CN105734054A - 强酸性条件下烟气同时脱硫脱氮用生物膜填料塔中功能菌群dna的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种强酸性条件下烟气同时脱硫脱氮用生物膜填料塔中功能菌群DNA的提取技术方法，属于生物法工业废气净化技术领域。本发明依据提取微生物DNA检测技术原理，针对从生物膜填料塔中采取的功能菌群样品，首先采用硫酸(烟气同时脱硫脱氮用生物膜填料塔系统中的主要致酸性生化反应产物)配制的pH调节液调节菌群样品液pH至适宜值pH＝4～6范围内，之后选用适宜提取此类菌群DNA；DNA提取试剂盒及按其规定操作即能够提取出功能菌群的DNA，由此形成了强酸性条件下烟气同时脱硫脱氮用生物膜填料塔中功能菌群DNA提取的新型技术方法。
Description
技术领域
本发明公开一种强酸性条件下烟气同时脱硫脱氮用生物膜填料塔中功能菌群DNA的新型提取技术方法，属于生物法工业废气净化技术领域。
技术背景
近年来，随着世界主要发达国家以及中国对工业烟气排放的SO2、NOx及烟尘等污染物控制的环保立法日趋严格，探求技术上先进、经济上合理的新型烟气同时脱硫脱氮技术一直是环保领域的新技术前沿研究热点之一。
生物法废气净化技术是一项废气净化新技术，其以经济、有效、污染物净化彻底、适合于净化处理低浓度工业废气等特点，近年来其已逐步发展成为世界上工业废气净化的一个前沿热点研究领域，其中生物法烟气同时脱硫脱氮技术即是一项广受关注的工业SO2、NOx烟气污染控制新技术。
生物膜填料塔烟气同时脱硫脱氮技术即是通过生物膜填料塔中的脱硫、脱氮功能微生物菌群的生物化学作用来实现对含SO2、NOx烟气的同时脱硫脱氮净化的。烟气同时脱硫脱氮用生物膜填料塔中的微生物通常是以脱硫、脱氮自养型功能菌为主构成的复合功能菌群。这类以自养菌为主的复合菌群通常生长繁殖速度较慢(尤其其中的脱氮菌群生长缓慢)。如果生物膜填料塔的操作条件改变而引起这类以自养菌为主的微生物菌群的生长环境条件变化，例如在生物挂膜初期塔内微生物菌群对操作条件适应性弱、随操作运行塔内嗜酸脱硫菌快速繁殖致使生物膜体系pH降低(一般降低至pH为0.5～2.0)、酸性快速增强从而抑制脱氮菌及其它微生物菌群的生长繁殖等(尤其对其中通常适宜在弱酸性及中性环境中生长的脱氮菌群正常发挥脱氮作用性能的影响较大)，就会对生物膜填料塔的烟气同时脱硫脱氮性能产生不利影响。这就需要有针对性地对烟气同时脱硫脱氮用生物膜填料塔中的功能微生物菌群结构进行检测和对比分析，并依据结果对不同类型功能菌群采取强化措施，以保证生物膜填料塔的烟气同时脱硫脱氮作用的高效持续稳定发挥。
按现阶段微生物检测技术，检测功能微生物菌群结构需要通过功能菌群取样、功能菌群总DNA提取、针对DNA的16SrRNA基因进行PCR扩增、PCR产物纯化、扩增、高通量测序、生物信息学分析等过程来完成。功能菌群DNA提取是其中的一个关键步骤。由于烟气同时脱硫脱氮用生物膜填料塔通常在低pH强酸性条件下操作运行，塔中微生物量极低，其中大多数微生物脱离强酸性环境后细胞易死亡裂解，暴露的DNA易变性解链。因此，难以按目前常规方法来有效提取功能菌群的DNA。
发明内容：
本发明的目的在于研究获得一种强酸性条件下烟气同时脱硫脱氮用生物膜填料塔中功能菌群DNA提取的新型技术方法。
