * Agente de Concentração Os agentes de concentração adequados para uso na execução do processo da invenção incluem aqueles agentes de concentração particulados que compreendem pelo menos um silicato de metal. Os silicatos de metal podem ser cristalinos ou amorfos (de preferência, amorfos). A concentração ou captura utilizando-se tais agentes de concentração é, em geral, não específica para nenhuma cepa, espécie ou tipo de micro-organismo particular e, portanto, fomece a concentração de uma população geral de micro-organismos em uma amostra. Cepas específicas de micro-organismos podem, então, ser detectadas entre a população de micro- organismos capturados usando-se qualquer método de detecção conhecido com sondas para cepas específicas. Dessa forma, os agentes de concentração podem ser usados para a — detecção de contaminantes microbianos ou patógenos (particularmente patógenos existentes em alimentos como bactérias) em amostras clínicas, alimentares, ambientais ou outras.

Quando dispersos ou suspensos em sistemas de água, os materiais inorgânicos como silicatos de metais apresentam cargas de superfície que são características do material e do pH do sistema de água. O potencial na interface material-água é chamado —de“potencialzeta”, que pode ser calculado a partir de mobilidades eletroforéticas (isto é, a partir das taxas segundo as quais as partículas de material deslocam-se entre os eletrodos carregados dispostos no sistema de água). De preferência, os agentes de concentração

E isstaaSs "têm um potencial zéta negativo a um pH de cerca de 7. . E . Os silicatos de metal úteis incluem silicatos de metais como magnésio, cálcio, .. zinco, alumínio, ferro, titânio, e similares (de preferência, magnésio, Zinco, ferro, e titânio, . com mais preferência, magnésio), e combinações dos mesmos. São preferenciais silicatos amorfosde metais em uma forma particulada pelo menos parcialmente fundida (com mais preferência, silicatos amorfos esferoidizados de metais, com a máxima preferência, silicato amorfo esferoidizado de magnésio). Silicatos de metais são conhecidos e podem ser quimicamente sintetizados por métodos conhecidos ou obtidos através da mineração e do processamento de minérios em bruto de ocorrência natural.

Formas particuladas, pelo menos parcialmente fundidas, de silicatos amorfos de metais podem ser preparadas empregando-se qualquer um dos métodos conhecidos de derretimento ou amaciamento de partículas de alimentação relativamente pequenas (por exemplo, partículas com tamanho médio de até cerca de 25 mícrons) sob condições controladas para produzir partículas geralmente elipsoidais ou esferoidais (ou seja, partículas que têm imagens bidimensionais ampliadas que são genericamente arredondadas e isentas de cantos ou bordas agudas, incluindo formatos verdadeiramente ou substancialmente circulares e elípticos e - quaisquer outros formatos redondos ou curvos). Tais métodos incluem atomização, polimento a fogo, fusão direta e similares. Um método preferencial é a fusão a chama, no qual partículas . substancialmente vítreas, pelo menos parcialmente fundidas, são formadas por fusão direta ou polimento a fogo de partículas sólidas de alimentação (por exemplo, como no método descrito na patente US nº 6.045.913 (Castle), cuja descrição é aqui incorporada, por referência). Com a máxima preferência, tais métodos podem ser utilizados para produzir silicatos amorfos esferoidizados de metais convertendo-se uma porção substancial de partículas de alimentação de formato irregular (por exemplo, de cerca de 15 a cerca de 99 volumes por cento, de preferência, de cerca de 50 a cerca de 99 volumes por cento, com mais preferência, de cerca de 75 a cerca de 99 volumes por cento, com a máxima preferência, de cerca de 90 a cerca de 99 volumes por cento) para partículas genericamente elipsoidais ou esferoidais.

Alguns silicatos amorfos de metais encontram-se comercialmente disponíveis. Por exemplo, silicato de magnésio amorfo esferoidizado está disponível comercialmente para uso em formulações cosméticas (por exemplo, como as contas 3M'Y Cosmetic Microspheres CM-111, disponível junto à 39M Company, de St. Paul, MN, EUA).

Em adição aos silicatos de metal, os agentes de concentração podem compreender adicionalmente outros materiais incluindo óxidos de metais (por exemplo, ferro ou titânio), outros materiais cristalinos, e similares, e combinações dos mesmos. Os — agentes de concentração, entretanto, para pelo menos algumas aplicações, contêm de preferência essencialmente nenhuma sílica cristalina.

Na execução do processo da invenção, os agentes de concentração podem ser usados em essencialmente qualquer forma .particulada (de preferência, uma forma : relativamente seca ou livre de voláteis) que é sensível a mistura com fibras para formar o | dispositivo de concentração usado no processo. Por exemplo, os agentes de concentração " podem ser usados na forma de pó ou podem ser aplicados a um suporte particulado como —cápsulas,ou similares.

De preferência, os agentes de concentração são usados sob a forma de um pó. Pós úteis incluem aqueles que compreendem micropartículas (de preferência, micropartículas que tem um tamanho de partícula) na faixa de cerca de 1 micrômetro (com mais preferência, cerca de 2 micrômetros, com mais preferência ainda, cerca de 3 micrômetros, com à máxima preferência, cerca de 4 micrômetros) a cerca de 100 micrômetros (com mais preferência, cerca de 50 micrômetros, com mais preferência ainda, cerca de 25 micrômetros, com a máxima preferência, cerca de 15 ou 20 micrômetros, onde qualquer limite inferior pode ser combinado com qualquer limite superior da faixa, conforme mencionado acima).

Os agentes de concentração particularmente preferenciais adequados para uso na execução do processo da invenção incluem aqueles que compreendem um silicato de metal amorfo e que têm uma composição superficial que tem uma razão de átomo de metal para . átomo de silício menor ou igual a cerca de 0,5 (de preferência, menor que ou igual a cerca de 0,4, com mais preferência, menor que ou igual a cerca de 0,3, com a máxima preferência, . menor que ou igual a cerca de 0,2), conforme determinado por espectroscopia fotoeletrônica deraiosX (XPS). Tais agentes de concentração incluem aqueles descritos na publicação de pedido de patente US 2010/0190171, publicada em 29 de julho de 2010 (Kshirsagar et al., 3M Innovative Properties Company), as descrições dos agentes de concentração e métodos de sua preparação estando aqui incorporados, a título de referência. De preferência, a composição de superfície dos agentes de concentração particularmente preferenciais compreende também pelo menos cerca de 10 em porcentagem atômica média de carbono (com mais preferência, pelo menos cerca de 12 em porcentagem atômica média de carbono, com à máxima preferência, pelo menos cerca de 14 em porcentagem atômica média de carbono), conforme determinado por espectroscopia fotoeletrônica de raios X (XPS). XPS é uma técnica que pode determinar a composição elementar dos elementos mais externos, aproximadamente de 3 a 10 nanômetros (nm) em uma superfície da amostra e que é sensível a todos os elementos da Tabela Periódica exceto o hidrogênio e o hélio. XPS é uma técnica quantitativa com limites de detecção para a maioria dos elementos na faixa de concentração de 0,1 a 1 em porcentagem atômica. As condições preferenciais de avaliação de composições de —superfícieparaa técnica XPS podem incluir um ângulo de emissão de 90 graus medido em relação à superfície da amostra com um ângulo sólido de aceitação de + 10 graus. Tais agentes de concentração de silicato de metal preferenciais podem ter asas — potenciais zeta que são mais negativos do que aqueles de, por exemplo, um síilicato de .

& metal comum, como talco normal. Ainda assim, os agentes de concentração podem ser surpreendentemente mais eficazes que o talco em concentrar micro-organismos como RF bactérias, cujas superfícies geralmente tendem a ser carregadas negativamente. De preferência, os agentes de concentração têm um potencial zeta negativo a um pH de cerca de 7 (com mais preferência, um potencial zeta Smoluchowski na faixa de cerca de -9 milivolts a cerca de -25 míilivolts a um pH de cerca de 7, com mais preferência ainda, um potencial zeta Smoluchowski na faixa de cerca de -10 milivolts a cerca de -20 milivolts a um pH de cerca de 7, com à máxima preferência, um potencial zeta Smoluchowski na faixade cerca de -11milivolts a cerca de -15 milivolts a um pH de cerca de 7).

Outros agentes de concentração particulamente preferenciais adequados para uso na execução do processo da invenção incluem aqueles que compreendem um silicato de metal amorfo modificado por um tampão de adsorção. Tais agentes de concentração incluem aqueles descritos no pedido de patente provisório US 61/289.213, depositada em 22 de dezembro de 2009 (Kshirsagar, 3M Innovative Properties Company), as descrições dos agentes de concentração e métodos de sua preparação estando aqui incorporados, a título de referência. . Dispositivo de Concentração Os dispositivos de concentração adequados para uso na execução do processo da . invenção incluem aqueles que compreendem (a) uma matriz de não tecido fibroso poroso e (b) uma pluralidade das partículas de agente de concentração descritas acima, as partículas sendo embutidas na matriz de não tecido fibroso poroso. Tais dispositivos de concentração podem ser preparados essencialmente por qualquer processo que é capaz de fomecer uma matriz de não tecido fibroso (isto é, uma manta ou meio, exceto o tecido de trama ou de malha, que compreende fibras interdispostas) que tem as partículas de agente de concentração embutidas —namesma.Os processos úteis incluem extrusão em blocos com passagem de ar quente em alta velocidade, fiação contínua, e outras técnicas de deposição a ar, cardação, deposição a úmido, e similares, e combinações dos mesmos (de preferência, deposição a ar, deposição a úmido, e combinações dos mesmos, com mais preferência, deposição a úmido). As fibras que são adequadas para uso na preparação da matriz de não tecido fibroso poroso do dispositivo de concentração incluem fibras polpáveis. As fibras polpáveis preferenciais são aquelas que são estáveis à radiação e/ou a uma variedade de solventes. As fibras úteis incluem fibras poliméricas, fibras inorgânicas, e combinações das mesmas (de preferência, fibras poliméricas e combinações das mesmas). De preferência, pelo menos parte das fibras que são utilizadas apresenta um grau de capacidade hidrofílica. As fibras poliméricas adequadas incluem aquelas produzidas a partir de polímeros naturais (animais ou vegetais) e/ou sintéticos, incluindo polímeros termoplásticos e dispersíveis por solvente. Os polímeros úteis incluem lã, seda, polímeros celulósicos (por exemplo, celulose,

— derivados de celulose, é similares), polímeros fluorados (por exemplo, poli(fluoreto de vinila), : poli(fluoreto de vinitideno), copolímeros de fluoreto de vinilideno como polifluoreto de vinilideno- co-hexafluoropropileno), copolímeros de cloro triluoroetileno — como poli(etileno-co-cloro . triluoroetileno), e similares), polímeros clorados, poliolefinas (por exemplo, poli(etileno), poli(propileno), poli(1-buteno), copolímeros de etileno e propileno, copolímeros de alfa-olefina como copolímeros de etileno ou propileno com 1-buteno, 1-hexeno, 1-octeno, e 1-deceno, polifetileno-co-1-buteno), polifetileno-co-1-buteno-co-1 -hexeno), e similares), polifisoprenos), polibutadienos), poliamidas — (por exemplo, náilon 6, náilon 6,6, náilon 6,12, politiminoadipoilimino-hexametileno), poliliminoadipoiliminodecametileno), policaprolactama, e similares), poliimidas (por exemplo, poli(pirometitimida) e similares), poliéteres, politéter sulfonas) (por exemplo, poli(difeniléter sulfona), poli(difenilsulfona-co-óxido de difenileno sulfona), e similares), poli(sulfonas), polifacetatos de vinila), copolímeros de acetato de vinila (por exemplo, polifetileno-co-acetato de vinila), copolímeros onde pelo menos parte dos grupos de acetato foi hidrolisado para fornecer vários polifálcoois vinílicos) incluindo poli(etileno-co- álcool vinílico), e similares), poli(ffosfazenos), polifésteres de vinita), poliféteres de vinila), polifálcoois vinílicos), poliaramidas (por exemplo, para-aramidas como poli(parafenileno . tereftalamida) e fibras disponíveis sob a designação comercial “KEVLAR”, junto à DuPont Co., de Wilmington, DE, EUA, polpas que estão disponíveis para comercialização em vários graus . com base no comprimento das fibras, que produzem polpas como, por exemplo, “KEVLAR 1F30&'e “KEVLAR 1F694”, ambas incluindo fibras de aramida que têm pelo menos 4 mm de comprimento, e similares), policcarbonatos), e similares, e combinações deles. As fibras poliméricas preferenciais incluem poliamidas, poliolefinas, polissulfonas, e combinações das mesmas (com mais preferência, poliamidas, poliolefinas, e combinações das mesmas, com a máxima preferência, náilons, poli(etileno), e combinações dos mesmos).

