JP6767992B2 - グアニジン官能化パーライト粒子、この粒子を含有する物品、並びにこの粒子及び物品の使用方法 - Google Patents
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Description
本開示は、グアニジン官能化パーライト粒子、不織布物品、積層物品、並びに流体試料中の微生物を検出するためなどの粒子、不織布物品、及び積層物品の使用方法に関する。
存在する微生物の同定及び/又は定量測定を行うために、様々な医療、食品、環境、又はその他の試料中における、細菌又は他の微生物の存在を検定することが、望ましい又は必要であることが多い。例えば、たとえ他の細菌の存在下であっても、特定の細菌種の存在又は不在を検査するために、細菌DNA又は細菌RNAの検査を行うことができる。しかしながら、特定の細菌の存在を検出する能力は、少なくとも部分的に、分析される試料中の細菌の濃度に依存する。試料中の細菌を濃縮することで、培養時間を短縮することができ、培養の工程の必要を排除することすら可能になる。よって、菌株に特異的な抗体を使用することによって、特定の細菌株を分離する(及びこれにより濃縮する)ための方法が(例えば、抗体をコーティングした磁石又は非磁石粒子の形態で)開発されている。しかしながら、このような方法は高価になり、少なくとも一部の診断用途に望まれる方法よりも依然としてやや遅い傾向がある。微生物の非特異的な濃縮又は捕捉は、炭水化物とレクチンタンパク質との相互作用に基づいた方法によって達成されている。様々な無機物質(例えば、ヒドロキシアパタイト及び金属水酸化物)もまた、細菌に非特異的に結合しこれを濃縮するために使用されている。このような非特異的濃縮法は、速度、費用、試料要件、空間要件、使いやすさ、現場使用の適格性、及び/又は有効性が異なる。
グアニジン官能化パーライト粒子並びに粒子を含む不織布物品及び積層物品が提供され、これらは流体試料中の微生物及び/又は細胞検体を検出するために使用できる。
グアニジン官能化パーライト粒子、粒子を含む不織布物品及び積層物品、並びに流体試料の微生物含有量の迅速な監視方法が提供される。グアニジン官能化粒子によって、少なくとも1種類の微生物又は標的細胞検体を濃縮し、結合した微生物又は標的細胞検体の検出を可能にする。グアニジン官能化粒子、不織布物品及び積層物品は、大量の流体試料と接触して微生物及び/又は標的細胞検体を濃縮でき、また検出前に汚染物質を除去するための更なる所望による洗浄も可能となる。
本開示に係る方法は、約15分で流体試料中の細菌汚染を迅速に検出できる。
したがって、グアニジン官能化粒子、不織布物品、積層物品及び方法は、流体試料中の微生物及び標的細胞検体の現場での検出に好適であり得る。
明細書及び特許請求の範囲の全体を通して特定の用語が使用されており、大部分は周知であるが、いくらか説明を必要とするものもある。本明細書で使用される場合、以下のように理解すべきである。
X3−nRa nSi−Y−G 式1
X3Si−Y−G 式2
X3−nRa nSi−Y−NH2 式5
反応スキームIIにおいて、O−メチルイソ尿素は、ヘミ硫酸塩として提供され、(メタノール中の)3−アミノプロピルトリメトキシシランと反応して、グアニジン基を形成する(グアニジン基及び会合する対イオンであるヘミサルフェートの荷電状態は、反応スキームIIに示されていない点に留意されたい。)。
X3−nRa nSi−Y−G
[式中、
nは、0、1、又は2であり、
各Raは、存在する場合には、独立してアルキル、アラルキル、又はアリールであり、
Yは、2〜20個の炭素原子を有するアルキレンを含む2価の基であり、
Gは、式−NH−C(=NH)−NH2で表されるグアニジン基であり、
