CN111254139A - 一种提取强酸性条件下基质微生物总rna和总蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提取强酸性条件下基质微生物总RNA和总蛋白的方法，属于分子生物学技术领域。本发明的方法包括以下步骤：1)取基质材料，采用pH＝3.6～5.5的缓冲溶液A在一定压力的水压下冲洗基质材料，将微生物从附着基质表面上洗脱，离心收集菌体；2)将步骤1)收集的菌体裂解，采用溶液B提取总RNA和总蛋白，所述溶液B为pH＝4.0～4.5的Trizol试剂。所述水压压力范围为30～120MPa。本发明提取方法显著改善了强酸性条件下基质附着微生物总RNA和总蛋白的提取效率和质量，满足同时提取或分别提取RNA和蛋白质的检测要求。

Description

一种提取强酸性条件下基质微生物总RNA和总蛋白的方法
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及分别或同时提取强酸性条件下基质微生物总RNA和总蛋白的方法。
背景技术
核糖核酸(RNA)是以DNA双链中的一条为模板转录，形成的一条单链生物大分子，主要功能是实现基因(DNA)中的遗传信息到蛋白质的表达，即遗传信息向表型转化的桥梁。对RNA的测定相较于DNA的测定，主要用于衡量生物体某一基因，或整个基因组在某一时间、环境下的表达水平。近年来，针对某一环境中微生物应对特定环境压力、污染物暴露或其他刺激因素对微生物群落生态功能的影响，基于新型分子生物学技术的各类RNA检测技术获得了长足的发展，实时荧光定量核酸扩增检测qPCR法、RNA芯片，乃至对总RNA进行测序的宏转录组技术得到了广泛地应用。
和RNA相比，蛋白质是更为直接的实现生命活动的有机大分子，同时也是构成细胞基本骨架的有机物之一。因此，蛋白质是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生命，它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。机体中的每一个细胞的几乎所有重要组成部分，以及细胞的所有重要生命过程都有蛋白质参与。近年来，针对某一环境中微生物应对特定环境压力、污染物暴露或其他刺激因素对微生物群落生态功能的影响，基于新型分子生物学技术的各类蛋白质检测技术也获得了长足的发展，蛋白质印迹法(WesternBlot)、酶联免疫吸附法(ELISA)，乃至基于质谱和数学分析的对总蛋白进行测定的宏蛋白组学技术得到了深入的发展和广泛的应用。
RNA和蛋白质检测的主要挑战之一是RNA或蛋白质的提取和纯化，由于RNA和蛋白质在生物体内不断合成和分解，以应对环境因素的改变，因此RNA或蛋白质的提取对取样时间点的把控要求严格。并且由于环境中(如人手和空气中)广泛存在RNA酶，在提取过程中极易引入体系中，因此RNA的提取需要格外小心，需要控制提取时样品的环境温度，缩短提取时间，提高提取效率，以避免RNA的降解。对于蛋白质而言，由于蛋白酶广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中，因此对于蛋白质的提取需要避免蛋白酶的作用。
对于强酸性环境(pH<3)中的微生物样品总RNA或总蛋白的提取纯化，还存在极端环境会为微生物带来严重的生存压力，微生物菌体一旦破裂，强酸性会导致RNA在极短的时间内降解为短链的小片段，或是引发蛋白质变性或水解为小片段，或自溶液中沉淀出去的问题。为了适应复杂生境，微生物自身会产生特殊的聚合酶，组成生物膜、菌团等共同抵抗复杂生境下的生存压力。但环境中存在的各种抑制物(氢离子、腐植酸、酚类化合物和重金属离子等)在低pH值条件下会影响微生物的酶活性，并导致核糖核酸分子的不稳定，直接引发蛋白质的变性和RNA的水解，环境样品中广泛存在的腐植酸类物质，由于其大分子的结构与核糖核酸或蛋白质部分类似，因此腐植酸类物质会与这两种生物大分子紧密结合，从而导致被共提取，引入杂质，进一步加大了下游实验的难度。
目前很多研究者采取了不同的方法预处理微生物样品，使其满足总RNA或总蛋白提取的需要。这些方法主要可分为两类，一种是在微生物生长的原始位置，通过依次添加不同的试剂，对总RNA进行提取的原位提取法。
经检索，现有技术公开了相关的申请案，如中国专利公开号为CN 105018472 A的申请案中公开了一种在栽培基质上紧密嵌合的菌丝体中RNA的提取方法，取布满菌丝体的培养基粗研后，采用含有溶菌酶和蛋白酶K的pH＝5.5～6.5的PBS缓冲液震荡分离菌丝和菌体，离心收集沉淀，再以含有EDTA、SDS的pH＝5.5～6.5的PBS缓冲液洗涤并进一步收集游离RNA后，用Trizol法提取RNA，获得的RNA质量较好。