As fibras inorgânicas adequadas incluem aquelas que compreendem pelo menos um material inorgânico selecionado a partir de vidros, cerâmicas, e combinações dos mesmos. As fibras inorgânicas úteis incluem fibras de vidro (por exemplo, vidro E, vidro S, e similares), fibras cerâmicas (por exemplo, fibras produzidas a partir de óxidos metálicos (como alumina), carbureto de silício, nitreto de boro, carbureto de boro, e similares), e similares, e combinações dos mesmos. As fibras cerâmicas úteis podem ser pelo menos parcialmente cristalinas (apresentando um padrão da difração de raios X por pó discernível ou contendo ambas as fases (de vidro) cristalina e amorfa). As fibras inorgânicas preferenciais incluem fibras de vidro e combinações das mesmas. As fibras usadas para formar a matriz de não tecido fibroso poroso podem ter um — comprimento e UM diâmetro que podem fornecer uma matriz que tem integridade estrutural suficiente e porosidade suficiente para uma aplicação específica (por exemplo, para um tipo específico de matriz de amostra). Por exemplo, comprimentos de pelo menos cerca de 0,5 mm,

" 1 mm, 2 mm, 3 mm, 4 mm, 6 mm, 8 mm; 10 mm, 15 mm, 20 mm, 25 mm, ou mesmo 30 mm (e. = . combinações dos mesmos), e diâmetros de pelo menos cerca de 10 um (micrômetro), 20 um, 40 um, ou mesmo 60 um (e combinações dos mesmos) podem ser úteis.

Os comprimentos e : diâmetros de fibra preferenciais irão variar, dependendo de fatores incluindo a natureza da fibra eotipode aplicação.

Por exemplo, poli(etileno) fibrilado pode ser útil em comprimentos de cerca de 1 mm a cerca de 3 mm, e náilon não fibrilado pode ser útil em comprimentos de cerca de6 mm a cerca de 12,5 mm, para uma variedade de matrizes de amostra.

Para facilitar o aprisionamento das partículas de agente de concentração elou para assegurar uma matriz de alta área superficial, as fibras usadas para formar a matriz denão tecido fibroso poroso compreendem, de preferência, pelo menos uma fibra fibrilada (por exemplo, sob a forma de uma fibra principal circundada por várias fibrilas menores fixadas). A fibra principal pode ter, em geral, um comprimento na faixa de cerca de 0,5 mm a cerca de 4 mm, e um diâmetro de cerca de 1 a cerca de 20 micrômetros.

As fibrilas podem ter, tipicamente, um diâmetro de submicrômetro.

A matriz de não tecido fibroso poroso pode compreender dois, três, quatro, ou mesmo quatro tipos diferentes de fibras.

Por exemplo, uma fibra de náilon pode ser - adicionada para resistência e integridade, enquanto polietileno fibrilado pode ser adicionado para aprisionamento dos particulados.

Se as fibras fibriladas e não fibriladas são usadas, . geralmente a razão entre o peso das fibras fibriladas e o peso das fibras não fibriladas pode —serde pelomenos cerca de 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 5:1, ou mesmo 8:1. Independente do(s) tipo(s) de fibras escolhido(s), a quantidade de fibra no dispositivo de concentração resultante (em forma seca) é, de preferência, de pelo menos cerca de 10, 12, 12,5, 14, 15, 18, 20, ou mesmo 22 por cento, em peso, até a cerca de 20, 25, 27, 30, 35, ou mesmo 40 por cento, em peso (com base no peso total de todos os componentes do dispositivo de concentração). De preferência, a matriz de não tecido fibroso poroso compreende adicionalmente pelo menos um aglutinante polimérico.

Os aglutinantes poliméricos adequados incluem materiais poliméricos naturais e sintéticos que são relativamente inertes (apresentando pouca ou nenhuma interação química com qualquer uma das fibras ou as partículas de agente de concentração). Os aglutinantes poliméricos úteis incluem resinas poliméricas (por exemplo, —sobaforma de pós e látices), fibras de aglutinante polimérico, e similares, e combinações dos mesmos.

Para pelo menos algumas aplicações, aglutinantes poliméricos preferenciais incluem fibras de aglutinante polimérico e combinações das mesmas.

Para outras aplicações, resinas poliméricas e combinações das mesmas podem ser aglutinantes poliméricos preferenciais.

As resinas poliméricas adequadas incluem, mas não se limitam a, borrachas naturais, —neopreno, copolímeros de estireno-butadieno, resinas de acrilato, cloreto de polivinila, acetato de polivinila, e similares, e combinações dos mesmos.

As resinas poliméricas preferenciais incluem resinas de acrilato e combinações das mesmas.

As fibras de aglutinante polimérico

E adequadas incluem fibras do tipo apenas adesivo (por .exemplo, fibras Kodel" 43UD, : disponíveis junto à Eastman Chemical Products, de Kingsport, TN, EUA), fibras : bicomponentes (por exemplo, fomas lado a lado como fibras bicomponentes de poliolefina E ligadas termicamente Chisso ES, disponíveis junto à Chisso Corporation, de Osaka, Japão, formasdebainhae núcleo, como fibras bicomponentes Melty"" tipo 4080, que têm um núcleo de poliéster e uma bainha de polietileno, disponível junto à Unitika Ltd., de Osaka, Japão, e similares), e similares, e combinações dos mesmos.

As fibras de aglutinante polimérico preferenciais incluem fibras bicomponentes e combinações das mesmas (com mais preferência, fibras bicomponentes de bainha e núcleo e combinações das mesmas). Independentemente do tipo de aglutinante polimérico usado, a quantidade de aglutinante no dispositivo de concentração resultante (sem forma seca) pode ser, em geral, de cerca de 3%, em peso, a cerca de 7%, em peso, (de preferência, cerca de 5%, em peso), com base no peso total de todos os componentes do dispositivo de concentração.

Tais quantidades de aglutinante polimérico podem, em geral, fornecer a matriz de não tecido fibroso poroso com integridade suficiente para uso em diversas aplicações, enquanto não reveste significativamente as partículas.

Surpreendentemente, a quantidade de aglutinante . polimérico no dispositivo de concentração pode ser menor que cerca de 5, 4, 3, 2, OU mesmo 1 por cento, em peso, em relação ao peso das fibras no dispositivo de concentração. . Em modalidades preferenciais do dispositivo de concentração, o aglutinante polimérico não adere substancialmente às partículas.

Em outras palavras, quando o dispositivo de concentração é examinado por microscopia eletrônica de varredura, menos que cerca de 5, 4, 3, 2, ou mesmo 1 por cento da superfície de área total das partículas está coberta com aglutinante polimérico.

O dispositivo de concentração usado no processo da invenção pode ser preparado —porum processo que compreende (a) fornecer uma pluralidade das fibras descritas acima, (b) fornecer uma pluralidade das partículas de agente de concentração descritas acima, e (c) formar pelo menos uma porção da pluralidade de fibras em uma matriz de não tecido fibroso poroso que tem pelo menos uma porção da pluralidade de partículas embutidas na mesma.

Conforme mencionado acima, a formação pode ser executada por essencialmente — qualquer processo que é capaz de fornecer uma matriz de não tecido fibroso (isto é, uma manta ou meio, exceto O tecido de trama ou de malha, que compreende fibras interdispostas) que tem as partículas de agente de concentração embutidas na mesma.

Os processos úteis incluem extrusão em blocos com passagem de ar quente em alta velocidade, fiação contínua, e outras técnicas de deposição a ar, cardação, deposição a úmido, esimilares, e combinações dos mesmos (de preferência, deposição a ar, deposição a úmido, e combinações dos mesmos, com mais preferência, deposição a úmido). De preferência, a formação é executada com O Uso de um processo de deposição a

[iss úmido que compreende (a) formar uma dispersão que compreende a pluralidade de fibras, a . . pluralidade de partículas (que pode ser adicionada e dispersa junto com outros componentes antes da execução de outras etapas do processo ou, se for desejado, pode ser adicionada e . dispersa mais adiante no processo, mas geralmente antes da remoção do líquido —dispersante), e pelo menos um aglutinante polimérico em pelo menos um líquido dispersante (de preferência, água), (b) pelo menos parcialmente depositar aglutinante polimérico sobre pelo menos uma porção das fibras, e (c) remover o líquido dispersante da dispersão.

Em tal processo, as fibras podem estar dispersas no líquido dispersante para formar uma pasta fluida.

Se for desejado, as fibras podem compreender aditivos, ou grupos ou porções químicas para auxiliarem sua dispersão.

Por exemplo, fibras à base de poliolefina podem compreender uma funcionalidade de anidrido maleico ou anidrido succínico, ou, durante o processo de fusão das fibras de polietileno, um tensoativo adequado pode ser adicionado.

A deposição do aglutinante polimérico sobre as fibras pode ser executada, ou antes, ou depois da remoção do líquido dispersante ou etapa de remoção de água, dependendo da natureza do aglutinante polimérico.

Por exemplo, quando um látex polimérico é usado como o aglutinante polimérico, o látex polimérico pode ser precipitado - nas fibras antes ou depois da adição das partículas e antes da remoção de água.

Após a remoção de água, o calor pode ser aplicado para finalizar a remoção de água e para fixar . o látex depositado resultante.

Quando fibras de aglutinante polimérico são usadas como o aglutinante polimérico, a remoção de água pode geralmente ser executada primeiro, seguido de aquecimento para a finalização da remoção de água e para fundir as fibras de aglutinante polimérico (e assim depositar aglutinante polimérico nas fibras). Um ou mais adjuvantes ou aditivos podem ser usados na preparação do dispositivo de concentração.

Os adjuvantes úteis incluem auxiliadores de processamento (por exemplo, agentes de precipitação como aluminato de sódio e sulfato de alumínio, que podem auxiliar na precipitação do aglutinante polimérico nas fibras), materiais que podem melhorar o desempenho geral do dispositivo de concentração resultante, e similares.

Quando usadas, as quantidades de tais adjuvantes podem situar-se na faixa de mais que zero até a cerca de 2%, em peso, (de preferência, até cerca de 0,5%, em peso, com base no peso total dos componentes do dispositivo de concentração), embora suas quantidades sejam, de preferência, mantidas o mais baixo possível, de modo a maximizar a quantidade de partículas de agente de concentração que podem ser incluídas.

Em um processo de deposição a úmido preferencial, as fibras (por exemplo, fibras partidas) podem ser mescladas em um recipiente na presença do líquido dispersante (por — exemplo, água, um solvente orgânico miscível em água como um álcool, ou uma combinação dos mesmos). A quantidade de cisalhamento usado para misturar a mistura resultante não pareceu afetar as propriedades finais do dispositivo de concentração resultante, embora a iESsts. — — quantidade de cisalhamento introduzida durante-a mistura é, de preferência, relativamente alta. t Depois disso, as partículas, o aglutinante polimérico, e um excesso de agente de precipitação á: (por exemplo, um agente de ajuste de pH como alume) podem ser adicionados ao recipiente. : Quando o processo de deposição a úmido preferencial é executado pelo uso de —métodos de folha de prova conhecidos na técnica, a ordem de adição dos três ingredientes à dispersão de fibra não afeta significativamente o desempenho final do dispositivo de concentração. A adição do aglutinante polimérico após a adição das partículas, entretanto, pode fornecer um dispositivo de concentração que apresenta uma adesão ligeiramente maior das partículas às fibras. Quando o processo de deposição a úmido preferencial! é executado com O Uso de um método contínuo, os três ingredientes são, de preferência, adicionados na ordem listada. (A seguinte descrição tem por base um método de folha de prova, embora os versados na técnica possam reconhecer prontamente como adaptar tal método para fornecer um processo contínuo). Depois das partículas, o aglutinante polimérico, e o agente de precipitação são adicionados à pasta aquosa líquida de fibras, a mistura resultante pode ser derramada em um molde, o fundo do mesmo podendo ser coberto por uma tela. O líquido dispersante (de . preferência, água) pode ser deixado para ser drenado a partir da mistura (sob a forma de uma folha úmida) através da tela. Depois que o líquido suficiente foi drenado da folha, a " folha úmida pode ser, em geral, removida do molde e seca por pressão, aquecimento, ou uma combinação dos dois. Geralmente, as pressões de cerca de 300 a cerca de 600 kPa e temperaturas de cerca de 100 a cerca de 200ºC (de preferência, cerca de 100 a cerca de 150ºC) podem ser usadas nestes processos de secagem. Quando fibras de aglutinante polimérico são usadas como o aglutinante polimérico no processo de deposição a úmido preferencial, nenhum agente de precipitação é necessário, e o calor aplicado pode ser usado parafundiras fibras de aglutinante polimérico.

