CN111269800B - 一种提取基质附着微生物总dna的装置和方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提取基质附着微生物总DNA的装置和方法，属于分子生物学技术领域，该装置包括控压冲洗装置、负压装置和收集装置，通过控压冲洗装置控制冲洗出水水压，通过负压管路将冲洗管路冲洗基质产生的混悬液收集至收集装置，本发明同时公开了DNA的提取方法，在加压下冲洗基质，配合负压装置收集样品，克服了现有技术针对附着在基质上的微生物样品存在取样困难、取样不完整的难题，显著改善了基质附着微生物基因组DNA的代表性、提取效率和质量，条带明亮清晰、基本无降解，对难提取微生物，如真菌等均有较好的提取效率。

Description

一种提取基质附着微生物总DNA的装置和方法

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种提取基质附着微生物总DNA的装置和方法。

背景技术

近年来，随着测序技术的发展，基于环境样品总脱氧核糖核酸(DNA)，对微生物多样性和功能进行分析的分子生物学方法不断完善，其中包括对某一特定基因的荧光定量核酸扩增检测(qPCR)法，对环境中微生物的总DNA进行测序的宏基因组技术等，逐步得到了广泛地应用。宏基因组技术被公认为是目前研究环境微生物群落结构和功能基因最全面、准确的方法，因为它没有特殊的选择性(例如纯培养/富集)，同时也减小了测序技术的偏好性(例如16S rRNA或iTS基因的PCR扩增步骤)。但是，以上这些技术的成功应用都需基于完善的DNA提取和纯化等预处理技术。

在自然环境当中，各类微生物(细菌、真菌、放线菌等)往往附着于泥沙、岩石等固体表面上，形成一层致密而薄的细胞层，微生物在其基础上不断生长和繁殖，包埋在由浓稠的胞外化合物所组成的基质中，构成一个功能和结构的整体，称之为生物膜，并依托生物膜进行生长、发育和增殖等生命活动。生物膜并不是均一不变的生物结构，绝大多数生物膜内部被形成的孔隙分隔，物质在生物膜内的传质阻力随着生物膜厚度的增长也不断增加，导致了生物膜出现分层。研究表明，异养生物膜内密度随厚度的变化而不断变化，从膜表面到底部生物膜密度逐渐提高，研究人员对一种处理生活污水的生物转盘反应器的生物膜内研究，发现了大量蜂窝状结构，膜内密布着10微米左右的微孔和20～200微米的大孔，膜内孔隙率沿膜厚方向逐渐变化，膜底部的孔隙率(～30％)远低于表面(～90％)。这些结果表明底层生物膜较表层更为致密，微生物间联系更为紧密，但是，由于现有DNA提取技术未针对生物膜各层间的采样一致性进行优化，特别是对于生长在多孔基质的生物膜或生物膜的底层微生物深嵌于基质中时，所取得的样品往往只包括其中易获得的表层或部分层的微生物菌群，而不包括基质孔内或嵌入于基质中的微生物群落，从而导致取样的典型性和代表性变差，如，在热泉的硫质喷气孔附近等极度酸性条件下生存的古菌或细菌等微生物群落，随生物膜生长扩大，其基质不断被侵蚀，底层微生物也不断向内生长，这些底层微生物群落在硫代谢中也起到了极为重要的作用，因此不能忽视。如果DNA提取方法仅针对表层微生物，很可能忽略这部分微生物的信息，从而造成微生物群落结构分析的失真和宏基因组分析的失准；此外，对于真菌，其可通过大量可分枝的丝状体，即菌丝(hypha)，形成菌落(colony)或菌索(rhizomorph)组织结构，在基质上生长、附着、蔓延，以进行生命活动，造成对环境中真菌样品进行DNA提取时很难自其生长基质上剥离菌丝体，导致提取产率低、质量差，代表性更加难以保证，造成上机测序获得的结果不准确或不全面等问题。

目前很多研究者采取了不同的方法预处理基质附着的微生物群落，使其满足总DNA提取的需要。这些方法主要可分为两类，一种是在微生物生长的原始位置，通过依次添加不同的试剂，对总DNA进行提取的原位提取法，例如，研究者对透析膜法培养的真菌选择将含菌丝的透析膜移至液氮预冷的研钵中直接研磨至粉末状，然后用Takara植物基因组DNA提取试剂盒提取DNA；针对土壤中的微生物样品，通常的提取方法为直接将土壤样品加入提取溶剂中，用高盐溶液溶胀破裂、玻璃珠物理破碎或冻融法破裂，配合溶菌酶作用的方法使微生物细胞膜/壁破裂后，再进行DNA的提取。

另一种是先应用试剂将微生物群落整体从附着基质上脱离下来，然后进行提取的异位提取法，例如，在《An effective method of DNA extraction for bioleachingbacteria from acid mine drainage》中，Zeng等人总结提取酸性矿井废水(pH＝4.0)微生物基因组核糖核酸的方法为首先用PBS溶液通过震荡摇晃沉积物样品，使微生物自沉积物固相自发转移到液相中，然后将收集的菌体置于含有SDS和CTAB的提取缓冲溶液中，先后在沸腾水浴、60±5℃和72℃中孵育，最后用苯酚/氯仿/乙醇和冰乙醇进行核酸抽提与沉淀；吴渊虬用干棉签吸取适量去离子水，在透明胶带留有指印痕迹的一面来回擦拭一次，再取第二根干棉签擦拭透明胶带同一表面，将两根棉签一同用超敏DNA提取试剂盒按步骤提取，先用裂解液裂解转移到棉签上的细胞，然后用硅珠吸附DNA后经清洗去除杂质后，洗脱收集总DNA。

虽然已经有上述已开发的各种针对不同研究者使用的提取方法，但是这些方法在针对环境中基质附着微生物的DNA提取时，均有各自的缺陷，如原位提取法中，液氮法研磨操作费时费力，需准备多个研钵，研磨后的器具不易完全清洗干净，导致提取后易污染后续样品，且在提取过程中需小心操作，不能震摇以避免DNA降解；而其他几种原位提取技术，一是需要将基质的小块完全浸没于提取液中，必须破坏基质表面，二是基质本身极易引入杂质，且提取液中普遍加入溶菌酶，导致微生物的细胞壁/膜破裂，细胞中的生物大分子大量溶出后，与基质中存在的腐殖酸、胞外蛋白、多糖、脂质、重金属等杂质发生络合等作用，导致该方法提取的DNA往往需要繁琐的后处理步骤，造成DNA提取效率的下降，甚至提取过程中的DNA大量降解，进而导致低丰度微生物的DNA损失至检测限之下，造成结果的代表性变差；而异位提取法中，由于震荡摇晃的机械力较小，或是由于棉签难以深入多孔基质的孔内部，往往转移下的微生物均为生物膜外层，难以将与基质紧密结合的微生物从基质上震荡或刮取下来，导致微生物的代表性极差。尚未有一种通用的快速、高效的自附着基质上获得具有代表性和典型性的微生物，并提取DNA的方法。