再如中国专利公开号为CN 101921341 A的申请案公开了一种提取土壤样品总蛋白的方法，通过直接将土壤样品加入蛋白提取液(曲拉通Triton X-100的EDTA-DTT-焦磷酸钠碳酸缓冲液)，室温振荡提取0.5～2.0小时，离心后上清液中获得提取的蛋白质。
另一种是将附着的微生物或细胞从生长的基质上洗脱或剥离下来，再进行提取的异位提取法，如中国专利公开号为CN 109234270 A中的申请案中公开了一种对贴壁培养的细胞，先用RNA提取溶液，裂解细胞表面，再使用移液器吹打细胞并移至收集管中，之后通过加入氯仿分层，以提取RNA的方法。
虽然上述不同研究者使用的提取方法已得到公开，但是尚未有针对环境溶液pH<3的中强酸性环境中，提取环境样品总RNA和总蛋白的方法。而且不同于纯培养液环境，附着于固态基质上的环境样品中，重金属和腐植酸等杂质含量较高、成分复杂，造成寻求通用方法更加困难。
因此，对于酸性溶液条件下的生物膜填料塔上的微生物来说，研究一种有针对性的、合适的核糖核酸提取方法是很有必要的。
发明内容
1.要解决的问题
针对强酸性(pH<3)条件下微生物极易失活、必须依托生物膜、菌胶团或多孔基质进行生命活动，且失活后细胞膜/壁破裂导致微生物染色体快速降解和蛋白变性，进而引发RNA长链分子碎片化和蛋白水解变性，造成RNA和蛋白提取产率低、质量差的问题；另外，由于RNA的等电点为约pH＝2～2.5之间，在pH<3的条件下容易自溶液中沉淀析出，进一步降低了提取液中RNA的浓度，导致最终提取物难以满足上机测序、qPCR，或Western Blot及宏蛋白组等技术前处理需要的问题，本发明的方法采用pH＝3.6～5.5的缓冲液在一定水压下将菌体从基质上冲洗脱落，菌体裂解后，再采用pH＝4.0～4.5的Trizol试剂进行RNA和蛋白质的提取，显著改善了强酸性条件下基质附着微生物总RNA和总蛋白的提取效率和质量。
2.技术方案
为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
本发明提供了一种提取强酸性条件下基质附着微生物总RNA和总蛋白的方法，包括以下步骤：
1)取基质材料，采用pH＝3.6～5.5的缓冲溶液A在一定压力的水压下冲洗基质材料，将微生物从附着基质表面上洗脱，离心收集菌体；
2)将步骤1)收集的菌体裂解，采用溶液B提取总RNA和总蛋白，所述溶液B为pH＝4.0～4.5的Trizol试剂。
作为本发明更进一步的改进，所述基质表面包括可供微生物附着生长的基质材料外表面或通过破碎材料使之暴露于外的微生物附着生长的内表面，所述总RNA为基质表面附着的所有微生物的RNA总和，所述总蛋白为基质表面附着的所有微生物的蛋白总和。
作为本发明更进一步的改进，所述步骤1)离心速度为5000g，离心时间2分钟，离心温度4℃。
作为本发明更进一步的改进，所述步骤1)中水压压力范围为30～120MPa。
作为本发明更进一步的改进，所述菌体裂解方法包括冻融法、超声法或液氮研磨法。
作为本发明更进一步的改进，所述步骤1)中缓冲溶液A的冲洗体积为10～100mL，洗脱时间不超过90秒。
作为本发明更进一步的改进，所述步骤1)中缓冲溶液A的冲洗体积为300mL，适宜压力为120MPa。
作为本发明更进一步的改进，所述步骤1)中缓冲溶液A的冲洗体积为80mL，适宜压力为80MPa。
作为本发明更进一步的改进，所述的缓冲溶液A为醋酸-醋酸钠缓冲溶液，摩尔浓度为0.1～0.2mol/L。
作为本发明更进一步的改进，步骤1)中使用缓冲溶液A时，将其装入水压容器中，采用30～100MPa的压力冲洗填料，使附着菌体从基质上脱落，溶液冲洗体积为10～100mL，该压力和冲洗体积时可需满足90秒内将菌体从基质上冲洗脱落，不宜过于强力(超过120MPa)，造成洗脱溶液和样品飞溅，根据实际的采样需求，可以通过调整不同水量以适应单细胞到大范围菌群取样的需要。
作为本发明更进一步的改进，步骤2)中使用的溶液B中含0.05～0.2mol/L的醋酸-醋酸钠，具体的所述溶液B中还含有相对于溶液的总量0.5～2mol/L浓度的胍盐、相对于溶液的总量0.05～0.2mol/L,pH＝4.0～4.5的醋酸-醋酸钠缓冲液、相对于溶液总量0.1-1％体积的十二烷基肌氨酸钠以及总体积30％～50％的酚类。
作为本发明更进一步的改进，所述溶液B提取总RNA和总蛋白的操作如下：
