CN104155253B - 一种快速检测生物表面活性剂产量的方法 - Google Patents

一种快速检测生物表面活性剂产量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速检测生物表面活性剂产量的方法，该方法包括以下步骤：培养微生物，得到微生物发酵液；制备上清液；测定吸光光度值A640和A550；根据吸光值的变化计算比色响应值；通过建立生物表面活性剂浓度与比色响应值的标准曲线，即可由发酵样品的比色响应值定量生物表面活性剂的产量，确定生物表面活性剂的产量。本发明比色过程可于酶标仪的酶标板内进行，试剂用量少，成本低，检测速度快、数量多，有效地提高了检测效率。可广泛地应用于生物表面活性剂检测领域中。

Description

一种快速检测生物表面活性剂产量的方法
技术领域
本发明涉及一种生物表面活性剂的检测方法，属于生物技术领域，具体涉及到一种快速检测生物表面活性剂产量的方法。
背景技术
生物表面活性剂(Biosurfactants，简称BS)是指微生物(多数是细菌、酵母菌、真菌)在一定条件下培养时，代谢合成的一种次级代谢产物，是集极性亲水基和非极性疏水基结构于一身的两亲化合物，能够显著降低表面张力和界面张力，促进原油的乳化和分散。与化学表面活性剂相比，其具有特异性强、高效、低毒、不污染环境等优点。
目前已有的生物表面活性剂检测方法有两种：一种是高效液相色谱法，该方法能够较为准确分析发酵样品中的生物表面活性剂含量，但需要高纯度的标品，一般实验室条件下不容易获得，且测试成本高、周期长；另一种是利用界面张力与表面活性剂浓度之间的关系来定量表面活性剂的方法，这种方法通常是经验性的，不能排除发酵液中其他具有表面活性的非目标产物对分析结果的影响，因此，该方法测试结果的准确性不高。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足而提供一种快速检测生物表面活性剂产量的方法，该方法具有操作简单、耗时短、效率高和成本低的特点。
一种快速检测生物表面活性剂产量的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)培养微生物
将产生物表面活性剂的菌种在发酵培养基中培养，接种量为2％～5％(V/V)，培养温度30℃～37℃，转速180～200rpm，培养时间24～48h，得到微生物发酵液。
(2)制备上清液
将1.5mL上述发酵液5000rpm离心5min，14000rpm离心5min，取300uL上清液加入2mL离心管，然后加1.2mL甲醇，5000rpm离心5min，14000rpm离心5min，用1mL针管取上清液过0.45um有机滤膜，得到上清液。
(3)测定吸光光度值
取75uL菌液上清和150uL聚联乙炔囊泡溶液于2mL离心管中，25-30℃水浴中反应10min，然后加到96孔板中，用酶标仪分别检测640nm和550nm的吸光值，即A640和A550。
(4)计算比色响应值
计算比色响应值CR％，计算公式为：
CR％＝[(PB0-PBf)/PB0]×100％
其中：PB＝A640/(A640+A550)；
PB0是囊泡颜色改变前的值；
PBf是外界刺激体系颜色发生改变后的值。
(5)确定生物表面活性剂的产量
取生物表面活性剂标品配制成浓度为1g/L的母液，分别稀释到50、100、150、200、250、300、400、500mg/L，分别取75uL各浓度溶液于2mL离心管中，再加入150uL聚联乙炔囊泡溶液，25-30℃水浴中反应10min，然后加到96孔板中，用酶标仪分别检测640nm和550nm的吸光值，计算比色响应值CR％，以CR％值为纵坐标，表面活性剂浓度为横坐标，通过线性回归处理得到标准曲线，发酵样品取三份平行样分别测定吸光值，按照公式计算比色响应值CR％，最终求得比色响应值的平均值，代入标准曲线方程即可得到发酵液中生物表面活性剂的产量。
所述的发酵培养基组成为葡萄糖3g/L、蛋白胨3g/L、酵母粉3g/L、磷酸氢二钾2.7g/L、氯化钠5g/L。
所述的聚联乙炔囊泡的合成方法是：称取0.1g 10,12-二十五碳二炔酸溶于1mL氯仿中；振荡待其完全溶解后用0.45um有机滤膜过滤，得到的溶液放入50mL磨口三角瓶中，40℃下旋转蒸干，避光放置；再用50mL、pH7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液溶解，90℃水浴中预热10min，70℃下超声15min，转至用锡纸包裹的50mL离心管中，在4℃冰箱中静置12h，然后在波长254nm的紫外灯下聚合3min，得到聚联乙炔囊泡溶液。
所述的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液，其配制方法为称取2.383g 4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶解在400mL蒸馏水中，加入0.5～1.0mol/L氢氧化钠调pH7.4，定容至500mL，4℃保存即获得4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液。
本发明优点及有益效果如下：
(1)本发明检测试剂用量少、成本低，检测1000个发酵液样品，只需要0.3g10，12-二十五碳二炔酸来合成聚联乙炔囊泡，成本低于300元。
(2)本发明利用酶标仪对样品进行检测，操作简便，检测速度快、数量多，一次可检测48或96个样品，96孔板检测一次用时小于30s，有效地提高了检测效率。
附图说明
图1为生物表面活性剂浓度与比色响应值的标准曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细的描述：
实施例1：
利用本发明对产生物表面活性剂菌Bacillus subtilis SL-2的产量检测，具体步骤如下：
(1)培养微生物
将产生物表面活性剂菌Bacillus subtilis SL-2在发酵培养基中培养，接种量为2％(V/V)，培养温度37℃，转速200rpm，培养时间48h，得到微生物发酵液。发酵培养基组成为葡萄糖3g/L，蛋白胨3g/L，酵母粉3g/L，磷酸氢二钾2.7g/L，氯化钠5g/L。
(2)制备上清液