为了解决烟气同时脱硫脱氮用生物膜填料塔运行环境的强酸性条件下功能菌群DNA难以提取的技术难题，本发明依据提取微生物DNA检测技术原理，针对从生物膜填料塔中采取的功能菌群样品，首先采用硫酸(烟气同时脱硫脱氮用生物膜填料塔系统中的主要致酸性生化反应产物)配制的pH调节液调节菌群样品pH至适宜值pH＝4～6，之后选用适宜提取此类菌群DNA的美国MPBiomedicals公司生产的6560-200型MPBIO土壤基因组DNA提取试剂盒及按其规定操作提取菌群DNA的技术方法进行了实验研究，由此形成了强酸性条件下烟气同时脱硫脱氮用生物膜填料塔中功能菌群DNA提取的新型技术方法。
本发明目的是这样实现的：一种强酸性条件下烟气同时脱硫脱氮用生物膜填料塔中功能菌群DNA的提取技术方法，其特征是针对从生物膜填料塔中采取的功能菌群样品，先采用由硫酸配制的pH调节液，调节菌群样品pH至适宜值pH＝4～6范围内，之后选用适宜提取此类菌群DNA的提取试剂盒，并按其规定操作即能够提取出强酸性条件下烟气同时脱硫脱氮用生物膜填料塔中功能菌群的DNA。
所述用于调节菌群样品pH值的pH调节液是由浓硫酸与蒸馏水混合配制成的pH值为4.0～6.0的pH调节液。
所述pH调节液调节菌群样品的pH值至适宜范围是pH＝4～6。
所述用于适宜提取此类菌群DNA的提取试剂盒是美国MPBiomedicals公司生产的6560-200型MPBIO土壤基因组DNA提取试剂盒。
本发明提取功能菌群DNA对应的生物法烟气同时脱硫脱氮技术原理、技术方案、生物膜填料塔实验系统装置及其操作运行方法等，均与前期研究形成的“液相催化氧化-微生物组合法同时脱除烟气中二氧化硫和氮氧化物的方法”[发明专利ZL200610011013.4]的相同，在此不再重述。
本发明技术将在工业低浓度SO2和NOx废气污染生物法控制技术研究与应用方面具有广阔的应用前景。
附图说明
图1本发明提取功能菌群DNA对应的生物法烟气同时脱硫脱氮技术方法的工艺流程示意图。
图中:1—预处理器(必要时使用)；2—引风机；3—生物膜填料塔；4—循环液储槽及泵。
具体实施方式：
为了生物膜填料塔的烟气同时脱硫脱氮作用能够高效持续稳定发挥，需要有针对性地对生物膜填料塔中的功能微生物菌群结构进行检测和对比分析，并依据结果对不同类型功能菌群采取强化措施。
本发明依据提取微生物DNA检测技术原理，针对从生物膜填料塔中采取的功能菌群样品(含取自循环液中的样品)，首先通过采用由硫酸配制的pH调节液调节菌群样品pH至适宜值，之后选用适宜提取此类菌群DNA的试剂盒及按其规定操作提取菌群DNA的技术方法操作，成功提取出了强酸性条件下烟气同时脱硫脱氮用生物膜填料塔中功能菌群的DNA。
本发明研究形成的强酸性条件下功能菌群DNA提取的新型技术方法操作步骤如下：
1.功能菌群样品取样、处理及保存
①根据检测分析需要，从生物膜填料塔内不同位置填料层中取出表面附着有生物膜的填料样品，每个样品体积约0.50L。
②将约0.50L生物膜填料样品置入1.0L烧杯中，加入取自该生物膜填料塔的循环液淹没生物膜填料样品至混合总体积约为1.0L，同时用精密pH试纸(量程0.5-5.0)测定其pH值(一般pH为0.5-2.0)。
③将装有生物膜填料样品的烧杯放在回旋振荡器(摇床)上，以转速为270r/min，摇动48h。再用超声波清洗仪，超声清洗10min。之后人工搅动2-3次，核看确认附着在填料样品表面的生物膜已全部脱落后，从烧杯中取出填料样品。
