CN113388663B - 一种难溶性植入剂无菌检查方法及无菌过滤装置 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种难溶性植入剂无菌检查方法及无菌过滤装置，属于药物分析技术领域。本发明的无菌检查方法包括以下步骤：研磨：将植入剂在无菌条件下研磨成细粉；过滤：将步骤(1)所得细粉放入过滤装置中，用无菌氯化钠蛋白胨缓冲液过滤；培养：将过滤后的粉末放入无菌容器中，加入培养基；同时按照相同方法设置对照组，对照组再分别额外加入对照微生物，培养3‑5天，观察菌落生长情况。其中，所述装置为增加了螺纹口的无菌过滤器。本发明方法能收集并有效暴露被包埋于固体植入剂中的微生物，并培养检查。经系统方法验证，与普通的直接接种法、薄膜过滤法相比，能有效检测出各种被包埋的微生物。
Description
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，尤其涉及到一种难溶性植入剂无菌检查方法及无菌过滤装置。
背景技术
植入剂，即植入式给药制剂，是一种新型的给药方式，具有长效缓释作用，一般供腔道、组织或皮下植入使用。植入剂常为无菌固体控制释放制剂，是一类可经手术植入或者经针头导入的控制释药系统，在植入前需要进行无菌检查。
论文“基于左旋聚乳酸的缓释依托泊苷植入剂的制备及抗肿瘤研究”记载了对缓释依托泊苷植入剂的无菌检测方法(《中国药典2015年版》)：取3个批次的缓释依托泊苷植入剂，每批取PY330集菌培养器1付，用少量缓冲液润湿滤膜，每批各取30盒，分别用灭菌顶针将药物颗粒推出至同一30mL灭菌的pH7.0氯化钠－蛋白胨缓冲液中，涡旋振摇5min后，将缓冲液按薄膜过滤法均匀滤至3个滤筒中，滤干后，其中2个滤筒加入100mL硫乙醇酸盐流体培养基，分别接入枯草芽孢杆菌和生孢梭菌，第3个滤筒加入改良马丁培养基。对于另一批号植入剂样品，其中2个滤筒加入100mL改良马丁培养基，分别接入白色念珠菌液作为阳性对照管，第3个滤筒加入硫乙醇酸盐流体培养基。按规定温度培养：细菌置于30-35℃，真菌置于25-28℃培养箱中，阳性对照组培养2-3天，供试品组培养14天，每天观察。
但是，考虑到部分固体植入剂的结构是由不易降解的高分子材料为外壳的，由于高分子材料可能将微生物包裹在其内部，需要较长的时间待高分子材料降解后才能释放出来，培养时间太短时可能不能有效降解高分子材料释放出微生物，极有可能造成漏检。另一方面，固体植入剂制作工艺中可能用到聚乳酸和三氯甲烷等，所得产品或多或少存在抑菌性，对上述检测方法的结果造成影响。
另外，大多数难溶的植入剂难以找到合适的溶媒，由于其难溶性，能够溶解的溶媒也会极大地破坏微生物，影响检测结果的准确性。
有鉴于此，本申请提供一种难溶性植入剂无菌检查方法，对植入剂进行粉碎成粉末，然后通过薄膜过滤-直接接种两法联用冲洗植入剂粉末去除产品的抑菌成分，再注入适量的培养基进行无菌检查。不过，目前市面上没有到可过滤粉末的无菌检查用的滤筒，如果待测样品用微生物限度检查用薄膜过滤支架过滤，再转移至玻璃瓶的话，过程中很难控制粉末洒落的情况，且无菌制剂用微生物限度检查用支架，污染的概率较大，就不能准确反应产品中是否有活微生物存在，因此本申请还提供一种能够用于薄膜过滤-直接接种两法联用的装置，与检测方法结合，可以有效消除待测样品中的抑菌成分，完整收集固体植入剂粉末和被包埋进入固体植入剂中的微生物，减少漏检。
发明内容
本发明的目的是提供一种难溶性植入剂无菌检查方法及无菌过滤装置。本发明方法能收集被包埋进入固体植入剂中的微生物，并培养检查。经系统方法验证，与普通的直接接种法、薄膜过滤法相比，能有效各种被包埋的微生物。
为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一方面，本发明提供一种难溶性植入剂无菌检查方法，包括以下步骤：
(1)研磨：将植入剂在无菌条件下研磨成细粉；
(2)过滤：将步骤(1)所得细粉放入过滤装置中，用无菌氯化钠蛋白胨缓冲液过滤；