各Xは、独立してアルコキシ又はアシルオキシである。]を有する少なくとも1個のシランによって修飾されたパーライト粒子を含む、実施形態1〜15のいずれか1つに記載の不織布物品である。
X3−nRa nSi−Y−G
[式中、
nは、0、1、又は2であり、
各Raは、存在する場合には、独立してアルキル、アラルキル、又はアリールであり、
Yは、2〜20個の炭素原子を有するアルキレンを含む2価の基であり、
Gは、式−NH−C(=NH)−NH2で表されるグアニジン基であり、
各Xは、独立してアルコキシ又はアシルオキシである。]を有する少なくとも1個のシランによって修飾されたパーライト粒子を含グアニジン官能化パーライト粒子である。
実施例1
無水メタノール(85mL)に溶解させた3−アミノプロピルトリメトキシシラン(17.9g、100mmol)溶液を、O−メチルイソ尿素ヘミ硫酸塩(12.3g、50mmol)で処理した。反応混合物を、一晩、窒素雰囲気下で撹拌した。この溶液の一部分(50g)を500mL丸底フラスコに移し、200mLの無水メタノールで希釈した。次に、パーライト4106粒子(50g)をフラスコに加え、脱イオン水(0.9mL、50mmol)を添加した。混合物を、3日間素早く撹拌し、トリメトキシシランと粒子との反応を促した。得られたグアニジン官能化パーライト粒子を、濾過により単離し、メタノール、水の順ですすぎ、空気乾燥させておいた。次に、真空オーブン中、70℃にて一晩、粒子を乾燥させた。ECSAで測定したときの窒素濃度%は下表1に示す。
実施例2
(実施例1の)グアニジン官能化パーライト粉末及び未処理パーライト(比較例1、CE1)のそれぞれ12mgずつを、キュベットに等分した。各試料1ミリリットル当たりが約3000RLUのATPシグナルを含む(水1ミリリットル当たり約7マイクロリットルのATP標準液)ように、ATP標準液を含有するATP添加水試料ストックを調製した。キュベットチューブには、1ミリリットルの添加試料を加え、チューブに蓋をし、チューブを10分間、14サイクル/分で回転台(Thermolyne VARI MIX rocking platform(Barnstead International,Iowa))に設置した。次にチューブを試験管立てに置き、10分間、粉末を沈殿させた。上澄み試料を別のキュベットへと取り除き、そのうちの100マイクロリットルを取り、ATPアッセイを試験した。
%ATP捕捉=(沈殿した粉末のRLU/1mLの添加試料のRLU)×100
結果を以下の表2に報告する。
実施例3及び4
下表3に示すような異なる量の繊維1、繊維2、繊維3、及び繊維4を混合することにより、2つの繊維プレミックスを調製した。4Lのブレンダ(VWR(Radnor,PA)より「WARING COMMERCIAL HEAVY DUTY BLENDER、モデル37BL84」の商品名で販売されるもの)中で、繊維を3リットルの冷たい脱イオン水に加え、低速で30秒間ブレンドした。この混合物を塊(nit)又は凝集(clump)のない均一な繊維分散体となっているかどうかについて検査した。実施例1からのグアニジン官能化パーライト粒子に更に1リットルの脱イオン水を加えて、低速で15秒間混合した。
大腸菌(ATCC51813、グラム陰性微生物)の画線培養から1つのコロニーを10mLのTSB(Difcoからのトリプチックソイブロス、3重量%)に播種し、37℃で約20時間、一晩インキュベートした。得られた細菌ストックは、約1×109cfu/mLを含んでいた。このストックは順次、脱イオン水で希釈し、1×105cfu/mLの作業ストックを作製した。
%捕捉効率=(試験用繊維性多孔質マトリックスディスクのRLU/100%対照のRLU)×100
比較例3
ケイソウ土粒子50gを実施例1に係る上記の方法に従ってグアニル化したが、ただし、(50gの部分ではなく)反応混合物溶液の48gの部分を500mL丸底フラスコに移し、200mLの無水メタノールで希釈した。真空オーブン中、70℃にて一晩、粒子を乾燥させ、47gのグアニジン官能化ケイソウ土を得た。ECSAで測定したときの窒素濃度%は下表6に示す。
