JP2014503201A - 微生物濃縮プロセス及び装置 - Google Patents
微生物濃縮プロセス及び装置 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2014503201A JP2014503201A JP2013543216A JP2013543216A JP2014503201A JP 2014503201 A JP2014503201 A JP 2014503201A JP 2013543216 A JP2013543216 A JP 2013543216A JP 2013543216 A JP2013543216 A JP 2013543216A JP 2014503201 A JP2014503201 A JP 2014503201A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- particles
- sample
- fibrous nonwoven
- fibers
- porous fibrous
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/40—Concentrating samples
- G01N1/405—Concentrating samples by adsorption or absorption
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
- C12M47/02—Separating microorganisms from the culture medium; Concentration of biomass
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/24—Methods of sampling, or inoculating or spreading a sample; Methods of physically isolating an intact microorganisms
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/40—Concentrating samples
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56911—Bacteria
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/84—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving inorganic compounds or pH
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/40—Concentrating samples
- G01N1/4077—Concentrating samples by other techniques involving separation of suspended solids
- G01N2001/4088—Concentrating samples by other techniques involving separation of suspended solids filtration
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
- G01N2035/00465—Separating and mixing arrangements
- G01N2035/00475—Filters
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Filtering Materials (AREA)
- Sampling And Sample Adjustment (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
検出又は検定のために微生物を捕捉又は濃縮するプロセスは、(a)(1)多孔質繊維性不織布マトリックス、及び(2)金属ケイ酸塩を含み、多孔質繊維性不織布マトリックス中に捕らえられている、少なくとも1つの濃縮剤の複数の粒子、を含む濃縮デバイスを提供すること、(b)少なくとも1つの標的細胞検体を含む試料を提供すること、(c)少なくとも1つの標的細胞検体の少なくとも一部が、濃縮デバイスに結合される又は捕捉されるように、濃縮デバイスを試料と接触させること、並びに(d)少なくとも1つの結合した標的細胞検体の存在を検出すること、を含む。
【選択図】なし
【選択図】なし
Description
[分野]
本発明は、検出又は検査の際に生存状態を保つような微生物の捕捉又は濃縮のためのプロセスに関するものである。他の態様では、本発明は、また、このようなプロセスを実施するために用いられる濃縮デバイス(及びこのデバイスを含む診断キット)、及びデバイスを調製するための方法にも関する。
本発明は、検出又は検査の際に生存状態を保つような微生物の捕捉又は濃縮のためのプロセスに関するものである。他の態様では、本発明は、また、このようなプロセスを実施するために用いられる濃縮デバイス(及びこのデバイスを含む診断キット)、及びデバイスを調製するための方法にも関する。
[背景]
微生物汚染により生じる食品媒介疾患及び院内感染は、世界中の無数の場所で懸案となっている。よって、微生物の存在の同定及び/又は定量測定を行うために、様々な医療、食品、環境、又はその他の試料中における、細菌又は他の微生物の存在を検定することが、望ましい又は必要であることが多い。
微生物汚染により生じる食品媒介疾患及び院内感染は、世界中の無数の場所で懸案となっている。よって、微生物の存在の同定及び/又は定量測定を行うために、様々な医療、食品、環境、又はその他の試料中における、細菌又は他の微生物の存在を検定することが、望ましい又は必要であることが多い。
例えば、たとえ他の細菌の存在下であっても、特定の細菌種の存在又は不在を検査するために、細菌DNA又は細菌RNAの検査を行うことができる。しかしながら、特定の細菌の存在を検出する能力は、少なくとも部分的に、分析される試料中の細菌の濃度に依存する。細菌試料は、検出に十分な濃度を確保するため、試料中の細菌の数を増加させるために塗られる又は培養されるが、この培養工程はしばしば時間がかかり、よって評価結果を顕著に遅らせることがある。
試料中の細菌を濃縮することで、培養時間を短縮することができ、培養の工程の必要を排除することすら可能になる。よって、菌株に特異的な抗体を使用することによって、特定の細菌株を分離する(及びこれにより濃縮する)ための方法が(例えば、抗体をコーティングした磁石又は非磁石粒子の形態で)開発されている。しかしながら、このような方法は高価になり、少なくとも一部の診断用途に望まれる方法よりも依然としてやや遅い傾向がある。
菌株特異的でない濃縮方法も使用されている(例えば、試料に存在する微生物のより総合的な評価を得るため)。混合した微生物群を濃縮した後、望ましい場合は、菌株特異的な精査を用いることによって特定の菌株の存在を判定することができる。
微生物の非特異的な濃縮又は捕捉は、炭水化物とレクチンタンパク質との相互作用に基づいた方法によって達成されている。非特異的捕捉装置としてキトサンコーティングされた支持体が使用され、微生物の栄養素の役目を果たす物質(例えば、炭水化物、ビタミン、鉄キレート化合物、及びシデロフォア)が、微生物の非特異的捕捉を提供するための配位子として有用であることも記述されている。
様々な無機物質(例えばヒドロキシアパタイト及び金属水酸化物)が、細菌に非特異的に結合しこれを濃縮するために使用されている。非特異的な捕捉のためには、無機バインダーを使用する及び/又は使用しない、物理的な濃縮方法(例えば濾過、クロマトグラフィー、遠心分離、及び重力沈殿)も利用されている。このような非特異的濃縮方法は、速度(少なくとも一部の食品試験手順は主な培養増菌段階として少なくとも一夜インキュベーションをなお必要とする)、コスト(少なくとも一部は高価な装置、材料、及び/又は訓練された技能者を必要とする)、試料条件(例えば、試料の性状及び/又は容積制限)、スペースの条件、使用の容易さ(少なくとも一部は複雑な多段階のプロセスを必要とする)、現場使用への適性、及び/又は有効性の点で様々である。
[概要]
よって我々は、病原微生物を迅速に検出するためのプロセスに対する切迫したニーズがあると認識している。このようなプロセスは、迅速なだけでなく、低コストで、単純であり(複雑な機器又は手順の必要がない)、及び/又は様々な条件下(例えば、様々な種類の試料マトリックス及び/又は病原微生物、様々な微生物充填量、及び様々な試料容量)で有効であることが好ましい。
よって我々は、病原微生物を迅速に検出するためのプロセスに対する切迫したニーズがあると認識している。このようなプロセスは、迅速なだけでなく、低コストで、単純であり(複雑な機器又は手順の必要がない)、及び/又は様々な条件下(例えば、様々な種類の試料マトリックス及び/又は病原微生物、様々な微生物充填量、及び様々な試料容量)で有効であることが好ましい。
簡単に言えば、1つの態様において、本発明は、試料中に存在する微生物株(例えば細菌、真菌類、酵母、原生動物、ウイルス(非エンベロープ型ウイルス及びエンベロープ型ウイルスの両方を含む)、及び細菌内生胞子、の菌株)を非特異的に濃縮するプロセスを提供し、これにより1つ以上の株の検出又は検定を行えるよう微生物は生存能力があるままである。該プロセスは、(a)(1)多孔質繊維性不織布マトリックス、及び(2)金属ケイ酸塩を含み、多孔質繊維性不織布マトリックス中に捕らえられている、少なくとも1つの濃縮剤の複数の粒子、を含む濃縮デバイスを提供すること、(b)少なくとも1つの標的細胞検体(例えば、少なくとも1つの微生物株)を含む試料(好ましくは、流体の形態)を提供すること、(c)少なくとも1つの標的細胞検体の少なくとも一部が、濃縮デバイスに結合される又は捕捉されるように、濃縮デバイスを試料と接触させる(好ましくは、試料を濃縮デバイスに通すことによって)こと、並びに(d)少なくとも1つの結合した標的細胞検体の存在を検出すること、を含む。
このプロセスは、場合によっては、試料から濃縮デバイスを分離すること、及び/又は少なくとも1つの結合した標的細胞検体を培養により増菌すること(例えば、一般的又は選択的な微生物増菌が所望されるかどうかによって、一般的な又は微生物に特異的な培地内で分離した濃縮デバイスをインキュベートすることにより)、及び/又は捕捉された標的細胞検体(例えば、微生物又はその1つ以上の構成要素)を、試料の接触後に濃縮デバイスから単離若しくは分離すること(例えば、溶出剤又は溶解剤を濃縮デバイスに通すことにより)を更に含むことができる。しかしながら、所望により、標的細胞検体の検出(例えば、培養による方法、顕微鏡観察方法/イメージング法、遺伝子学的検出方法、発光に基づく検出方法、又は免疫学的検出方法)は、一般に、濃縮デバイスの存在下で行われることができる。
本発明のプロセスは、特定の細胞検体(例えば、特定の微生物株)を標的としない。むしろ、多孔質繊維性不織布マトリックス中に捕らえられている特定の比較的安価な無機材料を含む濃縮デバイスは、様々な微生物の捕捉において驚くほど有効であり得るということ(及び無機材料無しの対応するデバイスと比較して、溶出による、捕捉されている微生物の単離又は分離において驚くほど有効であるということ)が見出された。このようなデバイスを使用して、1つ以上の微生物株(好ましくは、1つ以上の細菌株)をより容易、かつ迅速に検定することができるように、試料(例えば、食品試料)中に存在する微生物株を、非株特異的な方法で濃縮することができる。
本発明のプロセスは、比較的簡便で、低コスト(複雑な装置又は高価な株特異的な材料を必要としない)であり、かつ比較的速い(好ましい実施形態は、濃縮デバイスとの接触を持たない対応する対照試料に対して、比較的均質な流体試料中に存在する微生物の少なくとも約70パーセント(より好ましくは少なくとも約80パーセント、最も好ましくは少なくとも約90パーセント)を約10分未満に捕捉する)。粒子状濃縮剤のみを使用する場合と異なり、本プロセスは、比較的短時間試料と接触するだけで(例えば、最短で約20秒)、かつ沈降工程の必要なしに、驚くほど効果的に微生物を捕捉することができる。
本発明のプロセスはまた、驚くほど「検定に適している」。検出は、一般に、有意な検定干渉なく(例えば、濃縮デバイスによる検定用試薬の吸収によって生じる、又は濃縮デバイスからの検定インヒビターの浸出によって生じる検出誤差なく)濃縮デバイスの存在下で達成され得る。これにより、サンプリング環境下での迅速な(例えば、10分以下の速さ)濃縮及び検出が可能となる。
加えて、このプロセスは、様々な微生物(グラム陽性菌及びグラム陰性菌の両方などの病原体を含む)及び様々な試料(異なる試料マトリックス、及び少なくとも一部の従来技術とは違って、更に微生物含有量が少ない試料及び/又は大量の試料)に有効であり得る。よって、本発明のプロセスの少なくともいくつかの実施形態は、様々な状況下で病原微生物を迅速に検出するための低コストで簡単なプロセスに対する、上述のような緊迫したニーズに対応することができる。
このプロセスで使用される濃縮デバイスは、絶対ミクロンフィルターなどの少なくとも一部の濾過デバイスよりも少なくとも若干大きな詰まりに対する抵抗性を呈することができるので、本発明のプロセスは、食品試料(例えば、粒子を含有する食品試料、特に比較的粗い粒子を含むもの)中の微生物の濃縮に特に有利であることができる。このことは、より完璧な試料処理(食品試験において誤った陰性の検定を無くすことにおいて必須である)及び比較的大量の試料の取り扱い(例えば、野外条件下での)を容易にすることができる。
好ましい濃縮プロセスは、
(a)(1)(i)少なくとも1つのフィブリル化繊維、及び(ii)少なくとも1つのポリマーバインダー、を含む多孔質繊維性不織布マトリックス、並びに
(2)少なくとも1つの非晶質で回転楕円体状の金属ケイ酸塩を含む少なくとも1つの濃縮剤の複数の粒子であって、
多孔質繊維性不織布マトリックス中に捕らえられている、複数の粒子、を含む濃縮デバイスを提供すること、
(b)少なくとも1つの標的細胞検体を含む流体試料を提供すること、及び
(c)少なくとも1つの標的細胞検体の少なくとも一部が、濃縮デバイスに結合される又は捕捉されるように、流体試料を濃縮デバイスに通すこと、を含む。
(a)(1)(i)少なくとも1つのフィブリル化繊維、及び(ii)少なくとも1つのポリマーバインダー、を含む多孔質繊維性不織布マトリックス、並びに
(2)少なくとも1つの非晶質で回転楕円体状の金属ケイ酸塩を含む少なくとも1つの濃縮剤の複数の粒子であって、
多孔質繊維性不織布マトリックス中に捕らえられている、複数の粒子、を含む濃縮デバイスを提供すること、
(b)少なくとも1つの標的細胞検体を含む流体試料を提供すること、及び
(c)少なくとも1つの標的細胞検体の少なくとも一部が、濃縮デバイスに結合される又は捕捉されるように、流体試料を濃縮デバイスに通すこと、を含む。
別の態様において、本発明はまた、(a)多孔質繊維性不織布マトリックス、及び(b)非晶質で回転楕円体状の金属ケイ酸塩を含む少なくとも1つの濃縮剤の複数の粒子であって、多孔質繊維性不織布マトリックス中に捕らえられている、複数の粒子、を含む濃縮デバイスを提供する。本発明はまた、(a)少なくとも1つの本発明の上記濃縮デバイス、及び(b)上述の濃縮プロセスを実施するために用いられる少なくとも1つの試験容器又は試験試薬、を含む、本発明の濃縮プロセスを実施するために用いられる診断キットも提供する。
更に別の態様において、本発明は、(a)複数の繊維を提供すること、(b)非晶質で回転楕円体状の金属ケイ酸塩を含む少なくとも1つの濃縮剤の複数の粒子を提供すること、及び(c)複複数の繊維の少なくとも一部を、複数の粒子の少なくとも一部がその中に捕らえられている多孔質繊維性不織布マトリックスに形成すること、を含む、濃縮デバイスの調製プロセスを提供する。
更に別の態様において、本発明はまた、(a)多孔質繊維性不織布マトリックス、及び(b)非晶質で回転楕円体状の金属ケイ酸塩を含む少なくとも1つの濃縮剤の複数の粒子、を含み、粒子が、多孔質繊維性不織布マトリックス中に捕らえられているフィルター媒体を提供する。
[詳細な説明]
以下の「詳細な説明」では、様々な組の数値範囲(例えば、特定の部分における炭素原子の数、又は特定の成分の量など)が記載され、各組内では、範囲の任意の下限を範囲の任意の上限と対にすることができる。同様に、このような数値範囲は、範囲内に含まれる全ての数を含むことを意味する(例えば1〜5は、1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5などを含む)。
以下の「詳細な説明」では、様々な組の数値範囲(例えば、特定の部分における炭素原子の数、又は特定の成分の量など)が記載され、各組内では、範囲の任意の下限を範囲の任意の上限と対にすることができる。同様に、このような数値範囲は、範囲内に含まれる全ての数を含むことを意味する(例えば1〜5は、1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5などを含む)。
本明細書で使用するとき、用語「及び/又は」は、1つ若しくは全ての列挙した要素、又は2つ以上の列挙した要素のいずれかの組み合わせを意味する。
用語「好ましい」及び「好ましくは」は、特定の状況下で、特定の利点をもたらし得る本発明の実施形態を指す。しかしながら、同一又は異なる条件下において、他の実施形態が好ましい場合もある。更に、1つ以上の好ましい実施形態の引用は、他の実施形態が有用ではないという意味を含むものではなく、他の実施形態を本発明の範囲から除外することを意図しない。
「含む(comprises)」という用語及びその変化形は、それらの用語が説明及び請求項に出現する箇所において、限定的な意味を有するものではない。
本明細書で使用するところの「a」、「an」、「the」、「少なくとも1つの」及び「1以上の」は、互換可能に使用される。
上記「課題を解決するための手段」の節は、全ての実施形態又は本発明の全ての実施を説明しようとするものではない。以下の「発明を実施するための形態」が実施形態をより具体的に例示する。「発明を実施するための形態」にわたり、複数の実施例の一覧を通してガイダンスが提供されており、それら実施例は様々な組み合わせで用いられ得る。いずれの場合にも、記載した一覧は、代表的な群としてのみ役立つものであり、排他的な一覧として解釈されるべきではない。