A folha seca resultante pode então ter uma espessura média de pelo menos cerca de 0,2, 0,5, 0,8, 1, 2, 4, ou mesmo 5 mm até cerca de 5, 8, 10, 15, ou mesmo 20 mm. Até cerca de 100 por cento do líquido dispersante pode ser removido (de preferência, até cerca de 90 por cento, em peso). Calandragem pode ser usada para fornecer — processamento ou fusão adicional, se for desejado.

Conforme acima mencionado, as partículas de agente de concentração podem ser micropartículas. As micropartículas podem ser aprisionadas na matriz de não tecido fibroso poroso através de ou interações químicas (por exemplo, ligação química) ou interações físicas (por exemplo, adsorção ou aprisionamento mecânico), dependendo da natureza das fibras que — são utilizadas. Às modalidades preferenciais do dispositivo de concentração incluem aqueles que compreendem pelo menos uma fibra fibrilada que pode afetar aprisionamento mecânico das partículas de agente de concentração. Em uma modalidade do dispositivo de concentração, o

“ diâmetro médio eficaz das partículas é pélo menos cerca de 175 vezes menor que a espessura : não calandrada da folha depositada a úmido resultante (de preferência, pelo menos cerca de 250 vezes menor que a espessura não calandrada da folha, com mais preferência, pelo menos : cerca de 300 vezes menor que a espessura não calandrada da folha).

Uma vez que a capacidade e a eficiência do dispositivo de concentração podem variar, de acordo com a quantidade de partículas de agente de concentração contidas no mesmo, carregamentos de partícula relativamente altos podem ser geralmente desejáveis. A quantidade de partículas no dispositivo de concentração pode ser de preferência pelo menos cerca de 20, 30, 40, 50, 60, 70, ou mesmo 80 por cento, em peso, (com base no peso total de todos os componentes do dispositivo de concentração). As partículas são aprisionadas na matriz de não tecido fibroso poroso e, de preferência, distribuídas dentro da mesma (com mais preferência, as partículas são distribuídas de maneira essencialmente uniforme através da matriz).

O dispositivo de concentração resultante pode ter uma porosidade controlada (de preferência, que tem um tempo Gurley de pelo menos cerca de 0,1 segundo (com mais preferência, de pelo menos cerca de 2 a cerca de 4 segundos, com a máxima preferência, pelo menos cerca de 4 segundos) para 100 mL de ar). A base ponderal do dispositivo de . concentração (sob a forma de um material laminar) pode estar na faixa de cerca de 250 a cerca de 5000 g/m? (de preferência, na faixa de cerca de 400 a cerca de 1500 g/m?, com r mais preferência, de cerca de 500 a cerca de 1200 gm?).

Em geral, o tamanho médio de poro do material laminar pode estar na faixa de cerca de 0,1 a cerca de 10 micrômetros, conforme medido por microscopia eletrônica de varredura (SEM). Os volumes vazios na faixa de cerca de 20 a cerca de 80 volumes por cento podem ser úteis (de preferência, de cerca de 40 a cerca de 60 volumes por cento). À porosidade dos materiais laminares pode ser modificada (aumentada) através da inclusão —defibrasde diâmetro ou dureza maiores na mistura de fibra.

O material laminar pode ser flexível (por exemplo, capaz de ser enrolado ao redor de um núcleo de 2 cm (cerca de 0,75 polegada) de diâmetro). Esta flexibilidade pode permitir que o material laminar seja pregueado ou enrolado. O material laminar pode ter uma contrapressão relativamente baixa (o que significa que um volume relativamente alto de líquido pode ser — passado de maneira relativamente rápida através do mesmo sem gerar uma contrapressão relativamente alta). (Como usado aqui, o termo “contrapressão relativamente baixa” refere-se a uma contrapressão diferencial menor que cerca de 20,7 kPa (3 libras por polegada quadrada), 2,5 (17,2), 2 (13,8), 1,5 (10,3), ou mesmo 6,9 kPa (1 libra por polegada quadrada) a uma vazão de 3 mL/cm?, sendo que a vazão tem por base a área superficial frontal do material laminar.) O material laminar não calandrado pode ser cortado até um tamanho desejado e usado para executar o processo de concentração da invenção. Se for desejado (por exemplo, quando uma queda de pressão significativa ao longo da folha não é uma i

E preocupação), o material laminar pode ser calandrado para aumentar sua resistência à h tração antes do uso. Quando o material laminar será pregueado, a secagem ea ás calandragem podem ser, de preferência, evitadas. : Uma camada única de material laminar pode ser eficaz na execução do processo de concentração da invenção. As múltiplas camadas podem ser usadas para, se for desejado, fornecer uma capacidade de concentração maior.

Uma vantagem significativa da matriz de não tecido fibroso porosa do dispositivo de concentração é que tamanhos de partícula de agente de concentração pequenos (10 pum ou menores) e/ou partículas de agente de concentração com uma distribuição de tamanho relativamente amplo podem ser empregadas. Isto permite uma cinética de passagem única excelente, devido à área superficialrazões de massa aumentados e, para partículas porosas, distâncias de difusão interna minimizadas. Devido às quedas de pressão relativamente baixas, uma força de impulsão mínima (como gravidade ou um vácuo) pode ser usada para puxar uma amostra através do dispositivo de concentração, mesmo quando tamanhos de partícula de agente de concentração pequenos são empregados. Se for desejado, o dispositivo de concentração pode compreender adicionalmente . um ou mais de outros componentes como, por exemplo, um ou mais pré-filtros (por exemplo, para remover partículas de alimento relativamente amplas de uma amostra antes - da passagem da amostra através da matriz porosa), um suporte ou base para a matriz porosa (por exemplo, sob a forma de uma frita ou grade), uma tubulação para aplicação de um diferencial de pressão ao longo do dispositivo (por exemplo, para auxiliar na passagem de uma amostra através da matriz porosa), e/ou um compartimento externo (por exemplo, um cartucho descartável para conter e/ou proteger a matriz porosa). Amostra O processo da invenção pode ser aplicado a uma variedade de tipos diferentes de amostras, incluindo, mas não se limitando a, amostras médicas, ambientais, alimentares, clínicas e de laboratório, e combinações das mesmas. Amostras médicas ou veterinárias podem incluir, por exemplo, células, tecidos, ou fluidos de uma fonte biológica (por exemplo, um ser humano ou um animal) que devem ser testadas para diagnóstico clínico. Amostras ambientais podem ser, por exemplo, procedentes de um estabelecimento médico ou veterinário, uma instalação industrial, solo, uma fonte de água, uma área de preparo de alimentos (áreas de contato e não-contato com alimentos), um laboratório, ou uma área que tenha estado potencialmente sujeita a ações de bioterrorismo. As amostras de áreas de processamento, manipulação e preparação de alimentos são preferenciais, uma vez que são, frequentemente, de interesse particular em relação à contaminação de alimentos causada por patógenos bacterianos. As amostras obtidas sob a forma de um líquido ou sob a forma de uma dispersão ou

: suspensão de sólido em líquido podem ser usadas diretamente, ou podem ser concentradas : (por exemplo, por centrifugação) ou diluídas (por exemplo, mediante a adição uma solução " tampão (com pH controlado)). As amostra sob a forma de um sólido ou de um semissólido bs podem ser usadas diretamente ou podem ser extraídas, se for desejado, por um método como, por exemplo, lavagem ou enxágue com, ou suspensão ou dispersão em, um meio fluido (por exemplo, uma solução tampão). As amostras podem ser obtidas de superfícies (por exemplo, usando-se cotonete ou por enxágue). De preferência, a amostra é um fluido (por exemplo, um líquido, um gás, ou uma dispersão ou suspensão de sólido ou líquido em líquido ou gás).

Exemplos de amostras que podem ser usadas na execução do processo da invenção incluem alimentos (por exemplo, produtos frescos, ou lanches ou carnes frias prontas para consumo), bebidas (por exemplo, sucos ou bebidas carbonatadas), água (incluindo água potável), e fluidos biológicos (por exemplo, sangue total ou um componente do mesmo como plasma, uma fração de sangue enriquecido com plaquetas, um concentrado de plaquetas, ou concentrados de eritrócitos, preparações de células (por exemplo, tecido disperso, aspiração de medula óssea, OU medula óssea de estruturas vertebrais), suspensão de células, urina, saliva, e outros fluidos corpóreos, medula óssea, fluido pulmonar, fluido cerebral, exsudatos . de ferimentos, amostras de biópsia de ferimentos, fluido ocular, fluido espinhal, e similares), bem como preparações lisadas, como lisatos celulares, que podem ser formados usando-se f procedimentos conhecidos como O USO de tampões e lise e similares. As amostras preferenciais incluem alimentos, bebidas, água, fluidos biológicos, e combinações dos mesmos (com alimentos, bebidas, água, e combinações dos mesmos sendo mais preferencial, e com água sendo da máxima preferência). O volume da amostra pode variar dependendo da aplicação específica. Por exemplo, quando o processo da invenção é usado para uma aplicação de diagnóstico ou pesquisa, O volume da amostra pode tipicamente situar-se na faixa de microlitros (por exemplo, 10 microlitros ou mais). Quando o processo é usado para um teste de patógenos em alimentos ou teste de segurança de água potável, o volume da amostra pode tipicamente situa-se na faixa de mililitro a litro (por exemplo, 100 mililitros a 3 litros). Em uma aplicação industrial, como bioprocessamento ou formulação farmacêutica, o volume — pode serde dezenas de milhares de litros.

O processo da invenção pode isolar micro-organismos de uma amostra em um estado concentrado e pode, também, permitir o isolamento de micro-organismos dos componentes da matriz de amostra que podem inibir os procedimentos de detecção a serem utilizados. Em todos estes casos, O processo da invenção pode ser usado em adição a, ou no lugar de, outros — métodos de analito celular ou concentração de micro-organismo. Dessa forma, opcionalmente, as culturas podem ser desenvolvidas a partir de amostras antes ou depois da execução do processo da invenção, se for desejada uma concentração adicional. O enriquecimento de do culturas pode ser geral ou primário (de modo à enriquecer as concentrações da maioria ou E Eh essencialmente de todos os micro-organismos), ou pode ser específico ou seletivo (de modo a enriquecer apenas a(s) concentração(ões) de um ou mais micro-organismo(s) selecionado(s). y Estabelecer Contato O processo da invenção pode ser executado por qualquer um dos vários métodos conhecidos existentes ou que venham a ser desenvolvidos para proporcionar o contato entre dois materiais. Por exemplo, o dispositivo de concentração pode ser adicionado à amostra, ou a amostra pode ser adicionada ao dispositivo de concentração. O dispositivo de concentração pode ser imerso em uma amostra, uma amostra pode ser vertida sobre o dispositivo de concentração, uma amostra pode ser vertida em um tubo ou cavidade contendo o dispositivo de concentração, ou, de preferência, uma amostra pode ser passada sobre ou através (de preferência, através) do dispositivo de concentração (ou vice-versa). De preferência, o contato é executado de tal maneira que a amostra passa através de pelo menos um poro da matriz de não tecido fibroso poroso (de preferência, através de pelo menos um poro permeável). O dispositivo de concentração e a amostra podem ser combinados (com o uso de qualquer ordem de adição) em qualquer um de uma variedade de recipientes ou suportes - (opcionalmente, um recipiente terminado, fechado ou lacrado, de preferência, uma coluna, um cilindro de seringa, ou outro suporte projetado para conter o dispositivo sem essencialmente nenhum vazamento da amostra). Recipientes adequados para uso na execução do processo da invenção serão determinados pela amostra específica e poderão variar amplamente em tamanho e natureza. Por exemplo, o recipiente pode ser pequeno, como um recipiente de 10 microlitros (por exemplo, um tubo de ensaio ou seringa) ou maior, como um recipiente de 100 mililitros a 3 litros (por exemplo, um frasco de Erlenmeyer ou um recipiente cilíndrico anular).

O recipiente, o dispositivo de concentração e qualquer outro aparelho ou aditivos que entrem diretamente em contato com a amostra podem ser esterilizados (por exemplo, por calor controlado, gás de óxido de etileno, ou radiação) antes do uso, a fim de reduzir ou evitar qualquer contaminação da amostra que poderia causar erros de detecção. À quantidade de agente de concentração no dispositivo de concentração que é suficiente para capturar ou concentrar os micro-organismos de uma dada amostra para a detecção bem-sucedida varia — (dependendo, por exemplo, da natureza e forma do agente de concentração e do dispositivo, e do volume da amostra), e pode ser prontamente determinada pelo versado na técnica.