基于现有技术的缺陷，亟需发明一种新的快速、高效、易操作的自附着基质上获得微生物的装置和方法，从而保证取样的典型性和代表性。

发明内容

1、目标解决的问题

针对生物膜往往由多层组成，各层间的微生物组成存在较大的差异，现有微生物采样技术很难通过一次取样，快速获得各层的均一性样品，特别是当生物膜的生长基于多孔或生物膜的底层微生物深嵌于基质中时，所取得的样品往往只包括其中易获得的表层或部分层的微生物菌群，而不包括基质孔内或嵌入于基质中的微生物群落，从而导致取样的典型性和代表性变差等问题，本发明提供了一种通用的快速、高效、易操作的自附着基质上获得微生物的装置和方法，从而保证取样的典型性和代表性。

2、技术方案

为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案。

本发明提供了一种提取基质附着微生物总DNA的装置，包括控压冲洗装置、负压装置和收集装置，所述控压冲洗装置的出液端口处设有冲洗管路，所述收集装置分别与负压管路和负压泵相连通，所述的收集装置与负压泵相连通，所述的控压冲洗装置用于控制冲洗管路出水水压，所述的负压管路通过负压泵将冲洗管路冲洗微生物附着基质产生的液体抽吸至收集装置。

所述的控压冲洗装置安装在缓冲液容器下部，可以精确控制的出水水压(至少5级可调)，如维持出水压强0.5～100Mpa。所述冲洗管路可以控制冲洗液和基质接触位点的面积在需要取样的生物膜面积的2±0.2％以下。

所述的负压装置的真空度可调，以调节吸取气流的大小，且冲洗和负压管路均具有一定的防水性和耐酸碱性。所述装置整体可以通过电池给电的方式进行工作，从而实现野外操作。

作为本发明更进一步的改进，所述负压泵为防水泵，所述负压管路包括第一负压管路和第二负压管路，所述第一负压管路的一端与控压冲洗装置的底部密封连接，另一端为开放端，所述冲洗管路嵌套在第一负压管路内部，且所述冲洗管路的出水端位于第一负压管路的开放端上部；所述的第一负压管路上设置开口并通过所述开口与第二负压管路相连通，所述的第二负压管路与收集装置相连通。

所述第一和第二负压管路均为软管，从而适应采样的空间区域，所述冲洗管路为硬管以满足冲洗液加压需要。

作为本发明更进一步的改进，所述装置还包括杂质脱除装置，所述的杂质脱除装置分别与第二负压管路和收集装置相连通，所述杂质脱除装置用于去除较大的固体颗粒。

作为本发明更进一步的改进，所述第一负压管路开放端可连接不同形状的端口以适应不同实际情况的采样需要，可以将开放端连接锥形的端口，以保证不同条件下冲洗后溅射出的混悬洗脱液能够更完整的被收集。

作为本发明更进一步的改进，所述的冲洗管路的内径为(1～3)±0.3mm。

作为本发明更进一步的改进，所述控压冲洗装置可以与负压装置及管路独立设置，此时可以合并第一负压管路、第二负压管路为一根密封的软管；操作时冲洗管路的冲洗液流应以一斜角冲洗基质表面，负压装置应放置于其溅射液较为集中的位置，并考虑增大负压，以尽可能多的吸走含微生物混悬液。

作为本发明更进一步的改进，所述的收集装置包括一个隔液接口和离心管，第二负压管路自隔液接口穿过，直接将含微生物混悬液吸入离心管，隔液接口中留有一定体积，可以避免少量液体吸入负压泵，并且其通往负压泵的管路装有防倒吸单向阀，避免由于负压突然消失引发的倒吸或倒灌。收集装置通过螺纹接口与离心管密封连接，其留有的三个不同大小的螺纹接口以同心圆方式布置，实际使用时可以根据不同冲洗量的需要选择收集离心管的体积，或连接废液收集瓶。

作为本发明更进一步的改进，本发明提供了一种提取基质附着微生物总DNA的方法，所述方法包括以下步骤：

1)首先使负压装置运行，再利用控压冲洗装置控制冲洗管路的出水水压，使缓冲液A在加压条件下冲洗微生物附着基质；

2)所述冲洗后溅射出的混悬洗脱液通过负压管路收集至收集装置；

3)将收集装置中的液体离心，收集菌体样品；采用缓冲液B洗涤所述菌体样品，再次离心收集，提取总DNA。

作为本发明更进一步的改进，所述加压条件下的水压范围为30～120MPa。

作为本发明更进一步的改进，所述步骤1)中的缓冲液A为pH＝3.5～9.5的等渗缓冲液体系，该pH的选择需依据微生物所处环境溶液的pH值确定，一般不宜超过环境溶液pH值±2的范围，且以偏向中性为宜，使用体积为50～100mL，或根据冲洗面积(cm²)的五倍设为冲洗体积(mL)设置。所述步骤3)中的缓冲液B为含有EDTA的pH＝7～7.5的PBS-Tris缓冲溶液。所述缓冲液B中含有50～100mM Tris-HCl和50～100mM的EDTA。

所述步骤3)中的离心条件为离心速度为5000g，离心时间2分钟，离心温度4℃。

作为本发明更进一步的改进，所述缓冲液B的洗涤次数为2～3次，洗涤时间为2～5分钟，每次洗涤所用体积为20～50mL，所述提取总DNA的方法包括冻融法或超声法。

作为本发明更进一步的改进，所述的提取基质附着微生物总DNA的方法具体包括以下步骤：

步骤一、功能菌群样品的收集，收集过程如下：

S1、如微生物所附着的基质为小块状等易于获得的形状，则取约不超过0.5L体积的微生物生长状态良好的基质材料置于1L的烧杯中，采用所述的装置进行DNA提取，首先开启负压装置，然后利用控压冲洗装置控制冲洗管路的出水水压，使pH＝3.5～9.5的等渗缓冲液(缓冲液A)在高强水压(30-120MPa)条件下冲洗微生物附着基质；