定義
本特許出願で使用されるとき、
「アラミド」は芳香族ポリアミドを意味する。
本特許出願で使用されるとき、
「アラミド」は芳香族ポリアミドを意味する。
「細胞検体」は、細胞起源の検体(即ち、微生物又はその構成要素(例えば、細胞又は細胞要素、例えば、デオキシリボ核酸(DNA)若しくはリボ核酸(RNA)、タンパク質、アデノシン三リン酸(ATP)などのヌクレオチド等、及びそれらの組み合わせ))を意味し、本明細書における微生物又は微生物株といった記載は、あらゆる細胞検体に一般的に適用されることが意図されている。
「濃縮剤」は、細胞検体を結合する物質又は組成物(好ましくは、少なくとも約60パーセント、より好ましくは少なくとも約70パーセント、更により好ましくは少なくとも約80パーセント、最も好ましくは少なくとも約90パーセントの細胞検体捕捉又は結合効率を有する)を意味する。
「培養デバイス」は、細胞分裂を少なくとも1回生じさせ得る条件下において、微生物を増殖させるために使用することができる、デバイスを意味する(好ましくは、培養デバイスは、偶発的汚染の可能性を低減するか最小化するハウジング及び/又は微生物の増殖を支持する栄養素供給源を含む)。
「検出」は、細胞検体(例えば、それにより標的微生物が存在することを判定する、少なくとも標的微生物の構成要素)の同定を意味する。
「捕らえられている(enmeshed)」(繊維性不織布マトリックス中の濃縮剤の粒子に関して)は、粒子が、繊維性不織布マトリックスの表面上に支持されるだけでなく、繊維性不織布マトリックス中に捕捉されている(好ましくは、その中に分散している)ことを意味する。
「フィブリル化」(繊維又は繊維性材料に関して)は、繊維の本幹に結合しているフィブリル又は枝を形成するように(例えば、叩ことによって)処理されることを意味する。
「繊維性不織布マトリックス」は、間に挿入された繊維を含む、織物又は編物以外のウェブ又は媒体(例えば、メルトブロー法、スパンボンド法、又は他のエアーレイ法、カーディング法、湿式堆積法等によって間に挿入された繊維を含むウェブ)を意味する。
「遺伝子学的検出」とは、標的微生物に由来するDNA又はRNAなどの遺伝子学的物質の構成要素の同定を意味する。
「免疫学的検出」とは、標的微生物に由来するタンパク質又はプロテオグリカンなどの抗原性物質の同定を意味する。
「微生物」は、分析又は検出に好適な遺伝物質を有する何らかの細胞又は粒子を意味する(例えば、細菌、酵母、ウイルス、及び細菌内生胞子が挙げられる)。
「微生物株」は、検出方法により識別可能な微生物(例えば、異なる属、属内の異なる種、又は種内の異なる隔離体の微生物)の特定のタイプを意味する。
「パラアラミド」は、置換されている(例えば、アルキル置換されている)又は非置換のベンゼン環にパラ位で結合した(1位及び4位の炭素に結合した)アミド結合を有する芳香族ポリアミドを意味する。
「試料」とは、(例えば分析のために)採取される物質又は材料を意味する。
「試料マトリックス」は、細胞検体以外の試料の構成要素を意味する。
「標的細胞検体」は、検出しようとする任意の細胞検体を意味する。
「標的微生物」は、検出しようとする任意の微生物を意味する。
「貫通細孔」(多孔質マトリックスに関連する)は、マトリックスを通る通路又はチャネル(別々の入口及び出口を持つ)を含む細孔を意味する。
濃縮剤
本発明のプロセスを実施する際に使用するのに適した濃縮剤としては、少なくとも1つの金属ケイ酸塩を含む粒子状濃縮剤が挙げられる。金属ケイ酸塩は、結晶質又は非晶質(好ましくは、非晶質)であり得る。
本発明のプロセスを実施する際に使用するのに適した濃縮剤としては、少なくとも1つの金属ケイ酸塩を含む粒子状濃縮剤が挙げられる。金属ケイ酸塩は、結晶質又は非晶質(好ましくは、非晶質)であり得る。
このような濃縮剤を使用した濃縮又は捕捉は、一般的に特定の株、種、又は微生物のタイプに対して特異的ではなく、よって、試料内の微生物の全体的な個体群の濃縮を提供する。次いで、株特異的なプローブによる任意の公知の検出方法を用いて、捕捉された微生物の集団から微生物の特定の株を検出することができる。したがって、この濃縮剤は、臨床試料、食品試料、環境試料、又は他の試料中の汚染微生物又は病原体(特に細菌などの食品によって媒介される病原体)の検出に使用することができる。
金属ケイ酸塩などの無機材料は、水系中に分散又は懸濁されると、材料及び水系のpHに特徴的な表面電荷を示す。物質−水の界面の両側の電位は「ゼータ電位」と呼ばれ、電気泳動における移動度から(即ち、水系中に置かれた帯電電極間を物質の粒子が移動する速度から)計算することができる。好ましくは濃縮剤は、約7のpHにおいて負のゼータ電位を有する。
有用な金属ケイ酸塩としては、マグネシウム、カルシウム、亜鉛、アルミニウム、鉄、チタン、及び同類物(好ましくは、マグネシウム、亜鉛、鉄、及びチタン;より好ましくは、マグネシウム)、並びにこれらの組み合わせなどの金属のケイ酸塩が挙げられる。好ましいのは、少なくとも部分的に融合した粒子形態の非晶質金属ケイ酸塩である(より好ましくは非晶質で回転楕円体状の金属ケイ酸塩であり、最も好ましくは非晶質で回転楕円体状のケイ酸マグネシウムである)。金属ケイ酸塩は既知であり、既知の方法によって化学的に合成されることができ、又は天然に存在する原鉱石を採掘し、加工することによって得ることができる。
非晶質で少なくとも部分的に融合した粒子形態の金属ケイ酸塩は、略楕円体又は回転楕円体粒子(即ち、正確に又は実質的に円形及び楕円形の形状、並びに任意の他の丸い又は湾曲した形状といった、一般に丸みを帯びており、かつ尖った隅部又は縁部を有さない拡大された2次元の形を有する粒子)を作製するために、制御された条件下で比較的小さい供給粒子(例えば、平均粒径が最大約25マイクロメートル)を融解又は柔軟化させる既知の方法のいずれかによって調製することができる。かかる方法は、微粒子化、火造り、直接融合などを含む。好ましい方法は、(例えば、その記述が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第6,045,913号(Castle)に記載されている方法のように)固体供給粒子の直接融合又は火造りによって、少なくとも部分的に融合した実質的にガラス状の粒子を形成する炎融である。最も好ましくは、かかる方法を用いて、不規則な形状の供給粒子の大部分(例えば、約15〜約99体積%、好ましくは約50〜約99体積%、より好ましくは約75〜約99体積%、最も好ましくは約90〜約99体積%)を略楕円体又は回転楕円体粒子に変換することによって、非晶質で回転楕円体状の金属ケイ酸塩を作製することができる。
一部の非晶質金属ケイ酸塩は市販されている。例えば、非晶質で回転楕円体状のケイ酸マグネシウムは、化粧品処方で用いるために市販されている(例えば、3M Company(St.Paul,MN)から入手可能な3M(商標)Cosmetic Microspheres CM−111として)。
濃縮剤は、金属ケイ酸塩の他に、金属の酸化物(例えば、鉄又はチタン)、その他の結晶性物質、及び同類物、並びにこれらの組み合わせなどの他の物質を更に含むことができる。しかしながら、濃縮剤は、少なくとも一部の用途に関し、結晶性シリカを本質的に含有しないのが好ましい。
本発明のプロセスの実施においては、濃縮剤を、繊維とのブレンドにかけ易い、実質的にどの粒子形態(好ましくは、比較的乾燥した又は揮発分を含まない形態)でも使用して、このプロセスで使用される濃縮デバイスを形成することができる。例えば、濃縮剤を粉末の形で使用することができるか、又はビーズなどのような粒子状支持体に塗布することができる。
好ましくは、濃縮剤は粉末の形で使用される。有用な粉末としては、ミクロ粒子(好ましくは、約1マイクロメートル(より好ましくは約2マイクロメートル、更により好ましくは約3マイクロメートル、最も好ましくは約4マイクロメートル)〜約100マイクロメートル(より好ましくは約50マイクロメートル、更により好ましくは約25マイクロメートル、最も好ましくは約15又は20マイクロメートルの範囲の粒径を有する、ミクロ粒子であり、ここで、任意の下限は上述の範囲の任意の上限と対をなすことができる)を含むものが挙げられる。
本発明のプロセスを実施する際に使用するのに適した特に好ましい濃縮剤としては、非晶質金属ケイ酸塩を含むもの、及び、X線光電子分光法(XPS)で測定した場合に、金属原子とケイ素原子との比が約0.5以下(好ましくは約0.4以下、より好ましくは約0.3以下、最も好ましくは約0.2以下)である表面組成を有するものが挙げられる。かかる濃縮剤としては、2010年7月29日公開の米国特許出願公開第2010/0190171号(Kshirsagarら、3M Innovative Properties Company)に記載されているものが挙げられ、濃縮剤及びその調製方法の記述は、参照により本明細書に組み込まれる。
好ましくは、特に好ましい濃縮剤の表面組成は更に、X線光電子分光法(XPS)で測定した場合に、少なくとも約10平均原子パーセントの炭素(より好ましくは少なくとも約12平均原子パーセントの炭素、最も好ましくは少なくとも約14平均原子パーセントの炭素)を含む。XPSは、試料表面の最も外側の約3〜10ナノメートル(nm)の元素組成を測定できる技術であり、水素及びヘリウムを除く周期表の全ての元素に対して感度を有する。XPSは、ほとんどの元素に対して0.1〜1原子パーセントの濃度範囲の検出限界を有する定量的測定法である。XPSの好ましい表面組成の評価条件としては、受光立体角±10°で試料表面に対して測定されるテイクオフ角度90°を挙げることができる。
かかる好ましい金属ケイ酸塩濃縮剤は、例えば、普通のタルクなどの一般的な金属ケイ酸塩よりもマイナスのゼータ電位を有し得る。けれども、濃縮剤は、驚くべきことに、細菌などの微生物を濃縮する際にタルクよりも有効であり得るが、その表面は一般に、負に帯電する傾向がある。好ましくは、濃縮剤は、約7のpHで負のゼータ電位を有する(より好ましくは、約7のpHでスモルコウスキー(Smoluchowski)ゼータ電位が約−9ミリボルト〜約−25ミリボルトの範囲、更により好ましくは、約7のpHでスモルコウスキーゼータ電位が約−10ミリボルト〜約−20ミリボルトの範囲、最も好ましくは、約7のpHでスモルコウスキーゼータ電位が約−11ミリボルト〜約−15ミリボルトの範囲である)。
本発明のプロセスを実施する際に使用するのに適した他の特に好ましい濃縮剤としては、吸着緩衝液で改質された非晶質金属ケイ酸塩を含むものが挙げられる。このような濃縮剤としては、2009年10月22日出願の米国特許仮出願第61/289,213号(Kshirsagar、3M Innovative Properties Company)に記載の濃縮剤が挙げられ、濃縮剤及びその調製方法についての記載は、参照により本明細書に組み込まれる。
濃縮デバイス
本発明のプロセスを実施するために用いられるのに適した濃縮デバイスとしては、(a)多孔質繊維性不織布マトリックス、及び(b)複数の上述の濃縮剤の粒子、を含み、粒子が、多孔質繊維性不織布マトリックス中に捕らえられているものが挙げられる。かかる濃縮デバイスは、濃縮剤の粒子がその中に捕らえられている繊維性不織布マトリックス(即ち、間に挿入された繊維を含む、織物又は編物以外のウェブ又は媒体)を提供することができる、本質的にいかなるプロセスによっても調製することができる。有用なプロセスとしては、メルトブロー法、スパンボンド法、及び他のエアーレイ法、カーディング法、湿式堆積法等、並びにこれらの組み合わせ(好ましくは、エアーレイ法、湿式堆積法、及びこれらの組み合わせ、より好ましくは、湿式堆積法)が挙げられる。
本発明のプロセスを実施するために用いられるのに適した濃縮デバイスとしては、(a)多孔質繊維性不織布マトリックス、及び(b)複数の上述の濃縮剤の粒子、を含み、粒子が、多孔質繊維性不織布マトリックス中に捕らえられているものが挙げられる。かかる濃縮デバイスは、濃縮剤の粒子がその中に捕らえられている繊維性不織布マトリックス(即ち、間に挿入された繊維を含む、織物又は編物以外のウェブ又は媒体)を提供することができる、本質的にいかなるプロセスによっても調製することができる。有用なプロセスとしては、メルトブロー法、スパンボンド法、及び他のエアーレイ法、カーディング法、湿式堆積法等、並びにこれらの組み合わせ(好ましくは、エアーレイ法、湿式堆積法、及びこれらの組み合わせ、より好ましくは、湿式堆積法)が挙げられる。
濃縮デバイスの多孔質繊維性不織布マトリックスを調製する際に使用するのに適した繊維としては、パルプ化可能な(pulpable)繊維が挙げられる。好ましいパルプ化可能な繊維は、放射線及び/又は様々な溶媒に安定なものである。有用な繊維としては、ポリマー繊維類、無機繊維類、及びこれらの組み合わせ(好ましくは、ポリマー繊維類及びその組み合わせ)が挙げられる。好ましくは、使用する繊維の少なくともいくつかは、ある程度の親水性を呈する。
好適なポリマー繊維としては、熱可塑性及び溶媒分散性ポリマーなどの、天然(動物若しくは植物)ポリマー及び/又は合成ポリマーから製造されたものが挙げられる。有用なポリマーとしては、羊毛;絹;セルロース系ポリマー(例えば、セルロース、セルロース誘導体など);フッ素化ポリマー(例えば、ポリ(フッ化ビニル)、ポリ(フッ化ビニリデン))、フッ化ビニリデンのコポリマー(例えばポリ(フッ化ビニリデン−コ−ヘキサフルオロプロピレン))、クロロトリフルオロエチレンのコポリマー(例えばポリ(エチレン−コ−クロロトリフルオロエチレン)など);塩素化ポリマー;ポリオレフィン(例えば、ポリ(エチレン)、ポリ(プロピレン)、ポリ(1−ブテン)、エチレンとプロピレンとのコポリマー、αオレフィンコポリマー(例えば、エチレン又はプロピレンと1−ブテン、1−ヘキセン、1−オクテン、及び1−デセンとのコポリマー)、ポリ(エチレン−コ−1−ブテン)、ポリ(エチレン−コ−1−ブテン−コ−1−ヘキセン)、及び同類物);ポリ(イソプレン);ポリ(ブタジエン);ポリアミド(例えば、ナイロン6;ナイロン6,6;ナイロン6,12;ポリ(イミノアジポイルイミノヘキサメチレン);ポリ(イミノアジポイルイミノデカメチレン);ポリカプロラクタム;及び同類物);ポリイミド(例えば、ポリ(ピロメリットイミド)など);ポリエーテル;ポリ(エーテルスルホン)(例えば、ポリ(ジフェニルエーテルスルホン)、ポリ(ジフェニルスルホン−コ−酸化ジフェニレンスルホン)、及び同類物);ポリ(スルホン);ポリ(酢酸ビニル);酢酸ビニルのコポリマー(例えば、ポリ(エチレン−コ−酢酸ビニル)、アセテート基の少なくとも一部が加水分解されて各種ポリ(ビニルアルコール)(例えば、ポリ(エチレン−コ−ビニルアルコール)、及び同類物)を生成するコポリマー、及び同類物);ポリ(ホスファゼン);ポリ(ビニルエステル);ポリ(ビニルエーテル);ポリ(ビニルアルコール);ポリアラミド(例えば、ポリ(パラフェニレンテレフタルアラミド)などのパラアラミド及びDuPont Co.(Wilmington,DE)により商品名「KEVLAR」で販売されている繊維(該繊維のパルプは、パルプを形成する繊維長に基づき様々な等級で市販されており、例えば、「KEVLAR 1F306」及び「KEVLAR 1F694」などであり、これらは共に長さが少なくとも4mmであるアラミド繊維を含む)、及び同類物);ポリ(カーボネート);及び同類物;並びにこれらの組み合わせが挙げられる。好ましいポリマー繊維としては、ポリアミド、ポリオレフィン、ポリスルホン、及びこれらの組み合わせ(より好ましくは、ポリアミド、ポリオレフィン、及びこれらの組み合わせ;最も好ましくは、ナイロン、ポリ(エチレン)、及びこれらの組み合わせ)が挙げられる。
好適な無機繊維としては、ガラス、セラミックス、及びこれらの組み合わせから選択される少なくとも1つの無機材料を含むものが挙げられる。有用な無機繊維としては、繊維ガラス(例えば、Eガラス、Sガラスなど)、セラミック繊維(例えば、金属酸化物(アルミナなど)、炭化ケイ素、窒化ホウ素、炭化ホウ素などで製造された繊維)、及び同類物、並びにこれらの組み合わせが挙げられる。有用なセラミック繊維は、少なくとも部分的に結晶性であり得る(認識可能なX線粉末回折図形を示す、又は結晶質相及び非晶質(ガラス)相の両方を含有する)。好ましい無機繊維としては、繊維ガラス及びその組み合わせが挙げられる。
多孔質繊維性不織布マトリックスを形成するために使用される繊維は、特定用途(例えば、特定の種類の試料マトリックス)にとって十分な構造的一体性及び十分な多孔性を有するマトリックスを提供することができる長さ及び直径のものであり得る。例えば、少なくとも約0.5mm、1mm、2mm、3mm、4mm、6mm、8mm、10mm、15mm、20mm、25mm、又は更には30mm(及びこれらの組み合わせ)の長さ、並びに少なくとも約10μm(マイクロメートル)、20μm、40μm、又は更には60μm(及びこれらの組み合わせ)の直径が有用であり得る。好ましい繊維の長さ及び直径は、繊維の性質及び用途のタイプなどの要因に応じて様々である。例えば、様々な試料マトリックスに関し、長さ約1mm〜約3mmのフィブリル化ポリ(エチレン)が有用であり得、長さ約6mm〜約12.5mmの非フィブリル化ナイロンが有用であり得る。
濃縮剤の粒子の捕捉を促進するため及び/又は高表面積のマトリックスを確実にするために、多孔質繊維性不織布マトリックスを形成するために用いられる繊維は、(例えば、多くのより小さな結合フィブリルで取り囲まれた主繊維の形態の)少なくとも1つのフィブリル化繊維を含むのが好ましい。主繊維は、一般に、約0.5mm〜約4mmの範囲の長さ、及び約1〜約20マイクロメートルの直径を有し得る。フィブリルは、典型的には、μm未満の直径を有し得る。
多孔質繊維性不織布マトリックスは、2、3、4種類、又は更にはより多くの異なる種類の繊維を含み得る。例えば、強度及び一体性をもたせるためにナイロン繊維を加えることができる一方、粒子を捕捉するためにフィブリル化ポリエチレンを加えることができる。フィブリル化繊維及び非フィブリル化繊維を使用する場合、一般に、フィブリル化繊維と非フィブリル化繊維との重量比は、少なくとも約1:2、1:1、2:1、3:1、5:1、又は更には8:1であり得る。選択する繊維の種類にかかわらず、得られる濃縮デバイス(乾燥形態)中の繊維の量は、(濃縮デバイスの全構成要素の総重量に対して)好ましくは少なくとも約10重量%、12重量%、12.5重量%、14重量%、15重量%、18重量%、20重量%、又は更には22重量%、最大で約20重量%、25重量%、27重量%、30重量%、35重量%、又は更には40重量%である。
