BRPI0817602B1 - Processo para capturar ou concentrar micro- organismos e kits de diagnóstico - Google Patents

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A. Kshirsagar Tushar
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Description

(54) Título: PROCESSO PARA CAPTURAR OU CONCENTRAR MICRO-ORGANISMOS E KITS DE DIAGNÓSTICO (51) lnt.CI.: C12N 1/02; G01N 1/40; C12N 11/14; C12Q 1/04; C12Q 1/06; C12Q 1/14; C12Q 1/24; B01J 20/02; B01J 20/06; B01J 20/14 (30) Prioridade Unionista: 03/10/2007 US 60/977.200 (73) Titular(es): 3M INNOVATIVE PROPERTIES COMPANY (72) Inventor(es): MANJIRI T. KSHIRSAGAR; TUSHAR A. KSHIRSAGAR; THOMAS E. WOOD
1/39 “PROCESSO PARA CAPTURAR OU CONCENTRAR MICROORGANISMOS E KITS DE DIAGNÓSTICO”
Declaração de Prioridade [001] Este pedido reivindica a prioridade do pedido provisório US n° 60/977.200 depositado em 3 de outubro de 2007, cujo conteúdo está aqui incorporado para referência.
Campo da Invenção [002] A presente invenção refere-se a processos para capturar ou concentrar micro-organismos de modo que permaneçam viáveis para detecção ou teste. Em outros aspectos, esta invenção refere-se, também, a agentes de concentração (e métodos para sua preparação) e kits de diagnóstico para uso na execução de tais processos de concentração.
Antecedentes [003] As doenças causadas por alimentos e infecções adquiridas em hospitais resultantes da contaminação por micro-organismos são uma preocupação em vários locais ao redor do mundo. Assim, é frequentemente desejável ou necessário realizar testes para se detectar a presença de bactérias ou outros micro-organismos em várias amostras, sejam clínicas, ambientais ou outras, para se determinar a identidade e/ou a quantidade dos microorganismos presentes.
[004] DNA bacteriano ou RNA bacteriano, por exemplo, podem ser analisados para se avaliar a presença ou ausência de uma espécie particular de bactérias mesmo na presença de outras espécies de bactérias. A capacidade de detectar a presença de uma bactéria específica, entretanto, depende, pelo menos em parte, da concentração da bactéria na amostra sendo analisada. As amostras de bactérias podem ser colocadas em placas ou submetidas a um processo de cultura para aumentar a quantidade de bactérias na amostra para garantir um nível adequado de detecção, mas a etapa de cultura frequentemente exige um tempo substancial e, portanto, pode atrasar significativamente os resultados da avaliação.
[005] A concentração das bactérias na amostra pode reduzir o tempo de cultura ou mesmo eliminar a necessidade de tal etapa. Assim, foram desenvolvidos métodos para isolar (e por meio disso concentrar) determinadas cepas bacterianas utilizando-se anticorpos específicos para a cepa (por exemplo, sob a forma de partículas magnéticas ou nãoPetição 870170072712, de 27/09/2017, pág. 10/52
2/39 magnéticas revestidas com anticorpos). Tais métodos, entretanto, tendem a ser caros e ainda um pouco mais lentos que o desejado para pelo menos algumas aplicações de diagnóstico.
[006] Também têm sido utilizados métodos de concentração que não são específicos para cepas (por exemplo, para se obter uma avaliação mais genérica dos microorganismos presentes em uma amostra). Após a concentração de uma população mista de micro-organismos, a presença de determinadas cepas pode ser determinada, se desejado, utilizando-se sondas para cepas específicas.
[007] A concentração ou captura não-específica de micro-organismos tem sido realizada através de métodos baseados em interações entre carboidratos e proteína lectina. Suportes revestidos com quitosana têm sido usados como dispositivos de captura nãoespecífica, e substâncias (por exemplo, carboidratos, vitaminas, compostos quelantes de ferro, e sideróforos) que servem como nutrientes para micro-organismos também têm sido descritas como ligantes úteis para permitir a captura não-específica de micro-organismos.
[008] Vários materiais inorgânicos (por exemplo, hidróxi apatita e hidróxidos metálicos) têm sido usados não especificamente para ligar e concentrar bactérias. Os métodos de concentração físicos (por exemplo, filtragem, cromatografia, centrifugação e deposição gravitacional) também têm sido utilizados para captura não-específica, com e/ou sem o uso de agentes de ligação inorgânicos. Esses métodos de concentração nãoespecífica variam em velocidade, custo (necessidade de pelo menos alguns equipamentos caros, materiais e/ou técnicos treinados), requisitos de amostra (por exemplo, a natureza da amostra e/ou limitações de volume), requisitos de espaço, facilidade de uso (necessidade de pelo menos alguns complicados processos de múltiplas etapas), adequação para uso local e/ou eficácia.
Sumário da Invenção [009] Com isso, reconhecemos que há uma necessidade urgente por processos que permitam detectar rapidamente micro-organismos patogênicos. Esses processos serão de preferência não apenas rápidos, mas também de baixo custo, simples (sem envolver equipamentos ou procedimentos complexos), e/ou eficazes sob uma variedade de condições (por exemplo, com vários tipos de matrizes de amostra, várias cargas bacterianas e vários volumes de amostra).
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3/39 [0010] Brevemente, em um aspecto, esta invenção fornece um processo para concentrar não especificamente as cepas de micro-organismos (por exemplo, cepas de bactérias, fungos, leveduras, protozoários, vírus (incluindo vírus não-envelopados e vírus envelopados), e endósporos bacterianos) presentes em uma amostra, de modo que os micro-organismos permaneçam viáveis com o propósito de detecção ou teste de uma ou mais das cepas. O processo compreende (a) fornecer um agente de concentração (de preferência, um agente de concentração particulado) que compreende um meio de suporte de terra diatomácea, em ao menos uma porção de sua superfície, um tratamento de superfície que compreende um modificador de superfície que compreende dióxido de titânio, ouro ou platina em nanoescala fina, ou uma combinação dos mesmos; (b) fornecer uma amostra (de preferência, sob a forma de um fluido) que compreende pelo menos uma cepa de micro-organismo; e (c) colocar em contato (de preferência, por misturação) o agente de concentração com a amostra de modo que ao menos uma porção de pelo menos uma cepa de micro-organismo seja ligada ao ou capturada pelo agente de concentração. De preferência, o processo compreende ainda detectar a presença de ao menos uma cepa de micro-organismo ligada (por exemplo, por cultura, microscopia/formação de imagens, genética, bioluminescência ou métodos de detecção imunológica) e/ou a separação (de preferência, por deposição gravitacional) do agente de concentração resultante ligado ao micro-organismo. O processo pode, opcionalmente, compreender ainda separar da amostra o agente de concentração segregado resultante.
[0011] O processo da presente invenção não se destina a uma cepa de microorganismo específica. Ao contrário, descobriu-se que certos materiais inorgânicos relativamente baratos podem ser surpreendentemente eficazes na captura de uma variedade de micro-organismos. Esses materiais podem ser usados para concentrar as cepas de microorganismos presentes em uma amostra (por exemplo, uma amostra de alimento) em uma maneira que independe da cepa, de modo que uma ou mais das cepas de micro-organismos (de preferência, uma ou mais cepas de bactérias) podem ser testadas mais fácil e rapidamente.
[0012] O processo da invenção é relativamente simples e de baixo custo (sem exigir equipamentos complexos ou caros materiais de cepas específicas) e pode ser relativamente rápido (em modalidades preferenciais capturando pelo menos cerca de 70 por
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4/39 cento (com mais preferência, pelo menos cerca de 80 por cento; com a máxima preferência, pelo menos cerca de 90 por cento) dos micro-organismos presentes em uma amostra em menos de cerca de 30 minutos, em relação a uma amostra de controle correspondente sem agente de concentração). Além disso, o processo pode ser eficaz com uma variedade de microorganismos (incluindo patógenos como bactérias gram-positivas e gram-negativas) e com uma variedade de amostras (matrizes de amostras diferentes e, ao contrário de pelo menos alguns métodos da técnica anterior, mesmo amostras com baixo teor e/ou grandes volumes de microorganismos). Dessa forma, pelo menos algumas modalidades do processo da presente invenção podem satisfazer a urgente necessidade acima citada de processos simples e de baixo custo de detecção rápida de micro-organismos patogênicos sob uma variedade de condições.
[0013] Em outro aspecto, a invenção fornece também um kit de diagnóstico para uso na execução do processo da invenção, sendo que o kit compreende (a) um agente de concentração (de preferência, um agente de concentração particulado) que compreende um meio de suporte de terra diatomácea, em ao menos uma porção de sua superfície, um tratamento de superfície que compreende um modificador de superfície que compreende dióxido de titânio, ouro ou platina em nanoescala fina, ou uma combinação dos mesmos; e (b) um recipiente de teste (de preferência, um recipiente de teste esterilizado) para uso na execução do processo da invenção. De preferência, o kit de diagnóstico compreende adicionalmente um ou mais componentes selecionados a partir de meios de cultura de micro-organismos, reagentes de lise, tampões, componentes do teste de detecção genética, componentes do teste de detecção por bioluminescência, instruções para execução do processo, e combinações dos mesmos.
[0014] Em ainda um outro aspecto, a invenção apresenta um agente de concentração que compreende dióxido de titânio, ouro ou platina em nanoescala fina, ou uma combinação dos mesmos em um suporte particulado selecionado a partir de terra diatomácea, terra diatomácea modificada por óxido metálico, e combinações dos mesmos.
[0015] Em ainda outro aspecto, a invenção apresenta um processo para preparar um agente de concentração que compreende (a) o fornecimento de um suporte particulado selecionado a partir de terra diatomácea, terra diatomácea modificada por óxido
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5/39 metálico, e combinações dos mesmos; e (b) deposição de ouro e platina em nanoescala fina sobre o suporte por deposição física de vapor.
[0016] Em ainda um outro aspecto, a invenção apresenta um processo para preparar um agente de concentração que compreende (a) o fornecimento de um suporte particulado selecionado a partir de terra diatomácea, terra diatomácea modificada por óxido metálico, e combinações dos mesmos; (b) o fornecimento de um composto precursor de dióxido de titânio hidrolisável; (c) a combinação do suporte e do composto; e (d) hidrólise do composto de modo que o dióxido de titânio seja depositado sobre o suporte.