S2、冲洗过程溅射出来的溶液和微生物群落混悬液可通过负压装置吸至收集装置中，该过程中通过杂质脱除装置脱除较大的杂质颗粒，将收集装置中的液体采用短时低速离心的方式收集菌体，具体操作为：弃上清液，弃去基质材料，4℃离心(5000g)2分钟收集菌体；如基质的内部也长有需要提取的微生物群落，则可以对基质先破碎，暴露长有菌团内表面，然后进行冲洗，快速剥离附着的微生物，并离心收集(5000g)；如基质为难以获得的大块材料、或不宜破坏的岩壁表面等，则宜小心控制水压压强和冲刷方向，并确保负压吸入口环绕冲洗位置，以免冲洗下的菌体掉落，造成采样失败。经过该步骤，菌体由基质附着过渡到菌胶团状态。

步骤二、样品的预处理：对步骤一所得菌体采用缓冲液B进行洗涤，所述缓冲液B为PBS缓冲溶液，溶液中含有50～100mM Tris-HCl以及50～100mM EDTA，次数为2～3次，洗涤时间为2～5分钟，每次洗涤所用体积为20～50mL；每次洗涤后4℃离心(5000g)2分钟收集菌体于1.5mL离心管中，弃去上清液，加入70％乙醇完全浸没菌体小球。根据进一步处理时间间隔选择合适的储存条件，如需长期保存，则置于-80℃冰箱中保存。

步骤三、样品基因组核糖核酸的提取：将步骤二)中的菌体解冻，使用超声法或反复冻融法等方法破裂菌体后，使用土壤基因组总DNA提取试剂盒进行总DNA的提取，得到生物膜中微生物总脱氧核糖核酸。所述基因组核糖核酸提取试剂盒采用MP Biomedicals公司生产的6560-200型Fast

SPIN kit for Soil试剂盒。

步骤四、样品基因组核糖核酸的检测：取步骤三)得到的总脱氧核糖核酸微量，使用微量紫外可见分光光度计，进行核糖核酸含量测定，使用质量百分浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳检测得到微生物总脱氧核糖核酸的质量。

3、有益效果

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

(1)本发明的提取基质附着微生物总DNA的装置，通过设有的加压装置可以使缓冲液出水在带有一定压力下对基质进行冲洗，同时配合负压装置快速收集，可以使所取得的样品不仅包括易获得的表层或部分层的微生物菌群，还包括基质孔内或嵌入于基质中的微生物群落，取样完整，克服了现有技术取基质内部的样品存在的取样困难、取样不完整以及难以通过一次取样获得基质上附着的所有微生物信息的难题，从而改善了取样的典型性和代表性，有利于更好的解析微生物群落和功能基因，从而推动功能微生物的分离和利用，提取获得的DNA质量较好，采用1％琼脂糖凝胶电泳检测得到的总条带明亮清晰，上机测序时DNA链长和浓度符合测序和建库要求。

(2)本发明的提取基质附着微生物总DNA的装置，将负压管路分为第一负压管路和第二负压管路，将第一负压管路设置为相对较粗的管路，因此可以嵌套冲洗管路，本发明使冲洗管路全部嵌套在第一负压管路内部，且所述冲洗管路的出水端位于第一负压管路的开放端上部；因此可以使第一负压管路能够环绕在冲洗区域上方，同时保护冲洗管路的端口，所述开放端可连接不同形状的端口以适应不同实际情况的精准的采样需要。第一负压管路一端与控压冲洗装置底部通过密封连接从而保持一定的密封性，在冲洗基质的过程中溅射的菌体混悬液能够直接通过第一负压管路迅速通过抽吸收集，防止取样过程中的损失，因此本发明不仅采用加压保证取样的完整，同时能够保证样品收集的完整性。

(3)本发明的提取基质附着微生物总DNA的方法，和传统异位提取法相比，其采用的缓冲溶液和高强水压，可以快速地将附着于基质上的微生物冲洗下来，并迅速转移至缓冲溶液中，易于同步剥离和基质结合紧密的底层微生物，且提取速度更快；而传统异位提取法更易于获得生物膜表层微生物，甚至是脱离基质的死菌，且提取时间长，导致活菌比进一步降低；且本发明的提取基质附着微生物总DNA的装置各管路易于清洗，不易造成样品间的交叉污染。

(4)本发明的提取基质附着微生物总DNA的方法，和现有原位提取法相比，避免了取样时，对生物膜生长基质的破坏，有利于保持微生态的可持续利用，且可以极大地减少原位提取时引入的大量杂质，特别是易溶性的腐殖酸和重金属离子对微生物DNA聚合酶的影响。

(5)本发明的提取基质附着微生物总DNA的方法，在对强酸碱性、高盐等极端条件下基质附着生物膜中微生物总DNA的提取时优势更为明显，该方法处理生物膜，微生物自生物膜中脱离的速度很快，几乎瞬间完成，且较强的水力剪切力可同时将冲洗下的微生物快速和缓冲溶液混合，进一步缩短了混悬的时间，避免了清洗杂质导致的提取时间过长，引发的微生物在极端条件下的死亡，和随之出现的DNA严重降解现象；分两步进行菌液的pH调整，可以避免冲下的菌体由于环境中过于剧烈的pH变化导致的死亡和破裂，同时缓冲溶液B由于其采用含有适宜浓度的EDTA，可以很好地将菌体中的重金属离子螯合、将腐殖质吸附沉淀，将重金属与腐殖质等抑制物与核糖核酸分离，最大程度地降低了抑制物污染的风险，显著地提高下游操作中的提取效率。

(6)本发明提取方法显著改善了基质附着微生物基因组DNA的代表性、提取效率和质量，凝胶电泳检测得到的总条带在500bp以上、条带明亮清晰、基本无降解，对难提取微生物，如真菌等均有较好的提取效率，且二代测序上机测定更为准确，从而能够更加准确全面地反映极端酸性条件下基质附着微生物的生长、演化状况，为后续微生物物种组成、基因功能、信号通路等生态学研究，特别是新菌种的发现、优势物种的全基因组拼接组装和功能基因预测奠定了技术基础。

附图说明

图1为实施例1的提取基质附着微生物总DNA的装置示意图；

图2为实施例2的提取基质附着微生物总DNA的装置示意图；

图3为强酸性条件下实施例和对比例提取得到的微生物样品的DNA胶图；其中，图a为强酸环境下对比例1-9中提取真菌样品的iTS条带图，图b中包括实施例1-2提取真菌样品的iTS条带图和对比例1-4的细菌样品的16S rDNA条带图，图c为对比例5-9的细菌样品和实施例1-2的细菌样品的16S rDNA条带图；