对裂解后的菌体采用溶液B进行提取，加10倍体积的溶液B，然后按照每1ml溶液B加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上离心管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下(15℃～30℃)放置2～3分钟后，12000g以上(2℃～8℃)离心15分钟，使之分层为水相上清液、DNA中间层、下层酚相、底层腐殖酸和不溶物等杂质，从而分别或同时提取总RNA和总蛋白。
步骤2)的目的为：去除菌体中的DNA及腐植酸等物质，并将RNA提取至水相上清液、蛋白提取至酚相中。其中的胍盐具有很强的蛋白变性作用，遇蛋白质后，会快速溶解蛋白，结合超声破碎等处理，可以导致细胞膜结构的快速破坏，以及核蛋白与核酸的迅速分离，促使RNA释放到溶液中，而蛋白则被分配到酚相，腐殖酸等杂质则分配至底层沉淀。此外，由于DNA的等电点在pH＝4.0～4.5，因此其在溶液B中也会解离并沉淀出来，形成一层酚相与水相间的中间层沉淀，使所述溶液B的上清液中仅存在RNA，下层酚相溶液中主要含蛋白。
步骤2)中使用溶液B的总量应根据提取菌体的多少进行适当地调整，所用体积至少应为菌体的10倍以上。
本发明的方法可以用于分别或同时提取总RNA和总蛋白，所用容器和试液均需采用无RNA酶或经RNA酶灭活处置的容器或试液，提取过程中需带手套和口罩。
作为本发明更进一步的改进，本发明提供了强酸性溶液条件下基质附着的微生物总RNA和总蛋白的检测方法，具体操作步骤如下：
步骤一、功能菌群样品的收集：如微生物所附着的基质为小块状等易于获得的形状，则取约不超过0.5L体积的微生物生长状态良好的基质材料置于1L的烧杯中，用缓冲溶液A和适宜水压(30-120MPa，管路需耐酸腐蚀)冲洗基质材料上附着有菌体的部位使之快速脱离后，全部收集于烧杯中，弃去基质材料，4℃离心(5000g)2分钟收集菌体；
如基质的内部也长有需要提取的微生物群落，则可以对基质先破碎，暴露长有菌团内表面，然后进行冲洗，快速剥离附着的微生物，并离心收集(5000g)；如基质为难以获得的大块材料、或不宜破坏的岩壁表面等，则宜小心控制水压压强和冲刷方向，将烧杯、试管或其他装取菌体的容器，与基质表面接触后，待菌落冲洗脱落时接至容器中，以免冲洗下的菌体掉落，造成采样失败。在调整至适宜水压下，进行快速冲洗，基质表面附着的微生物菌团可自基质上脱落。经过该步骤，菌体所处环境由极端酸性条件下过渡到中度酸性条件。
步骤二、样品总RNA和总蛋白的提取：
步骤一所得菌体混悬液离心后弃上清，用液氮研磨法、超声法等常用方法裂解菌体，对所得菌体采用溶液B进行提取，加10倍体积的溶液B，然后按照每1ml溶液B加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上离心管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下(15℃～30℃)放置2～3分钟后，12000g以上(2℃～8℃)离心15分钟，使之分层为水相上清液、DNA中间层、下层酚相、底层腐殖酸和不溶物等杂质，从而分别或同时提取总RNA和总蛋白。其中，如果是分别提取总RNA或总蛋白，则待溶液B分层后，直接转移水相上清液或酚相溶液进行后续的提取和纯化即可；如果是同时提取，则应先转移并处理水相上清液，以避免总RNA的水解碎裂，并将剩余溶液储存于4℃保存，待总RNA提取完成后，进一步提取和纯化蛋白样品，或双人分别操作。
步骤三、样品总RNA和总蛋白的纯化：
取步骤二得到的总RNA，在得到的无色水相的离心管中，按照每1ml溶液B加0.5ml异丙醇的量(70％以上水相体积)加入异丙醇，如蛋白质和多糖污染较为严重，需添加与异丙醇等体积的高盐溶液(0.8M柠檬酸钠和1.2M的NaCl)，颠倒数次混匀，室温(15℃～30℃)放置约10分钟或-20℃放置1小时以上将RNA沉淀出来，在12000g以上(2℃～8℃)转速的条件下离心10分钟，加入适量75％乙醇漂洗后，再次以12000g以上(2℃～8℃)转速的离心(5分钟)，重复漂洗、离心，并晾干至微微发白后，加入无RNA酶或焦炭酸二乙酯(DEPC)处理过的去离子水30μL复溶。如样品杂质较多，也可以增加上柱纯化环节，在得到的无色水相的离心管中，加入等体积的无水乙醇，混匀，将得到溶液上样至硅胶吸附柱，在12000g以上(2℃～8℃)转速的条件下离心30秒，加入适量80％乙醇漂洗后，再次离心，重复漂洗后，离心晾干加入无RNA酶水，洗脱静置2分钟，再次离心1分钟，或者使用商业试剂盒，及其提供的方法纯化样品后，将得到的总RNA样品于-80℃保存以备长期使用；取步骤二得到的总蛋白酚相溶液，加入5倍体积醋酸铵的甲醇溶液沉淀蛋白，离心去上清液，以80％丙酮清洗后，再次离心去上清液，然后以丙酮清洗三次后，晾干于-80℃保存以备长期使用。