Breve Descrição dos Desenhos [0017] Essas e outras características, aspectos e vantagens da presente invenção serão mais bem entendidos com a descrição a seguir e com as reivindicações e os desenhos em anexo, sendo que:
[0018] A figura 1 mostra, em uma vista em corte lateral, um aparelho que foi utilizado na preparação de agentes de concentração para uso na execução das modalidades do processo da invenção descrita na seção de exemplos abaixo.
[0019] A figura 2 shows, em uma vista em perspectiva, o aparelho da FIGURA 1.
[0020] Essas figuras, que são idealizadas, não são desenhadas em escala e têm a finalidade de ser meramente ilustrativas e não-limitadoras.
Descrição Detalhada
Definições [0021] Conforme usado neste pedido de patente:
[0022] “Amostra” significa uma substância ou material que é coletado (por exemplo, para ser analisado);
[0023] “Matriz de amostra” significa os componentes de uma amostra exceto micro-organismos;
[0024] “Detecção” significa a identificação de pelo menos um componente de um micro-organismo, que determina que o micro-organismo está presente;
[0025] “Detecção genética” significa a identificação de um componente de material genético como DNA ou RNA derivado de um micro-organismo-alvo;
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6/39 [0026] “Detecção imunológica” significa a identificação de um material antígeno como uma proteína ou um proteoglicano derivado de um micro-organismo-alvo;
[0027] “Micro-organismo” significa qualquer célula que tem material genético adequado para análise ou detecção (incluindo, por exemplo, bactérias, leveduras, vírus e endósporos bacterianos);
[0028] “Cepa de micro-organismo” significa um tipo particular de microorganismo que é distinguível através de um método de detecção (por exemplo, microorganismos de diferentes gêneros, de diferentes espécies dentro de um gênero, ou de diferentes grupos isolados dentro de uma espécie); e [0029] “Micro-organismo-alvo” significa qualquer micro-organismo que se deseja detectar.
Agente de concentração [0030] Agentes de concentração adequados para uso na execução do processo da invenção incluem aqueles que compreendem um meio de suporte de terra diatomácea, em ao menos uma porção de sua superfície, um tratamento de superfície que compreende um modificador de superfície que compreende dióxido de titânio, ouro ou platina em nanoescala fina, ou uma combinação dos mesmos. A concentração ou captura utilizando-se tais agentes de concentração é, em geral, não específica para nenhuma cepa, espécie ou tipo de micro-organismo particular e, portanto, fornece a concentração de uma população geral de micro-organismos em uma amostra. Cepas específicas de microorganismos podem, então, ser detectadas entre a população de micro-organismos capturados usando-se qualquer método de detecção conhecido com sondas para cepas específicas. Dessa forma, os agentes de concentração podem ser usados para a detecção de contaminantes microbianos ou patógenos (particularmente patógenos existentes em alimentos como bactérias) em amostras clínicas, alimentares, ambientais ou outras.
[0031] Na execução do processo da invenção, os agentes de concentração podem ser utilizados em qualquer forma que seja sensível ao contato da amostra e à captura de micro-organismos (por exemplo, sob a forma de particulado ou aplicado a um suporte como uma vareta, filme, filtro, tubo, cavidade, placa, cápsulas, membrana, ou canal de um dispositivo de microfluido, ou similar). De preferência, os agentes de concentração são utilizados sob a forma de particulados.
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7/39 [0032] Quando dispersos ou suspensos em sistemas de água, os materiais inorgânicos apresentam cargas superficiais que são características do material e do pH do sistema de água. O potencial na interface material-água é chamado de “potencial zeta”, que pode ser calculado a partir de mobilidades eletroforéticas (isto é, a partir das taxas segundo as quais as partículas de material deslocam-se entre os eletrodos carregados dispostos no sistema de água). Pelo menos alguns dos agentes de concentração utilizados na execução do processo da invenção têm potenciais zeta que são pelo menos um pouco mais positivos que os dos agentes de terra diatomácea não tratada, e os agentes de concentração podem ser de maneira surpreendente significativamente mais eficazes que a terra diatomácea não tratada em concentrar micro-organismos como bactérias, cujas superfícies em geral tendem a ser carregadas negativamente. De preferência, os agentes de concentração têm um potencial zeta negativo a um pH de cerca de 7 (com mais preferência, um potencial zeta na faixa de cerca de -5 milivolts a cerca de -20 milivolts a um pH de cerca de 7; com mais preferência ainda, um potencial zeta na faixa de cerca de -8 milivolts a cerca de -19 milivolts a um pH de cerca de 7; com a máxima preferência, um potencial zeta na faixa de cerca de 10 milivolts a cerca de -18 milivolts a um pH de cerca de 7).
[0033] Dessa forma, descobriu-se que os agentes de concentração que compreendem certos tipos de terra diatomácea com tratamento de superfície ou modificação de superfície (isto é, que servem de suporte para um tratamento de superfície que compreende um modificador de superfície que compreende dióxido de titânio, ouro ou platina em nanoescala fina, ou uma combinação dos mesmos) podem ser surpreendentemente mais eficazes que a terra diatomácea não tratada ao concentrar micro-organismos. O tratamento de superfície de preferência compreende adicionalmente um óxido metálico selecionado a partir de óxido férrico, óxido de zinco, óxido de alumínio e similares, e combinações dos mesmos (com mais preferência, de óxido férrico). Embora os metais nobres como ouro sejam conhecidos por apresentar características antimicrobianas, os agentes de concentração que contêm ouro utilizados no processo da invenção podem ser surpreendentemente eficazes não só em concentrar os microorganismos, mas também em deixá-los viáveis para fins de detecção ou de teste.
[0034] Modificadores de superfície úteis incluem ouro em nanoescala fina; platina em nanoescala fina; ouro em nanoescala fina em combinação com pelo menos um óxido
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8/39 metálico (de preferência, dióxido de titânio, óxido férrico, ou uma combinação dos mesmos); dióxido de titânio; dióxido de titânio em combinação com pelo menos um outro óxido metálico (isto é, exceto dióxido de titânio); e similares; e combinações dos mesmos. Modificadores de superfície preferenciais incluem ouro em nanoescala fina; platina em nanoescala fina; ouro em nanoescala fina em combinação com pelo menos óxido férrico ou dióxido de titânio; dióxido de titânio; dióxido de titânio em combinação com pelo menos óxido férrico; e combinações dos mesmos.
[0035] Modificadores de superfície mais preferenciais incluem ouro em nanoescala fina; platina em nanoescala fina; ouro em nanoescala fina em combinação com óxido férrico ou dióxido de titânio; dióxido de titânio; dióxido de titânio em combinação com óxido férrico; e combinações dos mesmos (com mais preferência, ainda, ouro em nanoescala fina; ouro em nanoescala fina em combinação com óxido férrico ou dióxido de titânio; dióxido de titânio em combinação com óxido férrico; e combinações dos mesmos). Ouro em nanoescala fina, ouro em nanoescala fina em combinação com óxido férrico ou dióxido de titânio, e combinações dos mesmos são da máxima preferência.
Ouro e/ou platina [0036] Os agentes de concentração que compreendem ouro ou platina em nanoescala fina podem ser preparados depositando-se ouro ou platina sobre terra diatomácea por deposição física de vapor (opcionalmente, por deposição física de vapor em uma atmosfera oxidante).
[0037] Para uso na presente invenção, o termo “ouro ou platina em nanoescala fina” refere-se a corpos de ouro ou de platina (por exemplo, partículas ou aglomerados de átomos) que têm todas as dimensões menores que ou igual a 5 nanômetros (nm) em tamanho. De preferência, pelo menos uma porção do ouro ou da platina depositada tem todas as dimensões (por exemplo, diâmetro da partícula ou diâmetro do aglomerado de átomos) na faixa de até (menor que ou igual a) cerca de 10 nm em tamanho médio (com mais preferência, até cerca de 5 nm; com mais preferência ainda, até cerca de 3 nm).
[0038] Em modalidades da máxima preferência, pelo menos uma porção do ouro é nanoescala ultra (isto é, tem ao menos duas dimensões menores que 0,5 nm em tamanho e todas as dimensões menores que 1,5 nm em tamanho). O tamanho de
Petição 870170072712, de 27/09/2017, pág. 17/52
9/39 nanopartículas individuais de ouro ou de platina pode ser determinado por análise de microscopia eletrônica de transmissão (TEM), conforme é bem conhecido na técnica.
[0039] A quantidade de ouro ou de platina fornecida sobre a terra diatomácea pode variar em uma ampla gama. Como ouro e platina são materiais caros, é desejável não utilizar mais do que é razoavelmente necessário para se alcançar um grau desejado de atividade de concentração. Adicionalmente, devido ao fato de que o ouro ou a platina em nanoescala pode ser altamente móvel quando depositada utilizando-se a deposição física de vapor (PVD), a atividade pode ser comprometida se for utilizada uma quantidade excessiva de ouro ou de platina, devido à coalescência de pelo menos parte do ouro ou da platina em corpos grandes.
[0040] Por essas razões, a carga em peso do ouro ou da platina sobre a terra diatomácea está, de preferência, na faixa de cerca de 0,005 (com mais preferência, 0,05) a cerca de 10 por cento, em peso, com mais preferência de cerca de 0,005 (com mais preferência ainda, 0,05) a cerca de 5 por cento, em peso, e, com mais preferência ainda, de cerca de 0,005 (com a máxima preferência, 0,05) a cerca de 2,5 por cento, em peso, com base no peso total da terra diatomácea e do ouro ou da platina.
[0041] Ouro e platina podem ser depositados por técnicas de PVD (por exemplo, por bombardeamento iônico) para formar partículas ou aglomerados de átomos em nanoescala para ativação de concentração em uma superfície de suporte. Acredita-se que o metal seja depositado principalmente na forma elementar, embora outros estados de oxidação possam estar presentes.
[0042] Além de ouro e/ou platina, um ou mais outros metais podem também ser fornecidos sobre os mesmos suportes de terra diatomácea e/ou sobre outros suportes inter-misturados com os suportes contendo ouro e/ou platina. Exemplos de outros metais incluem prata, paládio, ródio, rutênio, ósmio, cobre, irídio e similares, e combinações dos mesmos. Se utilizados, esses outros metais poderão ser co-depositados em um suporte a partir de uma fonte-alvo igual ou diferente da fonte-alvo de ouro ou de platina utilizada. Alternativamente, esses metais podem ser fornecidos em um suporte antes ou depois da deposição do ouro e/ou da platina. Metais que requerem um tratamento térmico para ativação otimizada podem ser aplicados a um suporte termo-tratado antes da deposição do ouro e/ou da platina.