好ましくは、多孔質繊維性不織布マトリックスは、少なくも1つのポリマーバインダーを更に含む。好適なポリマーバインダーには、比較的不活性な(繊維又は濃縮剤粒子のいずれかと化学的相互作用をほとんどあるいは全く示さない)天然及び合成ポリマー材料が含まれる。有用なポリマーバインダーとしては、ポリマー樹脂(例えば、粉末及びラテックスの形態)、ポリマーバインダー繊維、及び同類物、並びにこれらの組み合わせが挙げられる。少なくとも一部の用途では、好ましいポリマーバインダーには、ポリマーバインダー繊維及びその組み合わせが含まれる。他の用途では、ポリマー樹脂類及びその組み合わせが好ましいポリマーバインダーであり得る。
好適なポリマー樹脂としては、天然ゴム、ネオプレン、スチレン−ブタジエンコポリマー、アクリル樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニルル、及び同類物、並びにこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。好ましいポリマー樹脂としては、アクリル樹脂類及びその組み合わせが挙げられる。好適なポリマーバインダー繊維としては、接着剤のみの繊維(adhesive-only type fibers)(例えば、Eastman Chemical Products(Kingsport,TN)より入手可能なKodel(商標)43UD繊維)、バイコンポーネント繊維(例えば、Chisso Corporation(Osaka,Japan)から入手可能なChisso ESポリオレフィンの熱結合バイコンポーネント繊維などの並列形状(side-by-side form)、Unitika Ltd.(Osaka,Japan)から入手可能なポリエステルコアとポリエチレンシースとを有するMelty(商標)繊維タイプ4080バイコンポーネント繊維などのシース−コア形状、及び同類物)、及び同類物、並びにこれらの組み合わせが挙げられる。好ましいポリマーバインダー繊維としては、バイコンポーネント繊維類及びその組み合わせ(より好ましくは、シース−コアのバイコンポーネント繊維及びその組み合わせ)が挙げられる。
使用するポリマーバインダーの種類にかかわらず、得られる濃縮デバイス(乾燥形態)中のバインダーの量は、一般に、濃縮デバイスの全構成要素の総重量に対して約3重量%〜約7重量%(好ましくは、約5重量%)であり得る。そうした量のポリマーバインダーは、一般に、粒子を大いにコーティングすることなく、多くの用途で使用するのに十分な一体性を多孔質繊維性不織布マトリックスにもたらすことができる。驚くべきことに、濃縮デバイス中のポリマーバインダーの量は、濃縮デバイス中の繊維の重量に対して約5重量%未満、4重量%未満、3重量%未満、2重量%未満、又は更には1重量%未満であり得る。
濃縮デバイスの好ましい実施形態では、ポリマーバインダーは粒子に実質的に付着しない。換言すれば、濃縮デバイスを走査電子顕微鏡で調べると、粒子の総面積の約5%未満、4%未満、3%未満、2%未満、又は更には1%未満がポリマーバインダーで覆われている。
本発明のプロセスで使用する濃縮デバイスは、(a)複数の上述の繊維を提供すること、(b)複数の上述の濃縮剤の粒子を提供すること、及び(c)複数の繊維の少なくとも一部を、複数の粒子の少なくとも一部がその中に捕らえられている多孔質繊維性不織布マトリックスに形成すること、を含むプロセスによって調製され得る。上記のように、形成することは、濃縮剤の粒子がその中に捕らえられている繊維性不織布マトリックス(即ち、間に挿入された繊維を含む、織物又は編物以外のウェブ又は媒体)を提供することができる本質的にいかなるプロセスによっても実施され得る。有用なプロセスとしては、メルトブロー法、スパンボンド法、及び他のエアーレイ法、カーディング法、湿式堆積法等、並びにこれらの組み合わせ(好ましくは、エアーレイ法、湿式堆積法、及びこれらの組み合わせ;より好ましくは、湿式堆積法)が挙げられる。
好ましくは、形成することは、(a)複数の繊維、複数の粒子(他のプロセス工程を行う前に他の構成要素と共に添加及び分散されることができるか、又は所望により、該プロセスの後半であるが、一般に分散液の除去前に添加及び分散され得る)、及び少なくとも1つの分散液(好ましくは、水)中の少なくとも1つのポリマーバインダー、を含む分散体を形成すること、(b)ポリマーバインダーを繊維の少なくとも一部の上に少なくとも部分的に堆積すること、並びに(c)分散体から分散液を除去すること、を含むウェットレイイングつまり「湿式堆積」プロセスを用いて行われる。かかるプロセスでは、繊維が分散液の中に分散されて、スラリーを形成することができる。所望により、繊維は、それらの分散を支援するための接着剤又は化学基若しくは化学的部分を含み得る。例えば、ポリオレフィン系繊維は、無水マレイン酸又は無水コハク酸官能基を含むことができ、又は、ポリエチレン繊維の溶解プロセス中に、好適な界面活性剤を添加することができる。
繊維上へのポリマーバインダーの堆積は、ポリマーバインダーの性質に応じて、分散液除去又は脱水工程の前又は後に行うことができる。例えば、ポリマーラテックスをポリマーバインダーとして使用する場合、ポリマーラテックスは、粒子添加の前又は後、及び脱水工程の前に繊維上に沈殿され得る。脱水後、熱を加えて、脱水を完了し、得られた堆積ラテックスを固めることができる。ポリマーバインダー繊維をポリマーバインダーとして使用する場合、最初に脱水を行った後、熱を加えて、脱水を完了しかつポリマーバインダー繊維を融解する(それによって、繊維上にポリマーバインダーを堆積する)ことができる。
濃縮デバイスの調製に際し、1つ以上の補助剤又は添加剤を使用することができる。有用な補助剤としては、加工助剤(例えば、ポリマーバインダーを繊維上に沈殿させるのを助けることができる、アルミン酸ナトリウム及び硫酸アルミニウムなどの沈降剤)、得られる濃縮デバイスの全体的性能を高めることができる物質、及び同類物が挙げられる。かかる補助剤を使用する場合、その量は0超から約2重量%まで(好ましくは、濃縮デバイスの構成要素の総重量に対して、最大約0.5重量%)であり得るが、含むことができる濃縮剤の粒子の量を最大にするために、その量をできるだけ低く抑えるのが好ましい。
好ましい湿式堆積プロセスでは、繊維(例えば、短繊維)は、分散液(例えば、水、アルコールなどの水混和性有機溶媒、又はこれらの組み合わせ)の存在下で容器内でブレンドされ得る。得られた混合物のブレンドに用いられる剪断量は、得られる濃縮デバイスの最終的な特性に影響を及ぼすことは見出されていないが、ブレンド中に導入される剪断量は比較的高いほうが好ましい。その後、粒子、ポリマーバインダー、及び過剰な沈降剤(例えば、ミョウバンなどのpH調整剤)を容器に加えることができる。
好ましい湿式堆積プロセスが、当該技術分野において既知のハンドシート法(hand-sheet method)により実施される場合、繊維分散体に3つの成分を加える順序が、濃縮デバイスの最終的な性能に有意な影響を与えることは見出されていない。しかしながら、粒子を加えた後にポリマーバインダーを加えることにより、繊維に対する粒子の接着がいくらか良好な濃縮デバイスを得ることができる。好ましい湿式堆積プロセスが連続法により実施される場合、3つの成分は記載の順序で加えられるのが好ましい。(以下の説明はハンドシート法に基づいているが、当業者は、かかる方法を連続プロセスに適合させる方法を容易に認識することができる。)
粒子の後、ポリマーバインダー及び沈降剤を繊維−液体スラリーに加え、得られた混合物を、底部をスクリーンで覆うことができる成形型に注ぎ込むことができる。分散液(好ましくは、水)は、スクリーンを通して(濡れたシート状の)混合物から排水させることができる。十分な量の液体が該シートから排水された後、通常、濡れたシートを成形型から取り外し、加圧、加熱、又はその2つの組み合わせにより該シートを乾燥させることができる。一般に、約300〜約600kPaの圧力及び約100〜約200℃(好ましくは、約100〜約150℃)の温度をこれら乾燥プロセスで用いることができる。ポリマーバインダー繊維を好ましい湿式堆積プロセスにおけるポリマーバインダーとして使用する場合、沈降剤は不要であり、加えられる熱を用いてポリマーバインダー繊維を融解することができる。
得られた乾燥シートは、少なくとも約0.2mm、0.5mm、0.8mm、1mm、2mm、4mm、又は更には5mm、最大で約5mm、8mm、10mm、15mm、又は更には20mmの平均厚さを有し得る。分散液の最大約100パーセントを除去することができる(好ましくは、最大約90重量%)。所望により、追加の加圧又は溶着を提供するために、カレンダ加工を用いることができる。
上記のように、濃縮剤の粒子はミクロ粒子であり得る。ミクロ粒子は、使用する繊維の性質に応じて、化学的相互作用(例えば、化学結合)又は物理的相互作用(例えば、吸着又は機械的捕捉)のいずれかにより、多孔質繊維性不織布マトリックス中に入り込むことができる。濃縮デバイスの好ましい実施形態としては、濃縮剤の粒子の機械的捕捉をもたらすことができる少なくとも1つのフィブリル化繊維を含むものが挙げられる。濃縮デバイスの一実施形態では、粒子の有効平均直径は、得られた湿式堆積シートのカレンダ加工されていない厚さの少なくとも約175分の1(好ましくは、カレンダ加工されていないシート厚の少なくとも約250の1、より好ましくはカレンダ加工されていないシート厚の少なくとも約300の1)である。
濃縮デバイスの能力及び効率は、含有する濃縮剤粒子の量によって様々であり得るので、比較的高い粒子負荷が一般に望ましくあり得る。濃縮デバイス中の粒子の量は、好ましくは、(濃縮デバイスの全構成要素の総重量に対して)少なくとも約20重量%、30重量%、40重量%、50重量%、60重量%、70重量%、又は更には80重量%であり得る。粒子は多孔質繊維性不織布マトリックス中に入り込み、その中に分散するのが好ましい(より好ましくは、粒子は、マトリックス全体に本質的に均一に分散される)。
得られた濃縮デバイスは、制御された多孔性を有し得る(好ましくは、空気100mLに対して少なくとも約0.1秒(より好ましくは少なくとも約2秒〜約4秒、最も好ましくは少なくとも約4秒)のガーレー時間を有する)。濃縮デバイス(シート材料の形態)の坪量は、約250〜約5000g/m2の範囲(好ましくは約400〜約1500g/m2の範囲、より好ましくは約500〜約1200g/m2の範囲)であり得る。
一般に、シート材料の平均細孔径は、走査電子顕微鏡(SEM)で測定した場合、約0.1〜約10マイクロメートルの範囲であり得る。約20体積%〜約80体積%(好ましくは、約40体積%〜約60体積%)の範囲の空隙体積が有用であり得る。シート材料の多孔性は、繊維混合物中により大きい直径又は剛性の繊維を含ませることにより修正する(増加させる)ことができる。
シート材料は可撓性であり得る(例えば、直径0.75インチ(約2cm)のコアに巻き付けることができる)。この可撓性は、シート材料にひだを付ける又はシート材料を丸めるのを可能にし得る。シート材料は、比較的低い背圧を有し得る(つまり、比較的大量の液体が、比較的高い背圧を生成することなく、比較的迅速にシート材料を通過することができる)。(本明細書で用いる場合、「比較的低い背圧」は、3mL/cm2の流速において約3ポンド/平方インチ(20.7kPa)、2.5ポンド/平方インチ(17.2kPa)、2ポンド/平方インチ(13.8kPa)、1.5ポンド/平方インチ(10.3kPa)、又は更には1ポンド/平方インチ(6.9kPa)未満の差背圧を指し、この場合、流速は、シート材料の前面表面積に基づく。)
カレンダ加工されていないシート材料を所望の寸法に切断し、本発明の濃縮プロセスを実施するために使用することができる。所望により(例えば、シート全体の有意な圧力低下が懸念事項でない場合)、使用の前に引張り強度を高めるために、シート材料をカレンダ加工することができる。シート材料にひだを付ける場合、乾燥及びカレンダ加工を避けることができるのが好ましい。
単一層のシート材料は、本発明の濃縮プロセスを実施するのに有効であり得る。より大きな濃縮能力を提供するために、所望により、多層を使用することができる。
濃縮デバイスの多孔質繊維性不織布マトリックスの有意な利点は、非常に小さな濃縮剤粒径(10μm以下)及び/又は比較的広範な粒径分布の濃縮剤粒子を採用することができることである。これにより、表面積/質量比が増大するため、優れたワンパスキネティクス(one-pass kinetics)が可能となり、多孔質粒子に関しては、内部拡散距離を最小にすることが可能となる。圧力低下が比較的小さいので、小さい粒径の濃縮剤を採用する場合でさえも、最小限の推進力(重力又は真空など)を用いて試料を濃縮デバイスに通過させることができる。
所望により、濃縮デバイスは、例えば、1つ以上のプレフィルター(例えば、試料を多孔質マトリックスに通す前に試料から比較的大きい食物粒子を除去するため)、多孔質マトリックスのための支持体又はベース(例えば、フリット又はグリッドの形態)、デバイス全体に圧力差を加えるためのマニホールド(例えば、試料を多孔質マトリックスに通すのを助けるため)、及び/又は外部ハウジング(例えば、多孔質マトリックスを収容する及び/又は保護するための使い捨てカートリッジ)などの1つ以上の他の構成要素を更に含むことができる。
試料
本発明のプロセスは、医療、環境、食品、飼料、臨床、及び検査室の試料、及びこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない、様々なタイプの試料に適用することができる。医療又は獣医試料には、例えば、臨床診断のために検査される生物源(例えばヒト又は動物)から得た細胞、組織、又は流体が含まれる。環境試料は、例えば、医療機関又は獣医機関、産業用設備、土壌、水源、食品調理領域(食品接触及び非接触領域)、検査室、又はバイオテロリズムの対象になり得る領域から得たものであり得る。食品の加工、取扱い、及び調理領域の試料は、細菌病原菌による食品供給汚染に関する特定の懸念があることが多いので、より好適である。
本発明のプロセスは、医療、環境、食品、飼料、臨床、及び検査室の試料、及びこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない、様々なタイプの試料に適用することができる。医療又は獣医試料には、例えば、臨床診断のために検査される生物源(例えばヒト又は動物)から得た細胞、組織、又は流体が含まれる。環境試料は、例えば、医療機関又は獣医機関、産業用設備、土壌、水源、食品調理領域(食品接触及び非接触領域)、検査室、又はバイオテロリズムの対象になり得る領域から得たものであり得る。食品の加工、取扱い、及び調理領域の試料は、細菌病原菌による食品供給汚染に関する特定の懸念があることが多いので、より好適である。
液体の形態で得られる試料、又は液体中の固体の分散液若しくは懸濁液の形態で得られる試料は、直接使用することができ、あるいは濃縮して(例えば遠心分離により)又は希釈して(例えば緩衝(pH調整済み)溶液の追加により)使用することができる。固体又は半固体の試料は、直接使用するか、あるいは例えば、所望であれば、流動体媒質(例えば緩衝液)で洗浄若しくはすすぎ、又は流動体媒質中に懸濁若しくは分散させることにより抽出することができる。試料は表面から(例えばスワブ拭き取り又はすすぎにより)採取することができる。好ましくは、試料は流体の形態で使用される(例えば、液体、気体、又は液体中若しくは気体中の固体若しくは液体の分散物若しくは懸濁物)。
本発明のプロセスを実施する際に使用できる試料の例としては、食品(例えば、生鮮農産物又はそのまま食べる昼食若しくは「調理された」食肉)、飲料(例えばジュース又は炭酸飲料)、水(飲料水を含む)、並びに生物学的流動体(例えば全血、又は血漿、血小板の豊富な血液分画、血小板濃縮物、圧縮した赤血球などの血液構成成分、細胞調製物(例えば細胞分散液、骨髄吸引物、又は脊椎骨髄)、細胞懸濁液、尿、唾液、及びその他の体液、骨髄、肺水、脳液、外傷滲出物、外傷生検試料、眼内液、脊髄液など)が挙げられ、また溶解緩衝液の使用などの手順を使用して形成することができる細胞可溶化物などの溶解調製物が含まれる。好ましい試料としては、食品、飲料、水、生体液、及びこれらの組み合わせ(食品、飲料、水、及びこれらの組み合わせがより好ましく、水が最も好ましい)が含まれる。
試料の量は、個々の用途に応じて異なり得る。例えば、本発明のプロセスを診断又は研究用途に使用する場合には、試料の量は、通常、マイクロリットルの範囲であり得る(例えば10マイクロリットル以上)。本プロセスが食品病原体試験検査又は飲料水安全性試験のために使用される場合、試料の量は通常、ミリリットル〜リットルの範囲であり得る(例えば100ミリリットル〜3リットル)。バイオプロセス又は製剤処方などの産業用途においては、この量は何万リットルであることがある。
本発明のプロセスは、濃縮状態の試料から微生物を分離し、更に、使用される検出手順を阻害し得る試料マトリックス構成成分から微生物を分離することも可能にする。これらすべての場合において、本発明のプロセスは、他の細胞検体又は微生物濃縮方法に追加し、又はその代わりに、用いることができる。よって、所望により、追加の濃縮が望ましい場合には、本発明のプロセスを実施の前又は後に試料から培養を行うことができる。このような培養増菌は一般的又は一次的(大部分又は本質的に全ての微生物の濃度を増菌)であるか、あるいは特異的又は選択的(1つ以上の選択された微生物のみの濃度を増菌)であることができる。
接触
本発明のプロセスは、2つの物質の間に接触をもたらす、様々な既知の方法又は今後開発される方法によって実施することができる。例えば、濃縮デバイスを試料に加えてもよく、又は試料を濃縮デバイスに加えてもよい。濃縮デバイスを試料中に浸漬することができ、試料を濃縮デバイスの上に注ぐことができ、試料を濃縮デバイスを入れた管又はウエルの中に注ぐことができ、又は好ましくは、試料を濃縮デバイスの上又は中に(好ましくは、中に)通すことができる(又は逆も可)。好ましくは、試料が多孔質繊維性不織布マトリックスの少なくとも1つの細孔内を(好ましくは、少なくとも1つの貫通細孔内を)通るような方法で接触を行う。
