JP2018509910A - 流体試料中の微生物を検出するための方法、デバイス、及びキット - Google Patents
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Abstract
Description
本開示は、流体試料中の微生物を検出する方法、並びに微生物の検出に用いるためのデバイス、及びデバイスを含むキットに関する。
細菌はほとんどの水相系において自然に発生し、冷却塔、熱交換器、飲料用途及び廃水用途、石油及びガス探査、並びに水圧破砕作業などの、水を用いる工業用途及び公共用途における問題の原因となり得る。細菌を許容限度内に維持するための効果的な殺菌プログラムを策定して実施するべく、細菌は監視される必要がある。微生物学的水質は通例、伝統的な成長ベースの方法によって評価される。これは実行に24〜48時間を要し得る。ATP生物発光アッセイに基づく高速な方法が、水中の微生物汚染を判定するために用いられている。なぜなら、これらの方法は即時の結果を提供するためである。しかし、これらの方法は、検出可能な応答を引き出すために少なくとも1×105コロニー形成単位(colony forming unit、cfu)/mLを必要とするため、検出感度によって制限される。処理化学物質又はマトリックス構成成分からの干渉が生物発光に影響を及ぼし、例えば、結果の誤り、及び殺生物剤の管理の失敗を招き得る。より多量の試料(例えば、100mL)を用いることによってATP生物発光アッセイの感度を増大させることができるが、このような方法は野外では実施が困難であり得る。
水又は水性分散液などの、流体試料中の微生物を検出するために用いることができるデバイス及び方法が提供される。
流体試料の微生物的質の監視のための高速な方法が提供される。これらの方法は、少なくとも1種類の微生物又は標的細胞検体を不織布物品によって濃縮するデバイスと、微生物又は標的細胞検体の検出とを組み合わせる。本開示に係るデバイスは多量の流体試料との接触を可能にし、また、検出前に汚染物質を除去するための更なる任意選択的な洗浄をも可能にする。不織布物品は検出のために受器へ容易に移し替えられる。本開示に係る方法は、水中の細菌汚染を約15分で容易に検出する能力を有する。したがって、これらの方法及びデバイスは、流体試料中の微生物及び標的細胞検体の野外ベースの検出のために適している。
明細書及び特許請求の範囲の全体を通して特定の用語が使用されており、大部分は周知であるが、いくらか説明を必要とするものもある。以下のことを理解されたい。本明細書で使用される場合:
用語「1つの(a)」、「1つの(an)」、及び「その(the)」は、「少なくとも1つの」と同義に使用され、記載される要素のうちの1つ以上を意味する。
X3−nRa nSi−Y−G 式1
X3Si−Y−G 式2
式1(又は式2)のシランが金属ケイ酸塩又はパーライト粒子の表面上の−OH基と反応する際、少なくとも1つのX脱離基が、ケイ素原子と金属ケイ酸塩、珪藻土、又はパーライト粒子の表面上の酸素原子との間の共有結合により置き換えられる。式1で表される一般形式のうち、n=0(すなわち、式2の場合)の場合の、特定の例示的なグアニジン含有リガンドを含む、グアニジン官能化金属ケイ酸塩、グアニジン官能化珪藻土、又はグアニジン官能化パーライト粒子の実施形態を、式3に示す(式3の円は金属ケイ酸塩又はパーライト粒子を表す)。
実施例1、2及び3:下表1に示すようなそれぞれ異なる量の繊維1、繊維2、繊維3、及び繊維4を混合することにより、繊維プレミックスを調製した。4Lのブレンダー(VWR(Radnor,PA)より「WARING COMMERCIAL HEAVY DUTY BLENDER、モデル37BL84」の商品名で販売されるもの)中で、繊維6を3リットルの冷たい脱イオン水に加え、低速で30秒間ブレンドした。この混合物を塊(nit)又は凝集(clump)のない均一な繊維分散体となっているかどうかについて検査した。添加剤粒子、CM−111を更に1Lの脱イオン水とともに加え、低速で15秒間混合した。
実施例4、5、6、7及び8:上述された手順を用いて実施例4、5、6、7、及び8の不織繊維性多孔質マトリックスを作製した。配合を下表2に示す。
実施例で使用された様々な細菌(下表3参照)は、ATCC(Manassas,VA)から入手した。