步骤四、样品总RNA和总蛋白的检测：取步骤三得到的总RNA微量，使用微量紫外可见分光光度计，进行核糖核酸含量测定，使用质量百分浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳检测得到微生物总RNA的质量；取步骤二得到的总蛋白约50微克，应用BCA蛋白试剂盒测定蛋白浓度，采用12％SDS-PAGE凝胶电泳检测得到总蛋白的质量。
3、有益效果
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
(1)本发明的提取强酸性条件下基质微生物总RNA和总蛋白的方法，采用缓冲液在水压为30～120MPa的条件下进行洗脱提取，可以快速地将附着于基质上的微生物提取冲洗下来，所述微生物包括易于剥离和基质结合紧密的，或是位于生物膜或菌团中的活体微生物，且提取速度更快，有利于避免传统异位提取法更易于获得脱离基质的死菌，造成污染，且提取时间长，导致活菌比进一步降低的缺陷，本发明采用的pH＝3.6～5.5的缓冲溶液A进行洗脱，有益于通过调节pH值，避免pH值剧烈变化导致的生物膜或菌团中微生物的大量死亡或在表面形成具有保护作用的致密生物膜，从而引发的无生命活性杂质过多导致的污染；
(2)本发明的提取强酸性条件下基质微生物总RNA和总蛋白的方法，和现有原位提取法相比，避免了原位提取时引入的大量杂质，特别是避免了易溶性的腐殖酸和重金属离子的影响，缩短了清洗杂质导致的提取时间过长，从而引发微生物在极强酸性条件下死亡，和随之出现的RNA和蛋白质严重降解的现象；
(3)本发明的提取强酸性条件下基质微生物总RNA和总蛋白的方法，在冲洗和提取步骤均进行pH调整，可以避免冲下的菌体由于环境中过于剧烈的pH变化导致的死亡和破裂，同时提取溶液B中采用的Trizol溶液中含有的胍盐是强效蛋白变性剂，其与所含酚类溶剂配合，可以有效抑制RNA酶的活性，此外其配合十二烷基肌氨酸钠，可以快速高效的溶解菌落生物膜表面的蛋白质，从而进一步破碎菌落，将提取出来的蛋白质富集至氯仿-酚有机相溶液中，RNA富集至水相上清液中，DNA在pH＝4.0～4.5间处于电中性，因此从水相中析出，漂浮在有机相和水相中间，形成中间层，不溶的其他细胞碎片和大分子腐殖质等杂质则会沉淀至底部，从而将DNA、多糖、腐殖质等杂质与RNA和蛋白质分离，最大程度地降低了杂质污染的风险，显著地提高下游操作中的提取效率。
(4)本发明提取方法显著改善了强酸性条件下基质附着微生物总RNA和总蛋白的提取效率和质量，凝胶电泳检测得到的RNA总条带在16S和23S rRNA附近聚集、条带明亮清晰、基本无5S rRNA处的降解，满足上机测序或qPCR实验需要；凝胶电泳检测得到的蛋白总条带清晰明亮、分子量覆盖完全，满足Western Blot或宏蛋白组等实验需要，能够更加准确全面地反映极端酸性条件下基质附着微生物的生长、演化状况，为后续微生物宏转录组、宏蛋白组、信号通路等研究，特别是优势物种应对环境压力的基因调控奠定了技术基础。
(5)本发明的方法提取的微生物总核糖核酸和总蛋白质量较好，采用1％琼脂糖凝胶电泳检测得到的16s rRNA和23s rRNA总条带明亮清晰，5s rRNA条带不明显，说明降解较少，上机测序或qPCR实验时RNA链长和浓度符合测序和建库要求；采用12％SDS-PAGE凝胶电泳检测得到总蛋白条带明亮清晰，分子量分布均匀，符合Western Blot及宏蛋白组等后续检测要求。
附图说明
图1为实施例和对比例提取的微生物总RNA样品的胶图；
图2为实施例和对比例提取填料外表面微生物总蛋白样品的胶图；
图3为实施例和对比例提取填料内表面微生物总蛋白样品的胶图；
图4为实施例和对比例提取的RNA样品波长260nm与280nmOD值之比图；
图5为实施例和对比例提取的蛋白样品的浓度对比图。
具体实施方式
为进一步了解本发明的内容，下面结合实施例对本发明一种提取强酸性条件下烟气脱硫脱氮生物膜填料塔中微生物总RNA和总蛋白的方法(所述的同步脱硫脱氮的生物膜填料塔装置结构图同中国专利申请号为CN2019101044777的装置)做进一步的描述。
实施例1
本实施例及以下实施例、对比例均针对一种烟气脱硫脱氮生物膜填料塔中强酸性循环液条件下填料表面附着的微生物总RNA和总蛋白的提取方法，选用烟气脱硫脱氮生物膜填料塔为样品来源的主要原因为：该填料塔的循环营养液pH值恰好落在0～3的范围内，其对烟气中氮氧化物和硫氧化物的去除，依托填料上的微生物膜或多孔表面的内层微生物进行，生物膜代谢硫氧化物和氮氧化物后显黄色，易于辨认，填料上微生物来源于污水处理厂生化池污泥，因此带有环境干扰物，且由于在实验室环境下运行，具有稳定的可重现性。以下提取方法，在单独或同时提取总RNA时，均采用RNA酶灭活的容器或试剂。