本発明のプロセスは、2つの物質の間に接触をもたらす、様々な既知の方法又は今後開発される方法によって実施することができる。例えば、濃縮デバイスを試料に加えてもよく、又は試料を濃縮デバイスに加えてもよい。濃縮デバイスを試料中に浸漬することができ、試料を濃縮デバイスの上に注ぐことができ、試料を濃縮デバイスを入れた管又はウエルの中に注ぐことができ、又は好ましくは、試料を濃縮デバイスの上又は中に(好ましくは、中に)通すことができる(又は逆も可)。好ましくは、試料が多孔質繊維性不織布マトリックスの少なくとも1つの細孔内を(好ましくは、少なくとも1つの貫通細孔内を)通るような方法で接触を行う。
濃縮デバイス及び試料を様々な容器又はホルダー(場合によっては、キャップ付き、密閉又は密封の容器、好ましくは、カラム、注射器筒、又は本質的に試料の漏洩無しでデバイスを収めるように設計された他のホルダー)のいずれかの中で(任意の追加順序を用いて)組み合わせることができる。本発明のプロセスを実施するために用いられるのに好適な容器は、個々の試料によって決定され、量及び性質により大きく異なり得る。例えば、容器は10マイクロリットル容器(例えば試験管又は注射器)などの小さいものであり得、又は100ミリリットルから3リットル容器(例えば、エルレンマイヤーフラスコ又は環状円筒容器)などの大きいものであり得る。
容器、濃縮デバイス、及び試料に直接接触する任意のその他の器具又は添加物を使用前に滅菌(例えば、制御された熱、エチレンオキシドガス、又は放射線によって)して、検出エラーを起こし得る試料のいかなる汚染も低減又は防止することができる。特定の試料の微生物の捕捉又は濃縮に充分な、検出を成功させる濃縮デバイス中の濃縮剤の量は、場合によって異なり(例えば、濃縮剤及びデバイスの性質及び形並びに試料の量に依存する)、当業者によって容易に決定可能である。
接触は、所望の期間行うことができる(例えば、数リットルの試料体積、又は濃縮デバイスを複数回通過させるプロセスでは、最大約60分、好ましくは約15秒〜約10分以上、より好ましくは約15秒〜約5分、最も好ましくは約15秒〜約2分の接触が有用であり得る。)随意であるが、微生物と濃縮デバイスとの接触を増大させるために好まれる方法であり得る、混合(例えば、試料の多孔質マトリックス内の通過を促進するための、攪拌、振盪、又はデバイス全体での圧力差の印加)及び/又はインキュベーション(例えば、周囲温度での)により、接触を増強することができる。
好ましくは、試料を少なくとも1回(好ましくは1回のみ)濃縮デバイスに通す(例えば、ポンプ送液により)ことにより、接触を行うことができる。任意のタイプのポンプ(例えば、蠕動ポンプ)又はデバイス全体で圧力差を生じさせるための他の装置(例えば、注射器又はプランジャ)を使用することができる。有用な流速は、試料マトリックスの性質及び特定用途などの要因に応じて異なる。
例えば、1分当り約100ミリリットルまで又はそれ以上のデバイスを通る試料流速が有効であり得る。好ましくは、飲料及び水などの試料では、1分当り約10〜20ミリリットルの流速を用いることができる。予め濾過された、ないしは別の方法で浄化された食品試料では、1分当り約6ミリリットル(15秒当り1.5ミリリットル)の流速が有用であり得る。牛挽肉又は七面鳥の挽肉などのより複雑な試料マトリックスでは、より長い接触時間及びよりゆっくりとした流速が有用であり得る。
好ましい接触方法には、(例えば、ポンプによって)試料を濃縮デバイスに通過させることが挙げられる。所望により、1つ以上の添加剤(例えば、溶解試薬、生物発光検定試薬、核酸捕捉試薬(例えば、電磁ビーズ)、微生物用培地、緩衝液(例えば、固形試料の湿潤のため)、微生物染色試薬、洗浄用緩衝液(例えば、結合していない物質を洗い流すため)、溶出剤(例えば血清アルブミン)、界面活性剤(例えば、Union Carbide Chemicals and Plastics(Houston,TX)から入手可能なTriton(商標)X−100非イオン性界面活性剤)、機械的磨耗/溶出剤(例えば、ガラスビーズ)、吸着緩衝液(例えば、上記の吸着緩衝液で改質された濃縮剤を調製するために使用したものと同じ緩衝液又は異なる緩衝液)、及び同類物)を、接触中に濃縮デバイスと試料との組み合わせに含ませることができる。
本発明のプロセスは、所望により、得られる標的細胞検体が結合した濃縮デバイス及び試料を分離させることを更に含む。分離は、当該技術分野において周知の数多くの方法によって実施可能である(例えば、標的細胞検体が結合した濃縮デバイスを該プロセスを実施する際に使用した容器又は保持器内に残すために、液状試料をポンプで吸い上げる、別の容器へ移す、又はサイホンで吸い上げることによる)。試料の接触後に、捕捉された標的細胞検体(標的微生物又はその1つ以上の構成要素)を濃縮デバイスから単離又は分離することも可能であり得る(例えば、溶出剤又は溶解剤を濃縮デバイスの上又は中に通すことによる)。
本発明のプロセスは、手動で(例えば、バッチ式で)行うことができ、又は(例えば、連続的又は半連続的処理を可能にするように)自動化することができる。
検出
様々な微生物は、本発明のプロセスを用いて濃縮及び検出することができ、該微生物としては、例えば、細菌、菌類、酵母、原生動物、ウイルス(非エンベロープ型ウイルス及びエンベロープ型ウイルスの両方を含む)、細菌内生胞子(例えばバチルス(炭疽菌、セレウス菌、及び枯草菌など)及びクロストリジウム(ボツリヌス菌、クロストリジウム・ディフィシル、及びウェルシュ菌など))、及び同類物、並びにこれらの組み合わせ(好ましくは、細菌、酵母、ウイルス、細菌内生胞子、及びこれらの組み合わせ、より好ましくは、細菌、酵母、細菌内生胞子、菌類、及びこれらの組み合わせ、更により好ましくは、細菌、酵母、及びこれらの組み合わせ、更により好ましくは、グラム陰性菌、グラム陽性菌、酵母、菌類、及びこれらの組み合わせ、最も好ましくは、グラム陰性菌、グラム陽性菌、酵母、及びこれらの組み合わせ)が挙げられる。このプロセスは、病原体の検出における有用性を有し、これは食品安全性又は医療、環境、若しくはテロ対策の理由から非常に重要であり得る。このプロセスは、病原菌(例えば、グラム陰性菌及びグラム陽性菌の両方)、並びに様々な酵母及びカビ(並びにこれらの任意の組み合わせ)の検出に特に有用であり得る。
様々な微生物は、本発明のプロセスを用いて濃縮及び検出することができ、該微生物としては、例えば、細菌、菌類、酵母、原生動物、ウイルス(非エンベロープ型ウイルス及びエンベロープ型ウイルスの両方を含む)、細菌内生胞子(例えばバチルス(炭疽菌、セレウス菌、及び枯草菌など)及びクロストリジウム(ボツリヌス菌、クロストリジウム・ディフィシル、及びウェルシュ菌など))、及び同類物、並びにこれらの組み合わせ(好ましくは、細菌、酵母、ウイルス、細菌内生胞子、及びこれらの組み合わせ、より好ましくは、細菌、酵母、細菌内生胞子、菌類、及びこれらの組み合わせ、更により好ましくは、細菌、酵母、及びこれらの組み合わせ、更により好ましくは、グラム陰性菌、グラム陽性菌、酵母、菌類、及びこれらの組み合わせ、最も好ましくは、グラム陰性菌、グラム陽性菌、酵母、及びこれらの組み合わせ)が挙げられる。このプロセスは、病原体の検出における有用性を有し、これは食品安全性又は医療、環境、若しくはテロ対策の理由から非常に重要であり得る。このプロセスは、病原菌(例えば、グラム陰性菌及びグラム陽性菌の両方)、並びに様々な酵母及びカビ(並びにこれらの任意の組み合わせ)の検出に特に有用であり得る。
検出される標的微生物の属には、リステリア属、大腸菌属、サルモネラ属、カンピロバクター属、クロストリジウム属、ヘリコバクター属、マイコバクテリウム属、シゲラ属、ブドウ球菌属、腸球菌属、バチルス属、ナイセリア属、シゲラ属、連鎖球菌属、ビブリオ属、エルシニア属、ボルデテラ属、ボレリア属、シュードモナス属、サッカロミケス属、カンジダ属、及び同様物、並びにこれらの組み合わせが挙げられる。試料には複数の微生物株が含まれることがあり、任意の株を、他の株とは独立して検出することができる。検出の標的となり得る具体的な微生物としては、大腸菌、腸炎エルシニア、仮性結核菌、コレラ菌、腸炎ビブリオ、ビブリオ・バルニフィカス、リステリア・モノサイトゲネス(リステリア・イノキュアがサロゲートである)、黄色ブドウ球菌、サルモネラ菌、サッカロマイセス・セレヴィシエ、カンジダ・アルビカンス、ブドウ球菌エンテロトキシン亜種、セレウス菌、炭疽菌、バチルス・アトロファエウス、バチルス・ズブチルス、ウェルシュ菌、ボツリヌス菌、クロストリジウム・ディフィシレ、エンテロバクター・サカザキ、大腸菌バクテリオファージがサロゲートであるヒト感染性非エンベロープ型腸内ウイルス、緑膿菌、及び同類物、並びにこれらの組み合わせ(好ましくは、黄色ブドウ球菌、リステリア・モノサイトゲネス(リステリア・イノキュアがサロゲートである)、サルモネラ菌、サッカロマイセス・セレヴィシエ、バチルス・ズブチルス、緑膿菌、大腸菌、大腸菌バクテリオファージがサロゲートであるヒト感染性非エンベロープ型腸内ウイルス、及びこれらの組み合わせ;より好ましくは、黄色ブドウ球菌、リステリア・モノサイトゲネス(リステリア・イノキュアがサロゲートである)、サッカロマイセス・セレヴィシエ、緑膿菌、及びこれらの組み合わせ)が挙げられる。
濃縮デバイスにより捕捉又は結合された(例えば、吸着又は篩い分けによる)微生物は、現在知られている、又は今後開発される本質的に任意の所望の方法によって検出可能である。このような方法には、例えば、培養による方法(時間が許す場合は好ましい場合がある)、顕微鏡(例えば透過光型顕微鏡又は落射蛍光顕微鏡(蛍光染料で標識した微生物を可視化するのに使用できる))、並びにその他の画像手法、免疫学的検出方法、及び遺伝子学的検出方法が挙げられる。微生物の捕捉後の検出プロセスは、任意に、試料マトリックスの構成要素を除去するために洗浄すること、濃縮デバイスの多孔質繊維性不織布マトリックスをスライスするか別の方法で細かくすること、細胞検体を濃縮デバイスから放出させるために染色する、沸騰させる、あるいは溶出緩衝液又は溶解剤を使用することなどを含み得る。
免疫学的検出は、標的生物に由来する抗原物質の検出であり、これは一般的に、細菌又はウイルス粒子の表面にあるマーカーとして作用する生物学的分子(例えばタンパク質又はプロテオグリカン)である。抗原物質の検出は通常、抗体、例えばファージディスプレイなどのプロセスによって選択されたポリペプチド、又はスクリーニングプロセスから得られたアプタマーによって行うことができる。
免疫学的検出方法は周知であり、それには、例えば免疫沈降及び酵素結合免疫吸着検定(ELISA)が挙げられる。抗体結合は、様々な方法で検出することができる(例えば、一次抗体又は二次抗体のいずれかを、蛍光染料で、量子ドットで、又は化学発光若しくは着色基質を生成できる酵素で標識し、プレートリーダー又はラテラルフロー装置のいずれかを用いる)。
検出はまた、遺伝子学的検定法(例えば核酸のハイブリダイゼーション又はプライマーを用いた増幅)によって実行することができ、これが好ましい方法であることが多い。捕捉又は結合された微生物は溶解され、遺伝子学的物質を検定に利用できるようにする。溶解方法は周知であり、これには例えば、音波処理、浸透性ショック、高温処理(例えば約50℃〜約100℃)、並びにリゾチーム、グルコラーゼ、チモラーゼ(zymolose)、リチカーゼ、プロテイナーゼK、プロテイナーゼE、及びウイルスエンドリシン(enolysins)などの酵素と共にインキュベーションすることが挙げられる。
一般的に使用されている遺伝子学的検出検定法の多くは、DNA及び/又はRNAを含む、具体的な微生物の核酸を検出する。遺伝子学的検出方法に使用される条件の厳密性は、検出される核酸配列の変異レベルに相関する。塩濃度及び温度の非常に厳しい条件により、標的の正確な核酸配列の検出が制限され得る。よって、標的核酸配列に小さな変異を有する微生物株は、非常に厳しい遺伝子学的検定法を使用して区別することができる。遺伝子学的検出は、核酸ハイブリダイゼーションに基づくことができ、その場合、一本鎖核酸プローブが微生物の変性核酸にハイブリッド化して、プローブ鎖を含む二本鎖核酸が生成される。当業者は、ゲル電気泳動、細管式電気泳動、又はその他の分離方法の後でハイブリッドを検出するための、放射性、蛍光、及び化学発光標識などのプローブ標識について熟知するであろう。
特に有用な遺伝子学的検出方法は、プライマーを用いた核酸の増幅に基づくものである。プライマーを用いた核酸増幅方法には、例えば、熱サイクル方法(例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)、及びリガーゼ連鎖反応(LCR))、並びに等温方法及び鎖置換増幅(SDA)(及びこれらの組み合わせ、好ましくはPCR又はRT−PCR)が挙げられる。増幅された生成物を検出する方法は、例えばゲル電気泳動分離及び臭化エチジウム染色、並びに生成物中に組み込んだ蛍光標識又は放射性標識の検出が含まれるが、これらに限定されない。増幅生成物の検出前に分離工程を必要としない方法(例えば、リアルタイムPCR又はホモジニアス検出法)も使用することができる。
生物発光検出法は周知であり、例えば、記述が参照により明細書に組み込まれる、米国特許第7,422,868号(Fanら)に記述されているものを含むアデノシン(adensosine)三リン酸(ATP)検出方法が挙げられる。他の発光に基づく検出方法も使用することができる。
本発明のプロセスは株特異性ではないため、同じ試料内で、複数の微生物株を検定のための標的にすることができる、一般的な捕捉システムを提供する。例えば、食品試料の汚染について検定を行う場合、同じ試料内でリステリアモノサイトゲネス、大腸菌、及びサルモネラの全部について試験を行うことが望ましい場合がある。捕捉工程を1回行い、次に例えば、これら微生物株それぞれの、異なる核酸配列を増幅するための固有プライマーを使用して、PCR又はRT−PCR検定を行うことができる。したがって、それぞれの株について別々の試料取扱い及び作製手順を行う必要性を回避することができる。
診断キット
本発明の濃縮プロセスを実施するために用いられるための診断キットは、(a)少なくとも1つの上述の濃縮デバイス、及び(b)本発明の濃縮プロセスの実施において使用するための少なくとも1つの試験容器又は試験試薬(好ましくは無菌の試験容器又は試験試薬)を含む。好ましくは、診断キットは、本プロセスを実施するための取り扱い説明書を更に含む。
本発明の濃縮プロセスを実施するために用いられるための診断キットは、(a)少なくとも1つの上述の濃縮デバイス、及び(b)本発明の濃縮プロセスの実施において使用するための少なくとも1つの試験容器又は試験試薬(好ましくは無菌の試験容器又は試験試薬)を含む。好ましくは、診断キットは、本プロセスを実施するための取り扱い説明書を更に含む。
有用な試験容器又はホルダーとしては上述のものが挙げられ、これを例えば、接触、インキュベーション、溶出液の捕集、又は他の所望のプロセス工程に使用することができる。有用な試験試薬としては、微生物培養又は生長媒体、溶解剤、溶出剤、緩衝液、発光検出検定構成要素(例えば、照度計、溶解剤、ルシフェラーゼ酵素、酵素基質、反応緩衝液など)、遺伝子学的検出検定構成要素など、及びこれらの組み合わせが挙げられる。好ましい溶解試薬は、緩衝液中に供給された溶解酵素又は薬品であり、好ましい遺伝子学的検出検定構成要素としては、標的微生物に固有の1つ以上のプライマーが挙げられる。キットは、場合によっては、無菌のピンセットなどを更に含むことができる。
フィルター媒体
他の実施形態において、本開示は、試料(例えば、水)から微生物汚染又は病原菌を除去するためのフィルター媒体を提供する。本開示に従って使用するのに適したフィルター媒体としては、(a)多孔質繊維性不織布マトリックス、及び(b)多孔質繊維性不織布マトリックス中に捕らえられている、複数の上述の濃縮剤の粒子と、を含むものが挙げられる。かかるフィルター媒体は、濃縮剤及び濃縮デバイスに関して上述したものと本質的に同じプロセスによって調製されることができ、かつ濃縮剤及び濃縮デバイスに関して上述したものと本質的に同じ材料を含み得る。
他の実施形態において、本開示は、試料(例えば、水)から微生物汚染又は病原菌を除去するためのフィルター媒体を提供する。本開示に従って使用するのに適したフィルター媒体としては、(a)多孔質繊維性不織布マトリックス、及び(b)多孔質繊維性不織布マトリックス中に捕らえられている、複数の上述の濃縮剤の粒子と、を含むものが挙げられる。かかるフィルター媒体は、濃縮剤及び濃縮デバイスに関して上述したものと本質的に同じプロセスによって調製されることができ、かつ濃縮剤及び濃縮デバイスに関して上述したものと本質的に同じ材料を含み得る。
本発明の目的及び利点は、以下の実施例によって更に例示されるが、これらの実施例において列挙される特定の材料及びその量は、他の諸条件及び詳細と同様に、本発明を過度に制限するものと解釈されるべきではない。以下の実施例における全ての部分、割合、比率などは、特に記載がない限り、重量によるものとする。用いた溶媒及びその他の試薬は、特に記載がない限り、Sigma−Aldrich Chemical Company(Milwaukee,WI)から入手した。全ての微生物培養物をThe American Type Culture Collection(ATCC;Manassas,VA)から購入した。特に指示しない限り、実験結果は2回の試験の平均である。トリプチックソイ寒天プレート上に選択した微生物を画線した後、プレートを37℃で一晩インキュベートすることによって、一晩培養物を調製した。全ての微生物の計数は、標準的なコロニー形成単位の微生物計数方法に従って行われ、計数は概数である。
濃縮剤
結晶質ケイ酸マグネシウム濃縮剤(以下、タルク)は、Mallinckrodt Baker,Inc.(Phillipsburg,NJ)から購入した。
結晶質ケイ酸マグネシウム濃縮剤(以下、タルク)は、Mallinckrodt Baker,Inc.(Phillipsburg,NJ)から購入した。
非晶質で回転楕円体状のケイ酸マグネシウム濃縮剤(以下、AS−タルク)は、3M(商標)Cosmetic Microspheres CM−111として入手した(固体球の形状;粒子密度2.3g/立方センチメートル;表面積3.3m2/g;粒径:約11マイクロメートルより90%小さい、約5マイクロメートルより50%小さい、約2マイクロメートルより10%小さい;3M Company(St.Paul,MN)より入手)。
ゼータ電位測定