(3)培养：将过滤后的粉末放入无菌容器中，加入培养基；
同时按照相同方法设置对照组，对照组再分别额外加入对照微生物，培养3-5天，观察菌落生长情况。
其中，所述装置为增加了螺纹口的无菌过滤器，通过设计螺纹口，在使用时使得无菌过滤器顶部为开口状态，方便加入固体粉末，无需通过管路进入滤器中。
优选的，步骤(1)中，所述研磨的方式包括但不限于匀浆仪、均质机、研磨仪、球磨仪、粉碎机、人工研磨等，进一步优选使用匀浆仪。
优选的，研磨转速为5000-40000r/min，再进一步优选为5000-30000r/min，最优选为10000r/min。
优选的，所述无菌过滤器还包括筛网，可以截留固体颗粒，以防影响结果观察及滤膜过滤效率。
优选的，步骤(2)中，所述无菌氯化钠蛋白胨缓冲液过滤的次数为4-7次，进一步优选为5次。
优选的，步骤(2)中，所述无菌氯化钠蛋白胨缓冲液过滤时，在过滤装置底部放有滤膜。
优选的，步骤(3)中，所述培养基为硫乙醇酸盐流体培养基或胰酪大豆胨液体培养基。
优选的，步骤(3)中，所述对照微生物为大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、生孢梭菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉菌
优选的，步骤(3)中，所述对照微生物接种量小于100cfu。
另一方面，本发明还提供一种无菌过滤装置，该装置为增加了螺纹口和筛网的无菌过滤器。
在使用时，通过螺纹口使无菌过滤器的顶部打开，底部安装滤膜，有利于难溶且有抑菌性的固体制剂的无菌检验。
优选的，所述筛网的目数为80目。
和现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明通过选择合适的方法将固体植入剂磨成细粉，能更完全的收集被包埋进入固体植入剂中的微生物，并进行培养检查，可以避免漏检，提高检测结果的准确性；
(2)检测时配合使用本发明的无菌过滤装置，方便加入固体粉末，无需通过管路进入滤器中，避免了粉末洒落造成漏检和二次污染造成误检的可能；
(3)本发明的无菌过滤装置设有滤网，可以截留固体颗粒，不会响及滤膜过滤效率，同时该装置能有效除去植入剂中的抑菌成分，避免对检测的影响。
附图说明
图1为本发明无菌过滤装置的正视图，
图中，1-螺纹口，2-筛网；
图2为本发明无菌过滤装置使用时顶部打开的俯视图，
图中，1-螺纹口，2-筛网。
具体实施方式
以下非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述内容仅仅是对本申请要求保护的范围的示例性说明，本领域技术人员可以根据所公开的内容对本申请的发明作出多种改变和修饰，而其也应当属于本申请要求保护的范围之中。
下面以具体实施例的方式对本发明作进一步的说明。本发明实施例中所使用的各种化学试剂如无特殊说明均通过常规商业途径获得。
本发明中，各组菌液组计数均控制在平均值±5cfu/ml。
下述实施例中，所用植入剂为按照专利申请CN201810963225.5中实施例所记载的方法制备的固体植入剂。
所述滤膜为维科生物科技，滤膜的规格：孔径0.45微米，直径47mm，批号20190612，有效期至2021.06.11。
所用无菌过滤装置为增加了螺纹口和筛网的无菌过滤器，结构如图1-2所示，筛网的目数为80目。
实施例1植入剂溶解性测试
因植入剂只溶于三氯甲烷及二氯甲烷中，微溶于甲醇及乙酸乙酯、丙酮等有机溶剂，而含氯有机溶剂对菌有强杀菌作用，乙酸乙酯、丙酮和甲醇对植入剂溶解较慢，且对菌杀菌性也较强，因此不适用。
在做无菌检查方法时，对溶媒的要求是：对微生物无毒性，且溶解时间较短，因供试品在制备到检测时间一般不超过两个小时。
取植入剂数片，用匀浆仪15000r研磨粉碎后得粉末备用。
①取植入剂粉末适量，加入含10％十四烷基异丙酯的pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液，观察溶解性；