图4为强酸性条件下实施例1-2和对比例1-9提取得到的微生物样品(包括细菌和真菌)的DNA浓度对比图；

图5为中性条件下实施例3和对比例10提取得到的微生物样品的DNA胶图；

图6为中性条件下实施例3和对比例10提取得到的微生物样品(包括细菌和真菌)的DNA浓度对比图；

图中：1、缓冲液容器；2、控压冲洗装置；3、冲洗管路；4、微生物附着基质；5、第一负压管路；6、第二负压管路；7、杂质脱除装置；8、收集装置；9、负压泵。

具体实施方式

为进一步了解本发明的内容，下面结合实施例对本发明一种提取强酸性条件下烟气脱硫脱氮生物膜填料塔中微生物总DNA的方法做进一步的描述。

实施例1

本发明的提取基质附着微生物总DNA的装置，如图1所示，包括控压冲洗装置2、负压装置和收集装置8，所述控压冲洗装置2出水端设有冲洗管路3，所述控压冲洗装置2用于控制冲洗管路3出水水压，所述的负压装置包括负压管路和负压泵9，所述负压管路包括第一负压管路5和第二负压管路6，所述第一负压管路5的一端与控压冲洗装置2密封连接，另一端设置为开放端；所述冲洗管路3嵌套在第一负压管路5内部，且且所述冲洗管路3的出水端位于第一负压管路5的开放端上部；因此可以使第一负压管路5能够环绕在冲洗区域上方，同时保护冲洗管路3的端口。

所述第一负压管路5上设置开口并通过所述开口与第二负压管路6相连通，所述第二负压管路6与收集装置8之间还设有杂质脱除装置7，所述的第二负压管路6与杂质脱除装置7相连通，所述杂质脱除装置7与收集装置8连通，所述杂质脱除装置7用于去除较大的固体颗粒。所述的收集装置8与负压泵9相连通，所述的负压管路通过负压泵9将冲洗管路3冲洗微生物附着基质4溅射出的混悬洗脱液收集至收集装置8，所述的冲洗管路3的内径为(1～3)±0.3mm，出水端可以控制冲洗液和基质接触位点的面积在需要取样的生物膜面积的2±0.2％以下。

所述的收集装置8可以为离心管，其留有不同大小的螺纹接口，实际使用时可以根据不同冲洗量的需要并联多个收集离心管。所述的控压冲洗装置2安装在缓冲液容器1的下部，可以精确控制出水水压(至少5级可调)，如维持出水压强0.5～100Mpa。

本实施例同时提供了针对烟气脱硫脱氮生物膜填料塔中超强酸性循环液条件下填料表面附着的细菌总DNA和16S rDNA的提取和测定方法，以及真菌总DNA提取和iTS的测定方法，其步骤为：

步骤一、功能菌群样品的收集：从CN109569270B所述的稳定运行的同步脱硫脱氮生物膜填料塔中，取循环营养液约0.5L微生物生长状态良好的陶粒填料置于1L的烧杯中，营养液pH＝0～2，本实施例中陶粒填料的直径为50～200mm，堆积密度200kg/m³，比表面积170～200m²/m³，孔隙率53％。

1)首先使负压装置开放端覆盖生物膜生长区域，运行负压泵，将配制好pH为3.5～9.5的磷酸缓冲溶液A装入缓冲液容器1中(溶液A体积100mL)，采用控压冲洗装置2控制冲洗管路3的出水压力为90MPa，在该压力条件下冲洗填料，将附着在填料上的菌体冲洗下来，并从极端酸性条件下过渡到中度酸性条件；

2)所述冲洗后溅射出的含微生物混悬液通过负压管路收集至收集装置8；将含微生物混悬液的50mL离心管自装置上取下，用5,000g的转速离心2分钟，离心温度4℃，直至菌悬液全部离心完。

步骤二、样品的预处理：对步骤一所得菌体采用溶液B进行洗涤，所述溶液B为pH＝pH＝7～7.5的PBS缓冲溶液，所述缓冲溶液中含有50～100mM Tris-HCl以及50～100mMEDTA，洗涤所用体积为20～50mL，在离心管中轻轻颠倒摇晃2分钟，洗涤完后通过用5,000g的转速离心2分钟收集菌体，离心温度4℃，洗涤2-3次，去除上清液，将菌体上的重金属离子和腐殖质尽可能地洗脱下来。以70％乙醇溶液复溶菌体，获得样品S1；同时取同一层的生物膜长势良好的填料相同量，改变条件进行以下平行操作：

重复S1样品制备过程中的同样操作，不同之处仅在于溶液B的磷酸缓冲液pH值为4.5，获得样品，S2；

重复S1样品制备过程中的同样操作，保持缓冲液冲洗压力不变，不同之处在于调整冲洗体积为300mL磷酸缓冲液，获得样品S3；

重复S1样品制备过程中的同样操作，保持缓冲液冲洗体积不变，不同之处在于调整冲洗压力，采用30MPa反复冲洗，将生物膜完全剥离，获得样品S4；

重复S1样品制备过程中的同样操作，保持缓冲液冲洗体积不变，不同之处在于采用150MPa冲洗体积获得样品S5；

重复S1样品制备过程中的同样操作，保持缓冲液冲洗体积不变，不同之处在于采用15MPa冲洗体积获得样品S6。

至此可以进行下一步实验，若并不立马进行下一步实验，需要将样品放于-80℃冰箱保存。

步骤三、样品基因组DNA的提取：将步骤二所得菌体解冻，使用超声破碎仪破碎，超声60％能量，3s工作、2s暂停，共超声2分钟，使菌体完全破裂后，使用MP Biomedicals公司生产的6560-200型

SPIN kit for Soil试剂盒，按照说明书提示的流程步骤进行DNA提取操作，得到强酸性条件下烟气脱硫脱氮用生物膜填料塔中微生物总DNA。

步骤四、样品基因组DNA的含量测定、16S rDNA的V3-V4高变区qPCR扩增和检测，以及iTS可变区扩增和检测：取步骤三得到的2μLDNA，使用微量紫外可见分光光度计，进行DNA含量测定，读取DNA浓度和260/280nm紫外OD值。再取4μLDNA，用细菌16S rDNA的V3-V4高变区引物模板进行16S rDNA的qPCR扩增实验。

为了保证后续数据分析的准确性及可靠性，需要两个条件，首先是尽可能使用低循环数扩增；其次保证每个样品扩增的循环数统一。为了达到以上目的，首先随机选取样品进行预实验，以确保在最低的循环数中绝大多数的样品能够扩增出浓度合适的产物，为所有样品的正式试验做充分准备。

在预实验完成后，PCR正式试验采用TransGen AP221-32：TransStart FastpfuDNA Polymerase，20μl反应体系：5×FastPfu Buffer 4μl、2.5mM dNTPs 2μl、ForwardPrimer(5μM)0.8μl、Reverse Primer(5μM)0.8μl、FastPfu Polymerase 0.4μl、BSA 0.2μl、Template DNA 10ng混合后补ddH₂O至20μl。

iTS可变区扩增和检测，用iTS引物模板进行qPCR扩增实验，在预实验完成后，PCR正式试验采用TaKaRa rTaq DNA Polymerase，20μl反应体系：10×Buffer 2μl，2.5mMdNTPs 2μl，Forward Primer(5μM)0.8μl，Reverse Primer(5μM)0.8μl，rTaq Polymerase0.2μl，BSA 0.2μl，Template DNA 10ng。