TM200自動滴定モジュール、pH電極、及びインライン電導度セルを備えた、Colloidal Dynamics Acoustosizer II(商標)多周波数電気音響スペクトル分析器(Colloidal Dynamics,Warwick,RI)を用いて、タルク及びAS−タルク濃縮剤の水分散液(Millipore Corporation(Bedford,MA)のMilli−Q(商標)Elix 10(商標)Synthesis A10脱イオンシステムを使用することにより得られる18メガオームの脱イオン水中の、それぞれ5.75重量パーセントのタルク及び5.8重量パーセントのAS−タルク)のゼータ電位を、添加した塩化水素酸の関数(pH)として測定した。次の一般的なパラメーターの極性較正及び極性試料設定を用いて、測定を行った。
TM200自動滴定モジュール、pH電極、及びインライン電導度セルを備えた、Colloidal Dynamics Acoustosizer II(商標)多周波数電気音響スペクトル分析器(Colloidal Dynamics,Warwick,RI)を用いて、タルク及びAS−タルク濃縮剤の水分散液(Millipore Corporation(Bedford,MA)のMilli−Q(商標)Elix 10(商標)Synthesis A10脱イオンシステムを使用することにより得られる18メガオームの脱イオン水中の、それぞれ5.75重量パーセントのタルク及び5.8重量パーセントのAS−タルク)のゼータ電位を、添加した塩化水素酸の関数(pH)として測定した。次の一般的なパラメーターの極性較正及び極性試料設定を用いて、測定を行った。
pH約7で、AS−タルクは約−12mVのスモルコフスキーゼータ電位を呈し、タルクは約−8mVのスモルコフスキーゼータ電位を呈した。
表面組成分析
タルク及びAS−タルク濃縮剤の試料の表面組成をX線光電子分光法(XPS、ESCAとしても既知である)により分析した。粉末の試料を、アルミニウム箔上の両面感圧接着テープに押し付けた。圧縮窒素ガスを吹き付けることにより、過剰の粉末を各試料表面から除去した。
タルク及びAS−タルク濃縮剤の試料の表面組成をX線光電子分光法(XPS、ESCAとしても既知である)により分析した。粉末の試料を、アルミニウム箔上の両面感圧接着テープに押し付けた。圧縮窒素ガスを吹き付けることにより、過剰の粉末を各試料表面から除去した。
単色Al−Kα X線励起源(1487eV)及び一定パスエネルギーモードで動作する半球状電子エネルギー分析器を有するKratos AXIS Ultra(商標)DLD分光計(Kratos Analytical,Manchester,England)を用いて、スペクトルデータを取得した。試料表面に対して測定して90度のテイクオフ角度で±10度の受光立体角で放出光電子を検出した。低エネルギー電子フラッドガンを使用して、表面帯電を最少化した。アノードに対する140ワットの電力及び2×10−8Torrのチャンバー圧力を用いて、測定を行った。
約300マイクロメートル×約700マイクロメートルの寸法の各濃縮剤試料の表面の一領域を各データ点に対して分析した。各試料の3つの領域を分析し、平均して、報告された平均原子パーセント値を得た。標準のVision2(商標)ソフトウェア(Kratos Analytical,Manchester,England)を用いて、データ処理を行った。結果(XPSにより検出可能なレベルで濃縮剤の表面上に存在する元素)を以下の表Aに示す。
材料:
■全ての細菌及び酵母保存培養物(サッカロマイセス・セレヴィシエ(ATCC 201390)、リステリア・モノサイトゲネス(ATCC 51414)、大腸菌(ATCC 51813)、緑膿菌(ATCC 9027)、黄色ブドウ球菌(ATCC 6538)、及びリステリア・イノキュア(ATCC 33090))は、特に指定しない限り、The American Type Culture Collection(Manassas,VA)から購入した。試験用微生物を、標準的微生物学技法に従って、トリプチックソイ寒天プレート上に保存培養物を画線し、プレートを37℃で一晩インキュベートすることによって調製した画線培養物から単離した。
■全ての細菌及び酵母保存培養物(サッカロマイセス・セレヴィシエ(ATCC 201390)、リステリア・モノサイトゲネス(ATCC 51414)、大腸菌(ATCC 51813)、緑膿菌(ATCC 9027)、黄色ブドウ球菌(ATCC 6538)、及びリステリア・イノキュア(ATCC 33090))は、特に指定しない限り、The American Type Culture Collection(Manassas,VA)から購入した。試験用微生物を、標準的微生物学技法に従って、トリプチックソイ寒天プレート上に保存培養物を画線し、プレートを37℃で一晩インキュベートすることによって調製した画線培養物から単離した。
■以下の繊維はMinifibers,Inc.(Johnson City,TN)から入手した。
−繊維1−1デニールのフィブリル化ポリエチレン繊維(FYBREL(商標)620)
−繊維2−フィブリル化ポリエチレン繊維(FYBREL(商標)400)
−繊維3−6デニール、長さ3.125mm(0.125インチ)のナイロン短繊維
−繊維4−6デニール、長さ6.25mm(0.25インチ)のナイロン短繊維
−繊維5−6デニール、長さ12.5mm(0.5インチ)のナイロン短繊維
−繊維7−1デニールのエチレンビニルアセテート(シース)/ポリプロピレン(コア)2成分繊維
■繊維6−長ガラス繊維(Schuller,Inc.(Denver,CO)のMicro−Strand 106−475 Glass繊維ガラス)
■ラテックスバインダー−Air Products Polymers(Allentown,PA)からAirflex 600BPとして購入した50重量%(wt%)固形分酢酸ビニルエマルション
■凝集剤−MP 9307凝集剤(ジメチルアミンとエピクロロヒドリンとのコポリマーの水溶液と考えられる)、Midsouth Chemical Co.,Inc.,Riggold,LA
■AS−タルク−非晶質ケイ酸マグネシウム回転楕円体(上述した3M Company(Paul,MN)から入手の3M(商標)Cosmetic Microspheres CM−111)
■BHIブロス−DIFCO(商標)Bovineハートインフュージョンブロス、Becton Dickinson(Sparks,MD)の汎用増殖培地、メーカーの説明書に従って3.7重量%(wt%)濃度で調製
■緩衝液−Butterfield緩衝液、pH 7.2±0.2;リン酸2水素カリウム緩衝液;VWRカタログ番号83008−093;VWR,West Chester,PA
■トリプチックソイ寒天プレート−Becton Dickinson(Sparks,MD)のDifco(商標)トリプチックソイ寒天、Difco(商標)トリプチックソイブロス(Becton Dickinson,Sparks,MD)を使用してメーカーの説明書に従って3重量%(wt%)で調製
■MOXプレート−Oxford培地、リステリア菌用に変更、Hardy Diagnostics(Santa Maria,CA)より入手の寒天系増殖培地
■YPD寒天プレート−5重量%のDifco(商標)Yeast Extract Peptone Dextose粉末及び1.5重量%のDifco(商標)寒天粉末を用いてメーカーの説明書に従って調製した寒天プレート(粉末は共にBecton Dickinson(Sparks,MD)より入手)
■大腸菌プレート−3M(商標)Petrifilm(商標)E.coli/Coliform計測プレート(少なくとも1つの発酵性栄養素を含む平板型フィルム培養デバイス);3M Company,St.Paul,MN
■ACプレート−3M(商標)Petrifilm(商標)好気性菌計測プレート(再水和可能な乾燥培地を含む平板型フィルム培養デバイス);3M Company,St.Paul,MN
■Y/Mプレート−3M(商標)Petrifilm(商標)Yeast and Mold計測プレート(再水和可能な乾燥培地を含む平板型フィルム培養デバイス);3M Company,St.Paul,MN
■PIAプレート−Teknova製のシュードモナス分離寒天培地;VWR(West Chester,PA)より購入
■C−寒天プレート−BBL(商標)CHROMagar(商標)黄色ブドウ球菌プレート(寒天系増殖培地;Becton Dickinson製;VWR(West Chester,PA)より購入)
■注射器−BD Luer−Lok(商標)チップシリンジ;VWR(West Chester,PA)より購入
■Elisa検定−3M(商標)TECRA(商標)リステリア菌可視イムノ検定キット;3M Company(St.Paul,MN)
■ストマッカー及びストマッカーバッグ−Stomacher(商標)400サーキュレータラボラトリーブレンダー及びStomacher(商標)ポリエチレンフィルターバッグ、Seward Corp.(Norfolk,UK);VWR(West Chester,PA)より購入
用語
■多孔質繊維性不織布マトリックス−以下の実施例及び比較例では、乾燥フェルト、パッド、マトリックス、ディスク、又はフィルターと呼ばれる場合もある。
■多孔質繊維性不織布マトリックス−以下の実施例及び比較例では、乾燥フェルト、パッド、マトリックス、ディスク、又はフィルターと呼ばれる場合もある。
■固形物滞留−用語「固形物滞留」は、パッド形成プロセス中に多孔質繊維性不織布マトリックス中に留まる全固形物の重量パーセントを指す。完成した乾燥多孔質不織布繊維マトリックスの総重量を、凝集剤以外のマトリックスを作製するために使用した全固形物の総重量(例えば、ラテックスバインダーの固形物、繊維、及びAS−タルクの総重量)で割って計算された。
■CFU−コロニー形成単位
■コロニー数−微生物コロニーは、特に明記しない限り、標準的な微生物学的手順に従って手作業で計数された。全てのコロニー計数は概数であった。
■濾液数−濾液中の微生物コロニーの数
■前濾過数−前濾過試料中の微生物コロニーの数
■MCE−多孔質繊維性不織布マトリックスの微生物捕捉効率(又は結合効率)は、マトリックスがいかに良好に微生物を捕捉するかの評価である。MCE(パーセント(%))は次式によって決定された。
MCE=100−[(濾液計数/前濾過計数)×100]
MCE=100−[(濾液計数/前濾過計数)×100]
実施例1〜17及び比較例C1〜C4:濃縮デバイス1〜17及びC1〜C4の調製
表1に示される繊維及び水の組成を有する繊維プレミックスを調製した。各繊維プレミックスは、最初にフィブリル化繊維(繊維1又は繊維2)と指定された量の水道水とを、4Lのブレンダー(Waringの市販のHeavy Duty Blender、モデル37BL84)内で中速で90秒間ブレンドすることによって調製された。繊維が癒着(nits)又は塊なく均一に分散されたことを確実にするために繊維を検査し、必要ならば、あらゆる塊を粉砕するために繊維を更にブレンドした。次に、更にブレンドしながら他の指定された繊維を加えた後、指定された量のプレミックスをステンレス鋼製ビーカーに加え、速度設定4のインペラミキサー(Fisher Scientific Stedfast Stirrer モデルSL2400、VWR(West Chester,PA)より入手可能)を使用して5分にわたって混合した。ラテックスバインダーは、使用する場合、50mLビーカー内の約25mLの水道水中に分散され、プレミックスに添加された。50mLビーカーを更に25mLの水道水ですすぎ、これもプレミックスに加え、得られた混合物を約2分にわたってブレンドした。凝集剤は、使用する場合、同様にビーカー内の約25mLの水道水中に分散され、ブレンドしながら混合物に加えられた後、ビーカーからの別の25mLのすすぎ水を加えた。ラテックスバインダーが溶液から繊維上に析出し、プレミックスの液相は、濁った状態から実質的に透明に変化した。次いで、AS−タルク粒子を混合物に加え、1分間ボルテックス混合した。
表1に示される繊維及び水の組成を有する繊維プレミックスを調製した。各繊維プレミックスは、最初にフィブリル化繊維(繊維1又は繊維2)と指定された量の水道水とを、4Lのブレンダー(Waringの市販のHeavy Duty Blender、モデル37BL84)内で中速で90秒間ブレンドすることによって調製された。繊維が癒着(nits)又は塊なく均一に分散されたことを確実にするために繊維を検査し、必要ならば、あらゆる塊を粉砕するために繊維を更にブレンドした。次に、更にブレンドしながら他の指定された繊維を加えた後、指定された量のプレミックスをステンレス鋼製ビーカーに加え、速度設定4のインペラミキサー(Fisher Scientific Stedfast Stirrer モデルSL2400、VWR(West Chester,PA)より入手可能)を使用して5分にわたって混合した。ラテックスバインダーは、使用する場合、50mLビーカー内の約25mLの水道水中に分散され、プレミックスに添加された。50mLビーカーを更に25mLの水道水ですすぎ、これもプレミックスに加え、得られた混合物を約2分にわたってブレンドした。凝集剤は、使用する場合、同様にビーカー内の約25mLの水道水中に分散され、ブレンドしながら混合物に加えられた後、ビーカーからの別の25mLのすすぎ水を加えた。ラテックスバインダーが溶液から繊維上に析出し、プレミックスの液相は、濁った状態から実質的に透明に変化した。次いで、AS−タルク粒子を混合物に加え、1分間ボルテックス混合した。
TAPPI(商標)パッドメーカー装置(pad maker apparatus)(Williams Apparatus(Watertown,NY))を使用してフェルトを調製した。この装置は、約20cm(8インチ)の正方形で深さ20cm(8インチ)の密閉箱を有し、この密閉箱は、底部の近くに細目スクリーン、及びこのスクリーンの下に排水弁を有していた。この箱のスクリーンの上方約1cmの高さまで水道水を充填した。粒子含有混合物を箱に注ぎ込み、弁を直ちに開いて、箱から水を引き出す真空を形成した。得られた湿式フェルトの厚さは約3mmであった。
この湿式フェルトを、装置から吸い取り紙のシート(20cm×20cm(8インチ×8インチ)、96ポンド(43.5kg)の白色紙、Anchor Paper(St.Paul,MN))の上に移した。フェルトを、フェルトの水分に応じて2〜4層の吸い取り紙の間に挟み、排出される水がもはや見られなくなるまで、空気で動くプレスセットの中の2つの強化スクリーンの間で、413kPa(60psi)(約82.7kPa(12psi)の圧力がフェルトに加わるように算出される)にて1〜2分間圧縮した。次に、圧縮されたフェルトを新しい吸い取り紙のシート上に移し、150℃に設定されたオーブン(Blue M,Blue Island,IL;Stabil−Therm(商標)モデルOV−560A2)内に約40分間入れて残留水を除去し、ラテックスバインダーを硬化及び/又はポリマーバインダー繊維を融解した。
実施例3〜5及びC2では、濡れた状態のフェルトをパッドメーカーの中に残し、重い(約5kg(10ポンド))ステンレス鋼製ローラーをフェルト上で転がして、フェルトから水分を取り除いた。次に、本質的に上記の手順に従ってフェルトを拭い取った。
実施例16は、ラテックスバインダーを添加する前にAS−タルク粒子を繊維プレミックスに加えたこと以外は、本質的に上記手順によって調製された。
得られた多孔質繊維性不織布マトリックスをプラスチックバッグの中に密封し、0.5kGy/時間で総線量4kGy、8時間ガンマ線照射するか、又は121℃で15分間オートクレーブして、マトリックスを滅菌した。正方形の試料マトリックス(20cm×20cm(8インチ×8インチ))を選択された実施例のマトリックスから切断し、秤量し、表2に示されるようにこれら試料マトリックスの固形物滞留の値を決定した。
実施例18〜20及び比較例C5:濃縮デバイス3〜5及びC2の試験
画線培養物から単離されたリステリア・イノキュアコロニーを5mLのBHIブロスに接種し、30℃で一晩(18〜20時間)インキュベートした。108CFU/mL(コロニー形成単位/mL)の一晩培養物を緩衝液で希釈し、100mLのBHIブロスに接種して、104CFU/mL(合計で106CFU)を有する細菌懸濁液を得た。
画線培養物から単離されたリステリア・イノキュアコロニーを5mLのBHIブロスに接種し、30℃で一晩(18〜20時間)インキュベートした。108CFU/mL(コロニー形成単位/mL)の一晩培養物を緩衝液で希釈し、100mLのBHIブロスに接種して、104CFU/mL(合計で106CFU)を有する細菌懸濁液を得た。
円形ディスク(直径48mm)を実施例3、5、及びC2のマトリックスから打ち抜き、121℃で15分間オートクレーブして、滅菌した。ディスクを正圧手動濾過装置(positive pressure manual filtration device)の薄膜支持体上に置き、この支持体を装置のフィルター本体に取り付けた。この装置は、国際公開特許番号WO2008/150779(図1A及び1B)に記載されている。細菌懸濁液を装置に注ぎ込み、プランジャで押して濾液を得た。この手順を各ディスクに対して実施した。
100マイクロリットル体積の2つの濾液及び前濾過対照を、緩衝液で1:10、1:100、及び1:1000に希釈し、MOXプレート上に塗り、37℃で18〜20時間インキュベートした。コロニーを手作業で計数し、微生物捕捉効率(MCE)を算出した。結果を表3に示す。
実施例21〜24:濃縮デバイス3の試験
表4に示される濃度を有するリステリア・イノキュアの細菌懸濁液を、本質的に実施例18の手順に従って一晩培養物から調製した。この懸濁液を、正圧手動濾過装置を使用して、実施例3で調製されたマトリックスの直径48mmの滅菌済みディスクを通して濾過した。得られた濾液及び濾過前の懸濁液の試料を、本質的に実施例18の手順に従って希釈し、塗り、インキュベートした。コロニーを手作業で計数し、微生物捕捉効率を算出した。結果を表4に示す。
表4に示される濃度を有するリステリア・イノキュアの細菌懸濁液を、本質的に実施例18の手順に従って一晩培養物から調製した。この懸濁液を、正圧手動濾過装置を使用して、実施例3で調製されたマトリックスの直径48mmの滅菌済みディスクを通して濾過した。得られた濾液及び濾過前の懸濁液の試料を、本質的に実施例18の手順に従って希釈し、塗り、インキュベートした。コロニーを手作業で計数し、微生物捕捉効率を算出した。結果を表4に示す。