④将装有从填料样品表面脱落的生物膜的烧杯静置3.0min后，倒出约0.4-0.5L上清液。[注：对于从生物膜填料塔循环液中采集功能菌群样品的情况，从此步骤开始处理及后续操作。]
⑤将烧杯中剩余的浓循环液用循环水多用真空泵并配以孔径为0.22μm的标准微孔滤膜过滤，将浓循环液中的微生物菌群样品富集在滤膜上。
⑥将滤膜上面向内对折后，置入已标记好的50mL离心管中，至此即获取了功能菌群样品。之后，将该离心管放入4℃的冷藏冰箱中保存备用。注意，在进行后续调节菌群样品pH值操作之前的保存时间不宜超过2h。
2.调节菌群样品pH值
①用蒸馏水稀释浓硫酸，配制总体积约100mLpH＝4～6的pH调节液备用。
②将4℃冷藏冰箱内保存的装有富集微生物菌群样品滤膜的50mL离心管取出，用橡皮乳头滴管滴加入配制的pH＝5.0的pH调节液至离心管尖底部。滴加pH调节液过程中注意冲洗浸泡滤膜，同时将离心管内的样品液摇匀，并同时用精密pH试纸(量程0.5-5.0)测定离心管内样品液的pH值。
③随滴加pH调节液量的逐步增加，离心管内样品液的pH值也随之升高。当样品液的pH值升高至事先设定的显示弱酸性pH值(在pH＝4～6范围内)时，即停止滴加pH调节液。经过这一pH调节过程，即实现了使离心管内菌群样品液的微环境从强酸性向弱酸性的转变。
④将装有上述已调节pH至适宜值的离心管静置10min后，倒出上清液。
⑤将离心管中剩余的浓循环液用一张新的孔径为0.22μm的标准微孔滤膜过滤，将浓循环液中的微生物菌群样品继续富集在新滤膜上。
⑥将新滤膜上面向内对折后连同原有滤膜，一同置入一个新的已标记好的50mL离心管中，至此即获取了调节pH至适宜值的功能菌群样品。之后，将该离心管放入4℃的冰箱冷藏室保存备用。注意，在进行后续DNA提取操作之前的保存时间不宜超过2h。
3.提取脱硫脱氮功能菌群DNA
①打开购买的美国MPBiomedicals公司生产的6560-200型MPBIO土壤基因组DNA提取试剂盒(以下简称“MP试剂盒)，并按说明书要求做好各种其自带器具试剂的使用准备。[经本发明实验研究确定，能够使用该试剂盒从经pH调节后的菌群样品液中提取出脱硫脱氮功能菌群的DNA。]
②将上述50mL离心管中的两张滤膜在管内剪碎，之后将滤膜碎片直接转移至紫色样品裂解管(LysingMatrixEtube管,MP试剂盒自带件)中。
③在紫色样品裂解管中，加入978μLSodiumPhosphateBuffer试剂(MP试剂盒自带试剂)，再加入122μLMTBuffer试剂(MP试剂盒自带试剂)；之后，将紫色样品裂解管置于均质破碎仪上，对管内沉淀物进行震荡破碎均质化，破碎条件为5.5m/s、45s。
④使用离心机，在14000r/min转速条件下，将紫色样品裂解管离心15min，之后转移该裂解管中上清液至一个新的1.5mL的离心管中；加入250μLProteinPrecipitationSolution试剂(MP试剂盒自带试剂)，上下颠倒混匀10次后，再次使用离心机，在14000r/min转速条件下，继续离心5.0min。
⑤将离心处理后的1.5mL离心管中的上清液转移至另一个新的15mL离心管中，加入1.0mL混匀后的BindingMatrix试剂(MP试剂盒自带试剂)，左右平行摇晃2.0min后，在室温下静置3.0min。