将3μlPCR产物上样至质量百分浓度为2％的琼脂糖凝胶，电泳检测得到微生物总DNA的质量，电泳电压为120V，电泳时间为20min。

正式反应应用PCR仪：ABI

9700型，PCR反应参数：a.1×(3minutes at95℃)，b.循环数×(95℃ 30秒；退火温度30秒；72℃ 45秒)，c.72℃ 10分钟，10℃直至反应终止。

根据图3和图4，比较S1-S6的胶图，均能提取并扩增出符合上机测序质量要求的真菌iTS和细菌16SrDNA，其中样品S1-S4的DNA扩增后胶图亮度类似，DNA浓度也基本一致，显示在一定pH、冲洗压力范围内，调整冲洗液pH，适当增加冲洗体积或减小冲洗压力均不会影响基质附着生物膜中微生物的DNA提取效果。S5的iTS条带亮度较强，DNA浓度更高，显示在适宜条件下，提高冲洗压力，可能会一定程度上增强生物膜中微生物，特别是真菌界微生物的DNA提取效果；与之相反，S6的真菌iTS和细菌16SrDNA条带亮度均较弱，DNA浓度低，表明冲洗压力不足时，获得的微生物生物质总量可能无法提取出足量的DNA。因此，在保证一定冲洗液冲洗体积和适宜pH值的条件下，冲洗压力在一定范围内满足DNA提取的需要，但是，应该注意的是，增加冲洗压力可能导致基质中其他杂质随冲洗液进入后续提取过程的量大为增加，使后处理步骤更为复杂，反而不利于获得高质量的DNA样品，因此应保持合适的水压进行冲洗。

实施例2

为了适应更精准的采样需要，本发明的装置中所述第一负压管路5的开放端可以可连接不同形状的端口以适应不同实际情况，如图2所示，可以将开放端通过连接锥形的端口以保证不同条件下冲洗后溅射出的混悬洗脱液能够更完整的被收集。

本实施例同时提供了利用本实施例的装置的DNA提取方法，所述方法针对如中国专利公开号为CN109569270B中描述的一种烟气脱硫脱氮生物膜填料塔的超强酸性循环液条件下填料内部附着的细菌总DNA和16S rDNA的提取和测定，同时对真菌总DNA提取和iTS的进行提取和测定，其步骤如下：

步骤一、功能菌群样品的收集：从同步脱硫脱氮的生物膜填料塔中，取约0.5L微生物生长状态良好的高聚耐酸塑料填料置于1L的烧杯中，本实施例中塑料填料的直径为约50mm，堆积密度500kg/m³，比表面积～700m²/m³，孔隙率75％，用物理手段破开填料表面，暴露内部多孔表面。将配制好的pH＝4的磷酸-磷酸二氢钾/邻苯二甲酸氢钾/醋酸-醋酸钾缓冲溶液80mL(视破开的表面数量和面积决定冲洗体积)装入缓冲液容器1中，利用控压冲洗装置2控制出水压力，采用60MPa的压力冲洗填料，将附着在填料上的菌体冲洗下来，并从极端酸性条件下过渡到中度酸性条件。将填料从烧杯中取出，将菌悬液倒入50mL离心管中，用6,000×g的转速离心5分钟，直至菌悬液全部离心完，获得样品I1；

取同一层的生物膜长势良好的填料相同量，重复以上操作，仅调整磷酸缓冲液pH值为5.5，获得样品，I2；保持缓冲液冲洗体积不变，仅调整冲洗体积为300mL磷酸缓冲液，获得样品I3；重复I1同样操作，调整冲洗压力，采用30MPa反复冲洗，将生物膜完全剥离，获得样品I4；重复I1同样操作，采用120MPa冲洗压力，获得样品I5；重复I1同样操作，采用15MPa冲洗压力，获得样品I6。

后续步骤同实施例1。根据图3和图4可知，I1采样的冲洗体积及水压、对应的冲洗时间较为适宜，因此获得的iTS和16S rDNA提取效果均较好；I2的iTS和16S rDNA胶图亮度和浓度均较I1更低，说明提取液pH值和基质生物膜原环境中相差较大时，易造成冲洗脱膜微生物的死亡，导致DNA的降解，影响提取效果；I3和I4的结果和I1较为类似，显示冲洗压力达到适宜值后，不会显著改善填料内部生物膜DNA的提取效果；I5的iTS和16S rDNA提取效果较其他样品均改善，显示增强冲洗压力会改善填料内部生物膜DNA的提取效果，这可能是由于填料内部结构较外表面复杂，增加冲洗压力能够有效穿透内部网络结构，改善提取效果；I6提取效果较差的原因和S6类似，显示冲洗压力过低时，冲洗液难以冲下足够量的微生物，导致生物膜DNA提取量的不足和代表性变差。

实施例3

本实施例采用实施例1的装置针对一种脱氮生物膜填料反应器中填料表面附着的真菌总DNA的进行提取，其步骤如下：

步骤一、功能菌群样品的收集：从填充有陶粒填料的脱氮生物膜滤池中，取约0.5L微生物生长状态良好的陶粒填料置于1L的烧杯中，本实施例中陶粒填料的直径为10～30mm，堆积密度300kg/m³，比表面积230～300m²/m³，孔隙率53％。将配制好的pH＝7的磷酸缓冲溶液100mL装入水压容器中，采用60MPa的压力冲洗填料，将附着在填料上的菌体冲洗下来，进入离心管。将含微生物混悬液的50mL离心管2支先后自装置上取下，用5,000×g的转速离心2分钟，直至菌悬液全部离心完。获得样品N1，取同一层的生物膜长势良好的填料相同量，重复以上操作，调整冲洗时间和冲洗体积，采用120MPa冲洗，将生物膜从填料表面完全剥离，获得样品N2，采用15MPa水压，冲洗填料表面获得样品N3。

后续步骤同实施例1。根据图5和图6可知，N1采样的冲洗体积及水压、对应的冲洗时间较为适宜，DNA质量较高，且浓度较高，无论是针对真菌的iTS，还是针对细菌的16SrDNA扩增结果均较好，两者亮度无明显差异，符合后续检测需要；N2的结果与N1类似，显示在达到一定冲洗压力后，继续提高冲洗压力不会增加冲下微生物的生物量，也不会显著影响微生物的整体组成；N3的DNA浓度较N1、N2低，质量相对较差，扩增后，真菌iTS条带亮度明显弱于N1和N2，细菌16S rDNA条带亮度略亮于N1和N2，显示水压过低时，可能导致提取获得的样品代表性变差。因此，需设置适宜的冲洗压力。

