JP2018510270A - 流体試料中の微生物を検出するための不織布物品及び当該不織布物品の使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本開示は、流体試料中の微生物を検出するための不織布物品及び当該不織布物品の使用方法に関する。
微生物の存在の同定及び/又は定量測定を行うために、様々な医療、食品、環境、又はその他の試料中における、細菌又は他の微生物の存在を検定することが、望ましい又は必要であることが多い。例えば、細菌DNA又は細菌RNAの検査は、たとえ他の細菌種の存在下であっても、特定の細菌種の存在又は不在を検査するために、行うことができる。しかしながら、特定の細菌の存在を検出する能力は、少なくとも部分的に、分析される試料中の細菌の濃度に依存する。試料中の細菌を濃縮することで、培養時間を短縮すること、又は培養工程の必要を排除することすら可能になる。よって、菌株に特異的な抗体を使用することによって、特定の細菌株を単離する(及びそれにより濃縮する)ための方法が(例えば、抗体をコーティングした磁性又は非磁性粒子の形態で)開発されている。しかしながら、このような方法は高価になり、少なくとも一部の診断用途に望まれる方法よりも依然としてやや遅い傾向がある。微生物の非特異的な濃縮又は捕捉は、炭水化物とレクチンタンパク質との相互作用に基づいた方法によって達成されている。様々な無機物質(例えばヒドロキシアパタイト及び金属水酸化物)も、細菌に非特異的に結合しこれを濃縮するために使用されている。このような非特異的濃縮法は、速さ、コスト、試料要件、スペース要件、使いやすさ、現場使用のための適合性、及び/又は有効性が様々である。
水又は水性分散体のような流体試料中の微生物及び/又は細胞検体の検出に使用できる不織布物品が提供される。
流体試料の微生物量をモニタリングするための不織布物品及び迅速方法が提供される。当該方法は、少なくとも1種の微生物又は標的細胞検体を濃縮する不織布物品と、微生物又は標的細胞検体の検出とを組み合わせる。不織布物品は、微生物及び/又は標的細胞検体を濃縮するために大量の流体試料と接触させてもよく、更に、検出前に汚染物質を除去するために任意選択の洗浄を行ってもよい。不織布物品は、検出用容器に容易に移される。本開示による方法は、流体試料中の細菌汚染を約15分ですぐに検出することができる。したがって、上記不織布物品及び方法は、流体試料中の微生物及び標的細胞検体のフィールドベースの検出に好適であり得る。
明細書及び特許請求の範囲の全体を通して特定の用語が使用されており、大部分は周知であるが、いくらか説明を必要とするものもある。本明細書で使用される場合、以下のように理解されるものとする。
式1(又は式2)で表されるシランが金属ケイ酸塩、珪藻土、又はパーライト粒子の表面上の−OH基と反応するとき、少なくとも1つの脱離基Xが、ケイ素原子と金属ケイ酸塩又はパーライト粒子の表面上の酸素原子との間の共有結合によって置き換えられる。式1で表される一般形態のうち、n=0(すなわち、式2におけるように)の場合の、特定の例示的なグアニジン含有リガンドを含むグアニジン官能化金属ケイ酸塩、珪藻土又はパーライト粒子の実施形態を、式3に示す(式3の円は金属ケイ酸塩又はパーライト粒子を表す)。
実施例1、2及び3:下の表1に示すように、様々な量の繊維1、繊維2、繊維3、及び繊維4を混合することによって3種類の繊維プレミックスを調製した。4Lのブレンダ(VWR(Radnor,PA)より「WARING COMMERCIAL HEAVY DUTY BLENDER、モデル37BL84」の商品名で入手可能)中で、3Lの冷脱イオン水に繊維を加え、低速で30秒間ブレンドした。この混合物を塊(nit)又は凝集(clump)のない均一な繊維分散体となっているかどうかについて検査した。添加剤粒子CM−111を、更に1Lの脱イオン水と共に加え、低速で15秒間混合した。
実施例4、5、6、7及び8:実施例4、5、6、7及び8の不織繊維性多孔質マトリックスを、上記の手順を用いて調製した。配合を、下の表2に示す。
実施例で使用した様々な細菌(下の表3参照)は、ATCC(Manassas,VA)から入手した。