比較例3(CE3)のグアニジン官能化ケイソウ土(DE)粉末及び未処理DE粉末(比較例4、CE4)のそれぞれ12mgずつを、キュベットに等分した。各試料1mL当たりが約3000RLUのATPシグナルを含む(水1mL当たり約32マイクロリットルのATP標準液)ように、ATP標準液を含有するATP添加水試料ストックを調製した。試験は上記の実施例2に記述するとおりに行った。平均総ATPシグナルは、試料1mL当たりのRLU単位で240×10=2400RLUであった。%ATP対照=(沈殿した粉末のRLU/1mLの添加試料のRLU)×100。その結果を下表7に示す。
実施例9及び10
パーライト476粒子及びパーライト4156粒子(それぞれ50g)を実施例1で上述されるようにグアニル化したが、ただし、(50gの部分ではなく)反応混合物溶液の48gを500mL丸底フラスコに移し、200mLの無水メタノールで希釈した。真空オーブン中、60℃にて一晩、粒子を乾燥させ、それぞれ49gのグアニジン官能化パーライト476粒子(実施例9)及びグアニジン官能化パーライト4156粒子(実施例10)を得た。ECSAで測定したときの窒素濃度%は下表8に示す。
実施例11及び12
グアニジン官能化パーライト476(実施例11)、未処理パーライト476(比較例5、CE5)、グアニジン官能化パーライト4156(実施例12)、及び未処理パーライト4156(比較例6、CE6)の粉末のそれぞれ12mgずつを、キュベットに等分した。各試料1mL当たりが約3000RLUのATPシグナルを含む(水1mL当たり約32マイクロリットルのATP標準液)ように、ATP標準液を含有するATP添加水試料ストックを調製した。試験は上記の実施例2に記述するとおりに行った。平均総ATPシグナルは、試料1mL当たりのRLU単位で240×10=2400RLUであった。%ATP対照=(沈殿した粉末のRLU/1mLの添加試料のRLU)×100。その結果を下表9に示す。
随伴水試料はカナダの油井から入手した。試料は、BBL緩衝液で順次希釈され、PACプレートで1mLずつ培養した。製造業者の説明書に従って、プレートを37℃で48時間インキュベートした。3M PETRIFILMプレートリーダを使用して、プレートの細菌数を分析した。各試料の100マイクロリットルの量をキュベットに加え、145マイクロリットルのCLEAN−TRACE Water−Plus総ATP抽出剤と混合し、10秒間ボルテックスした。450マイクロリットルの量のCLEAN−TRACE Water−Plus総ATP酵素を加え、10秒間混合した。アダプタを使用して(実施例5及び6に関して上述される)、キュベットをNGルミノメータに挿入し、ATPシグナルを測定した。
実施例1のグアニジン官能化粒子の平均細孔径未満の平均細孔径を有するスパンボンド基材を、清浄な実験台に平らに置く。基材上の16mm直径の円形領域をマークする。実施例1の物質の15mgアリコートを量り分け、マークした領域に置く。これを3回繰り返し、3つの複製試料を作製する。もう1枚のスパンボンド基材のシートを、量り分けた粉末のある領域上に平らに置く。上部のシートを注意深く偏平にする。マークした領域は、BRANSON 2000d ULTRASONIC WELDERを使用して超音波溶着する。超音波ホーンは、18mmの外径及び16mmの内径を有する。溶着は、250ジュールの設定にて平坦なアルミニウムプレートで行う。
Claims (10)
- 以下の式、
X3−nRa nSi−Y−G
[式中、
nは、0、1、又は2であり、
各Raは、存在する場合には、独立してアルキル、アラルキル、又はアリールであり、