对比例1

本实施例采用美国QIAGEN公司的强力土壤DNA提取试剂盒

DNAIsolation Kit异位提取极端酸性条件下的基因组DNA，其步骤如下：

1、从同步脱硫脱氮的生物膜填料塔中，取约0.5L微生物生长状态良好的陶粒填料置于1L的烧杯中，用反应器使用的循环营养液将填料浸没。将烧杯放在超声波清洗器中，冰浴，50kHz下以300W功率超声5min，把填料取出，将菌悬液倒入八根50mL离心管中，6000g离心5分钟，弃上清液，合并沉淀菌体，获得样品C1-1。延长超声时间至8min，获得样品C1-2，缩短超声时间至2分钟，获得样品C1-3。

2、在2ml Bead Solution Tubes里加入0.25g样品；

3、加入60μL C1溶液，倒置几次，或者轻微地短时漩涡混合。

4、将裂解管水平固定在涡旋仪固定夹上，(仪器型号13000-V1-24)。

5、最大速度漩涡10min。

6、将试管在10000g离心30s。

7、将上清液转移到另一支干净的2ml Collection Tube中。

8、在Collection Tube中加入250μL C2溶液，漩涡5s，4℃静置5min。

9、10000g离心1min。

10、为了避免聚集成团，将600μL上清液转移到另一只干净的2ml CollectionTube中。

11、加200μL C3溶液到上清液中，漩涡5s，4℃孵育5min。

12、10000g离心1min。

13、为了避免聚集成团，转移750μL上清液到干净的2ml Collection Tube中。

14、摇匀C4溶液，加12000μL到上清液中，涡旋5s。

15、转移675μL到MB Spin Column中，10000g离心1min，弃掉流出液。

16、重复14步两次，直到样品转移完毕。

17、加入500μL C5溶液，10000g离心30s。

18、弃掉流出液，再次10000g离心1min。

19、小心将MB Spin Column放到干净的2ml Collection Tube中，避免C5溶液溅到Column上。

20、加入100μL C6溶液到白色滤膜的中央，也可以使用无菌无DNA的PCR级别的超纯水代替。

21、室温10000g离心30s，弃掉MB Spin Column。DNA可以用于下游操作了。保存在-80℃冰箱中。

22、样品基因组DNA的检测：取提取的2微升DNA，使用微量紫外可见分光光度计，进行DNA含量测定，读取DNA浓度和260/280nm紫外OD值之比。再取4微升DNA，与1微升loadingbuffer混匀后，使用质量百分浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳检测得到微生物总DNA的质量，所使用的琼脂糖浓度为1％，电泳电压为120V，电泳时间为20min。

观察胶图可知3种预处理方法均无法提取出生物膜中真菌的DNA，可能是由于超声清洗法无法将与基质紧密结合的真菌该试剂盒针对DNA分子的专一性较差，260/280nm紫外OD值之比低于1.5，显示了严重的蛋白质污染。

对比例2

取同样量的填料重复对比例1所有步骤，仅将超声提取改为将烧杯置于摇床上100转/分钟震荡提取半个小时后将菌悬液离心处理，获得样品C2-1。

将震摇提取转速和时间改为150转/分1小时，获得样品C2-2；将震摇提取转速和时间改为50转/分15分钟，获得样品C2-3。

对比例3

本实施例采用SDS-CTAB的手提方法异位提取极端酸性条件下的基因组DNA，其步骤如下：

步骤一、功能菌群样品的收集：从同步脱硫脱氮的生物膜填料塔中，取约0.5L微生物生长状态良好的陶粒填料置于1L的烧杯中，用反应器使用的营养液将填料浸没。将烧杯放在超声波清洗器中，50kHz下300W超声5min，把填料取出来，将菌悬液倒入八只50mL离心管中，6000g离心5分钟，获得样品C3-1。延长超声时间至8min，获得样品C3-2，缩短超声时间至2分钟，获得样品C3-3。

步骤二、样品基因组DNA的提取：在步骤一收集菌体的离心管中加入1mL缓冲溶液(50mM Tris-HCl,pH＝8.0,50mM EDTA)悬浮菌体，加入1mg/mL(终浓度，下同)的溶菌酶液，37℃水浴30min并不是震荡摇匀；加入100μmL蛋白酶K、1.25％SDS和60mM的裂解液(2％Triton X-100，2.5mg/mL叠氮化钠，溶解于pH＝8.0的0.1mol/L Tris-HCl溶液中)，37℃水浴30min并不时震荡均匀；加入CTAB/NaCl溶液(终浓度为0.5％CTAB和50mM NaCl)，65℃水浴30min并不时震荡均匀；加入等体积24：1氯仿/异戊醇，混合均匀后冰浴5min，12,000×g离心5min，上清液转入新离心管并重复浸提数次；上清液转入新离心管后加入等体积异丙醇和1/10体积3M醋酸钠溶液，-20℃过夜；12,000×g离心5min，沉淀用预冷的70％乙醇洗涤两次，室温晾干，沉淀用50μL TE溶解。

步骤三、样品基因组DNA的检测：取步骤二得到的2微升DNA，使用微量紫外可见分光光度计，进行DNA含量测定，读取DNA浓度和260/280nm紫外OD值之比。再取4微升DNA，与1微升loading buffer混匀后，使用质量百分浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳检测得到微生物总DNA的质量，所使用的琼脂糖浓度为1％，电泳电压为120V，电泳时间为20min。

观察胶图和260/280nm紫外OD值之比，可以发现，除高速震荡法可以提取出部分降解为小片段的DNA分子外，其他两种方式都未能提取出DNA，且260/280nm紫外OD值之比<1.4，具有严重的蛋白质污染。