中和した水道水又は18MΩ二重脱イオン水のいずれか100mLに、種々の細菌をスパイクして、100cfu/mL(合計で100mL中に10,000cfu)とした。14mmのディスクを上記の種々の不織繊維性多孔質マトリックスから切り取り、ディスクをSWINNEX 13フィルタホルダ(カタログ番号SX0001300、EMD Millipore(Billerica,MA))に定置した。フィルタホルダを閉じて、BDルアーロックチップを備えた60mLのBDシリンジ(製品番号309653、Becton,Dickinson and Company)に取り付けた。フィルタホルダを取り付ける前に、シリンジからプランジャを外した。シリンジを、12ポートWaters Millipore SEP−PAK真空マニホールド(Waters Corporation(Milford,MA))に接続した。シリンジのそれぞれから濾過液を回収するために、回収管を試料ラックに定置した。真空マニホールドを、Air Cadet Vacuum/Pressure Station(型番420−3901、Barnant Company(Barrington,IL))に取り付け、溶液を、繊維性多孔質マトリックス材料に約15インチ水銀の減圧で通して濾過した。濾過に要した時間は1分未満であった。手作業での濾過の場合、シリンジのプランジャをバレル内に押すことによっても試料を濾過した。
捕捉効率(%)=(試験不織繊維性多孔質ディスクからのRLU/100%対照からのRLU)×100
拘束された細菌を含有する各不織繊維性多孔質マトリックスを、SWINNEXフィルタホルダから外し、1.5mL微量遠心管(Plastibrandマイクロチューブ、Brand GmbH&Co.KG(Wertheim,Germany))に無菌的に移した。細菌溶解試薬を含有するクリーントレース溶解試薬200μLを遠心管に加え、1分間ボルテックスし、室温で更に1分間静置した。クリーントレース・ルシフェリン−ルシフェラーゼ酵素試薬250μLを遠心管に加え、混合した。遠心管を直ちに卓上ルミノメータ(20/20nシングルチューブルミノメータ、Turner Biosystems(Sunnyvale,CA))に定置し、RLUの測定値を記録した。発光量の測定値は、ルミノメータと共に提供されたスプレッドシートインターフェースPCソフトウェアを使用して、ルミノメータから得た。10,000cfuの細菌を含有する緩衝液100μLを、1.5mL微量遠心管(Plastibrandマイクロチューブ)にピペットで移し、溶解剤混合物(200μL)及びATP試薬(250μL)を添加すると同時に発光を測定した。10,000cfuから得た相対発光単位を使用して、不織繊維性多孔質マトリックス中のATPの回収率を計算した(下の表4及び表5参照)。ATP回収率は、未切断材料の場合に30〜68%で変動し、繊維2を含まないマトリックスで最も高い回収率(60〜68%)が得られた。
TSA上の大腸菌(E coli)(ATCC 11229)の画線培養物を37℃で一晩インキュベートした。このプレートから、単離コロニーを取り出し、標準的な微生物学用ループを使用して5mLのTSB中に接種し、振盪培養器(INNOVA 44、New Brunswick Scientificより)内で37℃で20〜22時間インキュベートした。約2〜3×109cfu/mLを含有する一晩培養物を、バターフィールド緩衝液で連続希釈して、およそ1×106cfu/mLを有する接種材料を得た。
LRV=(濾過前試料中のcfu/mLの対数)−(濾過液試料中のcfu/mLの対数)
実施例14、15、及び16:下の表9に示すように、様々な量の繊維1、繊維2、繊維3、繊維4、及び金属リン酸塩濃縮剤としてのヒドロキシアパタイト(HA、BioRadより)を使用することによって、3種類の繊維プレミックスを調製した。不織繊維性多孔質マトリックスは、上記実施例1〜3の手順に従って調製した。得られた実施例14の不織繊維性多孔質マトリックスは、およそ0.8〜1mmの厚さであった。実施例15及び16の不織繊維性多孔質マトリックスは、それぞれ0.6〜0.9mm及び0.5〜0.8mmの厚さであった。
大腸菌(E. coli)(ATCC 51813、グラム陰性菌)画線培養物から、1つのコロニーを10mLのTSB(トリプチックソイブロス、3重量%、Difcoより)に接種し、37℃で一晩(約20時間)インキュベートした。得られた細菌ストックは約1×109cfu/mLを含有した。このストックをDI水で連続希釈して、1×104cfu/mLの作業用ストックを調製した。