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10/39 [0043] Deposição física de vapor refere-se à transferência física de metal de uma fonte ou alvo contendo metal para um meio de suporte. A deposição física de vapor pode ser vista como um fenômeno que envolve a deposição átomo a átomo, embora, na prática, o metal possa ser transferido como corpos extremamente finos constituindo mais de um átomo por corpo. O metal depositado pode interagir com a superfície do meio de suporte fisicamente, quimicamente, ionicamente, e/ou de outro modo.
[0044] A deposição física de vapor de preferência ocorre sob condições de temperatura e de vácuo nas quais o metal é bastante móvel e tende a migrar sobre a superfície do meio de suporte até ser imobilizado de alguma maneira (por exemplo, aderindo a um local sobre ou muito próximo da superfície de suporte). Os locais de aderência podem incluir defeitos como espaços vazios na superfície, descontinuidades estruturais como degraus e deslocamentos e limites interfaciais entre fases ou cristais ou outra espécie metálica como pequenos aglomerados metálicos. O metal depositado por PVD aparentemente é imobilizado o suficiente para que o metal possa reter um alto nível de atividade. Em contrapartida, as metodologias convencionais frequentemente permitem a agregação do metal em corpos tão grandes que a atividade pode ser comprometida ou mesmo perdida.
[0045] A deposição física de vapor pode ser executada em várias maneiras diferentes. Abordagens representativas incluem deposição por bombardeamento com íons (preferencial), evaporação e deposição a arco catódico. Qualquer uma dessas ou outras abordagens PVD pode ser usada na preparação dos agentes de concentração utilizados na execução do processo da invenção, embora a natureza da técnica PVD possa impactar a atividade resultante.
[0046] Por exemplo, a energia da técnica de deposição física de vapor pode impactar a mobilidade do metal depositado e daí sua tendência de coalescer. Energias mais elevadas tendem a corresponder a uma tendência maior de agregação do metal. A maior coalescência, por sua vez, tende a reduzir a atividade. Em geral, a energia da espécie depositante é menor para evaporação, maior para deposição por bombardeamento com íons (que pode incluir alguma quantidade de íons na qual uma pequena fração da espécie metálica incidente é ionizada), e maior para a deposição a arco catódico (que pode incluir várias dezenas de porcentagens de teor de íons). Consequentemente, se uma técnica PVD
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11/39 particular fornecer metal depositado que seja mais móvel que o desejado, pode ser útil utilizar uma técnica PVD de menor energia.
[0047] De preferência, a deposição física de vapor é realizada enquanto o meio de suporte a ser tratado é bem misturado (por exemplo, revolvido, fluidizado, moído, ou submetido a um processo similar) para assegurar o tratamento adequado das superfícies de suporte. Os métodos de revolver partículas para deposição por PVD são descritos na patente US n° 4.618.525 (Chamberlain et al.), cujas descrições são aqui incorporadas a título de referência.
[0048] Durante a aplicação da técnica PVD sobre partículas finas ou aglomerados de partículas finas (por exemplo, com diâmetro médio menor que cerca de 10 micrômetros), o meio de suporte é, de preferência, misturado e fragmentado (por exemplo, triturado ou moído até certo ponto) durante ao menos uma parte do processo PVD. Isso pode ajudar na manutenção da separação e do fluxo livre das partículas ou dos aglomerados durante a deposição. No caso de partículas finas ou aglomerados de partículas finas, pode ser vantajoso que a mistura das partículas seja tão vigorosa e rápida quanto possível e que ainda retenha a deposição controlada do metal.
[0049] A técnica PVD pode ser realizada utilizando-se qualquer um dos tipos de aparelhos existentes atualmente ou que venham a ser desenvolvidos com esse propósito. As FIGURAS 1 e 2 mostram, contudo, um aparelho preferencial (10). O aparelho (10) inclui um gabinete (12) que define uma câmara de vácuo (14) que contém um agitador de partículas (16). O gabinete (12), que pode ser produzido a partir de uma liga de alumínio se for desejado, é um cilindro oco orientado verticalmente (por exemplo, de 45 cm de altura e 50 cm de diâmetro). A base (18) contém uma porta (20) para uma válvula de porta de alto vácuo (22) seguida de uma bomba de difusão (24) de 15,2 cm (seis polegadas) bem como um suporte (26) para o agitador de partículas (16). A câmara de vácuo (14) pode ser submetida a vácuo com contrapressões na faixa de 1,13 mPa (10'6 Torr).
[0050] A parte superior do gabinete (12) inclui uma placa desmontável vedada com uma guarnição de borracha no formato “L” 28 que é equipada com um suporte externo, uma fonte de deposição por bombardeamento com íons magnétron de 7,6 cm (três polegadas) de diâmetro e alimentada por corrente contínua (CC) 30 (da US Gun II, US, INC.,
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San Jose, CA, EUA). Na fonte de deposição por bombardeamento com íons 30 é fixado um alvo de ouro ou de platina a ser bombardeado com íons 32 (por exemplo, com diâmetro de 7,6 cm (3,0 polegadas) x 0,48 cm (3/16 polegadas) de espessura). A fonte de deposição por bombardeamento com íons 30 é alimentada por um MDX-10 Magnetron Drive (Advanced Energy Industries, Inc, Fort Collins, CO, EUA) equipado com um sistema de supressão de arcos Sparc-le 20 (Advanced Energy Industries, Inc, Fort Collins, CO, EUA).
[0051] O agitador de partículas (16) é um cilindro oco (por exemplo, de 12 cm de comprimento x 9,5 cm de diâmetro horizontal) com uma abertura retangular (34) (por exemplo, de 6,5 cm x 7,5 cm). A abertura (34) é posicionada cerca de 7 cm diretamente abaixo da superfície 36 do alvo a ser bombardeado com íons (32), de modo que os átomos do material bombardeado possam entrar no volume do agitador (38). O agitador (16) é equipado com uma haste (40) alinhada com seu eixo. A haste (40) tem uma seção transversal retangular (por exemplo, 1 cm x 1 cm) na qual são parafusadas quatro lâminas retangulares (42) que formam um mecanismo de agitação ou roda de pás para as partículas do suporte sendo agitadas. Cada lâmina (42) contém dois orifícios (44) (por exemplo, com 2 cm de diâmetro) para promover a comunicação entre os volumes de partículas contidos em cada um dos quatro quadrantes formados pelas lâminas (42) e o agitador de partículas (16). As dimensões das lâminas (42) são selecionadas para proporcionar folgas laterais e axiais de 2,7mM ou 1,7 mM com as paredes do agitador (48).
[0052] A deposição física de vapor pode ser executada essencial mente a qualquer temperatura desejada em uma faixa muito ampla. Entretanto, o metal depositado pode ser mais ativo (talvez devido a mais defeitos e/ou menor mobilidade e coalescência) se for depositado a temperaturas relativamente baixas (por exemplo, a uma temperatura abaixo de cerca de 150°C, de preferência abaixo de cerca de 50 °C, com mais preferência à temperatura ambiente (por exemplo, cerca de 20°C a cerca de 27°C) ou menos). A operação sob condições ambiente pode ser em geral preferencial por ser eficaz e econômica, uma vez que o aquecimento ou o resfriamento não são necessários durante a deposição.
[0053] A deposição física de vapor pode ser executada em uma atmosfera de gás inerte para bombardeamento iônico (por exemplo, em argônio, hélio, xenônio, radônio, ou uma mistura de dois ou mais dos mesmos (de preferência, argônio)), e, opcionalmente, a deposição física de vapor pode ser executada em uma atmosfera oxidante. A atmosfera
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13/39 oxidante compreende, de preferência, ao menos um gás contendo oxigênio (com mais preferência, um gás contendo oxigênio selecionado a partir de oxigênio, água, peróxido de hidrogênio, ozônio, e combinações dos mesmos; com mais preferência ainda, um gás contendo oxigênio selecionado a partir de oxigênio, água, e combinações dos mesmos; com a máxima preferência, oxigênio). A atmosfera oxidante compreende adicionalmente um gás inerte para bombardeamento iônico como argônio, hélio, xenônio, radônio, ou uma mistura de dois ou mais dos mesmos (de preferência, argônio). A pressão total do gás (todos os gases) na câmara de vácuo durante o processo de PVD pode ser de cerca de 0,13 Pa a cerca de 3,3 Pa (1 mTorr a cerca de 25 mTorr) (de preferência, de cerca de 0,67 Pa a cerca de 1,9 Pa (5 mTorr a cerca de 15 mTorr). A atmosfera oxidante pode compreender de cerca de 0,05 por cento a cerca de 60 por cento, em peso, de gás contendo oxigênio (de preferência, de cerca de 0,1 por cento a cerca de 50 por cento, em peso; com mais preferência, de cerca de 0,5 por cento a cerca de 25 por cento, em peso), com base no peso total de todos os gases na câmara de vácuo.
[0054] O meio de suporte da terra diatomácea pode, opcionalmente, ser calcinado antes da deposição do metal, embora isso possa aumentar seu teor de sílica cristalina. Como o ouro e a platina são ativos imediatamente após a deposição via PVD, geralmente não há necessidade de tratamento por calor após a deposição do metal, ao contrário da deposição utilizando-se outras metodologias. Contudo, esse tratamento por calor ou calcinação pode ser feito, se desejado, para aumentar a atividade.
[0055] Em geral, o tratamento térmico pode envolver o aquecimento do suporte a uma temperatura na faixa de cerca de 125°C a cerca de 1000°C durante um período na faixa de cerca de 1 segundo a cerca de 40 horas, de preferência cerca de 1 minuto a cerca de 6 horas, em qualquer atmosfera adequada como ar, uma atmosfera inerte como nitrogênio, dióxido de carbono, argônio, uma atmosfera redutora como hidrogênio e similares. As condições térmicas particulares a serem usadas podem depender de vários fatores incluindo a natureza do suporte.
[0056] Em geral, o tratamento térmico pode ser executado abaixo de uma temperatura na qual os constituintes do suporte seriam decompostos, degradados, ou, de outro modo, desnecessariamente danificados termicamente. Dependendo de fatores como a natureza do suporte, a quantidade de metal e similares, a atividade poderá ser
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14/39 comprometida até certo ponto se o sistema for tratado termicamente a uma temperatura excessivamente alta.