对比例4

本对比例采用液氮研磨法配合Takara植物基因组DNA提取试剂盒提取DNA；其具体操作步骤如下：

取实施例2中同样体积和微生物生长状态的高聚耐酸塑料填料0.5L，置于1L的烧杯中，用物理手段破开填料表面，暴露内部多孔表面。将含菌丝的填料移至预冷的研钵中加液氮后，用硬纸壳覆盖研钵，然后直接研磨至粉末状，中间加液氮3-4次。(1)将固体粉末收集在Microtube底部。(2)加入400μl的Extraction Solution1，剧烈振荡5秒钟。如果粉末仍滞留于Microtube底部，需用手指轻弹Microtube使其悬浮。(3)轻微离心，加入80μl的Extraction Solution2，剧烈振荡5秒钟。添加Extraction Solution2后产生白色沉淀，剧烈振荡后溶液呈白浊状态。手指轻弹Microtube使底部固体悬浮。(4)轻微离心，加入150μl的Extraction Solution3，剧烈振荡5秒钟，手指轻弹Microtube使底部粉末悬浮。(5)轻微离心2秒钟以内，于50℃温浴15分钟。(6)12,000rpm 4℃离心15分钟。(7)取上层水相移至新的1.5ml Microtube中，上层水冻结的固体粉末室温放置5分钟左右融解相约400μl。注意尽量不要混入水相以外的物质。(8)添加等量的异丙醇，轻柔混匀，轻微离心后、用PipetTip尖端将粉末按压Microtube底部10次左右(9)12,000rpm 4℃离心10分钟。加入ExtractionSolution1(10)弃上清，注意不要吸取沉淀。振荡仪振荡5秒，轻微离心注：沉淀有时肉眼看不见。(11)加入1ml 70％乙醇，清洗沉淀。加入Extraction Solution2(12)12,000rpm 4℃离心3分钟。振荡仪振荡5秒，轻微离心16.弃上清，注意不要吸取沉淀。加入ExtractionSolution3(13)沉淀干燥，加入适量TE Buffer(约20μl)溶解沉淀。振荡仪振荡5秒，轻微离心，50℃温浴15分钟，获得样品C4-1。

将步骤(1)-(4)改为剧烈震荡10秒，获得样品C4-2；剧烈震荡2秒，获得样品C4-3。

对比例5

本对比例采用高盐溶液作为提取溶剂，溶胀破裂菌体后提取DNA的方法提取DNA；其具体操作步骤如下：

取实例1中微生物生长状态良好的陶粒填料0.3L置于1L的烧杯中，加入0.6L DNA提取液(100mmol/L Tris,100mmol/L EDTA,100mmol/L Na₃PO₄,1.5mol/L NaCl,1％CTAB,pH8.0),2mL蛋白酶K(20mg/mL)和50mL溶菌酶(0.15mol/L NaCl,0.1mol/L EDTA,15mg/mL溶菌酶,pH 8.0),37℃水浴2h。加入0.1L 20％SDS,65℃水浴过夜。加入1/3倍体积饱和NaCl,剧烈振荡,12 000r/min离心10min。取上清,用等体积苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)和氯仿∶异戊醇(24∶1)各抽提1次,水相中加入等体积TE,再加0.6倍体积的异丙醇室温沉淀DNA 2h,12000r/min离心10min收集DNA沉淀,1mL 70％乙醇洗涤1次,用200μL TE溶解，获得样品C5-1。

37℃水浴时间改为4h，获得样品C5-2；改为30min，获得样品C5-3。

对比例6

本对比例采用反复冻融法，溶胀破裂菌体后提取DNA的方法提取DNA；其具体操作步骤如下：

从同步脱硫脱氮的生物膜填料塔中，取约0.3L微生物生长状态良好的陶粒填料置于1L的烧杯中，加入0.6L TENP缓冲液(50mmol/L Tris,20mmol/L EDTA,100mmol/L NaCl，0.01g/mL PVP,pH 10.0)，-70℃,65℃反复冻融3次，10 000r/min离心10min,取上清,将土样沉淀重悬于1.5mL的溶菌酶溶液(0.15mol/L NaCl,0.1mol/L EDTA,15mg/mL溶菌酶,pH8.0)中,37℃温浴2h后,加入1.5mL 10％SDS(0.1mol/L NaCl,0.5mol/L Tris,10％SDS,pH8.0),反复颠倒混匀10min,10 000r/min离心10min,取上清。混合2次上清,用等体积苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)和氯仿∶异戊醇(24∶1)各抽提1次,水相中加入40μL的3mol/L乙酸铵和3mL无水乙醇,-20℃沉淀DNA 1h,12 000r/min离心10min收集DNA沉淀,1mL 70％乙醇洗涤1次,用100μL TE溶解，获得样品C6-1。

反复冻融改为5次，获得样品C6-2；再改为2次，获得样品C6-3。

对比例7

本实施例采用CTAB冻融法原位提取极端酸性条件下的基因组DNA，其步骤如下：

步骤一、功能菌群样品的收集：从同步脱硫脱氮的生物膜填料塔中，取约0.5L微生物生长状态良好的陶粒填料置于1L的烧杯中，与缓冲液A(pH＝8.0,0.1M EDTA，0.1M Tris-HCl，1.5M NaCl，0.1M NaH₂PO₄和0.1M Na₂HPO₄)混合，55℃孵育20min，离去除上清后，加入3mL缓冲液A和溶菌酶37℃孵育1h，再经20mg/ml蛋白酶K与10％CTAB在37℃处理30min，然后加入浓度为20％的SDS，65℃裂解细胞2h，离心获得含DNA的上清液和沉淀，将上清转移至新的离心管中；在上述所得沉淀中加入3mL缓冲液B(pH＝8.0，0.1M EDTA，0.1M Tris-HCl，1.5M NaCl，0.1M NaH₂PO₄，0.1M Na₂HPO₄和1wt％CTAB)和浓度为20％的SDS混合、65℃水浴15min。然后80℃冷冻15min，65℃水浴5min，反复冻融三次后，离心取上清液，与上述所得上清液混合；加入等体积的苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提蛋白，加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提蛋白，再用0.6倍体积的异丙醇进行沉淀2h；将混合液加入到离心纯化柱中，经离心洗涤50μL TE溶液洗脱后收集离心管中液体，即基因组DNA溶液样品C7-1。我们采用了不同的蛋白酶K和溶菌酶的处理时间，以探究不同的蛋白酶K和溶菌酶处理时间对DNA提取的影响，延长一倍溶菌酶和蛋白酶K处理时间(2h和1h)，获得样品C7-2；缩短一半溶菌酶和蛋白酶K处理时间(30min和15min)，获得样品C7-3。

对比例8

本对比例采用棉签刮取法异位提取填料生物膜DNA。

从同步脱硫脱氮的生物膜填料塔中，取约0.5L微生物生长状态良好的陶粒填料置于1L的烧杯中，用DNA取样特制的棉签2根，自填料表面刮取生物膜，并将棉签头折断，放置于样品提取离心管中，①向离心套管内加入180μl裂解液，浸没棉签头，99℃裂解5分钟；②8000g离心2分钟，弃套管，加入吸附液1000μl，硅珠16μl，蜗旋后静置15分钟；③8000g离心1分钟，弃上清，加入800μl漂洗液，充分混匀后8000g离心1分钟，弃上清；④置于56℃金属浴上烘干沉淀物，后加入20μl洗脱液，充分混匀后置于56℃金属浴上洗脱15分钟；⑤16000g离心2分钟，取上清液为样品C8-1。