②取植入剂粉末适量，加入二甲基亚砜溶液，观察溶解性；
③取植入剂粉末适量，加入含10％葵二酸二异辛酯的PH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液，观察溶解性；
④取植入剂粉末适量，加入含20％乙酸乙酯和吐温80的PH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液，观察溶解性；
⑤取植入剂粉末适量，加入含20％十四烷基异丙酯的PH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液，观察溶解性；
⑥取植入剂粉末适量，加入含20％液体石蜡的PH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液，加入，混匀，观察溶解性；
⑦取植入剂粉末适量，加入脂肪酶，观察溶解性。
结果：上述方法均无法溶解植入剂。
实施例2测定法
(1)取植入剂在无菌条件下研细(转速10000r/min)得细粉。
(2)取上述细粉0.225g加入至无菌过滤装置中(每个装置底部均配备滤膜)，用pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液过滤5次，每次100ml，过滤完毕，将过滤后的粉末分别小心加入至无菌玻璃瓶中。重复多次以制备多个粉末样品。
(3)培养分组：
按照表1条件设置不同组别，其中√表示加入，×表示不加入。
表1.
| 试验组 | 阳性对照组 | 供试品组 | 阴性对照组 | |
| 菌种 | √ | √ | × | × |
| 植入剂粉末 | √ | × | √ | × |
| 培养基 | √ | √ | √ | √ |
大肠埃希菌试验组：向有植入剂粉末的无菌玻璃瓶中加入100ml的硫乙醇酸盐流体培养基，接种1mL(小于100cfu)的大肠埃希菌；
大肠埃希菌阳性对照组：向空的无菌玻璃瓶中加入100ml的硫乙醇酸盐流体培养基，接种1mL(小于100cfu)的大肠埃希菌；
金黄色葡萄球菌试验组：向有植入剂粉末的无菌玻璃瓶中加入100ml的硫乙醇酸盐流体培养基，接种1mL(小于100cfu)的金黄色葡萄球菌；
金黄色葡萄球菌阳性对照组：向空的无菌玻璃瓶中加入100ml的硫乙醇酸盐流体培养基，接种1mL(小于100cfu)的金黄色葡萄球菌；
生孢梭菌试验组：向有植入剂粉末的无菌玻璃瓶中加入100ml的硫乙醇酸盐流体培养基，接种1mL(小于100cfu)的生孢梭菌；
生孢梭菌阳性对照组：向空的无菌玻璃瓶中加入100ml的硫乙醇酸盐流体培养基，接种1mL(小于100cfu)的生孢梭菌；
枯草芽孢杆菌试验组：向有植入剂粉末的无菌玻璃瓶中加入100ml的胰酪大豆胨液体培养基，接种1mL(小于100cfu)的枯草芽孢杆菌；
枯草芽孢杆菌阳性对照组：向空的无菌玻璃瓶中加入100ml的胰酪大豆胨液体培养基，接种1mL(小于100cfu)的枯草芽孢杆菌；
白色念珠菌试验组：向有植入剂粉末的无菌玻璃瓶中加入100ml的胰酪大豆胨液体培养基，接种1mL(小于100cfu)的白色念珠菌；
白色念珠菌阳性对照组：向空的无菌玻璃瓶中加入100ml的胰酪大豆胨液体培养基，接种1mL(小于100cfu)的白色念珠菌；
黑曲霉菌试验组：向有植入剂粉末的无菌玻璃瓶中加入100ml的胰酪大豆胨液体培养基，接种1mL(小于100cfu)的黑曲霉菌；
黑曲霉菌阳性对照组：向空的无菌玻璃瓶中加入100ml的胰酪大豆胨液体培养基，接种1mL(小于100cfu)的黑曲霉菌；
供试品对照组FTM：向空的无菌玻璃瓶中加入100ml的硫乙醇酸盐流体培养基；
供试品对照组TSB：向有植入剂粉末的无菌玻璃瓶中加入100ml的胰酪大豆胨液体培养基；
阴性对照组FTM：向空的无菌玻璃瓶中加入100ml的硫乙醇酸盐流体培养基；
阴性对照组TSB：向空的无菌玻璃瓶中加入100ml的胰酪大豆胨液体培养基。
每组均设置两个平行样。
结果如下：
表2.