Dióxido de titânio e/ou outros óxidos metálicos [0057] Os agentes de concentração que compreendem óxido metálico podem ser preparados depositando-se óxido metálico sobre terra diatomácea por hidrólise de um composto precursor de óxido metálico hidrolisável. Compostos precursores de óxido metálico adequados incluem complexos metálicos e sais metálicos que podem ser hidrolisados para formar óxidos metálicos. Complexos metálicos úteis incluem os que compreendem ligantes alcóxidos, peróxido de hidrogênio como ligando, ligantes carboxilato-funcionais e similares, e combinações dos mesmos. Sais metálicos úteis incluem superfícies metálicas, nitratos, haletos, carbonatos, oxalatos, hidróxidos e similares, e combinações dos mesmos.
[0058] Quando são utilizados sais metálicos ou complexos metálicos de peróxido de hidrogênio ou ligantes carboxilato-funcionais, a hidrólise pode ser induzida por meios químicos ou térmicos. Na hidrólise induzida quimicamente, o sal metálico pode ser introduzido sob a forma de uma solução em uma dispersão da terra diatomácea, e o pH da combinação resultante pode ser elevado mediante a adição de uma solução de base até que o sal metálico precipite como um complexo de hidróxido do metal sobre a terra diatomácea. Bases adequadas incluem metal alcalino e hidróxidos e carbonatos de metal alcalino-terroso, amônio e hidróxidos e carbonatos de alquil amônio e similares, e combinações dos mesmos. A solução de sal metálico e a solução de base podem geralmente ter uma concentração de cerca de 0,1 a cerca de 2 M.
[0059] De preferência, a adição do sal metálico na terra diatomácea é executada com agitação (de preferência, agitação rápida) da dispersão da terra diatomácea. A solução de sal metálico e a solução de base podem ser introduzidas na dispersão de terra diatomácea separadamente (em qualquer ordem) ou simultaneamente, de modo a produzir uma reação de preferência substancialmente uniforme do complexo de hidróxido metálico resultante com a superfície da terra diatomácea. A mistura de reação pode, opcionalmente, ser aquecida durante a reação para acelerar a velocidade da reação. Em geral, a quantidade de base adicionada pode ser igual ao número de moles do metal multiplicado pelo número de contraíons não-oxo e não-hidroxo no sal metálico ou no complexo metálico.
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15/39 [0060] Alternativamente, quando são usados sais de titânio ou de ferro, o sal metálico pode ser induzido termicamente para hidrolisar para formar o complexo de hidróxido do metal e para interagir com a superfície da terra diatomácea. Nesse caso, a solução de sal metálico pode geralmente ser adicionada a uma dispersão da terra diatomácea (de preferência, uma dispersão agitada) que tenha sido tratada a uma temperatura suficientemente alta (por exemplo, maior que cerca de 50°C) para promover a hidrólise do sal metálico. De preferência, a temperatura situa-se entre cerca de 75°C e 100°C, embora possam ser usadas temperaturas mais elevadas se a reação for executada em um aparelho de autoclave.
[0061] Quando são utilizados complexos de alcóxido metálico, o complexo metálico pode ser induzido para hidrolisar para formar um complexo de hidróxido do metal por hidrólise parcial do alcóxido metálico em uma solução de álcool. A hidrólise da solução de alcóxido metálico na presença de terra diatomácea pode resultar na deposição de uma espécie de hidróxido metálico sobre a superfície da terra diatomácea.
[0062] Alternativamente, o alcóxido metálico pode ser hidrolisado e depositado sobre a superfície da terra diatomácea reagindo o alcóxido metálico na fase de gás com água, na presença da terra diatomácea. Nesse caso, a terra diatomácea pode ser agitada durante a deposição em, por exemplo, um reator de leito fluidizado ou um reator de tambor giratório.
[0063] Após a hidrólise acima descrita do composto precursor do óxido metálico na presença da terra diatomácea, a terra diatomácea com superfície tratada resultante pode ser separada por decantação ou por filtragem ou ainda por outras técnicas conhecidas. O produto separado pode ser purificado por lavagem em água e pode então ser secado (por exemplo, a 50Oa150O).
[0064] Embora a terra diatomácea com superfície tratada geralmente possa ser funcional após a secagem, ela pode, opcionalmente, ser calcinada para remover subprodutos voláteis sendo aquecida em ar a uma temperatura de cerca de 250 °C a 650°C, em geral, sem perda da função. Essa etapa de calcinação pode ser preferencial quando alcóxidos metálicos são utilizados como os compostos precursores de óxidos metálicos.
[0065] Em geral, com compostos precursores de óxidos metálicos de ferro, os tratamentos de superfície resultantes compreendem óxido de ferro nanoparticulado.
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Quando a razão entre o peso do óxido de ferro e o peso da terra diatomácea é cerca de 0,08, a difração de raios X (XRD) não mostra a presença de um material de óxido de ferro bem definido. Em vez disso, são observadas reflexões adicionais de raios X a 3,80, 3,68 e 2,94 Á. O exame desse material via TEM mostra que a superfície da terra diatomácea é revestida de maneira relativamente uniforme com material de óxido de ferro globular nanoparticulado. O tamanho do cristalito do material de óxido de ferro é menor que cerca de 20 nm, com a maioria dos cristais tendo um diâmetro menor que cerca de 10 nm. O agrupamento desses cristais globulares sobre a superfície da terra diatomácea é denso na aparência, e a superfície da terra diatomácea parece ser tornada áspera pela presença desses cristais.
[0066] Em geral, com compostos precursores de óxidos metálicos de titânio, os tratamentos de superfície resultantes compreendem óxido de titânio nanoparticulado. Quando o dióxido de titânio é depositado sobre a terra diatomácea, a difração por raios X do produto resultante após a calcinação a cerca de 350°C pode mostrar a presença de pequenos cristais de óxido de titânio anatásio. Com razões titânio/terra diatomácea relativamente mais baixas ou nos casos em que são usadas misturas de precursores de óxido de titânio e ferro, em geral nenhuma evidência de anatásio é observada pela análise de raios X.
[0067] Como óxido de titânio é bem conhecido como um potente catalisador de foto-oxidação, os agentes de concentração de terra diatomácea modificada por óxido de titânio da presente invenção podem ser usados para concentrar micro-organismos para análise e, então, opcionalmente, também ser usados como agentes foto-ativáveis para o extermínio de micro-organismos residuais e a remoção de impurezas orgânicas indesejadas após o uso. Dessa forma, a terra diatomácea modificada por óxido de titânio pode isolar biomateriais para análise e, então, ser fotoquimicamente limpa para reutilização. Esses materiais podem, também, ser usados em aplicações de filtragem onde podem ser desejados os efeitos de remoção de micro-organismos bem como microbicida.
Terra diatomácea [0068] A terra diatomácea (ou Kieselguhr) é um material silicioso natural produzido a partir de restos de diatomáceas, uma classe de micro-organismos que vivem em oceanos. Dessa forma, a terra diatomácea pode ser obtida a partir de fontes naturais e também é comercialmente disponível (por exemplo, junto à Alfa Aesar, A Johnson Matthey Company,
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Ward Hill, MA, EUA). As partículas de terra diatomácea geralmente compreendem pequenas redes abertas de sílica sob a forma de cubos simétricos, cilindros, esferas, placas, caixas retangulares e similares. Geralmente, as estruturas de poros nessas partículas podem ser notavelmente uniformes.
[0069] A terra diatomácea pode ser usada na execução do processo da presente invenção como a matéria prima extraída de minas ou como partículas purificadas e opcionalmente moídas. De preferência, a terra diatomácea encontra-se sob a forma de partículas moídas com tamanhos na faixa de cerca de 1 micrômetro a cerca de 50 micrômetro de diâmetro (com mais preferência, cerca de 3 micrômetro a cerca de 10 micrômetro).
[0070] A terra diatomácea pode, opcionalmente, ser tratada termicamente antes do uso para remover quaisquer vestígios de resíduos orgânicos. Se for utilizado um tratamento por calor, pode ser preferível que o tratamento seja feito a uma temperatura de 500°C ou inferior, uma vez que temperaturas mais elevadas podem produzir níveis de sílica cristalina indesejavelmente altos.
Amostra [0071] O processo da invenção pode ser aplicado a uma variedade de tipos diferentes de amostras, incluindo, mas não se limitando a, amostras médicas, ambientais, alimentares, clínicas e de laboratório, e combinações das mesmas. Amostras médicas ou veterinárias podem incluir, por exemplo, células, tecidos, ou fluidos de uma fonte biológica (por exemplo, um ser humano ou um animal) que devem ser testadas para diagnóstico clínico. Amostras ambientais podem ser, por exemplo, procedentes de um estabelecimento médico ou veterinário, uma instalação industrial, solo, uma fonte de água, uma área de preparo de alimentos (áreas de contato e não-contato com alimentos), um laboratório, ou uma área que tenha estado potencial mente sujeita a ações de bioterrorismo. As amostras de áreas de processamento, manipulação e preparação de alimentos são preferenciais, uma vez que são, frequentemente, de interesse particular em relação à contaminação de alimentos causada por patógenos bacterianos.
[0072] As amostras obtidas sob a forma de um líquido ou sob a forma de uma dispersão ou suspensão de sólido em líquido podem ser usadas diretamente, ou podem ser concentradas (por exemplo, por centrifugação) ou diluídas (por exemplo, mediante a adição uma
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18/39 solução tampão (com pH controlado)). As amostras sob a forma de um sólido ou de um semisólido podem ser usadas diretamente ou podem ser extraídas, se for desejado, por um método como, por exemplo, lavagem ou enxágue com suspensão ou dispersão em um meio fluido (por exemplo, uma solução tampão). As amostras podem ser obtidas de superfícies (por exemplo, usando-se cotonete ou por enxágue). De preferência, a amostra é um fluido (por exemplo, um líquido, um gás, ou uma dispersão ou suspensão de sólido ou líquido em líquido ou gás).
[0073] Exemplos de amostras que podem ser usadas na execução do processo da invenção incluem alimentos (por exemplo, produtos vegetais frescos ou pratos pronto para consumo ou carnes preparadas (“frios”)), bebidas (por exemplo, sucos ou bebidas carbonatadas), água potável, e fluidos biológicos (por exemplo, sangue integral ou um componente do mesmo como plasma, uma fração de sangue enriquecida com plaquetas, um concentrado de plaquetas, ou células com grandes quantidades de eritrócitos; preparações de células (por exemplo, tecido disperso, aspiração de medula óssea, ou medula óssea de estruturas vertebrais); suspensão de células; urina, saliva, e outros fluidos corpóreos; medula óssea; fluido pulmonar; fluido cerebral; exsudatos de ferimentos; amostras de biópsia de ferimentos; fluido ocular; fluido espinhal; e similares), bem como preparações lisadas, como lisatos celulares, que podem ser formados usando-se procedimentos conhecidos como o uso de tampões e lise e similares. Amostras preferenciais incluem alimentos, bebidas, água potável, fluidos biológicos, e combinações dos mesmos (com alimentos, bebidas, água potável, e combinações dos mesmos sendo as mais preferenciais).