将采样棉签增加为3根，裂解液增加为270μl，其他操作同上，获得样品C8-2；棉签减少为1根，裂解液减少为90μl，其他操作同上，获得样品C8-3。

以上对比实施例部分获得16S rDNA条带，但除C5-2、C7-2、C8-2等少数几个，均较为模糊，亮度和DNA浓度显著低于实施例中获得的DNA，且均无法获得iTS条带，这表明以上方法提取获得的DNA代表性较差，对与基质结合紧密的物种几乎难以提取获得，不适宜用于生物膜中微生物群落结构和基因分布的整体研究。

对比例9

本实施例采用CTAB冻融法原位提取填料生物膜DNA，其步骤如下：

从实施例3填充有陶粒填料的脱氮生物膜滤池中，取约0.5L微生物生长状态良好的陶粒填料置于1L的烧杯中，冲洗液pH改为7.0，其余步骤同对比例7，获得样品C9-1、C9-2、C9-3。

图3为强酸性条件下实施例和对比例提取得到的微生物样品的DNA胶图；其中，图a为强酸环境下对比例1-9中提取真菌样品的iTS条带图，图b中包括实施例1-2提取真菌样品的iTS条带图和对比例1-4的细菌样品的16S rDNA条带图，图c为对比例5-9的细菌样品和实施例1-2的细菌样品的16S rDNA条带图。图3中，DL2000表示为Marker，CK为空白。

对比例10

本对比例采用棉签刮取法异位提取填料生物膜DNA，其步骤如下：

从实施例3填充有陶粒填料的脱氮生物膜滤池中，取约0.5L微生物生长状态良好的陶粒填料置于1L的烧杯中，冲洗液pH改为7.0，其余步骤同对比例8，获得样品C10-1、C10-2、C10-3。

图5为中性条件下实施例3和对比例10提取得到的微生物样品(包括细菌和真菌)的DNA浓度对比图；图5中，DL2000表示为Marker，CK为空白。

以上两种方法提取获得的DNA样品扩增后，真菌iTS只有C10-1有模糊条带，其他样品的条带几乎完全不可见，体现这两种方法几乎无法提取获得真菌DNA，而虽然除C10-1外其他样品的16S rDNA条带均亮度较强，但是C10-1几乎无法看到16S rDNA的条带。因此这两种方法即使在中性偏碱条件下提取获得的DNA代表性依然较差，特别是棉签刮取法，由于生物膜存在自基质向棉签转移，并再次溶解至提取液的两次过程，因此重现性较差，提取得到的微生物代表性不佳，不适宜于研究基质附着生物膜中微生物的群落结构。

以上内容是结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，不能认定本发明具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的构思的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明所提交的权利要求书确定的保护范围。

Claims (9)

1.一种提取基质附着微生物总DNA的装置，其特征在于：包括控压冲洗装置（2）、负压装置和收集装置（8），所述控压冲洗装置（2）的出液端口处设有冲洗管路（3），所述的负压装置包括负压管路和负压泵（9），所述收集装置（8）分别与负压管路和负压泵（9）相连通，所述的控压冲洗装置（2）用于控制冲洗管路（3）的出水水压，所述的负压管路通过负压泵（9）将冲洗管路（3）冲洗微生物附着基质（4）产生的液体抽吸至收集装置（8）；所述负压泵（9）为防水泵，所述负压管路包括第一负压管路（5）和第二负压管路（6），所述第一负压管路（5）的一端与控压冲洗装置（2）密封连接，其另一端设置为开放端；所述冲洗管路（3）嵌套在第一负压管路（5）内部，且所述冲洗管路（3）的出水端位于第一负压管路（5）开放端的上部；所述第一负压管路（5）上设置开口并通过所述开口与第二负压管路（6）相连通，所述的第二负压管路（6）与收集装置（8）相连通。

2.根据权利要求1所述的提取基质附着微生物总DNA的装置，其特征在于：所述装置还包括杂质脱除装置（7），所述的杂质脱除装置（7）分别与第二负压管路（6）和收集装置（8）相连通，所述杂质脱除装置（7）用于去除较大的固体颗粒。

3.根据权利要求2所述的提取基质附着微生物总DNA的装置，其特征在于：所述开放端可连接不同形状的端口以适应不同实际情况的采样需要，所述的冲洗管路（3）可控制冲洗液散射直径为（1~3）±0.3mm。

4.一种提取基质附着微生物总DNA的方法，其特征在于：所述方法利用权利要求1~3任意一项所述的提取基质附着微生物总DNA的装置进行DNA提取，所述方法包括以下步骤：

1）首先使负压装置运行，再利用控压冲洗装置（2）控制冲洗管路（3）的出水水压，使缓冲液A在加压条件下冲洗微生物附着基质（4）；

2）冲洗后溅射出的含微生物的混悬洗脱液通过负压管路收集至收集装置（8）；

3）将收集装置（8）中的液体离心，收集菌体样品；采用缓冲液B洗涤所述菌体样品，再次离心收集，提取总DNA。

5.根据权利要求4所述的提取基质附着微生物总DNA的方法，其特征在于：所述加压条件下的水压范围为30~120 MPa。

6.根据权利要求4或5所述的提取基质附着微生物总DNA的方法，其特征在于：所述步骤1）中的缓冲液A为pH=3.5~9.5的等渗缓冲液，所述缓冲液B为pH = 7 ~ 7.5的PBS缓冲溶液，所述缓冲液B中含有 50 ~ 100 mM Tris-HCl 以及 50 ~ 100 mM EDTA。

7.根据权利要求6所述的提取基质附着微生物总DNA的方法，其特征在于：所述步骤3）中的离心条件为：离心速度为5000 g，离心时间2分钟，离心温度4℃。

8.根据权利要求7所述的提取基质附着微生物总DNA的方法，其特征在于：所述缓冲液B的洗涤次数为2 ~ 3次，每次洗涤所用体积为20~50mL，所述步骤3）中提取总DNA的方法包括冻融法或超声法。

9.根据权利要求8所述的提取基质附着微生物总DNA的方法，其特征在于：提取结束后，需将第一负压管路（5）的开放端插入装有缓冲液A的烧杯中，开启负压，冲洗第一负压管路（5），洗去管路中残留的微生物，弃去冲洗液后开负压空抽，排空管路，以避免前次样品污染后续样品；如长期放置，需再以浓度75%及以上的乙醇冲洗管路，待乙醇自然挥干后，密封放置。

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