O contato pode ser executado por um período desejado (por exemplo, para volumes de amostra de vários litros ou para processos envolvendo múltiplas passagens através do dispositivo de concentração, um contato de até cerca de 60 minutos pode ser útil, de — preferência, de cerca de 15 segundos a cerca de 10 minutos ou mais, com mais preferência, de cerca de 15 segundos a cerca de 5 minutos, com à máxima preferência, de cerca de 15 segundos a cerca de 2 minutos). O contato pode ser aprimorado misturando-se (por exemplo,

20/42 À Ss. por misturação, agitação, ou aplicação de um diferencial de pressão no dispositivo para E facilitar a passagem da amostra através de sua matriz porosa) e/ou incubação (por exemplo, à * temperatura ambiente), que são opcionais, mas podem ser preferênciais, para aumentar O . contato do micro-organismo com o dispositivo de concentração.

De preferência, o contato pode ser realizado fazendo uma amostra passar pelo menos uma vez (de preferência, apenas uma vez) através do dispositivo de concentração (por exemplo, por bombeamento). Essencialmente, pode ser utilizado qualquer tipo de bomba (por exemplo, uma bomba peristáltica) ou outro equipamento para criar um diferencial de pressão no dispositivo (por exemplo, uma seringa ou êmbolo). As taxas de fluxo úteis irão variar, dependendo de tais fatores como a natureza da matriz de amostra e 4 aplicação específica.

Por exemplo, taxas de fluxo da amostra através do dispositivo de até cerca de 100 mililitros por minuto ou mais podem ser eficazes. De preferência, para amostras como bebidas e água, taxas de fluxo de cerca de 10 a 20 mililitros por minuto podem ser utilizadas. Para amostras de alimento pré-filtradas ou purificadas de outro modo, taxas de fluxo de cerca de 6 mililitros por minuto (1,5 mililitro por 15 segundos) podem ser úteis.

Tempos de contato mais longos e taxas de fluxo mais lentas podem ser úteis para . matrizes de amostra mais complexas como carne bovina ou de peru moída. Um método de contato preferencial inclui tal passagem da amostra através do F dispositivo de concentração (por exemplo, por bombeamento). Se for desejado, um ou mais aditivos (por exemplo, reagentes de lise, reagentes para ensaio bioluminescentes, reagentes de captura à base de ácido nucleico (por exemplo, microesferas magnéticas), meio de crescimento microbiano, tampões (por exemplo, para umedecer uma amostra sólida), reagentes de marcação microbianos, tampões de lavagem (por exemplo, para lavar material solto), agentes de eluição (por exemplo, albumina sérica), tensoativos (por exemplo, tensoativo não iônico Triton” X-100, disponível junto à Union Carbide Chemicals and Plastics, de Houston, TX, EUA), agentes de abrasão mecânica/eluição (por exemplo, microesferas de vidro), tampões de adsorção (por exemplo, o mesmo tampão usado para a preparação do agente de concentração com adsorção modificada por tampão mencionado acima ou um tampão diferente), e similares) podem ser incluídos na — combinação do dispositivo de concentração e amostra durante o contato. O processo da invenção pode, opcionalmente, compreender adicionalmente separação do dispositivo de concentração ligado ao analito celular alvo resultante e à amostra. À separação pode ser executada por numerosos métodos que são bem conhecidos na técnica (por exemplo, por bombeamento, decantação, ou sifonação de uma amostra fluida, a fim de se —deixaro dispositivo de concentração ligado ao analito celular alvo nó recipiente ou vasilhame utilizado na execução do processo). Também pode ser possível isolar ou separar os analitos celulares alvo capturados (micro-organismos alvo ou um ou mais componentes dos mesmos) a '

partir do dispositivo de concentração depois de contato com a amostra (por exemplo, passando- " se um agente de eluição ou um agente de lise sobre ou através do dispositivo de concentração). E O processo da invenção pode ser executado manualmente (por exemplo, de uma P maneira por lote) ou pode ser automatizado (por exemplo, para permitir o processamento processo contínuo ou semicontínuo). ki Detecção Uma variedade de micro-organismos pode ser concentrada e detectada através do uso do processo da invenção, incluindo, por exemplo, bactérias, fungos, leveduras, protozoários, vírus (incluindo ambos os vírus não envelopados e envelopados), endoesporos bacterianos (por exemplo, Bacillus (incluindo Bacíllus anthracis, Bacillus cereus, e Bacillus subtilis) e Clostridium (incluindo Clostridium botulinum, Clostridium diffícile, e Clostridium perfringens)), e similares, e combinações dos mesmos (de preferência, bactérias, leveduras, vírus, endósporos bacterianos, fungos, e combinações dos mesmos, com mais preferência, bactérias, leveduras, endósporos bacterianos, fungos, e combinações dos mesmos, com mais preferência ainda, bactérias, leveduras, fungos, e combinações dos mesmos, ainda com mais preferência, bactérias gram-negativas, bactérias gram-positivas, leveduras, fungos, e . combinações dos mesmos, com a máxima preferência, bactérias gram-negativas, bactérias gram-posiítivas, leveduras, e combinações dos mesmos). O processo tem utilidade na r detecção de patógenos, que podem ser importantes para a segurança de alimentos ou por razões médicas, ambientais ou antiterrorismo.

O processo pode ser particularmente útil na detecção de bactérias patogênicas (por exemplo, ambas as bactérias gram-negativas e gram- positivas), bem como várias leveduras e fungos (e combinações de quaisquer um destes). Os gêneros dos micro-organismos alvo a serem detectados incluem, mas não se limitam a, Listeria, Escherichia, Salmonela, Campylobacter, Clostridium, Helicobacter, — Mycobacterium, Staphylococcus, Shigella, Enterococcus, Bacillus, Neisseria, Shiguela, Streptococcus, Vibrio, Yersinia, Bordetella, Borrelia, Pseudomonas, Saccharomyces, Candida e similares, e combinações dos mesmos.

As amostras podem conter uma pluralidade de cepas de micro-organismos, e qualquer cepa específica pode ser detectada independentemente de qualquer outra cepa.

Cepas específicas de micro-organismo que podem ser alvos para à detecção incluem Escherichia coli, Yersinia enterocolítica, Yersinia pseudotuberculosis, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, Listeria monocytogenes (para o qual Listeria innocua é um representante), Staphylococcus aureus, Salmonella enteríca, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Staphylococcal enterotoxin ssp, Bacillus cereus, Bacillus anthracis, Bacillus atrophaeus, Bacillus subtilis, Clostridium perfringens, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Enterobacter sakazakii, vírus entéricos não envelopados de infecção humana, para o qual o bacteriófago Escherichia coli é um representante, Pseudomonas aeruginosa, € similares, e combinações dos mesmos (de preferência, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes

(para o qual Listeria innocua é um representante), Salmonella enterica, Saccharomyces e cerevisiae, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, vírus entéricos não envelopados de infecção humana, para o qual O bacteriófago Escheríchia coli é um " representante, e combinações dos mesmos, com mais preferência, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes (para o qual Listeria innocua é um representante), Saccharomyces cerevisiae, Pseudomonas aeruginosa, e combinações dos mesmos).

Os micro-organismos capturados ou ligados (por exemplo, por adsorção ou por peneiração) pelo dispositivo de concentração podem ser detectados usando-se essencialmente qualquer método desejado conhecido atualmente ou que venha a ser desenvolvido. Esses métodos incluem, por exemplo, métodos baseados em culturas (que podem ser preferenciais quando o tempo permite), microscopia (por exemplo, usando-se um microscópio de luz transmitida ou um microscópio de epifluorescência, que pode ser usado para visualizar micro-organismos marcados com corantes fluorescentes) e outros métodos de formação de imagens, métodos de detecção imunológica e métodos de detecção genética. O processo de detecção que segue a captura de micro-organismo pode incluir, opcionalmente, lavagem para remover componentes da matriz de amostra, . corte ou de outro modo dissolução da matriz de não tecido fibroso poroso do dispositivo de concentração, marcação, fervura, ou uso de tampões de eluição ou agentes de lise para a . liberação do analito celular do dispositivo de concentração, ou similares.

A detecção imunológica é a detecção de um material antígeno derivado de um organismo-alvo, que é comumente uma molécula biológica (por exemplo, uma proteína ou proteoglicano) agindo como um marcador sobre a superfície das bactérias ou das partículas virais. A detecção do material antígeno pode ser feita, tipicamente, por um anticorpo, um polipeptídeo selecionado a partir de um processo como Phage Display, ou um aptâmeroa partir de um processo de triagem.

Os métodos de detecção imunológica são bem conhecidos e incluem, por exemplo, imunoprecipitação e ensaio de imunossorvente ligado à enzima (ELISA). À ligação de anticorpos pode ser detectada de várias maneiras (por exemplo, pela marcação de um anticorpo primário ou secundário com um corante fluorescente, com um ponto — quântico, ou com uma enzima que pode produzir quimioluminescência ou um substrato colorido, e o uso de uma leitora de placas ou um dispositivo de fluxo lateral).

A detecção pode ser executada também por testes genéticos (por exemplo, por hibridização de ácido nucleico ou amplificação dirigida por iniciador), que é frequentemente um método preferencial. Os micro-organismos capturados ou ligados podem ser lisados para tomar —seumaterial genético disponível para teste. Os métodos de lise são bem conhecidos e incluem, por exemplo, tratamentos como sonicação, choque osmótico, tratamento por alta temperatura (por exemplo, de cerca de 50ºC a cerca de 100ºC), e a incubação com uma enzima como

23/42 ó lisozima, glucolase, zimolose, liticase, proteinase K, proteinase E, e enolisinas virais. x Muitos testes de detecção genética comumente usados detectam OS ácidos e. nucleicos de um micro-organismo específico, incluindo o DNA e/ou o RNA.

A estringência - das condições utilizadas em um método de detecção genética está correlacionada com o — nívelde variação na sequência do ácido nucleico que é detectada.

Condições altamente rigorosas de concentração de sal e temperatura podem limitar a detecção até a sequência exata de ácido nucleico do alvo.

Dessa forma, as cepas de micro-organismos com pequenas variações em uma sequência de ácido nucleico do alvo pode ser distinguida usando-se um teste genético altamente rigoroso.

À detecção genética pode se basear na hibridização de ácido nucleico onde uma sonda de ácido nucleico de filamento único é hibridizada até os ácido nucleicos sem propriedade do micro-organismo, de modo que é produzido um ácido nucleico de filamento duplo, incluindo a cepa de sonda.

O versado na técnica estará familiarizado — com identificações = de sondas, como radioativas, fluorescentes, e quimioluminescentes, para a detecção de híbridos após a eletroforese em gel eletroforese capilar, ou outro método de separação.

Os métodos de detecção genética particularmente úteis baseiam-se na : . amplificação de ácido nucleico dirigida por iniciadores.

Os métodos de amplificação de ácido nucleico dirigidos por iniciadores incluem, por exemplo, métodos de ciclagem r térmica (por exemplo, reação em cadeia de polimerase (PCR), reação em cadeia de ' 20 polimerase transcriptase reversa (RT-PCR), e reação em cadeia de ligase (LCR)), bem como métodos isotérmicos e amplificação de deslocamento de cepas (SDA) (e : combinações dos mesmos, de preferência, PCR ou RT-PCR). Os métodos para a detecção do produto amplificado não se limitam a e incluem, por exemplo, separação por eletroforese em gel e coloração por brometo de etídeo, bem como à detecção de uma : 25 —marca fluorescente ou marca de rádio incorporada no produto.

Os métodos que não : exigem uma etapa de separação antes da detecção do produto amplificado podem : também ser usados (por exemplo, PCR em tempo real ou detecção homogênea). ! Os métodos de detecção por bioluminescência são bem conhecidos e incluem, por ' exemplo, métodos de detecção por trifosfato de adenosina (ATP) inclusive aqueles descritos —napatente US nº 7.422.868 (Fan et al.), cujas descrições estão aqui incorporadas a título de ' referência.

Outros métodos de detecção por luminescência podem também ser utilizados. ' Como não é específico para uma determinada cepa, o processo da invenção fornece um sistema de captura geral que permite que múltiplas cepas de micro-organismos sejam o alvo para testes na mesma amostra.

Por exemplo, quando se testa quanto à contaminação de amostras de alimentos, pode ser desejado testar a presença de Listeria monocytogenes, Escherichia coli e salmonela dentro da mesma amostra.