実施例25及び26:濃縮デバイス4の試験
BHIブロス中のリステリア・イノキュアの細菌懸濁液(100mL及び250mL)を本質的に実施例18の手順に従って調製し、各細菌懸濁液は、105CFU/mL(合計で107CFU)の最終濃度を有していた。実施例4からのマトリックスの直径48mmの滅菌済みディスクを正圧手動濾過装置に入れ、100mLの細菌懸濁液をプランジャで押してこのディスクに通過させた。装置を分解して、ディスクを滅菌した培養皿に移し、更に分析した。清浄なディスクを使用して装置を再組立し、250mLの細菌懸濁液をプランジャで押して通過させた。手動濾過装置の容量は100mLであったので、250mLの細菌懸濁液は、100mL、100mL、及び50mLの量でプランジャで押された。懸濁液は全てディスクを通過し、これは目詰まりがなかったということを示している。得られた濾液、並びに濾過していない対照懸濁液を、本質的に実施例18の手順に従って希釈し、塗り、インキュベートした。コロニーを手作業で計数し、微生物捕捉効率を算出した。結果を表5に示す。
BHIブロス中のリステリア・イノキュアの細菌懸濁液(100mL及び250mL)を本質的に実施例18の手順に従って調製し、各細菌懸濁液は、105CFU/mL(合計で107CFU)の最終濃度を有していた。実施例4からのマトリックスの直径48mmの滅菌済みディスクを正圧手動濾過装置に入れ、100mLの細菌懸濁液をプランジャで押してこのディスクに通過させた。装置を分解して、ディスクを滅菌した培養皿に移し、更に分析した。清浄なディスクを使用して装置を再組立し、250mLの細菌懸濁液をプランジャで押して通過させた。手動濾過装置の容量は100mLであったので、250mLの細菌懸濁液は、100mL、100mL、及び50mLの量でプランジャで押された。懸濁液は全てディスクを通過し、これは目詰まりがなかったということを示している。得られた濾液、並びに濾過していない対照懸濁液を、本質的に実施例18の手順に従って希釈し、塗り、インキュベートした。コロニーを手作業で計数し、微生物捕捉効率を算出した。結果を表5に示す。
100mL及び250mLの濾過工程の後の濾過後のディスクを滅菌済みのハサミで分断し、緩衝液1mLの入った滅菌した50mLポリプロピレン製遠心分離管に加えて沸騰させた。次に、メーカーの説明書に従ってディスクをELISA検定で処理し、陽性であることが見出された(キットの参照カードを使用した目視イムノアッセイ)。
表5のデータは、ディスクが、使用した比較的大きな試料体積中の細菌を効果的に濃縮したことを示している。細菌懸濁液は、初期の100mL又は250mLから、ELISA検定で必要な少量(1mL未満)に濃縮された(表5の濃度倍数を参照のこと)。緩衝液中で沸騰させてもディスクは崩壊せず、ディスク材料は検定を有意に妨げなかった。
実施例27〜29及び比較例C6:濃縮デバイス4、6、7、及びC3の試験
側部真空ポートを有する1000mLのフラスコに、多孔質繊維性不織布マトリックス又はフィルターの支持体としての役割を果たす焼結ストッパーを取り付けた。支持体領域は、多孔質繊維性不織布マトリックスの直径36mm又は直径48mmの滅菌済み円形ディスクを保持するように寸法設定された。シリンダの上部及び底部周囲にフランジリムを有する開口収集シリンダ(最大容積100mL)をフラスコに固定し、それらの間にストッパーを固定した。フラスコと真空ポートを備えた栓とを可撓性のホースで接続して、真空濾過装置を提供した。装置は、各使用期間に先立ち、121℃にて15分間オートクレーブすることによって滅菌され、使用中は、各試料を濾過した後70重量%(wt%)のエタノール及び蒸留水ですすがれた。
側部真空ポートを有する1000mLのフラスコに、多孔質繊維性不織布マトリックス又はフィルターの支持体としての役割を果たす焼結ストッパーを取り付けた。支持体領域は、多孔質繊維性不織布マトリックスの直径36mm又は直径48mmの滅菌済み円形ディスクを保持するように寸法設定された。シリンダの上部及び底部周囲にフランジリムを有する開口収集シリンダ(最大容積100mL)をフラスコに固定し、それらの間にストッパーを固定した。フラスコと真空ポートを備えた栓とを可撓性のホースで接続して、真空濾過装置を提供した。装置は、各使用期間に先立ち、121℃にて15分間オートクレーブすることによって滅菌され、使用中は、各試料を濾過した後70重量%(wt%)のエタノール及び蒸留水ですすがれた。
実施例4、6、7、及びC3の多孔質繊維性不織布マトリックスからディスクを打ち抜き、滅菌処理した。実施例4及び6からのディスクは直径48mmであり、実施例7及びC3からのディスクは直径36mmであった。
それぞれが約105CFU/mL(合計107CFU)を含有する、BHIブロス中のリステリア・イノキュアの細菌懸濁液100mLを、本質的に実施例18の手順に従って調製した。各ディスクに関し、懸濁液を収集シリンダに注ぎ込み、真空を適用した。
得られた濾液、並びに前濾過懸濁液を、本質的に実施例18の手順に従って希釈し、塗り、インキュベートした。コロニーを手作業で計数し、微生物捕捉効率を算出した。結果を表6に示す。
真空濾過を用いたので、濾過は比較的迅速に達成された。それにもかかわらず、濃縮デバイス4、6、及び7のディスクによる細菌捕捉は、70%を超えていた。
実施例30並びに比較例C7及びC8:濃縮デバイス9及びC3の試験並びに粒子状濃縮剤のみ(AS−タルク)との比較
リステリア・モノサイトゲネス(ATCC 51414)の画線培養物を使用して、3mLのBHIブロス中でDensiCHEK(商標)濃度計(bioMerieux,Inc.(Durham,NC))を使用して0.5マクファーランド標準(分散した微生物を含む濁度標準)を調製した。約103CFU/mLを含有する細菌懸濁液を得るために、約108CFU/mLを含有する得られた細菌ストックをBHIブロスで連続的に希釈した。
リステリア・モノサイトゲネス(ATCC 51414)の画線培養物を使用して、3mLのBHIブロス中でDensiCHEK(商標)濃度計(bioMerieux,Inc.(Durham,NC))を使用して0.5マクファーランド標準(分散した微生物を含む濁度標準)を調製した。約103CFU/mLを含有する細菌懸濁液を得るために、約108CFU/mLを含有する得られた細菌ストックをBHIブロスで連続的に希釈した。
直径14mmのディスクを実施例9のマトリックスから打ち抜き、滅菌処理し、フィルターホルダー(直径13mmのSwinnex(商標)フィルターホルダー;Millipore Corp.,Bedford,MA)に挿入した。3立方センチメートル(cc)の注射器を使用して1.5mLの細菌懸濁液をホルダーのディスクの上に供給した。懸濁液を手作業で濾過し、濾過は20秒で完了した。実施例C3からのディスクも調製し、同じ方法で試験し、同じ時間内で濾過した。
得られた濾液を100マイクロリットル体積(不希釈)でMOXプレート上に塗った。各試験後に表面が滅菌されたピンセットを使用してディスクをフィルターホルダーから取り外し、100マイクロリットルの緩衝液でMOXプレート上を塗った。平板を37℃で18〜20時間インキュベートした。コロニーを手作業で計数し、微生物捕捉効率を算出した。結果を表7に示す。
実施例C5は、20mgのAS−タルク粉末を、滅菌した5mLポリプロピレン管(VWR(West Chester,PA)から入手のBD Falcon(商標))の中の1.1mLの細菌懸濁液に加えることによって調製された。管に蓋をし、1分当り14サイクルで揺動する揺動プラットフォーム(Thermolyne Vari Mix(商標)揺動プラットフォーム;Barnstead International(Iowa))の上に20秒間置いた。次いで、管をスタンドに1分間移し(tranferred)、その後AS−タルク粉末のほとんどの粒子は管の底に沈殿した。
(懸濁したAS−タルク粒子を含有している)100マイクロリットル体積の得られた上澄みをMOXプレート上に塗り、本質的にディスクのプレートと同じ方法で処理(インキュベート)した。100マイクロリットル体積の細菌懸濁液を1:10に希釈し、更に、本質的に対照(前濾過試料)と同じ方法で塗りインキュベートした。対照上のコロニー数は2600CFUであった。コロニーを手作業で計数し、微生物捕捉効率を算出した。結果を表7に示す。
実施例31並びに比較例C9及びC10:濃縮デバイス2及びC1並びに市販のナイロンフィルターの試験
七面鳥の挽肉(脂肪分12%と標示)を近くのスーパーで購入した。七面鳥の挽肉11gを殺菌したストマッカーバッグに入れ、ストマッカー内で毎分回転数(rpm)230の速度で30秒間、緩衝液99mLと共にブレンドした。ブレンドした試料を、実施例2のマトリックスの48mmの滅菌済みディスクを収容している上記正圧手動濾過装置(実施例18参照)に注ぎ込んだ(実施例31)。100mLのブレンド試料がディスクを通過するまで装置のプランジャを押し進めることによって正圧を加え、濾過時間を記録した。実施例C1のディスク(比較例C9)、及び3M Purification,Inc.(St.Paul,MN)から入手した0.45マイクロメートルのナイロンフィルター(比較例C10)を使用して、手順を繰り返した。結果を下表8に示す。
七面鳥の挽肉(脂肪分12%と標示)を近くのスーパーで購入した。七面鳥の挽肉11gを殺菌したストマッカーバッグに入れ、ストマッカー内で毎分回転数(rpm)230の速度で30秒間、緩衝液99mLと共にブレンドした。ブレンドした試料を、実施例2のマトリックスの48mmの滅菌済みディスクを収容している上記正圧手動濾過装置(実施例18参照)に注ぎ込んだ(実施例31)。100mLのブレンド試料がディスクを通過するまで装置のプランジャを押し進めることによって正圧を加え、濾過時間を記録した。実施例C1のディスク(比較例C9)、及び3M Purification,Inc.(St.Paul,MN)から入手した0.45マイクロメートルのナイロンフィルター(比較例C10)を使用して、手順を繰り返した。結果を下表8に示す。
近くのスーパーで購入した殺菌されたパルプを含まないオレンジジュースを使用してこの手順を繰り返した。11g体積のジュースを99mLの緩衝液に加え、約1分間かき回して混合し、得られた試料100mLを濾過した。濾過時間を測定し、結果が表8に示されている。
表8のデータは、肉及びジュース試料が実施例31及び比較例C9のディスクを通して無事に濾過され、該ディスクは、比較例C10の標準的な微生物学的フィルターよりも目詰まりに対して抵抗を有していたことを示している。
実施例32〜43及び比較例C11〜C13:濃縮デバイス6、8〜17、C3〜C4、及び市販のポリカーボネートフィルター膜の試験
冷凍牛挽肉(脂肪分15%と標示)を近くのスーパーで購入した。解凍した牛挽肉11gを殺菌したストマッカーバッグ内の緩衝液99mLと共にブレンドし、ストマッカー内で230rpmで30秒間処理した。表9に示される実施例及び比較例からのマトリックスのディスクを、本質的に実施例31の手順に従って試験した。市販のフィルター膜(直径14mmのWhatman、0.22マイクロメートルのポリカーボネートフィルター膜、VWR(West Chester,PA)より購入)も同様に、比較例C13として試験した。目詰まり及び流れ停止前にディスク又は膜を通過したブレンドされた牛肉の体積、並びに目詰まり及び流れ停止前の通過期間を記録し、表9に示す。
冷凍牛挽肉(脂肪分15%と標示)を近くのスーパーで購入した。解凍した牛挽肉11gを殺菌したストマッカーバッグ内の緩衝液99mLと共にブレンドし、ストマッカー内で230rpmで30秒間処理した。表9に示される実施例及び比較例からのマトリックスのディスクを、本質的に実施例31の手順に従って試験した。市販のフィルター膜(直径14mmのWhatman、0.22マイクロメートルのポリカーボネートフィルター膜、VWR(West Chester,PA)より購入)も同様に、比較例C13として試験した。目詰まり及び流れ停止前にディスク又は膜を通過したブレンドされた牛肉の体積、並びに目詰まり及び流れ停止前の通過期間を記録し、表9に示す。
近くのスーパーで購入した豆乳を使用して第2組の同じマトリックスを試験した。豆乳11mLを緩衝液99mLと共にかき回して試料を調製した。結果を表9に示す。
実施例43:濃縮デバイス14の試験
30℃でインキュベートしたYPD寒天プレートからのサッカロマイセス・セレヴィシエ(ATCC 201390)の画線培養物を使用して、3mLのビール中で0.5マクファーランド標準を調製した。ビールは地元の小売店で購入した。約106CFU/mLを含有する得られた酵母ストックを、非添加(unspiked)ビールで連続して希釈して、105CFU/mLを含有する酵母懸濁液を得た。懸濁液の1:100希釈物を100mLのビールに接種して、10CFU/mLを得た(合計で試料中約1000CFU)。添加(spiked)ビールを、実施例14から打ち抜いた14mm滅菌済みディスクを収容している上記フィルターホルダーに、20ccの注射器を使用して5回に分けて供給した。100mLの試料全てがディスクを通過した後、フィルターホルダーを分解し、表面が滅菌されたピンセットを使用してディスクを空の滅菌された1.5mLポリプロピレンキュベット(3M(商標)CLEAN−TRACE(商標)Surface ATPサンプリング装置;3M Company,St.Paul,MN)に移した。
30℃でインキュベートしたYPD寒天プレートからのサッカロマイセス・セレヴィシエ(ATCC 201390)の画線培養物を使用して、3mLのビール中で0.5マクファーランド標準を調製した。ビールは地元の小売店で購入した。約106CFU/mLを含有する得られた酵母ストックを、非添加(unspiked)ビールで連続して希釈して、105CFU/mLを含有する酵母懸濁液を得た。懸濁液の1:100希釈物を100mLのビールに接種して、10CFU/mLを得た(合計で試料中約1000CFU)。添加(spiked)ビールを、実施例14から打ち抜いた14mm滅菌済みディスクを収容している上記フィルターホルダーに、20ccの注射器を使用して5回に分けて供給した。100mLの試料全てがディスクを通過した後、フィルターホルダーを分解し、表面が滅菌されたピンセットを使用してディスクを空の滅菌された1.5mLポリプロピレンキュベット(3M(商標)CLEAN−TRACE(商標)Surface ATPサンプリング装置;3M Company,St.Paul,MN)に移した。
100マイクロリットルの酵素系及び50マイクロリットルのキットの抽出剤(3M(商標)CLEAN−TRACE(商標)Surface ATPシステム;3M Company,St.Paul,MN)をキュベットに加えて、濃縮された試料を調製した。キュベットの内容物を、ボルテックスミキサー(VWR(商標)Fixed Speedボルテックスミキサー;VWR,West Chester,PA)上で約3200rpmで5秒間ボルテックスすることによって混合した。ベンチトップ型照度計(bench-top luminometer)(Turner Biosystems(Sunnyvale,CA)の20/20nシングルチューブルミノメーター)を使用して相対光単位(RLU)を10秒おきに1分間測定することにより、濃縮試料のATP信号を決定した。ルミノメーターと共に供給された20/20n SISソフトウェアを使用して、ルミノメーターから発光値(ATP信号)を得た。結果を表10に示す。
ATP信号は、104CFU/mLの酵母ストックの1:10希釈物からの103CFU(103CFU対照)を含有する酵母懸濁液100マイクロリットルを使用して(100%信号対照)、及び濾過されていない添加ビール飲料100マイクロリットルを使用して(添加ビール対照)、対照に関しても、上記手順に従って決定された。バックグラウンドATP濃度は、100mLの非添加ビールを実施例14の多孔質繊維性不織布マトリックスを通して濾過して、非添加濾液を得、対照マトリックスを得るために上記手順に従って使用したマトリックスを処理することによって調製された試料に対して決定された。100マイクロリットル体積のビールのみ(濾過せず)も試験した(非添加ビール対照)。結果を表10に示す。
表10に示されるATP信号(%)を(非添加ビール対照からバックグラウンドATP信号を差し引いた後の濃縮試料から得たRLU値(補正RLU)及び103CFU対照からのRLUに基づいて)次の通りに算出した。
ATP(%)=(補正RLU/103CFU対照からのRLU)×100
ATP(%)=(補正RLU/103CFU対照からのRLU)×100
100mLのビール試料(添加ビール対照、並びに104CFU/mL酵母ストックの1:100希釈試料)のうちの1mLをメーカーの説明書に従ってY/Mプレート上に塗ることによって、酵母数を決定した。希釈試料は合計で1060CFUの酵母細胞を有した。
データは、濃縮試料からのサッカロミセス・セレビシエのATP信号が、未濾過の添加対照の約8倍であったことを示している。
実施例44〜45及び比較例C14:濃縮デバイス12、13、及びC4の試験
リステリア・モノサイトゲネスの画線培養物を使用して、3mLのBHIブロス中で0.5マクファーランド標準を調製した。約103CFU/mL含有する細菌懸濁液を得るために、108CFU/mLを含有する得られた細菌ストックをBHIブロスで連続的に希釈した。
リステリア・モノサイトゲネスの画線培養物を使用して、3mLのBHIブロス中で0.5マクファーランド標準を調製した。約103CFU/mL含有する細菌懸濁液を得るために、108CFU/mLを含有する得られた細菌ストックをBHIブロスで連続的に希釈した。
実施例12のマトリックスから14mmのディスクを打ち抜き、フィルターホルダーに挿入し、本質的に実施例30に記載の手順に従って試験した。1.5mL体積の懸濁液は、15秒で完全にディスクを通過した。実施例13及び比較例C4からのディスクを使用して濾過を繰り返した。各ディスクから得られた濾液、並びに未濾過の細菌懸濁液(対照)を100マイクロリットル体積のMOX寒天プレートに塗り、37℃で18〜20時間インキュベートした。コロニーを手作業で計数し、微生物捕捉効率を決定した。未濾過対照試料は2800CFU/mLを有していた。結果を表11に示す。
表面が滅菌されたピンセットを使用して各試験の使用済みディスクをフィルターホルダーから取り外し、100マイクロリットルの緩衝液をMOXプレート上に塗った。プレートを37℃で18〜20時間インキュベートした。全てのプレートはリステリア・モノサイトゲネスの増殖を示した。