本实施例设置实验组和对比组，实验组具体步骤为：
步骤一、功能菌群样品的收集：将配制好的pH＝3.6～5.5，摩尔浓度为0.1～0.2mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液100mL装入水压容器中，从稳定运行的同步脱硫脱氮的生物膜填料塔中(本实施例中陶粒填料的直径为50～200mm，堆积密度200kg/m3，比表面积170～200m2/m3，孔隙率53％，营养液pH＝0～3)，取约0.2L微生物生长状态良好的陶粒填料置于1L的烧杯中，采用上述缓冲液在90MPa的压力下冲洗填料，将附着在填料上的菌体冲洗下来，该压力下冲洗时间不超过90s，并从极端酸性条件下过渡到中度酸性条件。将填料从烧杯中取出，将菌悬液倒入15mL离心管中，用5,000g的转速离心2分钟，直至菌悬液全部离心完。
步骤二、样品总RNA和总蛋白的提取：从步骤一所得菌体中取体积约0.2mL，加入2mL，pH＝4的溶液B(溶液B为含0.05～0.2mol/L醋酸-醋酸钠，pH＝4.0～4.5的Trizol试剂)中，具体的：所述溶液B中含有相对于溶液的总量0.5-2mol/L浓度的胍盐、相对于溶液的总量0.05～0.2mol/L,pH＝4.0～4.5的醋酸-醋酸钠缓冲液、相对于溶液总量0.1-1％体积的十二烷基肌氨酸钠以及总体积30％～50％的酚类。
使用超声破碎仪破碎，超声60％能量，3s工作、2s暂停，共超声2分钟，使菌体完全破裂后，进行总RNA和总蛋白的提取，按照每1ml溶液B加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上离心管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下(15℃～30℃)放置2～3分钟后，12000g以上(2℃～8℃)离心15分钟，使之分层为水相上清液、DNA中间层、下层有机相、底层腐殖酸和不溶物等杂质沉淀。小心吸取水相上清液，于新的无RNA酶离心管中，再将下层有机相溶液转移至另一灭菌过的离心管中，并保存于2℃～8℃冰箱中等待处理。
步骤三、样品总RNA和总蛋白的纯化：
在含有水相上清液的离心管中加入加异丙醇和高盐溶液(0.8M柠檬酸钠和1.2M的NaCl)各1mL，颠倒数次混匀，-20℃放置1小时以上将RNA沉淀出来，在12000g以上(2℃～8℃)转速的条件下离心10分钟，加入适量75％乙醇漂洗后，再次以12000g以上(2℃～8℃)转速的离心(5分钟)，重复漂洗、离心，并晾干至微微发白后，加入无RNA酶或焦炭酸二乙酯(DEPC)处理过的去离子水60μL复溶，得到总RNA样品OR-1，将得到的总RNA样品于-80℃保存以备长期使用；将冰箱中的总蛋白有机相溶液取出，加入5倍体积2M醋酸铵的甲醇溶液沉淀蛋白，离心去上清液，以80％丙酮清洗后，再次离心去上清液，然后以丙酮清洗三次后，晾干，得到总蛋白样品OP-1，于-80℃保存以备长期使用，也可继续冻干后于4℃以下长期保存待用。
步骤四、样品总RNA和总蛋白的检测：取步骤三得到的2μLRNA，使用微量紫外可见分光光度计，进行RNA含量测定，读取RNA浓度和260/280nm紫外OD值，进行核糖核酸含量测定，使用质量百分浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳检测得到微生物总RNA的质量；取步骤二得到的总蛋白约50μL，应用BCA蛋白试剂盒测定蛋白浓度，采用12％SDS-PAGE凝胶电泳检测得到总蛋白的质量。
对比组1：取同一层的生物膜长势良好的填料相同量，重复以上操作，调整冲洗压力和冲洗体积，采用20mL醋酸-醋酸钠缓冲溶液，在30MPa条件下反复冲洗，其他步骤同实验组，获得RNA样品OR-0、蛋白样品OP-0。
对比组2：取同一层的生物膜长势良好的填料相同量，重复以上操作，采用500mL醋酸-醋酸钠缓冲溶液在150MPa条件下反复冲洗，其他步骤同实验组，获得样品RNA样品OR-2、蛋白样品OP-2；至此可以进行下一步实验，若并不立马进行下一步实验，需要将样品放于-80℃冰箱保存。
根据图1、图4，比较OR-0、OR-1、OR-2的胶图和260/280nm紫外OD值之比的对比图，样品OR-1的RNA质量最好，胶图呈现16S和23S rRNA聚集的长尾均匀分布的明亮条带，且260/280紫外OD值之比在1.95左右，说明蛋白质和DNA污染较少。而OR-2加大冲洗液量后，蛋白污染加大，260/280紫外OD值之比下降到约1.8，显示污染增多，且胶图在16S和23S rRNA聚集处亮度没有显著增强，显示RNA提取质量下降，这可能是由于加大冲洗压强后，冲下的死菌增多，引入的死菌降解后的RNA含量上升所导致，也可能是由于加大冲洗液量，冲洗时间对应延长为OR-1的约3倍，导致微生物在脱离所附着的基质和生物膜或菌团的保护结构下引发菌的死亡所产生，因此，过度加大冲洗量、延长冲洗时间，不仅不能增加RNA提取的总量，而且影响提取质量，导致提取得到的RNA样品质量变差。