可以看出，5天内试验组的菌落都能正常生长，样品的抑菌性能已消除，不会影响检测结果的准确性。而且使用本发明的装置，没有转移过程导致的粉末洒落，不会遗漏可能存在的微生物。
实施例3转速对微生物的生长和回收率的影响
培养法同实施例2；
回收率统计：
在匀浆杯中加入pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液100ml，再加入1ml菌落数不超过100cfu的细菌，分别用20000转，15000转，5000转的转速对细菌的回收率进行验证。
回收率计算公式：
表3.转速为20000r/min的测试结果
表4.转速为15000r/min的测试结果
表5.转速为10000r/min的测试结果
表6.转速为5000r/min的测试结果
综合考虑药品研磨的粉碎度及微生物回收率和生长情况，选择转速：10000r/min。
对比例1直接接种法
与实施例2不同的是，将植入剂研成细粉后，不使用本发明的装置，使用用薄膜过滤支架过滤，再转至玻璃瓶，其余皆相同。
表7.
可以看出，部分试验组中菌未生长，样品仍然具有抑菌性，影响检测结果的准确性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种难溶性植入剂的无菌检查方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）研磨：将植入剂在无菌条件下研磨成细粉，所述研磨的转速为5000 r/min或10000r/min；
（2）过滤：将步骤（1）所得细粉放入过滤装置中，用无菌氯化钠蛋白胨缓冲液过滤；
（3）培养：将过滤后的粉末放入无菌容器中，加入培养基；同时按照相同方法设置对照组，对照组再分别额外加入对照微生物，培养3-5天，观察菌落生长情况；
其中，所述过滤装置为增加了螺纹口和筛网的无菌过滤器，在使用时，通过螺纹口使无菌过滤器的顶部打开，在无菌过滤器的底部安装滤膜，所述筛网的目数为80目。
2.根据权利要求1所述的无菌检查方法，其特征在于，步骤（1）中，所述研磨的转速为10000 r/min。
3.根据权利要求1所述的无菌检查方法，其特征在于，步骤（3）中，所述培养基为硫乙醇酸盐流体培养基或胰酪大豆胨液体培养基。
4.根据权利要求1所述的无菌检查方法，其特征在于，步骤（3）中，所述对照微生物选自大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、生孢梭菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉菌。
5.一种无菌过滤装置在难溶性植入剂的无菌检查中的应用，其特征在于，所述无菌过滤装置为增加了螺纹口和筛网的无菌过滤器，在使用时，通过螺纹口使无菌过滤器的顶部打开，在无菌过滤器的底部安装滤膜，所述筛网的目数为80目；
所述应用包括以下步骤：
（1）研磨：将植入剂在无菌条件下研磨成细粉，所述研磨的转速为5000 r/min或10000r/min；
（2）过滤：将步骤（1）所得细粉放入过滤装置中，用无菌氯化钠蛋白胨缓冲液过滤；
（3）培养：将过滤后的粉末放入无菌容器中，加入培养基；同时按照相同方法设置对照组，对照组再分别额外加入对照微生物，培养3-5天，观察菌落生长情况。
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