将1.5mL发酵液5000rpm离心5min，14000rpm离心5min，取300uL上清液加入2mL离心管，然后加1.2mL甲醇，5000rpm离心5min，14000rpm离心5min，用1mL针管取上清液过0.45um有机滤膜，获得上清液。
(3)测定吸光光度值
合成聚联乙炔囊泡：称取0.1g 10,12-二十五碳二炔酸溶于1mL氯仿中；振荡待其完全溶解后用0.45um有机滤膜过滤，得到的溶液放入50mL磨口三角瓶中，40℃下旋转蒸干，避光放置；再用50mL、pH7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液溶解，90℃水浴中预热10min，70℃下超声15min，转至用锡纸包裹的50mL离心管中，在4℃冰箱中静置12h，然后在波长254nm的紫外灯下聚合3min，得到聚联乙炔囊泡溶液。
配制4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液：称取2.383g的4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶解在400mL蒸馏水中，加入0.5-1.0mol/L氢氧化钠调pH7.4，定容至500mL，4℃保存即获得HEPES缓冲液。
取75uL菌液上清和150uL聚联乙炔囊泡溶液于2mL离心管中，同时再做两个平行样，25～30℃水浴中反应10min，然后加到96孔板中，用酶标仪分别检测640nm和550nm的吸光值，结果如下表所示。
(4)计算比色响应值
将上述吸光值代入下列公式计算比色响应值CR％：
CR％＝[(PB0-PBf)/PB0]×100％
其中：PB＝A640/(A640+A550)
PB0＝A640/(A640+A550)＝0.7333/(0.7333+0.4093)＝0.6417
PBf1＝A640/(A640+A550)＝0.1375/(0.1375+0.6035)＝0.1856
PBf2＝A640/(A640+A550)＝0.1144/(0.1144+0.5227)＝0.1796
PBf3＝A640/(A640+A550)＝0.1172/(0.1172+0.4916)＝0.1925
CR1％＝[(PB0-PBf1)/PB0]×100％
＝(0.6417-0.1856)/0.6417×100％＝71％
CR2％＝[(PB0-PBf2)/PB0]×100％
＝(0.6417-0.1796)/0.6417×100％＝72％
CR3％＝[(PB0-PBf3)/PB0]×100％
＝(0.6417-0.1925)/0.6417×100％＝70％
CR％＝(CR1％+CR2％+CR3％)/3＝71.0％
(5)生物表面活性剂产量的确定
根据已经建立的生物表面活性剂浓度和比色响应值CR％的标准曲线方程，见图1，把CR％＝71％代入方程计算得出：生物表面活性剂产量为360.4mg/L。
实施例2：
利用本发明对产生物表面活性剂菌Bacillus subtilis S-3的产量检测，具体步骤如下：
(1)培养微生物
将产生物表面活性剂菌Bacillus subtilis S-3在发酵培养基中培养，接种量为4％(V/V)，培养温度37℃，转速180rpm，培养时间48h，得到微生物发酵液。发酵培养基组成为葡萄糖3g/L，蛋白胨3g/L，酵母粉3g/L，磷酸氢二钾2.7g/L，氯化钠5g/L。
(2)制备上清液
1.5mL发酵液5000rpm离心5min，14000rpm离心5min，取300uL上清液加入2mL离心管，然后加1.2mL甲醇，5000rpm离心5min，14000rpm离心5min，用1mL针管取上清液过0.45um有机滤膜，所得上清液用于检测。
(3)测定吸光光度值
合成聚联乙炔囊泡：称取0.1g 10,12-二十五碳二炔酸溶于1mL氯仿中；振荡待其完全溶解后用0.45um有机滤膜过滤，得到的溶液放入50mL磨口三角瓶中，40℃下旋转蒸干，避光放置；再用50mL、pH7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液溶解，90℃水浴中预热10min，70℃下超声15min，转至用锡纸包裹的50mL离心管中，在4℃冰箱中静置12h，然后在波长254nm的紫外灯下聚合3min，得到聚联乙炔囊泡溶液。
配制4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液：称取2.383g的4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶解在400mL蒸馏水中，加入0.5～1.0mol/L氢氧化钠调pH7.4，定容至500mL，4℃保存即获得4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液。
取75uL菌液上清和150uL聚联乙炔囊泡溶液于2mL离心管中，同时再做两个平行样，25～30℃水浴中反应10min，然后加到96孔板中，用酶标仪分别检测640nm和550nm的吸光值，结果如下表所示。
(4)计算比色响应值
将上述吸光值代入下列公式计算比色响应值CR％：
CR％＝[(PB0-PBf)/PB0]×100％
其中：PB＝A640/(A640+A550)
PB0＝A640/(A640+A550)＝0.7333/(0.7333+0.4093)＝0.6417
PBf1＝A640/(A640+A550)＝0.2171/(0.2171+0.7490)＝0.2247
PBf2＝A640/(A640+A550)＝0.1842/(0.1842+0.5710)＝0.2439
PBf3＝A640/(A640+A550)＝0.2035/(0.2035+0.7306)＝0.2179
CR1％＝[(PB0-PBf1)/PB0]×100％
＝(0.6417-0.2247)/0.6417×100％＝65％
CR2％＝[(PB0-PBf2)/PB0]×100％
＝(0.6417-0.2439)/0.6417×100％＝62％
CR3％＝[(PB0-PBf3)/PB0]×100％
＝(0.6417-0.2179)/0.6417×100％＝66％
CR％＝(CR1％+CR2％+CR3％)/3＝64％
(5)生物表面活性剂产量的确定
根据已经建立的生物表面活性剂浓度和比色响应值CR％的标准曲线方程，见图1，把CR％＝64％入方程计算得出：生物表面活性剂产量为326.5mg/L。