随伴水試料は、カナダの油井から得た。試料は、BBLで連続希釈し、1mLずつPACプレートに接種した。プレートを製造業者の指示に従って37℃で48時間インキュベートした。プレートを、3Mペトリフィルムプレートリーダーを使用して、細菌数について分析した。試料のそれぞれから体積100μLをキュベットに加え、145μLのクリーントレース溶解試薬と混合し、10秒間ボルテックスした。450μLの体積のクリーントレース・ルシフェリン−ルシフェラーゼ酵素試薬を加えた後、10秒間混合した。アダプタ(上の実施例17に記載)を使用して、キュベットをNGルミノメータに挿入して、ATP信号を測定した。
クリーントレース試験に対するATP信号の倍率=(濾過後の不織布マトリックスディスクからのRLU/未濾過試料100μLからのRLU)
実施例35:大腸菌(E. coli)(ATCC 51813、グラム陰性菌)の画線培養物から、1つのコロニーを10mLのTSB(トリプチックソイブロス、3重量%、Difcoより)に接種し、37℃で一晩(約20時間)インキュベートした。得られた細菌ストックは約1×109cfu/mLを含有した。このストックをDI水で連続希釈して、1×105cfu/mLの作業用ストックを調製した。
実施例36のマトリックス:下の表16に示すように、異なる量の繊維1、繊維2、繊維3、及び繊維4を混合することによって繊維プレミックスを調製した。不織繊維性多孔質マトリックスは、上記実施例1〜3の手順に従って調製した。得られた不織繊維性多孔質マトリックスの厚さは、0.8〜1.0mmであった。
ATP生物発光試験は、ビールのライン洗浄確認方法として使用されており、洗浄完了後の最終すすぎ水の試験に基づく。すすぎ水の試料をラインの分注側から採取し、次いで、ATP生物発光試験を用いて試験する。この試験は洗浄確認に関しては有用であるが、ビールライン内のビール又は製品試料を直接試験できることも有利と考えられる。
ATP信号(%)=(濃縮試料のRLU/100%対照ビールのRLU)×100
下の表18に示すように、様々な量の繊維1、繊維2、繊維4、繊維5及び繊維6を混合することによって3種類の繊維プレミックスを調製した。
大腸菌(E. coli)(ATCC11229、グラム陰性菌)の画線培養物から、1つのコロニーを10mLのTSB(トリプチックソイブロス、3重量%、Difcoより)に接種し、37℃で一晩(約20時間)インキュベートした。得られた細菌ストックは約1×109cfu/mLを含有した。このストックを脱イオン水で連続希釈して、1×102cfu/mLの作業用ストックを調製した。
対照%=(接種した濾過液のCFU)×100/100%対照のCFU
捕捉効率%=100−対照%
黄色ブドウ球菌(S. aureus)(ATCC 6538、グラム陽性菌)の画線培養物から、1つのコロニーを10mLのTSB(トリプチックソイブロス、3重量%、Difcoより)に接種し、37℃で一晩(約20時間)インキュベートした。得られた細菌ストックは約1×109cfu/mLを含有した。このストックを脱イオン水で連続希釈して、1×102cfu/mLの作業用ストックを調製した。
対照%=(接種した濾過液のCFU)×100/100%対照のCFU
捕捉効率%=100−対照%
下の表21に示すように、様々な量の繊維1、繊維4、繊維5及び繊維6を混合することによって2種類の繊維プレミックスを調製した。
大腸菌(E. coli)(ATCC 11229、グラム陰性菌)の画線培養物から、1つのコロニーを10mLのTSB(トリプチックソイブロス、3重量%、Difcoより)に接種し、37℃で一晩(約20時間)インキュベートした。得られた細菌ストックは約1×109cfu/mLを含有した。このストックを脱イオン水で連続希釈して、10cfu/mL、1×102cfu/mL、及び1×103cfu/mLの作業用ストックを調製した。
対照%=(接種した濾過液のCFU)×100/100%対照のCFU
捕捉効率%=100−対照%
黄色ブドウ球菌(S. aureus)(ATCC6538、グラム陽性菌)の画線培養物から、1つのコロニーを10mLのTSB(トリプチックソイブロス、3重量%、Difcoより)に接種し、37℃で一晩(約20時間)インキュベートした。得られた細菌ストックは約1×109cfu/mLを含有した。このストックを脱イオン水で連続希釈して、10cfu/mL、1×102cfu/mL、及び1×103cfu/mLの作業用ストックを調製した。
対照%=(接種した濾過液のCFU)×100/100%対照のCFU