[0074] O volume da amostra pode variar dependendo da aplicação específica. Por exemplo, quando o processo da invenção é usado para um diagnóstico ou aplicação de pesquisa, o volume da amostra pode tipicamente situar-se na faixa de microlitro (por exemplo, 10 pL ou mais). Quando o processo é usado para um teste de patógenos em alimentos ou teste de segurança de água potável, o volume da amostra pode tipicamente situa-se na faixa de mililitro a litro (por exemplo, 100 mililitros a 3 litros). Em uma aplicação industrial, como bioprocessamento ou formulação farmacêutica, o volume pode ser de dezenas de milhares de litros.
[0075] O processo da invenção pode isolar micro-organismos de uma amostra em um estado concentrado e pode, também, permitir o isolamento de microorganismos dos componentes da matriz de amostra que podem inibir os procedimentos de
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19/39 detecção a serem utilizados. Em todos esses casos, o processo da invenção pode ser usado além ou no lugar de outros métodos de concentração de micro-organismos. Dessa forma, opcionalmente, as culturas podem ser desenvolvidas a partir de amostras antes ou depois da execução do processo da invenção, se for desejada uma concentração adicional.
Contato [0076] O processo da invenção pode ser executado por qualquer um dos vários métodos conhecidos existentes ou que venham ser desenvolvidos para proporcionar o contato entre dois materiais. Por exemplo, o agente de concentração pode ser adicionado à amostra, ou a amostra pode ser adicionada ao agente de concentração. Uma sonda revestida com agente de concentração pode ser imersa em uma solução de amostra, uma solução de amostra pode ser derramada sobre um filme revestido com agente de concentração, uma solução de amostra pode ser derramada em um tubo ou cavidade revestida com agente de concentração, ou uma solução de amostra pode ser passada através de um filtro (por exemplo, um filtro com tecido ou não-tecido) revestido com agente de concentração.
[0077] De preferência, entretanto, o agente de concentração e a amostra são combinados (usando-se qualquer ordem de adição) em qualquer um dentre uma variedade de recipientes (opcionalmente, mas de preferência, um recipiente fechado, encerrado ou lacrado; com mais preferência, um tubo de ensaio, garrafa ou jarra fechados). Recipientes adequados para uso na execução do processo da invenção serão determinados pela amostra específica e poderão variar amplamente em tamanho e natureza. Por exemplo, o recipiente pode ser pequeno, como um recipiente de 10 microlitros (por exemplo, um tubo de ensaio) ou maior, como um recipiente de 100 mililitros a 3 litros (por exemplo, um frasco de Erlenmeyer ou uma garrafa de polipropileno de boca grande). O recipiente, o agente de concentração, e qualquer outro aparelho ou aditivos que entrarem em contato com a amostra diretamente poderão ser esterilizados (por exemplo, por calor controlado, gás de óxido de etileno, ou radiação) antes do uso, para reduzir ou evitar qualquer contaminação da amostra que possa causar erros de detecção. A quantidade de agente de concentração que é suficiente para capturar ou concentrar os micro-organismos de uma determinada amostra para a detecção bemsucedida irá variar (dependendo, por exemplo, da natureza e forma do agente de
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20/39 concentração e do volume da amostra) e pode ser prontamente determinada pelo versado na técnica. Por exemplo, 10 miligramas de agente de concentração por mililitro de amostra podem ser úteis para algumas aplicações.
[0078] Se for desejado, o contato pode ser realizado passando-se um agente de concentração particulado ao menos uma vez através de uma amostra (por exemplo, por deposição gravitacional ao longo de um período de, por exemplo, cerca de 10 minutos). O contato pode ser otimizado misturando-se (por exemplo, por movimentação, agitação, ou uso de uma plataforma de vibração) de modo que as partículas do agente de concentração passem repetidamente ou decantem através de uma porção substancial da amostra. Para pequenos volumes da ordem de microlitros (tipicamente menos que 0,5 mililitro), misturar pode ser rápido como por rotação ou “nutação”, por exemplo conforme descrito na patente US n° 5.238. 812 (Coulter et al.), cuja descrição é aqui incorporada, por referência. Para volumes maiores, da ordem de 0,5 mililitros ou mais (tipicamente 0,5 mililitro a 3 litros), a mistura pode ser feita revolvendo-se suavemente o agente de concentração particulado e a amostra em uma maneira “extremidade sobre extremidade”, por exemplo conforme descrito na patente US n° 5.576.185 (Coulter et al.), cuja descrição é aqui incorporada, por referência. A ação de revolver pode ser feita, por exemplo, por meio de um dispositivo configurado para segurar um tubo de ensaio ou outro tipo de vaso de reação e girar lentamente o tubo de ensaio ou o vaso em uma maneira “extremidade sobre extremidade”. O contato pode ser executado por um período desejado (por exemplo, para volumes de amostras de cerca de 100 mililitros ou menos, até cerca de 60 minutos de contato podem ser úteis; de preferência, cerca de 15 segundos a cerca de 10 minutos ou mais; com mais preferência, cerca de 15 segundos a cerca de 5 minutos).
[0079] Dessa forma, na execução do processo da invenção, a mistura (por exemplo, agitação, vibração ou movimentação) e/ou a incubação (por exemplo, à temperatura ambiente) são opcionais, mas preferenciais, para aumentar o contato dos micro-organismos com o agente de concentração. Um método de contato preferencial inclui a mistura (por exemplo, durante cerca de 15 segundos a cerca de 5 minutos) e a incubação (por exemplo, durante cerca de 3 minutos a cerca de 30 minutos) de uma amostra contendo micro-organismos (de preferência, um fluido) com agente de concentração particulado. Se for desejado, um ou mais aditivos (por exemplo, reagentes de lise, reagentes de teste de bioluminescência, reagentes de captura de ácido nucléico (por exemplo, cápsulas magnéticas), meio de
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21/39 crescimento microbiano, tampões (por exemplo, para umedecer uma amostra sólida), reagentes de coloração microbiana, tampões de lavagem (por exemplo, para remover material não ligado), agentes de eluição (por exemplo, albumina sérica), tensoativos (por exemplo, tensoativo nãoiônico Triton™ X-100 disponível junto à Union Carbide Chemicals and Plastics, Houston, TX, EUA), agentes de abrasão mecânica/eluição (por exemplo, contas de vidro) e similares) podem ser incluídos na combinação do agente de concentração e da amostra.
[0080] Se for desejado, o agente de concentração (sozinho ou em combinação com, por exemplo, materiais microbicida e/ou com materiais carreadores sob a forma de líquidos (por exemplo, água ou óleos), sólidos (por exemplo, tecidos, polímeros, papéis, ou sólidos inorgânicos), géis, cremes, espumas, ou pastas) pode ser aplicado ou esfregado contra uma superfície ou material não-poroso ou poroso, sólido, contaminado por micro-organismo ou que pode ser contaminado por micro-organismos (por exemplo, para uso como agente de “limpeza”). Se for desejado, podem ser utilizados aglutinantes, estabilizantes, tensoativos, ou outros modificadores de propriedade.
[0081] Para tal uso, o agente de concentração pode ser aplicado a materiais tecidos ou não-tecidos e pode ser aplicado a superfícies descartáveis como papel, lenços de papel, cotonete, bem como a uma variedade de materiais absorventes e não-absorventes. Por exemplo, o agente de concentração pode ser incorporado em materiais carreadores de pano ou de papel para uso como lenços de “limpeza”. O agente de concentração pode ser aplicado (por exemplo, sob a forma de lenços ou pastas que compreendem um material carreador) em superfícies sólidas, por exemplo, em ambientes domésticos, creches, instalações industriais e hospitalares, para limpar brinquedos, equipamentos, dispositivos médicos, superfícies de trabalho e similares. Quando utilizada para limpeza ou outras finalidades, a amostra pode ser simultaneamente coletada e colocada em contato com o agente de concentração em uma única etapa, se for desejado.
Segregação e/ou separação [0082] Opcionalmente, mas de preferência, o processo da invenção compreende adicionalmente a segregação do agente de concentração resultante ligado ao micro-organismo. De preferência, essa segregação pode ser feita baseando-se, ao menos em parte, na deposição gravitacional (sedimentação por gravidade; por exemplo, ao longo de um período de cerca de 5 minutos a cerca de 30 minutos). Em alguns casos, entretanto,
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22/39 pode ser desejável acelerar a segregação (por exemplo, por centrifugação ou filtragem) ou usar combinações de qualquer um dos métodos de segregação.
[0083] O processo da invenção pode, opcionalmente, compreender, ainda, a separação do agente de concentração resultante ligado ao micro-organismo e à amostra. Para amostras fluidas, isso pode envolver a remoção ou a separação do sobrenadante que resulta após a segregação. A separação do sobrenadante pode ser executada por meio de inúmeros métodos que são bem conhecidos na técnica (por exemplo, por decantação ou sifonamento, de modo a deixar o agente de concentração ligado ao micro-organismo no fundo do recipiente ou vaso utilizado no processo).
[0084] O processo da invenção pode ser executado manualmente (por exemplo, por lotes) ou pode ser automatizado (por exemplo, para permitir o processamento contínuo ou semico ntínuo).
Detecção [0085] Uma variedade de micro-organismos pode ser concentrada e, opcionalmente, mas de preferência, detectada pelo uso do processo da invenção, incluindo, por exemplo, bactérias, fungos, leveduras, protozoários, vírus (incluindo vírus não-envelopados e vírus envelopados), endósporos bacterianos (por exemplo, bacilo (incluindo Bacillus anthracis, Bacillus cereus e Bacillus subtilis) e clostrídio (incluindo Clostridium botulinum, Clostridium difficile e Clostridium perfringens)) e similares, e combinações dos mesmos (de preferência, bactérias, leveduras, vírus, endósporos bacterianos, fungos, e combinações dos mesmos; com mais preferência, bactérias, leveduras, vírus, endósporos bacterianos, e combinações dos mesmos; com mais preferência ainda, bactérias, vírus, endósporos bacterianos, e combinações dos mesmos; com a máxima preferência, bactérias gram-negativas, bactérias Gram-positivas, vírus não-envelopados (por exemplo, norovírus, poliovírus, vírus da hepatite A, rinovírus, e combinações dos mesmos), endósporos bacterianos, e combinações dos mesmos). O processo tem utilidade na detecção de patógenos, que podem ser importantes para a segurança de alimentos ou por razões médicas, ambientais ou antiterrorismo. O processo pode ser particularmente útil na detecção de bactérias patogênicas (por exemplo, bactérias gramnegativas e gram-positivas), bem como várias leveduras, bolor e micoplasmas (e combinações de qualquer um desses).