Yは、2〜20個の炭素原子を有するアルキレンを含む2価の基であり、
Gは、式−NH−C(=NH)−NH2で表されるグアニジン基であり、
各Xは、独立してアルコキシ又はアシルオキシである。]
を有する少なくとも1個のシランによって修飾されたパーライト粒子を含むグアニジン官能化パーライト粒子。 - X線光電子分光法(XPS)によって測定した場合、少なくとも2原子パーセントの表面窒素濃度を有する、請求項1に記載のグアニジン官能化パーライト粒子。
- a)繊維性多孔質マトリックスと、b)前記繊維性多孔質マトリックス内に捕らえられた複数のグアニジン官能化パーライト粒子と、を含み、
複数の前記グアニジン官能化パーライト粒子が、以下の式、
X 3−n R a n Si−Y−G
[式中、
nは、0、1、又は2であり、
各R a は、存在する場合には、独立してアルキル、アラルキル、又はアリールであり、
Yは、2〜20個の炭素原子を有するアルキレンを含む2価の基であり、
Gは、式−NH−C(=NH)−NH 2 で表されるグアニジン基であり、
各Xは、独立してアルコキシ又はアシルオキシである。]
を有する少なくとも1個のシランによって修飾されたパーライト粒子を含む、不織布物品。 - 前記繊維性多孔質マトリックスがポリマー繊維及び無機繊維を含む不織繊維層である、請求項3に記載の不織布物品。
- 前記繊維性多孔質マトリックスが捲縮していないポリマー繊維を含む不織繊維層である、請求項3又は4に記載の不織布物品。
- a.第1の基材と、
b.前記第1の基材の外周の少なくとも一部に沿って前記第1の基材に封止された第2の基材と、
c.前記第1の基材と前記第2の基材との間に配置された複数のグアニジン官能化パーライト粒子と、を含み、
複数の前記グアニジン官能化パーライト粒子が、以下の式、
X 3−n R a n Si−Y−G
[式中、
nは、0、1、又は2であり、
各R a は、存在する場合には、独立してアルキル、アラルキル、又はアリールであり、
Yは、2〜20個の炭素原子を有するアルキレンを含む2価の基であり、
Gは、式−NH−C(=NH)−NH 2 で表されるグアニジン基であり、
各Xは、独立してアルコキシ又はアシルオキシである。]
を有する少なくとも1個のシランによって修飾されたパーライト粒子を含む、積層物品。 - a)請求項6に記載の積層物品を準備する工程と、
b)少なくとも1種類の微生物株又は標的細胞検体を含有すると疑われる流体試料を準備する工程と、
c)前記少なくとも1種類の微生物株又は標的細胞検体の少なくとも一部分が前記積層物品に結合するように前記流体試料を前記積層物品と接触させる工程と、
d)前記少なくとも1種類の結合した微生物株又は結合した標的細胞検体の存在を検出する工程と、
を含む、流体試料中の微生物又は標的細胞検体を検出する方法。 - a)請求項1又は2に記載の複数のグアニジン官能化パーライト粒子を準備する工程と、
b)少なくとも1種類の微生物株又は標的細胞検体を含有すると疑われる流体試料を準備する工程と、
c)前記少なくとも1種類の微生物株又は標的細胞検体の少なくとも一部分が前記グアニジン官能化パーライト粒子に結合するように前記流体試料を前記複数のグアニジン官能化パーライト粒子と接触させる工程と、
d)前記少なくとも1種類の結合した微生物株又は結合した標的細胞検体の存在を検出する工程と、
を含む、流体試料中の微生物又は標的細胞検体を検出する方法。 - 前記結合した標的細胞検体が、核酸、タンパク質、細胞壁成分、ATP、又はこれらの組み合わせを含む、請求項7又は8に記載の方法。
- 前記接触させる工程が、前記流体試料を、4.0ポンド/平方インチ(psi)(27.58キロパスカル(kPa))以下の圧力で前記積層物品に通過させる工程を含む、請求項7に記載の方法。
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