実施例46〜49:濃縮デバイス8及び12の試験
緑膿菌(ATCC 9027)の画線培養物を使用して、3mLの濾過した蒸留脱イオン水(Milli−Q(商標)Gradient脱イオン化系から入手の18メガオーム水;Millipore Corporation(Bedford,MA))中で0.5マクファーランド標準を調製した。102CFU/mLの水中細菌懸濁液を得るために、108CFU/mLを含有する得られた細菌ストックを同じ水で連続的に希釈した。
緑膿菌(ATCC 9027)の画線培養物を使用して、3mLの濾過した蒸留脱イオン水(Milli−Q(商標)Gradient脱イオン化系から入手の18メガオーム水;Millipore Corporation(Bedford,MA))中で0.5マクファーランド標準を調製した。102CFU/mLの水中細菌懸濁液を得るために、108CFU/mLを含有する得られた細菌ストックを同じ水で連続的に希釈した。
実施例8の多孔質繊維性不織布マトリックスの14mmディスク(厚さ1.066mm)を打ち抜き、上記のフィルターホルダーに挿入した。1mL体積の細菌懸濁液を、本質的に実施例30に記載の手順に従って手作業で濾過した。濾過は15秒で完了した。得られた濾液をメーカーの説明書に従ってACプレート上に塗った。表面が滅菌されたピンセットを使用してディスクをフィルターホルダーから取り外し、100マイクロリットルの緩衝液をPIAプレート上に塗った。
実施例12からのマトリックスのディスク(厚さ1.336mm)を使用して手順を繰り返した。1mL体積の水中細菌懸濁液も対照としてACプレート上に塗った。全てのプレートを37℃で18〜20時間インキュベートした。ACプレート上の塗られた濾液からのコロニー数をメーカーの説明書に従って得た。未濾過細菌懸濁液のコロニー数は140CFU/mLであった。微生物捕捉効率の結果を表12に示す。
黄色ブドウ球菌(ATCC 6538)細菌懸濁液を、黄色ブドウ球菌の画線培養物から本質的に同じ方法で調製した。懸濁液を、実施例8及び12のマトリックスから打ち抜かれたディスクを通して濾過し、得られた濾液を、本質的に緑膿菌に関して記載された手順に従って微生物捕捉効率に関して分析した。未濾過細菌懸濁液のコロニー数は170CFU/mLであった。結果を表12に示す。使用済みディスクをC−寒天プレート上に塗り、本質的に緑膿菌で用いた手順に従って処理した。
(緑膿菌の細菌懸濁液が通過したディスクを含む)全てのPIAプレートは、緑膿菌が存在するという特徴である黄緑の色素を呈した。(黄色ブドウ球菌の細菌懸濁液が通過したディスクを含む)全てのC−寒天プレートは、黄色ブドウ球菌が存在するという特徴であるオレンジ−マゼンダ色を呈した。
実施例50−水濾過実施例
血液寒天プレート(5%羊血液を有するトリプチックソイ寒天、Hardy Diagnostics,Santa Maria,CA)上の大腸菌(ATCC 51813)の画線培養物を37℃で一晩インキュベートした。この培養物を使用して、3mLのButterfield緩衝液中でDensiCHEK(商標)濃度計(bioMerieux,Inc.(Durham,NC))を使用して0.5マクファーランド標準を調製した。1×108CFU/mLを含有する得られた細菌ストックを、Butterfield緩衝液で連続的に希釈して、約1×106CFU/mLを有する接種材料を得た。
血液寒天プレート(5%羊血液を有するトリプチックソイ寒天、Hardy Diagnostics,Santa Maria,CA)上の大腸菌(ATCC 51813)の画線培養物を37℃で一晩インキュベートした。この培養物を使用して、3mLのButterfield緩衝液中でDensiCHEK(商標)濃度計(bioMerieux,Inc.(Durham,NC))を使用して0.5マクファーランド標準を調製した。1×108CFU/mLを含有する得られた細菌ストックを、Butterfield緩衝液で連続的に希釈して、約1×106CFU/mLを有する接種材料を得た。
100mLの脱イオン水(MilliQ Gradient system(Millipore,Ma))に1:100希釈の106細菌/接種材料1mLを接種することによって試験試料を調製し、104CFU/mLを含有する水試験試料を得た(水中で合計106CFU)。
接種した水試料を、表13に示される繊維性不織布マトリックスの直径47mm打ち抜きディスクを保持している濾過装置を通してポンプで送った。装置は、フィルターディスクを本体に保持するための支持体スクリーンを有する、直径約60mm及び高さ約115mmのポリカーボネート製の円筒形本体を有していた。本体の上端部は、壁厚1/8”(0.32cm)のPVCチューブ(カタログ番号60985−522;VWR;Batavia,IL)によって蠕動ポンプ(モデル番号7553−70;Cole Parmer)に取り付けられた入口ポートを有するねじ付きキャップで閉じられた。水試料を濾過装置に供給するためにポンプを使用した。下端部は出口ポートを有し、円筒の底部を閉じるためにねじ山が付けられていた。漏れを防止するために螺合部品の間にOリングを配置した。空気をパージすることができるように、装置を上流側で通気した。
各マトリックスを2回試験した。接種した水の100mL試料を、濾過装置の中に70mL/分の流量でポンプで送った。殺菌した100mLのポリプロピレン製ビーカー内に濾液を収集した。各過試験の後、装置を分解し、無菌のピンセットを使用してディスクを取り出した。各試験の間に、フィルターを通した500mLの滅菌脱イオン水で濾過装置をすすいだ。
100マイクロリットル体積の各濾液及び前濾過懸濁液を、Butterield緩衝液で1:10及び1:100に希釈し、大腸菌プレート上に塗った。平板を37℃で18〜20時間インキュベートした。メーカーの説明書に従ってプレートからのコロニー数を測定した。対数減少値(LRV)は、水フィルターの細菌除去能力の指標である。この値は、塗られた濾過試料及び前濾過試料から得た計数に基づき、次の式を用いて算出された。
LRV=(前濾過試料中のCFU/mLの対数)−(濾過試料中のCFU/mLの対数)
前濾過懸濁液は、平均で9500CFU/mL(〜4Log CFU/mL)を含有していた。
対数減少値を表13に示す。
LRV=(前濾過試料中のCFU/mLの対数)−(濾過試料中のCFU/mLの対数)
前濾過懸濁液は、平均で9500CFU/mL(〜4Log CFU/mL)を含有していた。
対数減少値を表13に示す。
本明細書で引用した特許、特許文献、及び公報に含まれる参照された記述内容は、その全体が、それぞれが個々に組み込まれているかのように、参照により組み込まれる。本発明に対する様々な予見できない修正及び変更が、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく当業者に明らかとなるであろう。本発明は、本明細書に記載した例示的な実施形態及び実施例によって過度に限定されるものではなく、またかかる実施例及び実施形態は、一例として表されているだけであり、本発明の範囲は、以下のように本明細書に記載した請求項によってのみ限定されることを意図するものと理解されるべきである。
Claims (26)
- (a)(1)多孔質繊維性不織布マトリックス、及び
(2)金属ケイ酸塩を含み、前記多孔質繊維性不織布マトリックス中に捕らえられている、少なくとも1つの濃縮剤の複数の粒子、
を含む濃縮デバイスを提供すること、
(b)少なくとも1つの標的細胞検体を含む試料を提供すること、
(c)前記少なくとも1つの標的細胞検体の少なくとも一部が、前記濃縮デバイスに結合される又は捕捉されるように、前記濃縮デバイスを前記試料と接触させること、並びに
(d)少なくとも1つの結合した標的細胞検体の存在を検出すること、
を含む、濃縮プロセス。 - 前記多孔質繊維性不織布マトリックスが湿式堆積プロセスによって形成されている、請求項1に記載のプロセス。
- 前記多孔質繊維性不織布マトリックスが、少なくとも1つのフィブリル化繊維を含む、請求項1又は2に記載のプロセス。
- 前記多孔質繊維性不織布マトリックスの前記繊維が、ポリマー繊維、無機繊維、及びこれらの組み合わせから選択される、請求項1〜3のいずれか一項に記載のプロセス。
- 前記ポリマー繊維が、ポリアミド、ポリオレフィン、ポリスルホン、及びこれらの組み合わせから選択される少なくとも1つのポリマーを含む、請求項4に記載のプロセス。
- 前記無機繊維が、ガラス、セラミックス、及びこれらの組み合わせから選択される少なくとも1つの無機材料を含む、請求項4又は5に記載のプロセス。
- 前記多孔質繊維性不織布マトリックスが、少なくとも1つのポリマーバインダーを含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載のプロセス。
- 前記ポリマーバインダーが、ポリマー樹脂、ポリマーバインダー繊維、及びこれらの組み合わせから選択される、請求項7に記載のプロセス。
- 前記ポリマーバインダーが、前記濃縮剤の粒子に実質的に付着しない、請求項7又は8に記載のプロセス。
- 前記粒子が、前記多孔質繊維性不織布マトリックス中に機械的に捕捉されている、請求項1〜9のいずれか一項に記載のプロセス。
- 前記粒子がミクロ粒子を含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載のプロセス。
- 前記金属ケイ酸塩が非晶質である、請求項1〜11のいずれか一項に記載のプロセス。
- 前記金属が、マグネシウム、カルシウム、亜鉛、アルミニウム、鉄、チタン、及びこれらの組み合わせから選択される、請求項1〜12のいずれか一項に記載のプロセス。
- 前記金属がマグネシウムである、請求項1〜13のいずれか一項に記載のプロセス。
- 前記試料が流体の形態である、請求項1〜14のいずれか一項に記載のプロセス。
- 前記標的細胞検体が、細菌、菌類、酵母、原生動物、ウイルス、細菌内生胞子の細胞、これらの構成要素、及びこれらの組み合わせから選択される、請求項1〜15のいずれか一項に記載のプロセス。
- 前記接触が、前記試料を前記濃縮デバイスに通すことによって行われる、請求項1〜16のいずれか一項に記載のプロセス。
- 前記検出が、培養に基づく方法、顕微鏡及びその他のイメージング方法、遺伝子学的検出方法、免疫学的検出方法、発光に基づく検出方法、及びこれらの組み合わせから選択される方法によって行われる、請求項1〜17のいずれか一項に記載のプロセス。
- (a)(1)(i)少なくとも1つのフィブリル化繊維、及び
(ii)少なくとも1つのポリマーバインダー、を含む多孔質繊維性不織布マトリックス、並びに
(2)少なくとも1つの非晶質で回転楕円体状の金属ケイ酸塩を含む少なくとも1つの濃縮剤の複数の粒子であって、
前記多孔質繊維性不織布マトリックス中に捕らえられている、前記複数の粒子、
を含む濃縮デバイスを提供すること、
(b)少なくとも1つの標的細胞検体を含む流体試料を提供すること、
及び
(c)前記少なくとも1つの標的細胞検体の少なくとも一部が、前記濃縮デバイスに結合される又は捕捉されるように、前記流体試料を前記濃縮デバイスに通すこと、
を含む、濃縮プロセス。 - 前記プロセスが、少なくとも1つの結合した標的細胞検体の存在を検出することを更に含み、及び/又は前記非晶質で回転楕円体状の金属ケイ酸塩が、非晶質で回転楕円体状のケイ酸マグネシウムであり、及び/又は前記多孔質繊維性不織布マトリックスが湿式堆積プロセスによって形成されている、請求項19に記載のプロセス。
- (a)多孔質繊維性不織布マトリックス、及び
(b)非晶質で回転楕円体状の金属ケイ酸塩を含む少なくとも1つの濃縮剤の複数の粒子、
を含む濃縮デバイスであって、
前記粒子が、前記多孔質繊維性不織布マトリックス中に捕らえられている、濃縮デバイス。 - (a)少なくとも1つの請求項21に記載の濃縮デバイス、及び
(b)請求項1に記載のプロセスを実施するために用いられる少なくとも1つの試験容器又は試験試薬、
を含む、キット。 - (a)複数の繊維を提供すること、
(b)非晶質で回転楕円体状の金属ケイ酸塩を含む少なくとも1つの濃縮剤の複数の粒子を提供すること、及び
(c)前記複数の繊維の少なくとも一部を、前記複数の粒子の少なくとも一部がその中に捕らえられている多孔質繊維性不織布マトリックスに形成すること、
を含む、濃縮デバイスの調製プロセス。 - 前記形成することが湿式堆積プロセスにより実施され、及び/又は前記非晶質で回転楕円体状の金属ケイ酸塩が非晶質で回転楕円体状のケイ酸マグネシウムである、請求項23に記載のプロセス。
- 前記湿式堆積プロセスが、
(a)少なくとも1つの分散液中の前記複数の繊維、前記複数の粒子、及び少なくとも1つのポリマーバインダーの分散体を形成すること、
(b)前記ポリマーバインダーを、前記複数の繊維の少なくとも一部の上に堆積させること、並びに
(c)前記分散体から前記分散液を除去すること、
を含む、請求項24に記載のプロセス。 - (a)多孔質繊維性不織布マトリックス、及び
(b)非晶質で回転楕円体状の金属ケイ酸塩を含む少なくとも1つの濃縮剤の複数の粒子、を含み、
前記粒子が、前記多孔質繊維性不織布マトリックス中に捕らえられている、フィルター媒体。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US42011910P | 2010-12-06 | 2010-12-06 | |
US61/420,119 | 2010-12-06 | ||
PCT/US2011/062618 WO2012078426A2 (en) | 2010-12-06 | 2011-11-30 | Microorganism concentration process and device |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2014503201A true JP2014503201A (ja) | 2014-02-13 |
Family
ID=46207655
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2013543216A Pending JP2014503201A (ja) | 2010-12-06 | 2011-11-30 | 微生物濃縮プロセス及び装置 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US20130260370A1 (ja) |
EP (1) | EP2649193B1 (ja) |
JP (1) | JP2014503201A (ja) |
CN (1) | CN103221550B (ja) |
BR (1) | BR112013012967B1 (ja) |
WO (1) | WO2012078426A2 (ja) |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2017150063A1 (ja) * | 2016-03-01 | 2017-09-08 | 東亞合成株式会社 | 抗ウイルス剤、コーティング組成物、樹脂組成物及び抗ウイルス製品 |
JP2017530366A (ja) * | 2014-10-07 | 2017-10-12 | スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー | クロマトグラフ濃縮を使用する検体の検出方法 |
JP2017533188A (ja) * | 2014-10-01 | 2017-11-09 | スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー | デブリードマンのための多孔質デバイス、キット、及び方法 |
JP2018510270A (ja) * | 2015-03-19 | 2018-04-12 | スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー | 流体試料中の微生物を検出するための不織布物品及び当該不織布物品の使用方法 |
JP2018509910A (ja) * | 2015-03-19 | 2018-04-12 | スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー | 流体試料中の微生物を検出するための方法、デバイス、及びキット |
JP2018512133A (ja) * | 2015-03-19 | 2018-05-17 | スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー | 流体試料中の微生物株又は標的細胞検体を検出するためのデバイス、方法、キット、及びシステム |
Families Citing this family (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010078404A1 (en) * | 2008-12-31 | 2010-07-08 | 3M Innovative Properties Company | Methods, kits and systems for processing samples |
JP5690326B2 (ja) | 2009-04-03 | 2015-03-25 | スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー | 微生物濃縮方法及び装置 |
WO2010114725A1 (en) | 2009-04-03 | 2010-10-07 | 3M Innovative Properties Company | Microorganism concentration process and device |
BR112012015201A2 (pt) * | 2009-12-22 | 2016-03-29 | 3M Innovative Properties Co | processo de concentração de micro-organismo e agente de concentração para uso no mesmo |
JP6087426B2 (ja) | 2012-06-05 | 2017-03-01 | スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー | 微生物のランタン含有濃縮剤 |