⑥将上述离心管中液体手动混匀后，转移600μL液体(混匀)至SpinTMFilters双层套管(DNA纯化柱管，MP试剂盒自带件)的内管中；使用离心机，将SpinTMFilters管在14000r/min条件下，离心1.0min后，倒弃外管中的废液。
⑦重复一遍上述步骤⑥的操作。
⑧在上述SpinTMFilters管的内管中，加入500μL的SEWS-M试剂(MP试剂盒自带试剂)，用移液枪配以1000μL移液枪头小心地吹吸混匀后，使用离心机，在14000r/min条件下，离心1.0min后，倒弃外管中的废液。
⑨将上述离心处理1.0min后的SpinTMFilters管，在14000r/min条件下，再次离心2.0min后，倒弃外管中的废液。
⑩将SpinTMFilters管的内管取出并放入一个新的洁净1.5mL离心管中，在室温下放置干燥5.0min后，向SpinTMFilters管的内管中心处加入70μL双次蒸馏水并用移液枪(配以200μL移液枪头)小心搅拌混匀后，放入55℃电热恒温鼓风干燥箱中热激5.0min；之后，再次使用离心机，在14000r/min条件下，离心1.0min，将内管中的DNA洗脱至1.5mL的离心管，丢弃SpinTMFilters管的内管，下一步即可对其中提取的DNA进行浓度检测。
对1.5mL离心管中提取的DNA浓度进行检测，并确认达到满足后续高通量测序的样品DNA浓度要求后，将该DNA样品放入-80℃的超低温冷冻冰箱中保存。
4.检测提取的DNA浓度
使用型荧光计以及QubitdsDNAHSAssayKit试剂盒(简称dsDNAHS试剂盒)进行提取DNA的浓度检测。
①按型荧光计使用要求配制工作液：按A试剂:B试剂＝199:1的比例配制工作液10mL。(注：A和B试剂均为dsDNAHS试剂盒自带试剂。其中：A试剂为dsDNABRBuffer，B试剂为dsDNABRReagent*200×。)
②取两个型荧光计配套使用的assaytubes管，先分别向两个管中各加入前面配制的工作液190μL，然后再分别加入10μL的标准样品#1试剂及10μL标准样品#2试剂(两种试剂均为dsDNAHS试剂盒自带试剂)；在室温条件下，手工震荡混匀后，使用微型低速离心机，离心30s。
③再取一个assaytubes管，先向管中加入配制的工作液198μL，之后再加入2μL已确认提取出DNA的待检测菌群DNA样品液；在室温条件下，手工震荡混匀后，使用微型低速离心机，离心30s。
④用型荧光计检测2个标准样品的荧光检测数值，连接两点绘制出一条浓度标准直线；之后，用荧光计检测一个待测菌群DNA样品液的荧光检测数值。之后，依据2个标准样品的荧光检测数值及绘制出的浓度标线，计算确定待测样品液的菌群DNA浓度。
如果检测出待测样品液的DNA浓度在1.0ng/μL以上时，则可以进行后续DNA的PCR扩增以及上IlluminaMiseq测序仪进行功能菌群的高通量测序检测分析工作。如果检测出待测菌群样品液的DNA浓度低于1.0ng/μL时，则需要重复上述DNA提取操作，直至待测菌群样品液的DNA浓度达到1.0ng/μL后，方可开展后续工作。
一、试剂盒列表：
二、试剂与用品用具列表：
三、仪器设备列表：
本发明具体实施方法是：根据需要从生物膜填料塔内不同位置表面附着有生物膜的填料以及从生物膜填料塔循环液中取出功能菌群样品后，首先用由硫酸配制的pH调节液调节菌群样品pH至适宜值pH＝4～6，之后选用适宜提取此类菌群DNA的美国MPBiomedicals公司生产的6560-200型MPBIO土壤基因组DNA提取试剂盒并按其规定操作即可提取出功能菌群的DNA。