中和された水道水(0.1%のチオ硫酸ナトリウムで中和)又は18メガオームの二重脱イオン水のいずれか100mLに様々な細菌をスパイクし、約100cfu/mL(総量、100mL中約10,000cfu)を得た。上述された様々な不織繊維性多孔質マトリックスから14mmディスクを切り出し、ディスクをSWINNEX13フィルタホルダ(カタログ番号SX0001300、EMD Millipore,Billerica,MA)内に配置した。フィルタホルダを閉じ、BD LUER−LOK先端部を有する60mLのBDシリンジ(製品番号309653、Becton,Dickinson and Company)に取り付けた。フィルタホルダを取り付ける前にシリンジからのプランジャを取り外した。シリンジを12−place Waters Millipore SEP−PAK真空マニフォールド(Waters Corporation,Milford,MA)に接続した。シリンジの各々から濾液を収集するための収集管を試料ラック内に配置した。真空マニフォールドをAir Cadet Vacuum/Pressure Station(型番420〜3901、Barnant Company,Barrington,IL)に取り付け、溶液を、約15インチの真空水銀圧力で繊維性多孔質マトリックス材料に通して濾過した。濾過に要したのは1分未満であった。手動濾過のために、試料はまた、シリンジプランジャを押して外筒内を進めることによって濾過した。
容器、フィルタホルダ及び第2のアダプタは、ステレオリソグラフィ機(SLA Model SLA−250/40機)において、製造業者の使用説明書に従って、UV硬化型エポキシ組成物(ACCURA60エポキシ樹脂)を用いてCAD図面から構築した。デバイスは(図2E及び図3E)に従って形成されたが、第1のアダプタを含まなかった。エポキシ組成物及び機器は、3D Systems Corporation Rock Hill S.C.)によって製造された。
TSA上の大腸菌(ATCC11229)の画線培養物を37℃で一晩インキュベートした。このプレートから、孤立したコロニーを取り出し、標準的な微生物学ループを使用して5mLのTSB中に接種し、振盪インキュベータ(New Brunswick ScientificからのINNOVA44(登録商標))内において37℃で20〜22時間インキュベートした。〜2〜3×109cfu/mLを含有する一晩培養物を、バターフィールド緩衝液中で連続的に希釈し、およそ1×106cfu/mLを有する接種物を得た。
LRV=(濾過前試料中のcfu/mLの対数)−(濾液試料中のcfu/mLの対数)
実施例14、15、16、17及び18:実施例1、2及び3において説明された手順を用いて実施例14、15、16、17、及び18の不織繊維性多孔質マトリックスを作製した。配合を下表11に示す。実施例14のマトリックスの厚さは約2.0〜2.3mmであり、実施例15は約1.2〜1.5mmであり、実施例16は約0.65〜0.85mmであり、実施例17は約0.6〜0.8mmであり、実施例18は厚さ約0.6〜0.8mmであった。
実施例19、20及び21:実施例1、2及び3において説明された手順を用いて実施例19、20及び21の不織繊維性多孔質マトリックスを作製した。配合を下表12に示す。構成成分を121℃で30分間加圧滅菌し(AMSCO CENTURY Scientific model SV−120加圧滅菌器、Steris Corporation,Mentor,OH)、その後、上述したように、マトリックスの調製のために滅菌水と混合した。繊維3(2成分エチレン酢酸ビニル/ポリプロピレン繊維)は加圧滅菌の間にそのコンシステンシーを失い、その追加は、非常に脆いマトリックスをもたらした。実施例19のマトリックスの厚さは約0.4〜0.6mmであり、実施例20は約0.4〜0.6mmであり、実施例21は厚さ約0.8〜1.0mmであった。
実施例14〜21において調製した不織繊維性多孔質マトリックスの捕捉効率を、実施例10において説明したように試験した。投入溶液中の細菌の数及び濾液中に残された細菌の数を用いて百分率捕捉効率を算出した。細菌捕捉は材料に依存して88〜99パーセントに及んだ(下表13参照)。この場合も先と同様に、繊維2(ナイロン)を有しない繊維性マトリックスは、捕捉率の目立つほどの差を全く示さなかった。加圧滅菌した材料を用いて調製したマトリックスは、加圧滅菌していない材料と同様の回収を示した。
3M Companyから、カップ、カラー、使い捨てライナー及び蓋を内包する3M PPS(paint preparation system、塗装調製システム)を入手した。ステレオリソグラフィ機(SLA Model SLA−250/40機)において、製造業者の使用説明書に従って、UV硬化型エポキシ組成物(ACCURA60エポキシ樹脂)を用いてCAD図面からフィルタアダプタを構築した。デバイスは図7D及び図7Eに従って形成した。エポキシ組成物及び機器は、3D Systems Corporation)によって製造された。