Claims (4)

1.一种快速检测生物表面活性剂产量的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)培养微生物
将产生物表面活性剂的菌种在发酵培养基中培养，接种量为2％～5％(V/V)，培养温度30℃～37℃，转速180～200rpm，培养时间24～48h，得到微生物发酵液；
(2)制备上清液
将1.5mL上述发酵液5000rpm离心5min，14000rpm离心5min，取300uL上清液加入2mL离心管，然后加1.2mL甲醇，5000rpm离心5min，14000rpm离心5min，用1mL针管取上清液过0.45um有机滤膜，得到上清液；
(3)测定吸光光度值
取75uL上述上清液和150uL聚联乙炔囊泡溶液于2mL离心管中，25-30℃水浴中反应10min，然后加到96孔板中，用酶标仪分别检测640nm和550nm的吸光值，即A640和A550；
(4)计算比色响应值CR％
比色响应值CR％计算公式为：
CR％＝[(PB0-PBf)/PB0]×100％
其中：PB＝A640/(A640+A550)；
PB0是囊泡颜色改变前的值；
PBf是外界刺激体系颜色发生改变后的值；
(5)确定生物表面活性剂的产量
取生物表面活性剂标品配制成浓度为1g/L的母液，分别稀释到50、100、150、200、250、300、400、500mg/L，分别取75uL各浓度溶液于2mL离心管中，再加入150uL聚联乙炔囊泡溶液，25～30℃水浴中反应10min，然后加到96孔板中，用酶标仪分别检测640nm和550nm的吸光值，计算比色响应值CR％，以CR％值为纵坐标，表面活性剂浓度为横坐标，通过线性回归处理得到标准曲线，发酵样品取三份平行样分别测定吸光值，按照公式计算比色响应值CR％，最终求得比色响应值的平均值，代入标准曲线方程即可得到发酵液中生物表面活性剂的产量。
2.根据权利要求1所述的快速检测生物表面活性剂产量的方法，其特征在于，所述的发酵培养基组成为葡萄糖3g/L、蛋白胨3g/L、酵母粉3g/L、磷酸氢二钾2.7g/L、氯化钠5g/L。
3.根据权利要求1所述的快速检测生物表面活性剂产量的方法，其特征在于，所述的聚联乙炔囊泡，其合成方法为称取0.1g 10,12-二十五碳二炔酸溶于1mL氯仿中；振荡待其完全溶解后用0.45um有机滤膜过滤，得到的溶液放入50mL磨口三角瓶中，40℃下旋转蒸干，避光放置；再用50mL、pH7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液溶解，90℃水浴中预热10min，70℃下超声15min，转至用锡纸包裹的50mL离心管中，在4℃冰箱中静置12h，然后在波长254nm的紫外灯下聚合3min，得到聚联乙炔囊泡溶液。
4.根据权利要求3所述的快速检测生物表面活性剂产量的方法，其特征在于，所述4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液，其配制方法为称取2.383g的4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶解在400mL蒸馏水中，加入0.5～1.0mol/L氢氧化钠调pH7.4，定容至500mL，4℃保存即获得4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液。
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