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23/39 [0086] Os gêneros dos micro-organismos-alvo a serem detectados incluem, mas não se limitam a, listeria, escherichia, salmonela, Campylobacter, clostrídio, Helicobacter, micobactéria, estafilococo, shiguela, enterococo, bacilo, neisséria, shiguela, estreptococo, vibrão, yersínia, bordetella, borrélia, pseudomonas, sacaromicetos, cândida e similares, e combinações dos mesmos. As amostras podem conter uma pluralidade de cepas de microorganismos, e qualquer cepa específica pode ser detectada independentemente de qualquer outra cepa. Cepas de micro-organismos específicos que podem ser alvos para a detecção incluem Escherichia coli, Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolytícus, Vibrio vulnificus, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Salmonella enterica, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Staphylococcal enterotoxin ssp, Bacillus cereus, Bacillus anthracis, Bacillus atrophaeus, Bacillus subtilis, Clostridium perfringens, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Enterobacter sakazakii, Pseudomonas aeruginosa e similares, e combinações dos mesmos (de preferência, Staphylococcus aureus, Salmonella enterica, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus atrophaeus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, vírus entéricos não-envelopados que infectam seres humanos dos quais o bacteriófago Escherichia coli é um hospedeiro, e combinações dos mesmos).
[0087] Os micro-organismos que foram capturados ou ligados (por exemplo, por adsorção) pelo agente de concentração podem ser detectados essencialmente por qualquer método desejado que seja atualmente conhecido ou que venha a ser desenvolvido. Esses métodos incluem, por exemplo, métodos baseados em culturas (que podem ser preferenciais quando o tempo permite), microscopia (por exemplo, usando-se um microscópio de luz transmitida ou um microscópio de epifluorescência, que pode ser usado para visualizar micro-organismos marcados com corantes fluorescentes) e outros métodos de formação de imagens, métodos de detecção imunológica e métodos de detecção genética. O processo de detecção após a captura dos micro-organismos pode incluir, opcionalmente, a lavagem para remover componentes da matriz de amostra.
[0088] A detecção imunológica é a detecção de um material antígeno derivado de um organismo-alvo, que é comumente uma molécula biológica (por exemplo, uma proteína ou proteoglicano) agindo como um marcador sobre a superfície das bactérias ou das partículas virais. A detecção do material antígeno pode ser feita,
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24/39 tipicamente, por um anticorpo, um polipeptídeo selecionado a partir de um processo como Phage Display, ou um aptâmero a partir de um processo de triagem.
[0089] Os métodos de detecção imunológica são bem conhecidos e incluem, por exemplo, imunoprecipitação e ensaio de imunossorvente ligado a enzima (ELISA). A ligação de anticorpos pode ser detectada de várias maneiras (por exemplo, pela marcação de um anticorpo primário ou secundário com um corante fluorescente, com um ponto quântico, ou com uma enzima que pode produzir quimioluminescência ou um substrato colorido, e o uso de uma leitora de placas ou um dispositivo de fluxo lateral).
[0090] A detecção pode ser executada também por testes genéticos (por exemplo, por hibridização de ácido nucléico ou amplificação dirigida por iniciador), que é frequentemente um método preferencial. Os micro-organismos capturados ou ligados podem ser lisados para tornar seu material genético disponível para teste. Os métodos de lise são bem conhecidos e incluem, por exemplo, tratamentos como sonicação, choque osmótico, tratamento por alta temperatura (por exemplo, de cerca de 50°C a cerca de 100Ό), e a incubação com uma enzima como lisozima, glucolase, zimolose, liticase, proteinase K, proteinase E, e enolisinas virais.
[0091] Muitos testes de detecção genética comumente usados detectam os ácidos nucléicos de um micro-organismo específico, incluindo o DNA e/ou o RNA. A estringência das condições utilizadas em um método de detecção genética está correlacionada com o nível de variação na sequência do ácido nucléico que é detectada. Condições altamente rigorosas de concentração de sal e temperatura podem limitar a detecção até a sequência exata de ácido nucléico do alvo. Dessa forma, as cepas de microorganismos com pequenas variações em uma sequência de ácido nucléico do alvo podem ser distinguidas usando-se um teste genético altamente rigoroso. A detecção genética pode se basear na hibridização de ácido nucléico onde uma sonda de ácido nucléico de filamento único é hibridizada até os ácidos nucléicos sem propriedade do micro-organismo, de modo que é produzido um ácido nucléico de filamento duplo, incluindo a cepa de sonda. O versado na técnica estará familiarizado com identificações de sondas, como radioativas, fluorescentes, e quimioluminescentes, para a detecção de híbridos após a eletroforese em gel, eletroforese capilar, ou outro método de separação.
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25/39 [0092] Os métodos de detecção genética particularmente úteis baseiam-se na amplificação de ácido nucléico dirigida por iniciadores. Os métodos de amplificação de ácido nucléico dirigida por iniciadores incluem, por exemplo, métodos de ciclagem térmica (por exemplo, reação em cadeia de polimerase (PCR), reação em cadeia de polimerase transcriptase reversa (RT-PCR), e reação em cadeia de ligase (LCR)), bem como métodos isotérmicos e amplificação de deslocamento de cepas (SDA) (e combinações dos mesmos; de preferência, PCR ou RT-PCR). Os métodos para a detecção do produto amplificado não se limitam a e incluem, por exemplo, separação por eletroforese em gel e coloração por brometo de etídeo, bem como a detecção de uma marca fluorescente ou marca de rádio incorporada no produto. Os métodos que não exigem uma etapa de separação antes da detecção do produto amplificado podem também ser usados (por exemplo, PCR em tempo real ou detecção homogênea).
[0093] Os métodos de detecção por bioluminescência são bem conhecidos e incluem, por exemplo, métodos de detecção por trifosfato de adenosina (ATP) inclusive aqueles descritos na patente US n° 7.422.868 (Fan et al.), cujas descrições estão aqui incorporadas a título de referência.
[0094] Como não é específico para uma determinada cepa, o processo da invenção fornece um sistema de captura geral que permite que múltiplas cepas de microorganismos sejam o alvo para testes na mesma amostra. Por exemplo, quando se testa quanto à contaminação de amostras de alimentos, pode ser desejado testar a presença de Listeria monocytogenes, Escherichia coli e salmonela dentro da mesma amostra. Uma única etapa de captura pode, então, ser seguida de, por exemplo, testes PCR ou RT-PCR usandose iniciadores específicos para amplificar diferentes sequências de ácido nucléico de cada uma dessas cepas de micro-organismos. Dessa forma, pode-se evitar a necessidade de manuseio e procedimentos de preparo de amostras separadas para cada cepa.
Kit de diagnóstico [0095] Um kit de diagnóstico para uso na execução do processo da invenção compreende (a) um agente de concentração acima descrito (de preferência, particulado); e (b) um recipiente de teste (de preferência, um recipiente de teste esterilizado) para uso na execução do processo da invenção. De preferência, o kit de diagnóstico compreende adicionalmente um ou mais componentes selecionados a partir de cultura de micro-organismo
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26/39 meios de crescimento, reagentes de lise, tampões, componentes do teste de detecção por bioluminescência (por exemplo, luminômetro, reagentes de lise, enzima luciferase, substrato de enzimas, tampões de reação e similares), componentes do teste de detecção genética, instruções para a execução do processo, e combinações dos mesmos. Um preferencial reagente de lise preferencial é uma enzima lítica fornecida em uma solução tampão, e componentes do teste de detecção genética preferenciais incluem um ou mais iniciadores específicos para um micro-organismo-alvo.
[0096] Por exemplo, uma modalidade preferencial do kit de diagnóstico da invenção contém um agente de concentração particulado (por exemplo, em um recipiente descartável esterilizado como um frasco de vidro ou de polipropileno), juntamente com instruções de uso do dito agente para executar o processo da invenção (por exemplo, misturando-se o agente de concentração com uma amostra fluida a ser analisada, permitindo-se que o agente de concentração seja depositado por gravidade, removendo-se o sobrenadante resultante, e detectando-se a presença de pelo menos uma cepa de micro-organismo-alvo ligada por agente de concentração). O agente de concentração pode, opcionalmente, ser hidratado em um pequeno volume de tampão com conservante para otimizar a estabilidade durante o armazenamento e transporte e/ou pode ser contido/separado em um saco de contenção lacrado e de abertura por rasgamento para evitar contaminação. O agente de concentração pode estar sob a forma de uma dispersão ou suspensão em um líquido ou pode estar sob a forma de pó. De preferência, o kit de diagnóstico compreende alíquotas previamente medidas (por exemplo, com base no volume da amostra) do agente de concentração particulado (com mais preferência, contido em um ou mais sacos de contenção lacrados e de abertura por rasgamento).
Exemplos [0097] Os objetivos e vantagens desta invenção são ilustrados, ainda, pelos exemplos a seguir, porém, os materiais e quantidades relatados nestes exemplos, bem como outras condições e detalhes, não devem ser interpretados de modo a limitar indevidamente esta invenção.
Materiais [0098] A terra diatomácea (Kieselguhr) foi adquirida junto à Alfa Aesar (A Johnson Matthey Company, Ward Hill, MA, EUA) como um pó branco (malha 325; todas as
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27/39 partículas com tamanho menor que 44 micrômetros). Mostrou-se por difração de raios X (XRD) que esse material continha sílica amorfa juntamente com α-cristobalite e quartzo cristalino. A terra diatomácea calcinada foi adquirida junto à Solvadis, GmbH, Frankfurt, Alemanha (e observou-se que a mesma compreendia pequenas hastes de cerca de 5 a cerca de 80 micrômetros de comprimento e de cerca de 3 a cerca de 8 micrômetros de largura, juntamente com discos porosos e fragmentos de discos de até cerca de 60 micrômetros de comprimento primário e fragmentos assimétricos de cerca de 3 a cerca de 60 micrômetros de comprimento primário). Mostrou-se por XRD que esse material compreendia predominantemente a-cristobalite.
[0099] Todas as culturas de micro-organismos foram adquiridas junto à the American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, EUA).