Uma única etapa de captura pode, então, ser seguida de, por exemplo, testes PCR ou RT-PCR usando-se iniciadores específicos para amplificar diferentes sequências de ácido nucleico de cada uma . dessas cepas de micro-organismos. Dessa forma, pode-se evitar a necessidade de NS manuseio e procedimentos de preparo de amostras separadas para cada cepa. " Kit de Diagnóstico Um kit de diagnóstico para uso na execução do processo de concentração da invenção compreende (a) pelo menos um dispositivo de concentração descrito acima, e (b) pelo menos um recipiente de teste ou reagente de teste (de preferência, um recipiente de teste ou reagente de teste estéril) para uso na execução do processo de concentração da invenção. De preferência, o kit de diagnóstico compreende, ainda, instruções para executar o processo.

Recipientes de teste ou suportes úteis incluem aqueles descritos acima e podem ser usados, por exemplo, para contato, para incubação, para coleta de eluído, ou para outras etapas de processamento desejadas. Reagentes de teste úteis incluem cultura ou meio de crescimento de micro-organismos, agentes de lise, agentes de eluição, tampões, componentes de teste de detecção por luminescência (por exemplo, luminômetro, reagentes de lise, enzima de luciferase, substrato enzimático, tampões de reação, e similares), componentes de teste de detecção genética, e similares, e combinações dos . mesmos. Um agente de lise preferencial é uma enzima lítica ou produto químico fornecido em um tampão, e componentes de teste de detecção genética preferenciais incluem um . ou mais iniciadores específicos para um micro-organismo-alvo. O kit pode, opcionalmente, compreender, ainda, fórceps esterilizados, ou similares. Meio Filtrante Em outras modalidades, a presente descrição apresenta um meio filtrante para remoção de contaminantes ou patógenos microbianos de uma amostra (por exemplo, água). O meio filtrante adequado para uso, de acordo com a presente descrição, inclui aqueles que compreendem (a) uma matriz de não tecido fibroso poroso e (b) uma pluralidade das partículas de agente de concentração descritas acima, as partículas sendo embutidas na matriz de não tecido fibroso poroso. Tal meio filtrante pode ser preparado essencialmente pelos mesmos processos, e inclui essencialmente os mesmos materiais, como aqueles acima descritos em relação a agentes de concentração e dispositivos de concentração. Exemplos Os objetivos e vantagens desta invenção são ilustrados, ainda, pelos exemplos a seguir, porém, os materiais e quantidades particulares relatadas nestes exemplos, bem como outras condições e detalhes, não devem ser construídas para limitar desnecessariamente esta invenção. Todas as partes, porcentagens, razões e assim por diante, nos Exemplos a seguir, são expressas em peso, à menos que seja observado de outro modo. Solventes e outros reagentes usados foram obtidos da Sigma-Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI, EUA) exceto se especificado diferentemente. Todas as culturas de micro-organismos foram

O adquíridas junto à The American Type Culture Collection (ATCC, de Manassas, VA, EUA). : E Resultados experimentais são obtidos a partir de uma média de 2 testes, exceto onde especificado em contrário.

Culturas de um dia para o outro foram preparadas por estriamento F de micro-organismos selecionados em placas de ágar tríptico de soja e, então, a incubação das placasa37ºC de um dia para o outro.

Todas as contagens de micro-organismo foram realizadas de acordo com procedimentos de contagem microbiológica padrão para unidades de formação de colônia, e as contagens são de números aproximados.

Agentes de concentração O agente de concentração silicato cristalino de magnésio (deste ponto em diante do presente documento referido como talco) foi adquirido junto à Mallinckrodt Baker, Inc. (Phillipsburg, NJ, EUA). O agente de concentração de silicato amorfo esferoidizado de magnésio (deste ponto em diante do presente documento referido como talco-AS) foi obtido como contas 3MTM Cosmetic Microspheres CM-111 (conformado como esferas sólidas, densidade da partícula de 2,3 g/lcentimetros cúbico, área superficial de 3,3 m?/g, tamanho de partícula: 90 por cento menos que cerca de 11 mícrons, 50 por cento menos que cerca de 5 mícrons, 10 por cento + menos que cerca de 2 mícrons, disponível junto à 38M Company, de St.

Paul, MN, EUA). Medições do Potencial Zeta . Os potenciais zeta das dispersões aquosas dos agentes de concentração talco e talco- AS(5,75 por cento em peso de talco e 5,8 por cento, em peso, de talco-AS, respectivamente, em água deionizada de 18 mega Ohms obtida utilizando-se um sistema de desionização Milli- QT” Elix 107º Synthesis A10 da Millipore Corporation, Bedford, MA, EUA) foram medidos como função do ácido clorídrico adicionado (pH) empregando-se um analisador espectral eletroacústico de multi-frequência Colloidal Dynamics Acoustosizer 117% (Colloidal Dynamics, —Wanvick, RI, EUA) equipado com um módulo de tituiagem automática TM200, eletrodo de pH e célula de condutividade em linha.

As medições foram realizadas usando-se a calibração polar e ajustes de amostra polares com os seguintes parâmetros gerais: Volume inicial: 170 mL de dispersão Volume de titulagem: 5 a 10 mL ao final, 20 etapas para cada titulagem Titrante: ácido clorídrico 1,0 N em água (J.T.

Baker, Phillipsburg, NJ, EUA) Taxa de agitação: 300 revoluções por minuto (rpm) Taxa de bombeamento: 400 mL por minuto Atraso de mistura: 120 segundos com agitação após a adição de ácido antes da medição A um pH de cerca de 7, o talco-AS apresentou um potencial zeta de Smoluchowski de cerca de -12 mV, e o talco apresentou um potencial zeta de Smoluchowski de cerca de -8 mV.

26/42 | À Análise da composição de superfície - dao t E: As composições de superfície das amostras dos agentes de concentração de talco e talco-AS foram analisadas por espectroscopia fotoeletrônica de raios X (XPS, , também conhecida como ESCA). As amostras dos pós foram prensadas em fitas adesivas deladoduploe sensíveis à pressão sobre papel alumínio.

O excesso de pó foi removido de cada superfície da amostra aplicando-se gás nitrogênio comprimido.

Os dados espectrais foram adquiridos com o uso de um espectrômetro Kratos AXIS Ultra” DLD (Kratos Analytical, de Manchester, Inglaterra) que tem uma fonte de excitação de raios X AktK, monocromática (1487 eV) e um analisador de energia de elétrons hemisférico operado a um modo de energia de passagem.

Os fotoelétrons emitidos foram detectados a um ângulo de emissão de 90 graus medido em relação à superfície da amostra com um ângulo sólido de aceitação de + 10 graus.

Uma pistola de elétrons de baixa energia foi usada para minimizar a carga da superfície.

As medições foram feitas com o uso de uma energia de 140 Watts ao ânodo e uma pressão da câmara de 2 x 10º Torr.

Uma área da superfície de cada amostra de agente de concentração medindo cerca de 300 micrômetros por cerca de 700 micrômetros foi analisada para cada ponto de - dados.

Três áreas em cada amostra foram analisadas e sua média calculada para se obter os valores médios em porcentagem atômica relatados.

O processamento dos dados foi - executado usando-se o software padrão Vision2"” (Kratos Analytical, Manchester, Inglaterra). Os resultados (elementos presentes em um nível detectável por XPS sobre a superfície dos agentes de concentração) são mostrados na Tabela A abaixo: Tabela A.

Agente de Magnésio Silício Razão Carbono Oxigênio Concentração | (Porcentagem | (Porcentagem entre | (Porcentagem | (Porcentagem Atômica Atômica magnésio Atômica Atômica Média) Média) e silício Média) Média) SA Te IA A Aa aca sea ea o ee Materiais: m Todas as culturas estoque bacterianas e de levedura (Saccharomyces —cerevisiae (ATCC 201390), Listeria monocytogenes (ATCC 51414), Escherichia coli (ATCC 51813), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027), Staphylococcus aureus (ATCC 6538), e Listeria innocua (ATCC 33090)) foram obtidas junto à The American Type Culture Collection, de Manassas, VA, EUA, exceto onde indicado de outro modo.

Os micro- organismos para teste foram isolados de uma cultura estriada preparada por estriamento deuma cultura estoque em uma placa de ágar tríptico de soja e incubação de um dia para o outro a 37ºC, de acordo com práticas de microbiologia padrão.

E FE u As seguintes fibras foram obtidas junto à Minifibers, Inc., de Jonnson City, TN, EUA : - Fibra 1 — fibras de polietileno fibriladas de 1 denier (FYBREL'Y 620) e - Fibra 2 — fibras de polietileno fibriladas (FYBRELTY 400) - - Fibra 3 — fibras de náilon cortadas de 6 denier com 3,125 mm (0,125 polegada) decomprimento - Fibra 4 — fibras de náilon cortadas de 6 denier com 6,25 mm (0,25 polegada) de comprimento - Fibra 5 — fibras de náilon cortadas de 6 denier com 12,5 mm (0,5 polegada) de comprimento - Fibra 7 — fibras bicomponentes de etileno - acetato de vinila (bainha)/polipropileno (núcleo) de 1 denier m Fibra 6 — fibras de vidro longas (fibras de vidro Micro-Strand 106-475, obtidas junto à Schuller, Inc., de Denver, CO, EUA) = Aglutinante de Látex — 50%, em peso, de sólidos de emulsão de acetato de vinila, vendido sob a designação comercial Airflex 600BP, disponível junto à Air Products Polymers, de Allentown, PA, EUA - m Flocutante — floculante MP 9307 (que acredita-se ser uma solução aquosa de um copolímero de dimetilamina e epicloridrina), Midsouth Chemical Co., Inc., de Riggold, LA, EUA " m Talco AS — esferoides de silicato de magnésio amorfos (3MTY Cosmetic —Microspheres CM-111 descritas acima, disponíveis junto à 3M Company, de St.

Paul, MN, EUA)

m Caldo BHI — meio de crescimento de propósito geral de caldo de infusão de coração bovino DIFCOTY, disponível junto a Becton Dickinson, de Sparks, MD, EUA, preparado a 3,7%, em peso, de concentração, de acordo com as instruções do fabricante

1 Solução Tampão - tampão Butterfield, pH 7,2 + 0,2, solução tampão de fosfato de

— potássio monobásico, número de catálogo VWR 83008-093, WVWR, de West Chester, PA, EUA m Placa de Ágar Tríptico de Soja — ágar tríptico de soja Difco'"v, obtido junto à Becton Dickinson, de Sparks, MD, EUA, preparado a 3%, em peso, de acordo com as instruções do fabricante com o uso de caldo triptcaseína de soja Difco"”, Becton

Dickinson, de Sparks, MD, EUA nm Placa de MOX Meio Oxford, modificado para Listeria, meio de crescimento à base de ágar, obtido jutno à Hardy Diagnostics, de Santa Maria, CA, EUA m Placa de ágar YPD — uma placa de ágar preparada de acordo com as instruções do fabricante com 5%, em peso, de pó de dextrose peptona de extrato de levedura Difco'?" e 1,5%, em peso, de pó de ágar Difco"", ambos pós obtidos junto à —Becton Dickinson, de Sparks, MD, EUA nm Placa de E. coli — placa de contagem de E. coli/coliformes 3MTY Petrifilm ” (dispositivos de cultura de filme plano que compreendem pelo menos um nutriente o fermentável), 3M Company, de St: Paul; MN, EUA AA : m Placa de AC — placa de contagem aeróbica 3MTY PetrifimT" (um dispositivo de E cultura de filme plano que compreende um meio de cultura seco e re-hidratável), 3M F Company, de St.

Paul, MN, EUA nu Placas de Y/M — placas de contagem de levedura e fungo 3M TM Petrifim " (um dispositivo de cultura de filme plano que compreende um meio de cultura seco e re- hidratável), 3M Company, de St.

Paul, MN, EUA m Placas de PIA — ágar de isolamento Pseudomonas, disponível junto à Teknova, obtido junto à VWR, de West Chester, PA, EUA m Placas de c-ágar — placas de Staph aureus BBLTY CHROMagar"" (meio de crescimento à base de ágar, produzidas pela Becton Dickinson, obtidas junto à VWR, de West Chester, PA, EUA) m Seringas — seringa de ponta BD Luer-Lok?Y, disponível junto à VWR, de West Chester, PA, EUA m Ensaio ELISA - kit de imunoteste visual de Listeria 3MTM TECRATY, 3M Company, de St.

Paul, MN, EUA m Sacos para homogeneização de amostras — distribuidor para misturador de laboratório StomacherT" 400 e sacos filtrantes de polietileno StomacherT", Seward Corp., " de Norfolk, Reino Unido, obtidos junto à VWR, de West Chester, PA, EUA Termos m Matriz de não tecido fibroso poroso — pode também ser chamada de feltro seco, um bloco, uma matriz, um disco, ou um filtro nos exemplos e exemplos comparativos a seguir m Retenção de Sólidos — O termo “retenção de sólidos” refere-se à porcentagem, em peso, de sólidos totais retida em uma matriz de não tecido fibroso poroso durante um — processo de produção de bloco.