捕捉効率%=100−対照%
Claims (17)
- a)繊維性多孔質マトリックスと、b)前記繊維性多孔質マトリックスに捕らえられた複数の濃縮剤粒子と、を含む不織布物品であって、前記繊維性多孔質マトリックスが無機繊維及びポリマー繊維から本質的になる、不織布物品。
- 前記ポリマー繊維が2成分繊維を含む、請求項1又は2に記載の不織布物品。
- 前記無機繊維がガラス繊維を含む、請求項1に記載の不織布物品。
- 前記無機繊維及びポリマー繊維が50mm未満の平均長さを備える、請求項1〜3のいずれか一項に記載の不織布物品。
- 前記不織布物品が、前記不織布物品の総乾燥重量に基づいて5〜60重量%の濃縮剤粒子と、前記不織布物品の前記総乾燥重量に基づいて40〜95重量%の繊維性多孔質マトリックスと、を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の不織布物品。
- 前記繊維性多孔質マトリックスが、非捲縮ポリマー繊維を含む不織繊維層である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の不織布物品。
- 前記繊維性多孔質マトリックスが不織繊維層であり、前記濃縮剤粒子が前記不織繊維層内全体に分散されている、請求項1〜6のいずれか一項に記載の不織布物品。
- 前記繊維性多孔質マトリックスがポリアミド繊維を含まない、請求項1〜7のいずれか一項に記載の不織布物品。
- 前記濃縮剤粒子が、非晶質金属ケイ酸塩、グアニジン官能化金属ケイ酸塩、珪藻土、表面改質珪藻土、γ−FeO(OH)、金属炭酸塩、金属リン酸塩、シリカ、パーライト、グアニジン官能化パーライト、グアニジン官能化珪藻土、又はこれらの組み合わせを含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の不織布物品。
- 前記繊維性多孔質マトリックスが0.15mm〜2mmの厚さを有する、請求項1〜9のいずれか一項に記載の不織布物品。
- 前記ポリマー繊維がフィブリル化ポリエチレン繊維と2成分繊維とを含み、前記無機繊維がガラス繊維を含み、前記濃縮剤粒子が非晶質金属ケイ酸塩、グアニジン官能化金属ケイ酸塩、珪藻土、表面改質珪藻土、グアニジン官能化珪藻土、γ−FeO(OH)、金属炭酸塩、金属リン酸塩、シリカ、パーライト、グアニジン官能化パーライト、又はこれらの組み合わせを含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の不織布物品。
- 流体試料中の微生物又は標的細胞検体を検出する方法であって、
a)請求項1〜11のいずれか一項に記載の不織布物品を提供する工程と、
b)少なくとも1種の微生物株又は標的細胞検体を含有すると疑われる流体試料を提供する工程と、
c)前記少なくとも1種の微生物株又は標的細胞検体の少なくとも一部が前記不織布物品に拘束されるように、前記流体試料を前記不織布物品と接触させる工程と、
d)拘束された前記少なくとも1種の微生物株又は標的細胞検体の存在を検出する工程と、を含む、方法。 - 拘束された前記少なくとも1種の微生物株又は標的細胞検体の存在を検出する工程の前に、前記少なくとも1種の微生物株又は標的細胞検体を拘束した不織布物品を少なくとも1種の検出試薬と接触させて定置する工程を更に含む、請求項12に記載の方法。
- 前記検出する工程が生物発光法を含む、請求項12又は13に記載の方法。
- 拘束された前記少なくとも1種の微生物株を溶解剤と接触させる工程を更に含む、請求項12〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1種の微生物株又は標的細胞検体を拘束した不織布物品を少なくとも1種の検出試薬と接触させて定置する前記工程の前に、前記少なくとも1種の微生物株又は標的細胞検体を拘束した不織布物品を洗浄することを更に含む、請求項12〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記流体試料が、管腔又はカニューレを有するデバイスからのすすぎ液を含み、前記接触させる工程が、前記管腔又はカニューレを有するデバイスが前記不織布物品と流体連通している一体型アセンブリ内で起こる、請求項12〜16のいずれか一項に記載の方法。
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