另一方面，OR-0样品260/280紫外OD值之比在1.85左右，但是RNA胶图显示16S和23S rRNA聚集处亮度显著下降，这一结果表明，冲击水压和冲击体积过小时，冲洗下来的菌量不足，且冲下部分中包含较多生物膜或菌胶团表面的蛋白质保护层与表层死菌，从而影响了提取质量。
总蛋白样品的胶图见图2，根据图2，比较OP-0、OP-1、OP-2的胶图，OP-1、OP-2亮度相似，而OP-0由于冲击水压和冲击体积过小时，冲洗下来的菌量不足，几乎无条带，显示蛋白提取，需达到一定的生物量，否则难以获得足够的蛋白量，但是达到所需的冲洗压强和时间，满足生物量的需求后，进一步延长冲洗时间和加大压强无助于提取量的增加。这一结果也与BCA测定的蛋白浓度相吻合。
实施例2
本实施例针对一种烟气脱硫脱氮生物膜填料塔中超强酸性循环液条件下填料内部附着的微生物总RNA的提取方法，操作步骤基本同实施例1，其步骤如下：
步骤一、功能菌群样品的收集：从同步脱硫脱氮的生物膜填料塔中，取约0.2L微生物生长状态良好的高聚耐酸塑料填料置于1L的烧杯中，本实施例中塑料填料的直径为约50mm，堆积密度500kg/m3，比表面积～700m2/m3，孔隙率75％，用物理手段破开填料表面，暴露内部多孔表面。将配制好的与实施例相同的醋酸-醋酸钠缓冲溶液80mL(视破开的表面数量和面积决定冲洗体积)装入水压容器中，采用80MPa的压力冲洗填料，将附着在填料上的菌体冲洗下来，并从极端酸性条件下过渡到中度酸性条件。将填料从烧杯中取出，将菌悬液倒入50mL离心管中，用6,000g的转速离心5分钟，直至菌悬液全部离心完。后续步骤同实施例1，获得样品RNA样品IR-1、蛋白样品IP-1作为实验组；
对比组1：取同一层的生物膜长势良好的填料相同量，重复以上操作，调整冲洗时间和冲洗体积，采用300mL醋酸-醋酸钠缓冲溶液，在120MPa条件下反复冲洗，将生物膜从球体内部完全剥离，其他步骤同实验组，获得样品IR-2、IP-2。
对比组2：采用10mL醋酸-醋酸钠缓冲溶液，在20MPa条件下反复冲洗，其他步骤同实验组，冲洗内部孔隙获得样品IR-0、IP-0。
后续步骤同实施例1。总RNA胶图和260/280紫外OD值之比参见图1和图4，总蛋白样品的胶图见图3，IR-1采样的冲洗体积及水压、对应的冲洗时间较为适宜，因此获得的结果较好，IR-0和IR-2结果较差的原因分别与OR-0和OR-2类似。整体而言，由于填料内部的生物量较表面生物膜低，提取得到的RNA量较外表面生物膜少，其中IR-0由于冲洗量较少，几乎看不到16S rRNA和23S rRNA条带，无法用于后续qPCR或测序实验。蛋白跑胶的结果与RNA结果稍有区别，IP-2获得的蛋白条带亮度显著高于IP-0和IP-1，显示蛋白质样品由于稳定性较核酸样品更强，加大冲洗量有助于获得更多的蛋白，从而增加提取的效率。综合两种结果，300mL，120MPa反复冲洗为内部菌胶团同时提取总RNA和总蛋白，或单独提取总蛋白时的最优预处理方式，而80mL，80Mpa冲洗为内部菌胶团单独提取总RNA时的最优预处理方式。
对比例1
本对比例采用CN105018472 A中采用的一种在栽培基质上紧密嵌合的菌丝体中RNA的提取方法，提取极端酸性条件下的基因组RNA。
其步骤如下：从同步脱硫脱氮、单独脱硫和单独脱氮的生物膜填料塔中，取约0.2L微生物生长状态良好的陶粒填料置于2L的烧杯中，加入3倍体积的缓冲液I(20mg/mL溶菌酶500μL+20mg/mL蛋白酶K 200μL+0.02～0.1mmol/L pH＝5.5～6.5PBS缓冲液配制成1000ml溶液)；至淹没过布满菌丝体的填料，放置摇床，保持温度35～40℃，摇床转速100～150rpm摇动2～3h，3000～4000rpm低速离心10～15min；收集上清液；沉淀加入缓冲液II(1mmolEDTA+10％SDS 10ml+0.02～0.1mmol pH＝5.5～6.5的PBS缓冲液配制成100ml溶液)洗涤，3000～4000rpm低速离心10～15min，洗涤过程重复2～5次，取每次洗涤后的上清液合并，在转速10000～12000rpm，4℃离心10～15min，弃上清液，收集沉淀，采用TRIZOL试剂，按步骤二、三方式处理。获得样品CR-1，同样条件跑胶。