Ele é calculado dividindo-se o peso total de uma matriz de não tecido fibroso poroso finalizada e seca pelo peso total de todos os materiais sólidos usados para se produzir a matriz, exceto o floculante (por exemplo, o peso total dos sólidos de aglutinante de látex, fibras, e talco AS). m CFUs — unidades formadoras de colônia m Contagem de colônia — Colônias de micro-organismos foram contadas manualmente, de acordo com procedimentos de microbiologia padrão, exceto onde especificado em contrário.

Todas as contagens de colônia foram aproximadas. nm Contagem de filtrado — a contagem de colônias de micro-organismos em um filtrado m Contagem pré-filtração — a contagem de colônias de micro-organismos em uma amostra pré-filtração m MCE — Eficiência de captura de micro-organismos (ou eficiência de ligação) de | uma matriz de não tecido fibroso poroso é uma determinação de quão bem uma matriz

À À captura micro-organismos. À MCE, em por cento (%), foi determinada pela seguinte fórmula: - - : MCE = 100 — [contagem de filtrado/contagem pré-filtração) x 100] Exemplos de 1 a 17 e Exemplos Comparativos de C1 a C4: Preparação dos - Dispositivos de Concentração de 1a17edeC1aC4 Pré-misturas de fibra foram preparadas, que tem as composições de fibra e água mostradas na Tabela 1. Cada pré-mistura de fibra foi preparada, primeiro, por mistura de uma fibra fibrilada (Fibra 1 ou Fibra 2) com a quantidade de água de torneira fria especificada em um misturador de 4 L (misturador para tarefas pesadas Waring comercial, Modelo 37BL84) a velocidade média durante 90 segundos. As fibras foram examinadas para se assegurar que elas foram uniformemente dispersas sem aglomerados ou nódulos, e foram misturadas adicionalmente, se necessário, para quebrar quaisquer nódulos. As outras fibras especificadas foram então adicionadas com mistura adicional, e a quantidade de pré- mistura especificada foi, então, adicionada a um béquer de aço inoxidável e misturada com um misturador de hélice (agitador Fisher Scientific Stedfast, modelo SL2400, disponível junto à VWR, de West Chester, PA, EUA) a um ajuste de velocidade de 4 durante cinco minutos. Quando usado, o aglutinante de látex foi disperso em cerca de 25 mL de água de . torneira em um béquer de 50 mL e adicionado à pré-mistura. O béquer de 50 mL foi enxaguado com outros 25 ml de água de torneira, que também foram adicionados à pré- " mistura, e a mistura resultante foi misturada durante cerca de 2 minutos. Quando usado, o —floculante foi disperso de modo semelhante em cerca de 25 mL de água de torneira em um béquer e adicionado à mistura durante misturação, seguido da adição de outros 25 mL de água enxágue do béquer. O aglutinante de látex caiu da solução nas fibras, e a fase líquida da pré-mistura mudou de turva para substancialmente límpida. Então, partículas de talco AS foram adicionadas à mistura e misturadas por vórtice durante 1 minuto.

Um feltro foi preparado usando-se um aparelho de produção de bloco TAPPITV (Williams Apparatus, de Watertown, NY, EUA). O aparelho tinha uma caixa fechada medindo cerca de 20 centímetros (8 polegadas) quadrados e 20 centímetros (8 polegadas) de profundidade, com uma tela de malha fina próxima do fundo e uma válvula de dreno abaixo da tela. A caixa foi preenchida com água de torneira até uma altura de cerca de 1 cm acimada tela. Uma mistura contendo partículas foi despejada na caixa, e a válvula foi aberta imediatamente, criando um vácuo que puxou a água para fora da caixa. O feltro disposto a úmido resultante tinha aproximadamente 3 mm de espessura.

O feltro disposto a úmido foi transferido do aparelho para uma folha de papel mata- borrão (20 centímetros por 20 centímetros (8 polegadas por 8 polegadas) papel branco de —43,5-kg(96-libras), Anchor Paper, de St. Paul, MN, EUA). O feltro foi imprensado entre 2-4 camadas de papel mata-borrão, dependendo da umidade do feltro, e pressionado entre 2 telas reforçadas em uma prensa movida a ar ajustada para 413 kPa (60 psi), calculado como sendo

É cerca de 82,7 kPa (12 psi) de pressão exercidos no feltro) durante 1-2 minutos, até que S nenhuma água expelida foi observada. O feltro prensado foi, então, transferido para uma folha Ê nova de papel mata-borrão e colocado em um forno (Blue M, de Blue Island, IL, EUA, Stabil- e Therm'" modelo OV-560A2) ajustado a 150ºC durante cerca de 40 minutos, para remover — águaresidualecuraro aglutinante de látex elou as fibras de aglutinante polimérico fundidas.

Para os Exemplos de 3 a 5 e C2, o feltro molhado foi deixado no produtor de bloco, e um cilindro de aço inoxidável pesado (de aproximadamente 5 kg (10 libras)) foi rolado sobre o feltro para remover à água do mesmo. O feltro foi, então, enxugado essencialmente de acordo com o procedimento descrito acima.

O exemplo 16 foi preparado essencialmente pelo procedimento descrito acima, exceto pelo fato de que as partículas de talco AS foram adicionadas à pré-mistura de fibra antes da adição do aglutinante de látex.

As matrizes de não tecido fibroso porosos resultantes foram vedadas em sacos plásticos e irradiadas com radiação gama a 0,5 kGy/hora durante 8 horas, para uma dose total de 4 kGy, ou foram autoclaveadas a 121ºC durante 15 minutos, para esterilizar as matrizes. Matrizes de amostra quadradas (medindo 20 centímetros por 20 centímetros (8 - polegadas por 8 polegadas)) foram cortadas a partir das matrizes dos Exemplos selecionados, foram pesadas, e os valores de retenção de sólidos foram determinados . para estas matrizes de amostra, conforme mostrado na Tabela 2.

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& : Tabela2 ||| E Es. ó 7 : [amer TT TTa a ) [FeeTa ae saias 9 | 60 | so7 | 605 | ext | ess : Exemplos de 18 a 20 e Exemplo Comparativo C5: Teste dos Dispositivos de Concentração de 3 a 5 e C2 Uma colônia de Listeria innocua, isolada de uma cultura estriada, foi inoculada em 5mbLdecaldoBHIeincubada a 30ºC de um dia para o outro (18-20 horas). À cultura de um dia para o outro de 10º CFUs/mL (unidades de formação de colônia/mL) foi diluída na solução tampão e incubada em 100 mL de caldo BHI para se obter uma suspensão bacteriana que tem 10* CFUs/mL (10º CFUs no total). Discos circulares (de 48 mm de diâmetro) foram perfurados por matriz a partir das matrizes dos Exemplos 3, 5 e C2, e colocados na autoclave a 121ºC durante 15 minutos para esterilização. Um disco foi colocado no suporte de membrana de um dispositivo de filtração manual de pressão positiva, e o suporte foi fixado ao corpo do filtro do dispositivo. O dispositivo é descrito na publicação internacional WO2008/150779 (Figuras 1A e 1B). À . suspensão bacteriana foi derramada no dispositivo e imersa para produzir um filtrado. Este procedimento foi executado para cada disco.

á Dois volumes de 100-microlitros do filtrado e um controle pré-filtração foram diluídos a 1:10, 1:100, e 1:1000, com a solução tampão, colocada em placas de MOX, e incubada a 37ºC durante 18-20 horas. As colônias foram contadas manualmente, e a eficiência de captura de micro-organismos (MCE) foi calculada. Os resultados são mostrados na Tabela 3.

Tabela 3. E EEE o JE A Oo Bepostivo de comeeniação | [e LED ER Rs Exemplos de 21 a 24: Teste do Dispositivo de Concentração 3 As suspensões bacterianas de Listeria innocua, que têm as concentrações mostradas na Tabela 4, foram preparadas a partir de culturas de um dia para o outro, essencialmente de acordo com o procedimento do Exemplo 18. As suspensões foram filtradas através de discos esterilizados de 48 mm de diâmetro da matriz preparada no i Exemplo 3, com o uso do dispositivo de filtração manual de pressão positiva. As amostras do filtrado e da suspensão resultantes antes da filtração foram diluídas, colocadas em placas, e incubadas essencialmente de acordo com o procedimento do Exemplo 18. As colônias foram contadas manualmente, e a eficiência de captura de micro-organismos foi — calculada. Os resultados são mostrados na Tabela 4. Tabela 4.

o Osso ora me o ro DS [ETasnda de Captura de mio oraaniêmes O) | 65 | ST st | 7 . Exemplos 25 e 26: Teste do Dispositivo de Concentração 4 As suspensões bacterianas (100 mL e 250 mL) de Listeria innocua em caldo BHI foram preparadas essencialmente de acordo com o procedimetno do Exemplo 18, cada uma contendo uma concentração final de 10º CFUs/mL (10 CFUSs no total). Um disco esterilizado de48mm de diâmetro da matriz do Exemplo 4 foi colocado em um dispositivo de filtração manual de pressão positiva, e a suspensão bacteriana de 100 mL foi passada através do disco. O dispositivo foi desmontado para transferir o disco para uma placa de cultura estéril para análise adicional. O dispositivo foi remontado com um disco limpo, e a suspensão bacteriana de 250 mL foi passada através do mesmo. À capacidade do dispositivo de filtração —manualerade 100 mL, então a suspensão bacteriana de 250 mL foi passada em quantidades de 100 mL, 100 mL e 50 mL. Todas as suspensões passaram através do disco, indicando que não houve obstrução. Os filtrados resultantes, bem como suspensões de controle não filtradas, foram diluídas, colocadas em placas, e incubadas essencialmente de acordo com o r procedimento do Exemplo 18. As colônias foram contadas manualmente, e a eficiência de — captura de micro-organismos foi calculada. Os resultados são mostrados na Tabela 5.

Os discos pós-fitração das etapas de filtação de 100 mL e 250 mL foram cortados com o uso de tesouras esterilizadas e adicionados a tubos de centrifugação de polipropileno estéreis de 50 mL contendo 1 mL de solução tampão para fervura. Os discos foram então processados de acordo com as instruções do fabricante em um ensaio ELISA emostraram-se positivos (imunoteste visual com o uso do cartão de referência do Kit). Tabela 5. Exemp!l | Dispositivo | Volume CFUs CFUs CFUs MCE | Concentração onº de da Total na no Capturadas | (%) da Dobra concentração | Amostra | Amostra | Filtrado pelo Disco (mL) 4 19x 0,5 100X

NARA MARAR 3,5x 1x10 2,5x10 250X

O Os dados na Tabela 5 mostram que os discos concentraram efetivamente as bactérias nos volumes relativamente amplos de amostra que foram utilizados. As suspensões bacterianas foram concentradas a partir de um volume inicial de 100 mL ou 250 mL em uma 25 quantidade pequena (menor que 1 mL) necessária para um ensaio ELISA (consulte a concentração de dobra na Tabela 5). Mesmo quando fervidos em um tampão, os discos não se desintegraram, e os materiais do disco não interferiram significativamente com oteste. - Exemplos de 27 a 29 e Exemplo Comparativo C6: Teste dos Dispositivos de . Concentração 4,6,7, e c3 Um frasco de 1000 mL, que tem uma porta de vácuo lateral, foi equipado com uma tampa sinterizada que serviu como o suporte para uma matriz ou filtro de não tecido fibroso porosos.

A área de suporte foi dimensionada para suportar um disco circular esterilizado de 36 mm ou 48 mm de diâmetro da matriz de não tecido fibroso poroso.

Um cilindro de coleta aberta (com 100 mL de capacidade), que tem bordas flangeadas ao redor do topo e do fundo do cilindro, foi preso ao frasco com a tampa presa entre os mesmos.

Uma mangueira flexível conectou O frasco a uma torneira equipada com uma porta de vácuo para fornecer um aparelho de filtragem à vácuo.

O aparelho foi esterilizado por autoclave a 121ºC durante minutos antes de cada período de uso €, durante o uso, foi enxaguado com 70%, em peso, de etanol e água destilada após a filtração de cada amostra.

Os discos foram perfurados por matriz a partir das matrizes de não tecido fibroso 15 —porososdos Exemplos 4, 6,7, e Cô e esterilizadas.