カナダ内の油井から生産水試料を入手した。図9Fに示されるとおりのデバイスを組み立て、10mLの生産水試料D(即ち、比較例1)を10立方センチメートルのシリンジ内に充填し、実施例1の不織繊維性多孔質マトリックスの直径14mmのディスクを、Oリングガスケットを用いて第1のアダプタに取り付けた。10mLの生産水を滴下的に不織繊維性多孔質マトリックスに通して濾過した。これは約1分を要した。有利に、混濁した生産水試料は、シリンジプランジャに対して、(印加された一定の圧力ではなく)増大する圧力を印加することを必要とするほどに十分な背圧を発生させることなく、シリンジアダプタのルアーロック部分の小さい直径から、シリンジホルダ及びフィルタホルダのネジ付き部分のより大きい直径へ通過した。濾液は廃棄した。生産水試料の全てがディスクを通過することを確実にするために、シリンジを5mLの空気で満たし、シリンジアダプタに接続し、その後、空気を押して不織繊維性多孔質マトリックスに通過させた。次に、シリンジホルダをフィルタホルダから、この2つの部品のネジを緩めて互いから切り離すことによって、取り外し、これにより、不織繊維性多孔質マトリックスへのアクセスを提供した。ATP Water Testを入手し、試験具上の箔シールに穴をあけ、そばに置いておいた。ATP Water Testからの試料収集棒を用い、棒をマトリックス上で円形に数回転させることによって、不織繊維性多孔質マトリックスを拾い上げた。棒の端部にくっついた不織繊維性多孔質マトリックスを有する試料棒を、あらかじめ穴をあけた試験具内に挿入し、製造業者の使用説明書に従ってNG照度計上で分析した。その結果得られた、相対発光単位(RLU)による信号は、‘フィルタ − 無洗浄’の実施例25の測定値を発生させた。
下記表16に示すとおりの異なる量の繊維1、繊維4、繊維5及び繊維6を混合することによって、2種類の繊維プレミックスを調製した。
大腸菌(ATCC11229、グラム陰性菌)の画線培養物からの単一のコロニーを10mLのTSB(Difcoからのトリプチックソイブロス、3重量%)中に接種し、37度Cで約20時間一晩インキュベートした。結果として得られた細菌原料は約1×109cfu/mLを含有した。その原料を脱イオン水中で連続的に希釈し、10cfu/mL、1×102cfu/mL、及び1×103cfu/mLの作業用原料を作製した。
%捕捉効率=100−%対照標準
n=3、括弧内に指示されていない限り、%標準偏差<10%。播種した100%対照標準は、総量205cfu/mL(24%の標準偏差)、1895cfu及び18450cfuを有した。
黄色ブドウ球菌(ATCC6538、グラム陽性菌)の画線培養物からの単一のコロニーを10mLのTSB(Difcoからのトリプチックソイブロス、3重量%)中に接種し、37度Cで約20時間一晩インキュベートした。結果として得られた細菌原料は約1×109cfu/mLを含有した。その原料を脱イオン水中で連続的に希釈し、10cfu/mL、1×102cfu/mL、及び1×103cfu/mLの作業用原料を作製した。
%捕捉効率=100−%対照標準
n=3、括弧内に指示されていない限り、%標準偏差<10%。播種した100%対照標準は、総量195cfu/mL(40%の標準偏差)、1380cfu(12%の標準偏差)及び15950cfuを有した。
Claims (21)
- 流体試料中の微生物を検出する方法であって、
a)1)繊維性多孔質マトリックス、及び2)前記繊維性多孔質マトリックス内に捕らえられた複数の濃縮剤粒子を含む不織布物品を提供することと、
b)少なくとも1種類の微生物株又は標的細胞検体を含有する疑いがある流体試料を提供することと、
c)前記少なくとも1種類の微生物株又は標的細胞検体の少なくとも一部分が前記不織布物品に拘束されるように、前記流体試料を前記不織布物品と接触させることと、
d)前記少なくとも1種類の微生物株又は標的細胞検体が拘束された不織布物品を少なくとも1種類の検出試薬と接触させて配置することと、
e)前記少なくとも1種類の拘束された微生物株、又は拘束された標的細胞検体の存在を検出することと、を含む、方法。 - 前記検出することが、培養ベースの検出方法、画像検出方法、蛍光ベースの検出方法、比色分析的検出方法、免疫学的検出方法、遺伝子学的検出方法、生物発光ベースの検出方法、又はこれらの組み合わせを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記試薬が溶解剤を更に含む、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記試薬がルシフェラーゼを含む、請求項3に記載の方法。