观察胶图图1，可知该方法提取出的菌体中RNA，几乎看不到16S rRNA和23S rRNA条带，可能是由于该方法溶解菌体，使其从基质上脱离的效果较差，且造成提取RNA分子的前处理步骤耗时过长，菌体在pH变化过程中大量死亡，导致RNA在酸性溶液中降解所致。
对比例2
本对比例采用CN109234270 A中描述的方法异位提取极端酸性条件下的基因组RNA，其步骤如下：
从同步脱硫脱氮、单独脱硫和单独脱氮的生物膜填料塔中，取约0.2L微生物生长状态良好的陶粒填料置于1L的烧杯中，吸去营养液，在烧杯中直接加入RNA提取溶液(含30～50％体积的酚、3～10％体积的多元醇、0.5～2M浓度的胍盐、0.1～1％体积的十二烷基肌氨酸钠、0.05-0.2M浓度的醋酸和0.05-0.2M的醋酸钠)，每10cm2生长的生物膜中加入1ml的RNA提取溶液，但需使生物膜部分浸没于RNA提取溶液液面以下，静置10分钟，便于裂解液均匀分布细胞表面裂解，再使用移液器吹打生物膜并移至收集管中；向上述步骤中的溶液中加入氯仿，每使用1ml RNA提取液中加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，在12,000转每分钟转速，4-25℃条件下离心1分钟，此时样品会分为三层：红色有机相、中间层和上层无色水相，其中RNA主要在水相中，将水相(约500μL)转移至一个新的RNase-Free的离心管中；在得到的无色水相的离心管中，加入等体积的无水乙醇，混匀，将得到溶液转入硅胶膜吸附柱中，在4-25℃，12,000转每分钟转速的条件下离心30秒，若一次不能将全部溶液和混合物加入吸附柱，分两次转入吸附柱中，在4-25℃，12,000转每分钟转速的条件下离心30秒，弃掉收集管中的废液，向吸附柱中加入500μL80％乙醇漂洗液，在12,000转每分钟转速条件下离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中，重复此步骤一次，将吸附柱放入收集管中，在12,000转每分钟转速条件下离心2分钟，尽量除去漂洗液，将吸附柱置于室温放置2分钟，彻底晾干，加入30-50μL的洗脱液RNase-Free的ddH2O，室温静置2分钟，在温度4-25℃，12,000转每分钟转速条件下离心1分钟，获得样品CR-2，样品保存于-80℃以备长期使用。
观察胶图图1可以发现，该方法提取的菌体中RNA，几乎看不到16S rRNA和23SrRNA条带，可能是由于该方法溶解菌体后用枪头吹打的方式，水压过低，使其从基质上脱离的效果较差，且造成提取RNA分子的前处理步骤耗时过长，菌体在pH变化过程中大量死亡，导致RNA在酸性溶液中降解所致。
对比例3
本实施例采用公开号为CN 101921341 A的申请案所述的一种提取环境样品总蛋白的方法提取，其步骤如下：
从同步脱硫脱氮、单独脱硫和单独脱氮的生物膜填料塔中，取约0.2L微生物生长状态良好的陶粒填料置于1L的烧杯中，加5倍体积预冷的离子去除剂(50mM的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液，20mM的乙二胺四乙酸，100mM的氯化钠，0.01g/mL的聚乙烯吡咯烷酮，pH＝10.0)去除土壤各种离子、无机物、有机物以及胞外游离的蛋白，加5倍体积预冷的0.01M磷酸缓冲液，pH＝7.4，混匀震荡15分钟，破碎填料后取长有生物膜的部分10,000×g离心10分钟，收集沉淀，重复该步骤两次；用于平衡渗透压、维持离子强度和pH＝7.4；加5倍体积的无菌超净水，涡旋混匀，于室温10,000×g离心10分钟，收集沉淀；用于洗涤沉淀并主要去除无机盐离子；取长有生物膜的部分冷冻研磨并冻干，称取10g上述预处理后的冷冻干燥样品于50mL预冷无菌离心管中，加30mL细胞样品蛋白提取液(100mM的Tris-HCl缓冲溶液，1mM的二硫苏糖醇，pH＝7.8，100微升2.0mg/L的多物种蛋白酶抑制剂)，涡旋混匀，每个样品3次重复；置于冰浴中用超声波法彻底破碎细胞；20000×g，4℃下离心15分钟，收集上清液，重复离心操作一次，收集所有的蛋白液，加入质量比为80％的固体硫酸铵溶解度后，置于4℃振荡充分混匀，20000×g，4℃下离心20分钟，收集析出的蛋白，加50微升的1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶溶解液溶解后，获得微生物蛋白样品CP-1，与实施例2样品一同跑胶，图3显示结果几乎不显示蛋白条带，显示该方法由于前处理步骤过长，且第一步直接采用pH＝7.4的清洗液，造成生物膜的pH值剧烈变化，导致活性菌的死亡，从而造成提取的失败。
对比例4