Os discos dos Exemplos 4 e 6 tinham 48 mm de diâmetro, e os discos dos Exemplos 7 e C3 tinham 36 mm de diâmetro. há Quatro suspensões bacterianas de 100 mL de Listeria innocua em caldo BHI, cada uma contendo aproximadamente 10º CFUS/mL (10º CFUs no total) foram preparadas Pr essencialmente de acordo com o procedimento para o exemplo 18. Para cada disco, uma suspensão foi derramada no cilindro de coleta, e vácuo foi aplicado.

Os filtrados resultantes, bem como as suspensões pré-filtração, foram diluídos, colocados em placas, e incubados essencialmente de acordo com O procedimento do Exemplo 18. As colônias foram contadas manualmente, e a eficiência de captura de micro- organismos foi calculada.

Os resultados são mostrados na Tabela 6. Tabela 6. Cosme — [7 | *[>[2) [osposivo e comentação | A | S | 7 |O) easá dama | 3 | 2 1 |) [—EW [| T|* "*) Uma vez que a filtragem a vácuo foi utilizada, a filtração foi afetada de maneira relativamente rápida.

À captura de bactérias pelos discos dos dispositivos de concentração 4,6,e7, entretanto, não foi maior que 70%. Exemplo 30 e Exemplos Comparativos C7 e CB: Teste dos Dispositivos de Concentração 9 e C3 e Comparação com um Agente de Concentração de Particulado Sozinho (Talco AS) Uma cultura estriada de Listeria monocytogenes (ATCC 51414) foi usada para preparar um padrão 0,5 McrFarland (uma turvação padrão que compreende micro-organismos d E dispersos) em 3 mL de caldo BHI, com o uso-de um -densitômetro DensiCHEKTY, disponível eba - junto à bioMerieux, Inc., de Durham, NC, EUA. A solução bacteriana estoque resultante, contendo aproximadamente 10º CFUs/mL, foi diluída serialmente em caldo BHI, para se obter . uma suspensão bacteriana que tem aproximadamente 10º CFUS/mML. Um disco de 14 mm de diâmetro foi perfurado por matriz a partir da matriz do exemplo 9, esterilizado, e inserido em um suporte de filtro (suporte de filtro de 13 mm de diâmetro SwinnexTY, Milipore Corp., de Bedford, MA, EUA). Um seringa de 3 centímetros cúbicos (cc) foi usada para fornecer 1,5 mL da suspensão bacteriana ao disco no suporte. A suspensão foi filtrada manualmente, e a filtração foi finalizada em 20 segundos. Um disco do Exemplo C3 também foi preparado, testado da mesma maneira, e filtrado na mesma quantidade de tempo.

Os filtrados resultantes foram colocados em placas de MOX em volumes de 100 microlitros (não diluídos). Os discos foram removidos do suporte de filtro depois de cada teste com o uso de um fórceps de superfície esterilizada e colocados em placas de MOX com 100 microlitros da solução tampão. As placas foram incubadas à 37ºC durante 18-20 horas. As colônias foram contadas manualmente, e a eficiência de captura de micro- organismos foi calculada. Os resultados são mostrados na Tabela 7. « O Exemplo C5 foi preparado pela adição de 20 mg de pó de talco AS a 1,1 mL da suspensão bacteriana em um tubo de polipropileno estéril de 5 mL (BD Falcon"", disponível r junto à VWR, de West Chester, PA, EUA). O tubo foi tampado e colocado em uma plataforma de agitação (plataforma de agitação Thermolyne Vari Mix'Y, disponível junto à Barnstead International, de lowa, EUA) com agitação a 14 ciclos por minuto durante 20 segundos. Então o tubo foi transferido para um suporte durante 1 minuto, período após O qual a maioria das partículas de pó de talco AS ficou depositada no fundo do tubo. Um volume de 100 microlitros do supernatante resultante (contendo partículas de talco AS suspensas) foi colocado em uma placa de MOX e processado (incubado) essencialmente da mesma maneira que as placas dos discos. Um volume de 100 microlitros da suspensão bacteriana foi diluído a 1:10, e também colocado em uma placa e incubado essencialmente da mesma maneira que um controle (amostra pré-filtração). A contagem de colônia do controle foi de 2600 CFUs. As colônias foram contadas manualmente, e a eficiência — de captura de micro-organismos foi calculada. Os resultados são mostrados na Tabela 7. Tabela 7.

Exemplo nº Dispositivo de concentração ou Eficiência de Captura de micro- | es | Agente organismos (%) e | rama tas [7 Deposio de consenso EI [Ro Dersa detona E Exemplo 31 e Exemplos Comparativos C9 e C10: Teste dos Dispositivos de

Concentração 2 e C1 e de um Filtro de Náilon Comercial peido : " Peru moído (marcado com 12% de gordura) foi obtido junto a uma mercearia local.

Onze gramas de peru moído foram colocados em um saco para homogeneização de - amostras estéril e misturados com 99 mL de solução tampão em sacos para homogeneização de amostras a uma velocidade de 230 revoluções por minuto (rpm) durante 30 segundos.

A amostra misturada foi derramada no dispositivo de filtração manual de pressão positiva descrito acima (vide Exemplo 18) contendo um disco esterilizado de 48 mm da matriz do Exemplo 2 (para o Exemplo 31). Uma pressão positiva foi aplicada empurrando-se o êmbolo do dispositivo até que 100 mL da amostra misturada passasse através do disco, e o tempo de filtração foi registrado.

O procedimento foi repetido com um disco do Exemplo C1 (para o Exemplo Comparativo C9) e com um filtro de náilon de 0,45 mícrons (para O Exemplo Comparativo C10) obtido junto à 3M Purification, Inc., de St.

Paul, MN, EUA.

Os resultados são mostrados na Tabela 8 abaixo.

O procedimento foi repetido com o uso de suco de laranja sem polpa pasteurizado, obtido junto a uma mercearia local.

Um volume de 11 g de suco foi adicionado a 99 mL de solução tampão, girado durante cerca de um minuto para misturar, - e 100 mL da amostra resultante foram filtrados.

O tempo de filtração foi medido, e os resultados são mostrados na Tabela 8. r Tabela 8. Exemplo nº Dispositivo de O eonceneçao RECO Ea A Fr a Cc1o Filtro de Náilon menor que 1 es | Sn Os dados na Tabela 8 mostram que amostras de came e suco foram corretamente filtradas através dos discos do Exemplo 31 e do Exemplo Comparativo C9, que são um pouco mais resistentes à obstrução que o filtro de microbiologia padrão do Exemplo Comparativo C10. Exemplos de 32 a 43 e Exemplos Comparativos de C11 a C13: Teste dos Dispositivos de Concentração 6, de 8 a 17, C3 e CA, e de uma Membrana Filtrante de — Policarbonato Comercial Came bovina moída e congelada (marcada com 15% de gordura) foi obtida junto a uma mercearia local.

Onze gramas de came bovina moída descongelada foram misturados com 99 mL de solução tampão em um saco para homogeneização de amostras estéril e foram processados em um saco para homogeneização de amostras a 230 rpm durante 30 segundos. — Discos das matrizes dos Exemplos e Exemplos Comparativos mostrados na Tabela 9 foram testados essencialmente de acordo com O procedimento do Exemplo 31. Uma membrana

SsSaSsSda fitrânte comercial (membrana fitrante de policarbonato Whatman de 14 mm de diâmetro e 0,22. . : . mícron, obtida junto à VWR, de West Chester, PA, EUA) também foi testada como o Exemplo Comparativo C13. O volume da came bovina misturada que passou através do disco ou - membrana antes de obstrução e interrompimento do fluxo, e o tempo de passagem antes da —obstruçãoeinterrompimento de fluxo, foram anotados e são mostrados na Tabela 9. Uma segunda série das mesmas matrizes foi testada com o uso de leite de soja obtido a partir de uma mercearia local. As amostras foram preparadas por centrifugação de 11 mL de leite de soja com 99 mL de solução tampão. Os resultados são mostrados na Tabela 9. Tabela 9. Exemplo Dispositivo de nº concentração Volume Tempo Volume Tempo EO dd, FR ce AE E Aro OE A

EA RAR Fr e a E RE Ac eae | RI EE a a TRA A EA A cat

EEE AR ee ua Fra a EMITE A A a AE caça EE OI O EAR a NE c13 Membrana Filtrante de Policarbonato Comercial * NDindica que a filtração terminou após 30 segundos sem fluxo notável através do dispositivo de concentração. Exemplo 43: Teste do Dispositivo de Concentração 14 Uma cultura estriada de Saccharomyces cerevisiae (ATCC 201390) de uma placa de ágar YPD, incubada a 30ºC, foi usada para produzir um padrão 0,5 McFarland em 3 mL de cerveja. A cerveja foi obtida a partir de um estabelecimento local. A solução de levedura estoque resultante, contendo aproximadamente 10º CFUs/mL, foi diluída serialmente em cerveja não contaminada para se obter uma suspensão de levedura contendo 10º CFUs/mL. Uma diluição de 1:100 da suspensão foi inoculada em 100 mL de cerveja para fornecer 10 CFUs/mL (total de aproximadamente 1000 CFUs na amostra). A cerveja contaminada foi

38/42 | fornecida ao suporte de filtro descrito acima, contendo um disco perfurado por matriz : esterilizado de 14 mm do Exemplo 14, em cinco lotes com o uso de uma seringa de 20 cc. Depois que todos os 100 mL da amostra passaram através do disco, o suporte de filtro foi . desmontado e o disco foi transferido, com o uso de um fórceps de superfície esterilizada, a um cadinho de polipropileno estéril de 1,5 mL (dispositivo de amostragem de superfície de ATP 3MTY CLEAN-TRACE'Y, 3M Company, de St. Paul, MN, EUA).

Uma amostra concentrada foi preparada pela adição de 100 microlitros de sistema enzimático e 50 microlitros do dissolvente para extração do kit (sistema de superfície de ATP 3MTM CLEAN-TRACETY, 3M Company, de St. Paul, MN, EUA) ao cadinho. Os conteúdos do cadinho foram misturados por vortexação durante 5 segundos a cerca de 3200 rpm em um misturador por vórtice (misturador por vórtice de velocidade fixa VWR"", VWR, de West Chester, PA, EUA). O sinal ATP da amostra concentrada foi determinado mediante a medição das unidades de luz relativas (ULRs) durante intervalos de um minuto a 10 segundos, com o uso de um luminômetro de bancada (luminômetro de tubo único de 20/20n, disponível junto à —Tumer Biosystems, de Sunnyvale, CA, EUA). Os valores de luminescência (sinal de ATP) foram obtidos a partir do luminômetro com o uso de um software SIS de 20/20n que foi - fornecido com o luminômetro. Os resultados são mostrados na Tabela 10. O sinal de ATP também foi determinado de acordo com o procedimento acima para - controles que usam 100 microlitros da suspensão de levedura contendo 10º CFUs (10º CFU de controle) de uma diluição de 1:10 da solução de levedura estoque de 10º CFUS/mL (100% de controle de sinal) e que usam 100 microlitros das amostras de cerveja não contaminada não filtrada (cerveja contaminada de controle). Os níveis de ATP de fundo foram determinados em uma amostra preparada por filtração de 100 mL de cerveja não contaminada através da matriz de não tecido fibroso poroso do Exemplo 14 para se obter um filtrado não contaminado, e — processamento da matriz usada de acordo com o procedimento descrito acima para se obter uma matriz de controle. Um volume de 100 microlitros de apenas cerveja (sem filtração) também foi testado (cerveja não contaminada de controle). Os resultados são mostrados na Tabela 10. A % de sinal de ATP, mostrada na Tabela 10, foi calculada (com base nos valores de ULR obtidos a partir da amostra concentrada após subtração do sinal de ATP de fundo da cerveja não contaminada de controle (ULRs corrigidas) e as ULRs do controle de 10º CFU) da seguinte forma: % de ATP = (ULRs corrigidas/ULRs do Controle de 10º CFU) x 100 As contagens de levedura foram determinadas por plaqueamento de 1 mL das amostras de cerveja de 100 mL (cerveja contaminada de controle, bem como uma amostra —diluídade1:100das 10º CFUs/mL da solução de levedura estoque) em, placas de YIM, de acordo com as instruções do fabricante. A amostra diluída tinha um total de 1060 CFUs de células de levedura.