- 前記接触させることが、前記不織布物品を通した前記流体試料の濾過を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1種類の微生物株又は標的細胞検体が拘束された不織布物品を少なくとも1種類の検出試薬と接触させて配置する前に、前記少なくとも1種類の微生物株又は標的細胞検体が拘束された不織布物品を洗浄することを更に含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記配置することが、前記少なくとも1種類の微生物株又は標的細胞検体が拘束された不織布物品を、材料であって、それを通じて検出信号が検出されることができる材料を含む受器内に配置することを含み、前記受器は前記少なくとも1種類の試薬を内包する、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記接触させることが、前記少なくとも1種類の微生物株又は標的細胞検体が拘束された不織布物品を、前記少なくとも1種類の試薬を内包する受器内に押し込むことを含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的細胞検体が、少なくとも1種類の核酸、タンパク質、又はアデノシン三リン酸(ATP)を含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記接触させることが、前記流体試料を、4.0psi(27.6kPa)以下の圧力で前記不織布物品に通過させることを含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記不織布物品が0.15ミリメートル〜2ミリメートルの厚さを有する、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 流体試料を不織布物品と接触させるためのデバイスであって、1)試料容器と、2)フィルタホルダと、3)不織布物品であって、a)繊維性多孔質マトリックス、及びb)前記繊維性多孔質マトリックス内に捕らえられた複数の濃縮剤粒子を含む、不織布物品と、4)前記フィルタホルダを受器と接合させるように構成された第1のアダプタと、を備えるデバイス。
- 前記試料容器が、第1のリザーバを含む自立型容器、前記自立型容器の前記第1のリザーバ内に収容される寸法に作られ、第2のリザーバを含む変形可能な自己支持型受器であって、前記自立型容器が前記変形可能な自己支持型受器よりも剛性が高く、前記自立型容器は、内部に形成された開口部を含む底部を含み、前記開口部を通して前記変形可能な自己支持型受器がアクセスされることができる、自己支持型受器を備える、請求項12に記載のデバイス。
- 前記フィルタホルダを真空源、収集容器、又は前記試料容器に取り付けるように構成された第2のアダプタを更に備える、請求項12に記載のデバイス。
- 前記容器が少なくとも300ミリリットルの容積を備える、請求項12〜14のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記繊維性多孔質マトリックスが、非捲縮ポリマー繊維を含む不織布繊維層である、請求項12〜15のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記繊維性多孔質マトリックスがポリアミド繊維を含まない、請求項12〜16のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記濃縮剤粒子が、非晶質金属ケイ酸塩類、グアニジン官能化金属ケイ酸塩類、珪藻土、表面修飾珪藻土、グアニジン官能化珪藻土、γ−FeO(OH)、金属炭酸塩類、金属リン酸塩類、シリカ、パーライト、グアニジン官能化パーライト、又はこれらの組み合わせを含む、請求項12〜17のいずれか一項に記載のデバイス。
- 流体試料を不織布物品と接触させるためのデバイスであって、1)試料容器と、2)受器と接合するように構成されたフィルタホルダと、3)不織布物品であって、a)繊維性多孔質マトリックス、及びb)前記繊維性多孔質マトリックス内に捕らえられた複数の濃縮剤粒子を含む不織布物品と、を備えるデバイス。
- a.流体試料を不織布物品と接触させるためのデバイスであって、1)試料容器と、2)フィルタホルダと、3)不織布物品であって、i)繊維性多孔質マトリックス、及びii)前記繊維性多孔質マトリックス内に捕らえられた複数の濃縮剤粒子を含む、不織布物品と、4)第1のアダプタと、を備えるデバイスと、
b.受器であって、前記第1のアダプタが前記フィルタホルダを前記受器と接合させるように構成されている、受器と、を備えるキット。 - 前記キットを使用するための使用説明書を更に備える、請求項20に記載のキット。
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