本实施例采用《MBR膜污染解析及MFC-MBR耦合系统膜污染控制研究》中，苏欣颖所描述的方法提取总蛋白，用纯水替代配制好的pH＝4.5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，进行第一步的冲洗操作，其他步骤按照实施例1进行，最终获得蛋白样品CP-2，与实施例2样品一同跑胶。图3结果几乎不显示蛋白条带，显示该方法由于直接使用纯水冲洗，造成生物膜的pH值和渗透压剧烈变化，导致活性菌的死亡，从而造成提取的失败。
对比例5
本对比例采用刮取法原位提取极端酸性条件下的基因组RNA和蛋白质，其步骤如下：
步骤一、功能菌群样品的收集：从同步脱硫脱氮、单独脱硫和单独脱氮的生物膜填料塔中，取约0.5L微生物生长状态良好的陶粒填料置于1L的烧杯中，用灭菌消毒且RNA酶灭活过的棉签及刮刀物理剥离表明的生物膜于一个15mL离心管中。按实施例1中步骤提取样品RNA和蛋白质，获得样品CR-3(RNA)、CP-3(蛋白质)。
图1结果表明，用本方法可以提取获得少量的RNA，16S rRNA和23S rRNA条带可见，且纯度较高(260/280紫外OD值之比在～1.85)(见图4结果)，但是，浓度显著低于CR-1；蛋白跑胶未见明显条带，意味着该方法局限性较大，且由于酸性条件下，生物膜所生长的内表面在长期酸性腐蚀下往往孔洞较多，菌胶团或生物膜样品难以通过刮取获得，且极易引入杂质，因此，该方法对强酸性条件下的RNA提取适用性较差。
经对以上不同实施案例的对比分析可以发现，只有实施例1和2，通过加压缓冲溶液冲洗、调节pH以及缓冲溶液洗涤重金属离子和腐殖质，均能够得到较长、较完整的RNA片段和蛋白质，从而使下游实验分子生物学实验能够顺利进行。根据图1-图4可知，而对比例1、2无论是原位还是异位提取RNA，均不能在极端酸性条件下提取出高质量的样品总RNA，对比例5虽然提取得到了部分RNA样品，但是样品量远低于实施例1，导致后续高通量测序实验或qPRC实验难以进行；对比例3～5均无法提取出蛋白样品，用于后续实验。
以上内容是结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，不能认定本发明具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的构思的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明所提交的权利要求书确定的保护范围。

Claims (10)

1.一种提取强酸性条件下基质附着微生物总RNA和总蛋白的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)取基质材料，采用pH＝3.6～5.5的缓冲溶液A在一定压力的水压下冲洗基质材料，将微生物从附着基质表面上洗脱，离心收集菌体；
2)将步骤1)收集的菌体裂解，采用溶液B提取总RNA和总蛋白，所述溶液B为pH＝4.0～4.5的Trizol试剂。
2.根据权利要求1所述的提取强酸性条件下基质附着微生物总RNA和总蛋白的方法，其特征在于：所述步骤1)中水压压力范围为30～120MPa。
3.根据权利要求1或2所述的提取强酸性条件下基质附着微生物总RNA和/总蛋白的方法，其特征在于：所述步骤1)中缓冲溶液A的冲洗体积为10～100mL。
4.根据权利要求3所述的提取强酸性条件下基质附着微生物总RNA和总蛋白的方法，其特征在于：所述方法还包括总RNA和总蛋白的纯化步骤。
5.根据权利要求4所述的提取强酸性条件下基质附着微生物总RNA和总蛋白的方法，其特征在于：所述的缓冲溶液A为醋酸-醋酸钠缓冲溶液，摩尔浓度为0.1～0.2mol/L。
6.根据权利要求5所述的提取强酸性条件下基质附着微生物总RNA和总蛋白的方法，其特征在于：所述菌体裂解方法包括冻融法、超声法或液氮研磨法。
7.根据权利要求6所述的提取强酸性条件下基质附着微生物总RNA和总蛋白的方法，其特征在于：所述溶液B中含有摩尔浓度为0.05～0.2mol/L的醋酸-醋酸钠。
8.根据权利要求1或2所述的提取强酸性条件下基质附着微生物总RNA和总蛋白的方法，其特征在于：所述步骤1)中缓冲溶液A的冲洗体积为80mL，水压的压力为80MPa。
9.根据权利要求8所述的提取强酸性条件下基质附着微生物总RNA和总蛋白的方法，其特征在于：所述步骤1)离心速度为5000g，离心时间2分钟，离心温度4℃。
10.根据权利要求9所述的提取强酸性条件下基质附着微生物总RNA和总蛋白的方法，其特征在于：所述基质表面包括基质材料外表面和/或内表面。
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