— Tabela 10. — - ó aaa : Amostra Sinal de ATP Sinal de ATP %% de Sinal de ATP em À (ULRs) Corrigido (ULRs) Relação ao Controle de - 10º CFU Cerveja de Controle Não Contaminada o ommnaeteras | em mo | TE Cerveja de Controle 3592 8% Contaminada o Filtrado de Controle Não Contaminado A rosa torenmeis | am Rm SO Os dados mostram que o sinal de ATP da S. cerevisiae da amostra concentrada tinha aproximadamente 8 vezes aquele da cerveja contaminada de controle não filtrada. Exemplos 44 e 45 e Exemplo Comparativo C14: Teste dos Dispositivos de Concentração12,13,€ C4 f Uma cultura estriada de Listeria monocytogenes foi usada para produzir um padrão 0,5 McFarland em 3 mL de caldo BHI. A solução bacteriana de estoque resultante, É contendo 10º CFUs/mL, foi diluída serialmente no BHI para fornecer uma suspensão bacteriana contendo aproximadamente 10º CFUS/mL.

Um disco de 14 mm foi perfurado por matriz a partir da matriz do Exemplo 12, inserido no suporte de filtro, e testado essencialmente de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 30. Um volume de 1,5 mL da suspensão passou completamente através do disco em 15 segundos. A filtração foi repetida com o uso de discos do Exemplo 13 e do Exemplo Comparativo C4. Os filtrados resultantes de cada disco, bem como à suspensão bacteriana não filtrada (controle), foram colocados em placas de ágar de MOX em volumes de 100 microlitros e incubados a 37ºC durante 18 — 20 horas. As colônias foram contadas manualmente, e a eficiência de captura de micro-organismos foi determinada. A amostra de controle não filtrada tinha 2800 CFUs/mL. Os resultados são mostrados na Tabela 11. O disco usado de cada teste foi removido do suporte de filtro com o uso de um fórceps de superfície esterilizada e colocado em placas de MOX com 100 microlitros da solução tampão. As placas foram incubadas a 37ºc durante 18-20 horas. Todas as placas apresentaram um crescimento de Listeria monocytogenes. Tabela 11. Exemplo nº Dispositivo de Eficiência de Captura de concentração micro-organismos (%)

EA OO

E A cao : i E TA EA oa RO ASIESAEo | Exemplos de 46 a 49: Teste dos Dispositivos de Concentração 8 e 12 Ê Uma cultura estriada de Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027) foi usada para se produzir um 0,5 McFarland padrão em 3 mL de água deionizada destilada filtrada (18 megaohm de água de um sistema de deionização gradiente MINli-QTY, Millipore, de Bedford, MA, EUA). À solução bacteriana estoque resultante contendo 10º CFUs/mL foi diluída serialmente na mesma água para fornecer uma suspensão bacteriana de 10º CFUs/mL na água.

Um disco de 14 mm da matriz de não tecido fibroso poroso do Exemplo 8 (espessura de 1,066 mm) foi perfurado por matriz e inserido no suporte de filtro descrito acima.

Um volume de 1 mL da suspensão bacteriana foi filtrado manualmente essencialmente de acordo como procedimento descrito no Exemplo 30. A filtração foi finalizada em 15 segundos.

Os filtrados resultantes foram colocados em placas de AC de acordo com as instruções do fabricante.

O disco foi removido do suporte de filtro com o uso de um fórceps de superfície esterilizada e foi colocado em placas de PIA com 100 microlitros da solução tampão.

O procedimento foi repetido com o USO de um disco da matriz do Exemplo 12 - 145 (com uma espessura de 1,336 mm). Um volume de 1 mL da suspensão bacteriana em água também foi colocado em placas de AC como um controle.

Todas as placas foram É incubadas a 37ºC durante 18-20 horas.

As contagens de colônia dos filtrados colocados em placas de AC foram obtidas conforme as instruções do fabricante.

À suspensão bacteriana não filtrada tinha uma contagem de colônia de 140 CFUs/mL.

Os resultados da eficiênciade captura de micro-organismos são mostrados na Tabela 12. Uma suspensão bacteriana de Staphylococcus aureus (ATCC 6538) foi preparada essencialmente da mesma maneira que uma cultura de estriamento de S. aureus.

A suspensão foi filtrada através de discos que foram cortados por matriz a partir das matrizes dos Exemplos 8 e 12, e os filtrados resultantes foram analisados para eficiência de captura de micro-organismos — essencialmente de acordo com O procedimento descrito para P. aeruginosa.

A suspensão bacteriana não filtrada tinha uma contagem de colônia de 170 CFUs/mL.

Os resultados são mostrados na Tabela 12. Os discos usados foram colocados em placas de cágar e processados essencialmente de acordo com O procedimento usado para P. aeruginosa.

Tabela 12. | Exemplo nº Dispositivo de Micro-organismo Eficiência de Captura de concentração micro-organismos (%) o E — E een [O 5 ses E ra E es á Todas as placas de PIA (contendo - discos através dos quais suspensões . bacterianas de P. aeruginosa passaram) apresentaram um pigmento amarelo esverdeado, É característica da presença de P. aeruginosa. Todas as placas de c-ágar (contendo discos - através dos quais suspensões bacterianas de S. aureus passaram) apresentaram uma coloraçãomagenta alaranjada, característica da presença de S. aureus. Exemplo 50 — Exemplos de Filtração de Água Uma cultura estriada de E coli (ATCC 51813) em uma placa de sangue de ágar (ágar tríptico de soja com 5% de sangue de ovelha, Hardy Diagnostics, de Santa Maria, CA, EUA) foi incubada de um dia para o outro a 37ºC. A cultura foi usada para preparar umpadrão05 McrFarland com o uso de um densitômetro DensiCHEKT" (bioMerieux, Inc., de Durham, NC, EUA) em 3 ml de tampão Butterfield. A solução bacteriana estoque resultante contendo 1x 10º CFUs/mL foi diluída serialmente em Butterfield para se obter um inoculo com aproximadamente 1 X 10º CFU/mL. Uma amostra de teste foi preparada por inoculação em 100 mil de água deionizada (sistema gradiente MÍNIQ, Millipore, MA, EUA) em uma diluição de 1:100 do inoculo de 10º bactérias/ml! resultando em uma amostra de água contendo 10º CFU/ml - (10º CFUs no total, em água). A amostra de água inoculada foi bombeada através de um dispositivo de filtração f suportando um disco de corte por matriz de 47 mm de diâmetro da matriz de não tecido fibrosomostrada na Tabela 13. O dispositivo tinha um corpo cilíndrico de policarbonato de cerca de 60 mm de diâmetro e cerca de 115 mm de altura, e que tem uma tela de suporte para suportar o disco filtrante no corpo. À extremidade de topo do corpo foi fechada com uma tampa rosqueada que tem uma porta de entrada fixada a uma bomba peristáltica (Modelo nº 7553-70, Cole Parmer) por uma tubulação de PVC com uma parede de 0,32 —cm(1/8")de espessura (H de catálogo 60985-522, VWR, de Batavia, IL, EUA). A bomba foi usada para fornecer a amostra de água ao dispositivo de filtração. A extremidade inferior tinha uma porta de saída e foi rosqueada para fechar o fundo do cilindro. Aneis em o foram posicionados entre as partes rosqueadas para evitar vazamentos. O dispositivo foi ventilado no lado a montante para permitir purgação do ar.

Cada matriz foi testada em duplicatas. Uma amostra de 100 mL de água inoculada foi bombeada no dispositivo de filtração a uma vazão de 70 miminuto. Os filtrados foram coletados em béqueres de polipropileno estéreis de 100 ml. Após cada teste de filtração, o dispositivo foi desmontado e os discos foram removidos com o uso de um fórceps estéril. Entre cada teste, O dispositivo de filtração foi enxaguado com 500 mL de água deionizada esterilizada e filtrada.

Volumes de cem microlitros de cada filtrado e uma suspensão pré-filtração, foram diluídos a 1:10 e 1:100 no tampão Butterfield e colocados em placas de E. coli. As placas foram incubadas a 37ºC durante 18-20 horas. As contagens de colônia foram

& — determinadas a partir das placas de acordo com as instruções do fabricante.

O valor de . redução de log (LRV) é uma indicação da capacidade de remoção bacteriana de um filtro de água.

Os valores foram calculados com base nas contagens obtidas junto aos filtrados - colocados em placas e as amostras pré-filtração, com o uso da fórmula abaixo: LRV= (Log de CFUs/ml na amostra pré-filtração) - (Log de CFUs/m! na amostra filtrada) A suspensão pré-filtração continha uma média de 9500 CFU/mI (-4 Log de CFU/ml). Os valores de redução de Log são mostrados na Tabela 13. Tabela 13. [Bem | Ds TER) [Best] 3 | esses | [se een] * | As descrições referidas contidas nas patentes, documentos de patente e publicações citadas na presente invenção estão aqui incorporadas a título de referência f integralmente como se cada um fosse individualmente incorporado.

Várias modificações e alterações imprevisíveis desta invenção se tornarão aparentes aos versados nessas f técnicas sem que se desvie do escopo e do espírito da invenção.

Deve-se compreender que esta invenção não se destina a ser indevidamente limitada pelas modalidades e exemplos ilustrativos aqui apresentados, e que esses exemplos e modalidades são apresentados apenas a título de exemplo, sendo que o escopo da invenção é destinado a ser limitado apenas pelas reivindicações aqui apresentadas da seguinte forma.

Claims (10)

REIVINDICAÇÕES

1. Processo de concentração CARACTERIZADO por compreender (a) fornecer um dispositivo de concentração que compreende (1) uma matriz de não tecido fibroso poroso, e (2) uma pluralidade de partículas de pelo menos um agente de concentração que compreende um silicato de metal, sendo que as ditas partículas são embutidas na dita matriz de não tecido fibroso poroso, (b) fornecer uma amostra que compreende pelo menos um analito celular alvo, (c) colocar em contato o dito dispositivo de concentração com a dita amostra, de modo que pelo menos uma porção de pelo menos um analito celular alvo é ligada a ou capturada pelo dito dispositivo de concentração, e (d) detectar a presença de pelo menos um analito celular alvo ligado.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato das fibras da dita matriz de não tecido fibroso poroso serem selecionadas a partir de fibras poliméricas, fibras inorgânicas, e combinações das mesmas.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato da dita matriz de não tecido fibroso poroso compreender pelo menos um aglutinante polimérico.

4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de | a 3, “CARACTERIZADO pelo fato do dito silicato de metal ser amorfo.

5. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de | a 4, CARACTERIZADO pelo fato do dito metal ser selecionado a partir de magnésio, cálcio, zinco, alumínio, ferro, titânio, e combinações dos mesmos.

6. Dispositivo de concentração CARACTERIZADO por compreender (a) uma matriz de não tecido fibroso poroso, e (b) uma pluralidade de partículas de pelo menos um agente de concentração que compreende um silicato de metal amorfo e esferoidizado, sendo que as ditas partículas são embutidas na dita matriz de não tecido fibroso poroso.

7. Kit CARACTERIZADO por compreender (a) pelo menos um dispositivo de concentração conforme definido na reivindicação 6;e (b) pelo menos um recipiente de teste ou reagente de teste para uso na execução do processo conforme definido na reivindicação 1.

8. Processo para a preparação de um dispositivo de concentração CARACTERIZADO por compreender: (a) fornecer uma pluralidade de fibras,

(b) fornecer uma pluralidade de partículas de pelo menos um agente de concentração que compreende um silicato de metal amorfo e esferoidizado, e (c) formar pelo menos uma porção da dita pluralidade de fibras em uma matriz de não tecido fibroso poroso que tem pelo menos uma porção da dita pluralidade de partículas embutidas na mesma.

9. Processo, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato da dita formação ser executada por um processo de deposição a úmido, e/ou sendo que o dito silicato de metal amorfo e esferoidizado é um silicato de magnésio amorfo e esferoidizado.

10. Meio filtrante CARACTERIZADO por compreender: (a) uma matriz de não tecido fibroso poroso, e (b) uma pluralidade de partículas de pelo menos um agente de concentração que compreende um silicato de metal amorfo e esferoidizado, sendo que as ditas partículas são embutidas na dita matriz de não tecido fibroso poroso.

TH É — RESUMO = EA : “PROCESSO E DISPOSITIVO PARA CONCENTRAÇÃO DE MICRO-ORGANISMOS! A presente invenção refere-se a um processo para a captura ou concentração de . micro-organismos para detecção ou teste que compreende (a) fornecer um dispositivo de concentração que compreende (1) uma matriz de não tecido fibroso poroso e (2) uma pluralidade de partículas de pelo menos um agente de concentração que compreende um silicato de metal, sendo que as partículas são embutidas na matriz de não tecido fibroso poroso, (b) fornecer uma amostra que compreende pelo menos um analito celular alvo, (c) colocar em contato o dispositivo de concentração com à amostra, de modo que pelo menos uma porção de pelo menos um analito celular alvo é ligada a ou capturada pelo dispositivo de concentração, e (d) detectar a presença de pelo menos um analito celular alvo ligado. .