具体操作步骤详见前述的强酸性条件下功能菌群DNA提取的新型技术方法的相关内容。
实施例1～5：
在采用按生物法烟气同时脱硫脱氮操作的生物膜填料塔系统(单塔系统)上进行强酸性条件下生物膜填料塔中功能菌群的DNA提取实验。生物膜填料塔系统由预处理器(1)、引风机(2)、一个生物膜填料塔(3)、循环液储槽及循环泵(4)组成，其流程和连接方式见如图1所示。
其中的生物膜填料塔是塔径为80mm、高为1500mm的小型玻璃生物膜填料塔，填料塔内分两段装填直径为2.5cm的类球形陶粒，填料体积2.5L×2。实验操作均在常温常压条件下进行，气体流量为0.2m3/h，烟气中SO2和NOX浓度分别为500～3000mg/m3、500～2000mg/m3，循环液流量为8～10L/h，循环液pH0.5～2.0。生物膜填料塔进、出口SO2和NOX气体浓度采用英国产烟气分析仪KM900进行测定。
实验期间，分别对烟气同时脱硫脱氮用生物膜填料塔中生物膜填料及循环液进行了功能菌群5次取样实验，其中3次未按照、2次按照本发明的强酸性条件下功能菌群DNA提取的新型技术方法，对生物膜菌群样品进行了功能菌群的DNA提取实验。实验结果如表1所示。
经对表1中的实验结果进行对比分析可以看出，对于从生物膜填料塔内不同位置表面附着有生物膜的填料以及从生物膜填料塔循环液中取出的功能菌群样品，其中2次取样实验按照本发明技术方法首先用pH调节液调节菌群样品pH至适宜值pH＝5(在适宜pH＝4～6范围内)，之后采用美国MPBiomedicals公司生产的6560-200型MPBIO土壤基因组DNA提取试剂盒并按其规定操作均顺利提取出了功能菌群的DNA。另外3次取样实验由于没有使用pH调节液调节菌群样品pH至适宜值，即使采用适宜提取此类菌群DNA的试剂盒，也不能提取出此类菌群的DNA，后续采用IlluminaMiseq测序仪进行功能菌群的高通量测序检测分析工作也将无法进行。
表1强酸性条件下烟气同时脱硫脱氮用生物膜填料塔中功能菌群DNA提取的实验结果
Claims (4)
1.一种强酸性条件下烟气同时脱硫脱氮用生物膜填料塔中功能菌群DNA的提取技术方法，其特征是针对从生物膜填料塔中采取的功能菌群样品，先采用由硫酸配制的pH调节液，调节菌群样品pH至适宜值pH＝4～6范围内，之后选用适宜提取此类菌群DNA的提取试剂盒，并按其规定操作即能够提取出强酸性条件下烟气同时脱硫脱氮用生物膜填料塔中功能菌群的DNA。
2.根据权利要求1所述的一种强酸性条件下烟气同时脱硫脱氮用生物膜填料塔中功能菌群DNA的提取技术方法，其特征是所述用于调节菌群样品pH值的pH调节液是由浓硫酸与蒸馏水混合配制成，该pH调节液的pH值为4.0～6.0。
3.根据权利要求1或2所述的一种强酸性条件下烟气同时脱硫脱氮用生物膜填料塔中功能菌群DNA的提取技术方法，其特征是用所述pH调节液调节菌群样品的pH值至适宜范围是pH＝4～6。
4.根据权利要求1或2所述的一种强酸性条件下烟气同时脱硫脱氮用生物膜填料塔中功能菌群DNA的提取技术方法，其特征是所述用于适宜提取此类菌群DNA的提取试剂盒是美国MPBiomedicals公司生产的6560-200型MPBIO土壤基因组DNA提取试剂盒。
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