US9351797B2 (en) | 2012-10-08 | 2016-05-31 | 3M Innovative Properties Company | Wash monitor and method of use |
CN105579396B (zh) * | 2013-09-30 | 2017-10-27 | 3M创新有限公司 | 胍官能化金属硅酸盐粒子以及制备和使用此类粒子的方法 |
US10253353B2 (en) * | 2013-12-06 | 2019-04-09 | The Broad Institute, Inc. | Enhanced methods of ribonucleic acid hybridization |
JP2017503881A (ja) | 2013-12-18 | 2017-02-02 | スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー | 分離用の多孔質物品 |
JP6157751B2 (ja) * | 2013-12-19 | 2017-07-05 | スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー | 微生物除去及び低圧力低下の濾過を行うための積層物品、その製造方法、並びに使用方法 |
CN104155253B (zh) * | 2014-09-09 | 2016-09-14 | 中国石油化工股份有限公司 | 一种快速检测生物表面活性剂产量的方法 |
WO2016099950A1 (en) | 2014-12-17 | 2016-06-23 | 3M Innovative Properties Company | Luciferin-containing substrate and monitoring device including the substrate |
US10427131B2 (en) | 2015-03-19 | 2019-10-01 | 3M Innovative Properties Company | Guanidine-functionalized perlite particles, articles containing the particles, and methods of using the particles and articles |
GB201703383D0 (en) | 2017-03-02 | 2017-04-19 | Gargle Tech Ltd | Testing for particulates |
EP3662052A4 (en) * | 2017-08-02 | 2021-03-24 | Hemosmart MedicalTechnology Ltd. | FUNCTIONALIZED MESH AND FLUIDIC APPARATUS FOR CAPTURING CELLS OR MOLECULES IN SOLUTION |
CN115430471A (zh) | 2018-09-05 | 2022-12-06 | 英雄科学有限公司 | 微粒测试的设备及方法 |
WO2020123997A1 (en) * | 2018-12-13 | 2020-06-18 | The Regents Of The University Of California | Non-living surrogate indicators and methods for sanitation validation |
CN111235142A (zh) * | 2020-01-20 | 2020-06-05 | 南京大学 | 一种强酸性条件下基质附着生物膜中微生物总dna的提取方法 |
CN111254139A (zh) * | 2020-01-20 | 2020-06-09 | 南京大学 | 一种提取强酸性条件下基质微生物总rna和总蛋白的方法 |
CA3202405A1 (en) | 2021-01-06 | 2022-07-14 | Zvi Feldman | Filtration sampling devices |
US20220364973A1 (en) * | 2021-05-13 | 2022-11-17 | Honeywell International Inc. | In situ fluid sampling device and method of using the same |
Family Cites Families (25)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NL296324A (ja) * | 1962-08-06 | |||
US5230949A (en) * | 1987-12-21 | 1993-07-27 | Entek Manufacturing Inc. | Nonwoven webs of microporous fibers and filaments |
US5498478A (en) * | 1989-03-20 | 1996-03-12 | Weyerhaeuser Company | Polyethylene glycol as a binder material for fibers |
US5432000A (en) * | 1989-03-20 | 1995-07-11 | Weyerhaeuser Company | Binder coated discontinuous fibers with adhered particulate materials |
US5071610A (en) * | 1990-02-23 | 1991-12-10 | Minnesota Mining And Manufacturing Company | Method of making a controlled pore composite polytetrafluoroethylene |
WO1993001494A1 (en) * | 1991-07-12 | 1993-01-21 | Toxi Lab, Inc. | Method and apparatus for improved solid phase extraction |
US5328758A (en) | 1991-10-11 | 1994-07-12 | Minnesota Mining And Manufacturing Company | Particle-loaded nonwoven fibrous article for separations and purifications |
DE69505692T2 (de) * | 1994-11-10 | 1999-07-22 | Minnesota Mining & Mfg | Festphaseextraktion durch verwendung einer verbundfolie für direktes messen der radioaktivität |
US6045913A (en) | 1995-11-01 | 2000-04-04 | Minnesota Mining And Manufacturing Company | At least partly fused particulates and methods of making them by flame fusion |
WO1998002224A1 (en) * | 1996-07-12 | 1998-01-22 | Ibc Advanced Technologies, Inc. | Method for the colorimetric quantification of ions |
WO1998004335A1 (en) * | 1996-07-29 | 1998-02-05 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Method of using cationic charge modified filter |
US6139749A (en) * | 1997-11-20 | 2000-10-31 | 3M Innovative Properties Company | Method for radioactive species analysis using a self-scintillating sheet material |
MXPA03006966A (es) * | 2001-02-06 | 2003-11-18 | Watervisions Int Inc | Composiciones de magnesio insoluble que contienen minerales, para su uso en la filtracion de fluidos. |
US6630016B2 (en) * | 2002-01-31 | 2003-10-07 | Koslow Technologies Corp. | Microporous filter media, filtration systems containing same, and methods of making and using |
US20040159605A1 (en) * | 2002-02-01 | 2004-08-19 | Hughes Kenneth D. | Compositions of insoluble magnesium containing minerals for use in fluid filtration |
MXPA06014480A (es) * | 2004-06-09 | 2007-03-21 | Pathogen Removal And Diagnosti | Particulas incluidas en un substrato poroso para la remocion de analitos objetivo de una muestra. |
JP5255273B2 (ja) | 2004-07-02 | 2013-08-07 | プロメガ コーポレイション | 微生物atpの抽出及び検出システム |
RU2317843C2 (ru) * | 2005-08-08 | 2008-02-27 | Институт физики прочности и материаловедения Сибирского отделения Российской академии наук (ИФПМ СО РАН) | Фильтрующий материал, способ его получения и способ фильтрования |
US7790217B2 (en) * | 2005-08-22 | 2010-09-07 | Quick-Med Technologies, Inc. | Method of attaching an antimicrobial cationic polyelectrolyte to the surface of a substrate |
US20080026041A1 (en) * | 2005-09-12 | 2008-01-31 | Argonide Corporation | Non-woven media incorporating ultrafine or nanosize powders |
US20070272606A1 (en) * | 2006-05-25 | 2007-11-29 | Freese Donald T | Multi-functional coatings on microporous substrates |
EP2203550B1 (en) * | 2007-10-03 | 2015-12-02 | 3M Innovative Properties Company | Microorganism concentration process |
EP2379697A2 (en) * | 2008-12-31 | 2011-10-26 | 3M Innovative Properties Company | Sampling devices and methods for concentrating microorganisms |
WO2010114725A1 (en) * | 2009-04-03 | 2010-10-07 | 3M Innovative Properties Company | Microorganism concentration process and device |
JP5690326B2 (ja) * | 2009-04-03 | 2015-03-25 | スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー | 微生物濃縮方法及び装置 |
-
2011
- 2011-11-30 BR BR112013012967-0A patent/BR112013012967B1/pt not_active IP Right Cessation
- 2011-11-30 EP EP11847458.4A patent/EP2649193B1/en active Active
- 2011-11-30 WO PCT/US2011/062618 patent/WO2012078426A2/en active Application Filing
- 2011-11-30 US US13/876,022 patent/US20130260370A1/en not_active Abandoned
- 2011-11-30 JP JP2013543216A patent/JP2014503201A/ja active Pending
- 2011-11-30 CN CN201180055862.9A patent/CN103221550B/zh active Active
-
2017
- 2017-12-21 US US15/849,830 patent/US20180128722A1/en not_active Abandoned
Cited By (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2017533188A (ja) * | 2014-10-01 | 2017-11-09 | スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー | デブリードマンのための多孔質デバイス、キット、及び方法 |
JP2017530366A (ja) * | 2014-10-07 | 2017-10-12 | スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー | クロマトグラフ濃縮を使用する検体の検出方法 |
JP2018510270A (ja) * | 2015-03-19 | 2018-04-12 | スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー | 流体試料中の微生物を検出するための不織布物品及び当該不織布物品の使用方法 |
JP2018509910A (ja) * | 2015-03-19 | 2018-04-12 | スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー | 流体試料中の微生物を検出するための方法、デバイス、及びキット |
JP2018512133A (ja) * | 2015-03-19 | 2018-05-17 | スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー | 流体試料中の微生物株又は標的細胞検体を検出するためのデバイス、方法、キット、及びシステム |
WO2017150063A1 (ja) * | 2016-03-01 | 2017-09-08 | 東亞合成株式会社 | 抗ウイルス剤、コーティング組成物、樹脂組成物及び抗ウイルス製品 |
CN108697094A (zh) * | 2016-03-01 | 2018-10-23 | 东亚合成株式会社 | 抗病毒剂、涂料组合物、树脂组合物及抗病毒制品 |
JPWO2017150063A1 (ja) * | 2016-03-01 | 2019-01-24 | 東亞合成株式会社 | 抗ウイルス剤、コーティング組成物、樹脂組成物及び抗ウイルス製品 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
BR112013012967B1 (pt) | 2021-03-02 |
WO2012078426A2 (en) | 2012-06-14 |
EP2649193A2 (en) | 2013-10-16 |
WO2012078426A3 (en) | 2012-10-04 |
BR112013012967A2 (pt) | 2020-08-11 |
EP2649193B1 (en) | 2020-06-17 |
CN103221550B (zh) | 2018-05-11 |
US20130260370A1 (en) | 2013-10-03 |
US20180128722A1 (en) | 2018-05-10 |
EP2649193A4 (en) | 2014-05-28 |
CN103221550A (zh) | 2013-07-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP2649193B1 (en) | Microorganism concentration process and device | |
JP5943933B2 (ja) | 微生物濃縮プロセス及び装置 | |
US10240018B2 (en) | Microorganism concentration process and device | |
EP3083036B1 (en) | Porous articles for separation | |
US20100190171A1 (en) | Microorganism concentration process | |
JP6087426B2 (ja) | 微生物のランタン含有濃縮剤 | |
JP2018510270A (ja) | 流体試料中の微生物を検出するための不織布物品及び当該不織布物品の使用方法 | |
EP2855696B1 (en) | Bismuth-containing concentration agents for microorganisms |