[00100] Os agentes de concentração que compreendem vários modificadores de superfície diferentes (isto é, dióxido de titânio; dióxido de titânio em combinação com óxido férrico; platina; ouro; e ouro em combinação com óxido férrico) foram preparados por tratamento de superfície aplicado à terra diatomácea da maneira descrita a seguir:
Deposição do ouro [00101 ] Cerca de 57 a 60 g de meio de suporte de terra diatomácea seca ou de terra diatomácea modificada por óxido metálico (cerca de 300 mL de volume de pó) foram secos adicionalmente em um forno a 150°C durante 24 horas para remover a água residual. A amostra resultante seca foi colocada ainda quente no aparelho de PVD descrito acima na descrição detalhada com o aparelho de PVD consistindo em um agitador de partículas com uma folga entre lâminas de 2,7 mM. A câmara de vácuo do aparelho foi, então, submetida a vácuo a uma contrapressão de cerca de 1,3 mPa (5x10'5 Torr) e gás compreendendo gás argônio de bombardeamento iônico foi admitido na câmara a uma pressão de cerca de 1,3 Pa (10 mTorr).
[00102] O processo de deposição de metal foi, então, executado aplicando-se energia ao cátodo do aparelho durante um período previamente definido, com a haste e as lâminas furadas do agitador de partículas girando a 4 rpm durante o revestimento do metal por bombardeamento com íons pelo magnétron de CC a uma potência controlada de 0,02 kW. A duração do revestimento por bombardeamento com íons foi de 5 horas. Depois de terminado o revestimento por bombardeamento com íons, a câmara de vácuo foi ventilada
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28/39 com ar em condições ambiente e a amostra revestida com metal resultante foi removida do aparelho de PVD e peneirada em tela de malha 25 (0,707 mM) para separar os particulados finos gerados durante o processo. A quantidade de metal que foi depositada sobre a amostra foi determinada pesando-se (antes e depois do processo de deposição) o alvo de bombardeamento iônico do metal que foi utilizado. Em geral, cerca de 18 por cento da perda de peso do alvo representaram o metal depositado sobre a amostra (com base na análise de plasma acoplado por indução). Com essas informações, calculou-se a quantidade resultante de ouro no meio de suporte que era de cerca de 0,9 por cento em peso.
Deposição da platina [00103] O processo de deposição com ouro descrito acima foi essencialmente repetido, com exceção de que um alvo de platina de 7,62 cm (3 polegadas) foi substituído pelo alvo de ouro de 7,62 cm (3 polegadas) que havia sido utilizado, a potência foi ajustada em 0,03 kW e o tempo de deposição foi de 1 hora. A quantidade resultante de platina sobre o meio de suporte calculada foi de cerca de 0,25 por cento em peso.
Deposição do dióxido de titânio [00104] Foi preparada uma solução desidratada de oxissulfato de titânio (IV) de 20 por cento em peso dissolvendo-se 20,0 g de TiO(SO4).2H2O (Noah Technologies Corporation, San Antonio, TX, EUA) em 80,0 g de água deionizada com agitação. 50,0 g dessa solução foram misturados com 175 mL de água deionizada para formar uma solução de composto precursor de dióxido de titânio. Foi preparada uma dispersão de terra diatomácea dispersando-se 50,0 g de terra diatomácea em 500 mL de água deionizada em um grande béquer com agitação rápida. Depois de aquecer a dispersão de terra diatomácea a cerca de 80Ό, a solução de composto precursor de dióxido de titânio foi adicionada por gotejamento durante a agitação rápida durante um período de cerca de 1 hora. Após a adição, o béquer foi coberto com uma tampa de vidro e seu conteúdo aquecido até o ponto de fervura durante 20 minutos. Uma solução de hidróxido de amônio foi adicionada ao béquer até que o pH do conteúdo atingisse cerca de 9. O produto resultante foi lavado por decantação até que o pH da água de lavagem fosse neutro. O produto foi separado por filtragem e seco de um dia para o outro a 100°C.
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29/39 [00105] Uma porção do produto seco foi colocada em um cadinho de porcelana e calcinada aquecendo-a da temperatura ambiente a 350°C a uma taxa de aquecimento de cerca de 3°C por minuto e, então, mantida em 350°C durante 1 hora.
Deposição de óxido de ferro [00106] O óxido de ferro foi depositado sobre a terra diatomácea usando-se essencialmente o processo de deposição de dióxido de titânio descrito acima, com exceção de que uma solução de 20,0 g de Fe(NO3)3-9H2O (J.T. Baker, Inc., Phillipsburg, NJ, EUA) dissolvida em 175 mL de água deionizada foi substituído pela solução de sulfato de titanil. Uma porção da terra diatomácea modificada por óxido de ferro resultante foi calcinada de modo similar a 350°C para testes adicionais.
Deposição do óxido de ferro e do dióxido de titânio [00107] Uma mistura de óxido de ferro e de dióxido de titânio foi depositada sobre a terra diatomácea usando-se essencial mente o processo de deposição de dióxido de titânio descrito acima, com exceção de que uma solução de 10,0 g de_Fe(NO3)3-9H2O (J.T. Baker, Inc., Phillipsburg, NJ, EUA) e 25,0 g de TiO(SO4).2H2O (Noah Technologies Corporation, San Antonio, TX, EUA) dissolvida em 175 mL de água deionizada foi substituída pela solução de sulfato de titanil. Uma porção da terra diatomácea modificada por óxido de ferro e por dióxido de titânio resultante foi calcinada de modo similar a 350°C para testes adicionais.
Método do teste de concentração de micro-organismos [00108] Uma colônia de micro-organismos isolada foi inoculada em 5 mL de caldo de soja BBL™ Trypticase™ (Becton Dickinson, Sparks, MD, EUA) e incubada a 37°C durante 18 a 20 horas. Essa cultura formada de um dia para o outro com ~109 unidades formadoras de colônia por mL foi diluída em um tampão de adsorção (contendo 5 mM KCI, 1mM CaCI2, 0,1 mM MgCI2, e 1 mM K2HPO4) com pH de 7,2 para obter 103 micro-organismos por mL de diluição. Um volume de 1,1 mL da diluição de micro-organismos foi adicionado a tubos de polipropileno de 5 mL, separados, identificados e esterilizados (BD Falcon™, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EUA) contendo 10 mg de agente de concentração, cada um dos quais foi fechado e misturado em um misturador de vórtice Thermolyne Maximix Plus™ (Barnstead International, lowa, EUA). Cada tubo fechado foi incubado à temperatura ambiente (25°C) durante 15 minutos em uma plataforma de vibração Thermolyne Vari Mix™ (Barnstead
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International, lowa, EUA). Após a incubação, cada tubo permaneceu em repouso na bancada do laboratório por 10 minutos para decantar o agente de concentração. Os tubos com as amostras de controle contendo 1,1 mL da diluição de micro-organismos sem agente de concentração foram tratados da mesma maneira. O agente de concentração decantado resultante e/ou o sobrenadante (e as amostras de controle) foram então usados para análise.
[00109] O agente de concentração decantado foi ressuspenso em uma solução tampão de Butterfield esterilizada de 1 mL (pH 7,2 ± 0,2; solução tampão de fosfato de potássio monobásico; número de catálogo VWR 83008-093, VWR, West Chester, PA, EUA) e colocado em um meio de cultura consistindo em placas 3M™ Petrifilm™ de contagem aeróbica (secas, reidratáveis; 3M Company, St. Paul., MN) de acordo com as instruções do fabricante. A contagem aeróbica foi quantificada usando-se uma leitora de placas 3M™ Petrifilm™ (3M Company, St. Paul, MN, EUA). Os resultados foram calculados usando-se a seguinte fórmula:
Porcentagem de UFC/mL no agente de concentração ressuspenso = (número de colônias do agente de concentração ressuspenso em placas) / (número de colônias da amostra de controle não tratada em placas) x 100 (onde UFC = unidade formadora de colônia, que é uma unidade de microorganismos vivos ou viáveis).
[00110] Os resultados foram então relatados em termos de porcentagem de captura dos micro-organismos pelo agente de concentração usando-se a fórmula abaixo: Eficiência de captura ou porcentagem de captura = porcentagem de UFC/mL no agente de concentração ressuspenso [00111] Para fins de comparação, em ao menos alguns casos 1 mL do sobrenadante foi removido e colocado em placas não diluído ou diluído a 1:10 na solução tampão de Butterfield e colocado em um meio de cultura consistindo em placas 3M™ Petrifilm™ de contagem aeróbica. A contagem aeróbica foi quantificada usando-se uma leitora de placas 3M™ Petrifilm™ (3M Company, St. Paul., MN). Os resultados foram calculados usando-se a seguinte fórmula:
Porcentagem de UFC/mL no sobrenadante = (número de colônias do sobrenadante colocado em placas) / (número de colônias da amostra de controle não tratada em placas) x 100
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31/39 (onde UFC = unidade formadora de colônia, que é uma unidade de microorganismos vivos ou viáveis).
[00112] Quando as colônias de micro-organismos e o agente de concentração apresentaram cor similar (fornecendo pouco contraste para a leitora de placas), os resultados foram baseados no sobrenadante e foram então relatados em termos de porcentagem de captura dos micro-organismos pelo agente de concentração usando-se a fórmula abaixo:
Eficiência de captura ou porcentagem de captura = 100 - porcentagem de UFC/mL no sobrenadante
Exemplos 1 a 12 e exemplos comparativos 1 e 2 [00113] Usando-se o método de teste de concentração de micro-organismos descrito acima, 10 mg de vários agentes de concentração diferentes de terra diatomácea com superfície tratada ou de terra diatomácea calcinada com superfície tratada (preparados conforme descrito acima) e 10 mg de terra diatomácea não tratada (deste ponto em diante do presente documento, DE) foram testados separadamente quanto à concentração bacteriana em relação aos micro-organismos-alvo, a bactéria gram-negativa Salmonella enterica, subespécie Typhimurium enterica serovar (ATCC 35987) e a bactéria gram-positiva Staphylococcus aureus (ATCC 6538). Os resultados são mostrados na Tabela 1 abaixo.
Tabela 1.
Exemplo n° Micro-organismo Agente de concentração Porcentagem de captura ± desvio padrão
C-1 Estafilococo DE 54 ±13
1 Estafilococo TiO2-DE 94 ±4
2 Estafilococo Fe2O3-TiO2-DE 96 ±1
3 Estafilococo Fe2O3-TiO2-DE calcinada 100 ±0
4 Estafilococo Pt-DE calcinada 99± 0
5 Estafilococo Au- Fe2O3-DE 99 ±0
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6 Estafilococo Au-DE calcinada 99 ±0
C-2 Salmonela DE 45 ±1
7 Salmonela TiO2-DE 86 ±3
8 Salmonela Fe2O3-TiO2-DE 88 ±1
9 Salmonela Fe2O3-TiO2-DE calcinada 89 ±5
10 Salmonela Pt-DE calcinada 72 ±1
11 Salmonela Au- Fe2O3-DE 91 ±6
12 Salmonela Au-DE calcinada 100 ±0
13 Salmonela Au-DE 89 ±2
Exemplos 14 a 19 e exemplo comparativo 3 [00114] Usando-se o método de teste de concentração de micro-organismos descrito acima, 10 mg de vários agentes de concentração diferentes de terra diatomácea com superfície tratada ou de terra diatomácea calcinada com superfície tratada (preparados conforme descrito acima) e 10 mg de terra diatomácea não tratada (deste ponto em diante do presente documento, DE) foram testados separadamente quanto à concentração de leveduras do micro-organismo-alvo, Saccharomyces cerevisiae (102UFC/ml_; ATCC 201390). Os materiais resultantes foram colocados em um meio de cultura consistindo em placas 3M™ Petrifilm™ de contagem de levedura e bolor (secas, reidratáveis; 3M Company, St. Paul, MN) e incubados durante 5 dias de acordo com as instruções do fabricante. As colônias isoladas de levedura foram contadas manualmente, e a porcentagem de captura foi calculado conforme descrito acima. Os resultados são mostrados na Tabela 2 abaixo (desvio padrão para todas as amostras menor que 10 por cento).
Tabela 2.
Exemplo n° Micro-organismo Agente de concentração Porcentagem de captura
C-3 Saccharomyces DE 42
14 Saccharomyces TiO2-DE 99
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15 Saccharomyces De Fe2O3-TiO2 93
16 Saccharomyces De Fe2O3-TiO2-calcinada 100
17 Saccharomyces Pt-DE calcinada 100
18 Saccharomyces Au- Fe2O3-DE 100
19 Saccharomyces Au-DE calcinada 99
Exemplos 20 a 22 e exemplos comparativos 4 a 6 [00115] Amostras de alimentos foram adquiridas em uma mercearia local (Cub Foods, St. Paul). Amostras de presunto fatiado, alface e suco de maçã (11 g) foram pesadas em pratos de vidro esterilizados e inseridas em bolsas-filtro de polietileno Stomacher™ esterilizadas (Seward Corp, Norfolk, Reino Unido). As amostras de alimentos foram injetadas com culturas bacterianas a uma concentração de 102 UFC/mL usando-se uma cultura formada de um dia para o outro durante 18-20 horas (estoque) de Salmonella enterica, subespécie Typhimurium enterica serovar (ATCC 35987). Depois disso, foi adicionada uma solução tampão de Butterfield de 99 mL em cada amostra injetada. As amostras resultantes foram misturadas durante um ciclo de 2 minutos em um misturador Stomacher™ 400 Circulator (Seward Corp. Norfolk, Reino Unido). As amostras misturadas foram coletadas em tubos de centrifugação cônicos de polipropileno de 50 mL esterilizados (BD Falcon™, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EUA) e centrifugadas (centrífuga Eppendorf™ 5804; Westbury, NY, EUA) a 2000 revoluções por minuto (rpm) durante 5 minutos para remover grandes resíduos. Os sobrenadantes resultantes foram usados como amostras para testes adicionais.
[00116] Usando-se o método de teste de concentração de micro-organismos descrito acima, cada amostra de teste de 1 mL preparada conforme descrito acima foi adicionada separadamente a um tubo de ensaio contendo 10 mg de terra diatomácea com superfície tratada e a um tubo de controle de ensaio contendo 10 mg de terra diatomácea não tratada e testada quanto à concentração bacteriana do micro-organismo-alvo, Salmonella enterica, subespécie Typhimurium enterica serovar (ATCC 35987). Para testes com alface, as amostras foram colocadas em placas de petri esterilizadas de 100 x 20 mM pra cultura em tecido (Sarstedt, Newton, NC, EUA) e incubadas sob luz ultravioleta (UV) em um estojo de luz Alphalmager™ Multilmage™ (Alpha Innotech Corporation, San
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Leandro, CA, EUA) durante 1 hora para eliminar a flora de segundo plano. Nessas amostras tratadas com UV, foi confirmada a ausência de flora nativa (colocando-se e contando-se uma amostra de 1 mL em placas essencialmente conforme descrito acima) e, então, usadas para experiências de concentração. Os resultados são mostrados na Tabela 3 abaixo (desvio padrão para todas as amostras menor que 10 por cento).
Tabela 3.
Exemplo n°. Micro-organismo Agente de concentração Amostra Porcentagem de captura
C-4 Salmonela DE Suco de maçã 43
20 Salmonela Au- Fe2O3-DE Suco de maçã 94
C-5 Salmonela DE Presunto 75
21 Salmonela Au- Fe2O3-DE Presunto 94
C-6 Salmonela DE Alface 55
22 Salmonela Au- Fe2O3-DE Alface 80
Exemplos 23 e 24 e exemplos comparativos 7 e 8 [00117] Seguindo o procedimento dos exemplos 20-22 e dos exemplos comparativos 4-6 acima com uma amostra de 25 g de peru fatiado e 225 mL de solução tampão de Butterfield), terra diatomácea com tratamento de superfície e terra diatomácea não tratada foram testadas separadamente quanto à concentração do micro-organismo-alvo Salmonella enterica, subespécie Typhimurium enterica serovar (ATCC 35987) de amostras de grande volume (300 mg de agente de concentração por 30 mL de volume da amostra). Foi testada também água potável (100 mL) obtida de um bebedouro, e coletada em uma garrafa de vidro de 250 mL esterilizada (VWR, West Chester, PA, EUA) e inoculada com o micro-organismo-alvo Salmonella enterica, subespécie Typhimurium enterica serovar (ATCC 35987) a 102 UFC/mL. A água inoculada resultante foi completamente misturada manualmente 5 vezes e incubada à temperatura ambiente (25°C) durante 15 minutos.
[00118] As amostras de 30 mL preparadas conforme descrito acima foram adicionadas em tubos de centrifugação cônicos de polipropileno de 50 mL esterilizados (BD Falcon™, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EUA) contendo 300 mg de agente de
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35/39 concentração e foram testadas usando-se o método de teste de concentração de microorganismos descrito acima. O agente de concentração decantado resultante foi ressuspenso em uma solução tampão de Butterfield de 30 mL esterilizada e colocado em um meio de cultura consistindo em placas 3M™ Petrifilm™ de contagem aeróbica. Os resultados são mostrados na Tabela 4 abaixo (desvio padrão para todas as amostras menor que 10 por cento).
Tabela 4.
Exemplo n° Micro-organismo Agente de concentração Amostra Porcentagem de captura
C-7 Salmonela DE Água potável 79
23 Salmonela Au- Fe2O3-DE Água potável 97
C-8 Salmonela DE Peru 52
24 Salmonela Au- Fe2O3-DE Peru 88
Exemplos 25 a 32 [00119] Amostras de 10 mg de vários agentes de concentração diferentes de terra diatomácea com superfície tratada (preparadas conforme descrito acima) foram testadas separadamente quanto à concentração dos endósporos bacterianos alvos Bacillus atrophaeus (ATCC 9372) e Bacillus subtilis (ATCC 19659). O método de teste de concentração de micro-organismos descrito acima foi utilizado com as seguintes modificações: as culturas formadas de um dia para o outro tinham 1,4x103 UFC/mL de Bacillus atrophaeus e 6x102 UFC/mL de Bacillus subtilis, respectivamente: os sobrenadantes resultantes foram colocados em placas não diluídos: e o agente de concentração decantado com micro-organismo ligado foi ressuspenso em uma solução tampão de Butterfield de 5 mL esterilizada e colocada em placas em duplicata (1 mL cada). As eficiências de captura foram calculadas com base nas contagens dos sobrenadantes em placas, e os resultados são mostrados na Tabela 5 abaixo (desvio padrão para todas as amostras menor que 10 por cento).
Tabela 5.
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Exemplo n° Micro-organismo Agente de concentração Porcentagem de captura
25 Bacillus atrophaeus TiO2-DE 79
26 Bacillus atrophaeus Pt-DE 100
27 Bacillus atrophaeus Au-DE 81
28 Bacillus atrophaeus Au- Fe2O3-DE 100
29 Bacillus subtilis TÍO2-DE 97
30 Bacillus subtilis Pt-DE 100
31 Bacillus subtilis Au-DE 99
32 Bacillus subtilis Au- Fe2O3-DE 99
Exemplos 33-36 [00120] Amostras de 10 mg de dois agentes de concentração diferentes de terra diatomácea com superfície tratada (ou seja, Pt-DE e Au- Fe2O3-DE) foram testadas separadamente quanto à concentração alvo, um vírus não-envelopado infectante de bactérias, bacteriófago MS-2 da Escherichia coli (ATCC 15597-B1; que é frequentemente usado como um substituto para vários vírus não-envelopados entéricos que infectam seres humanos). Um método ágar de duas camadas (descrito a seguir) foi utilizado para testar a captura do bacteriófago MS-2 da Escherichia coli (ATCC 15597-B1) usando-se bactérias Escherichia coli (ATCC 15597) como hospedeiro.
[00121] O estoque de bacteriófago MS-2 de Escherichia coli foi diluído dez vezes em série em um tampão de adsorção 1X esterilizado (contendo KCI5 mM, CaCb 1 mM, 0,1 mM MgCÍ2, e 1 mM K2HPO4) a um pH de 7,2 para obter duas diluições com 103 e 102 unidades formadoras de placa por mililitro (UFP/mL), respectivamente. Um volume de 1,0 mL da diluição resultante do bacteriófago foi adicionado a um tubo de polipropileno de 5 mL identificado e esterilizado (BD Falcon™, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EUA) contendo 10 mg de agente de concentração e misturado em um misturador de vórtice Thermolyne Maximix Plus™ (Barnstead International, lowa). O tubo fechado foi incubado à temperatura ambiente (25°C) durante 15 minutos em uma plataforma de vibração Thermolyne Vari Mix™
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37/39 (Barnstead International, lowa). Após a incubação, o tubo permaneceu em repouso na bancada do laboratório por 10 minutos para decantar o agente de concentração. Um tubo com a amostra de controle contendo 1,0 mL da diluição do bacteriófago sem agente de concentração foi tratado da mesma maneira. O agente de concentração decantado resultante e o sobrenadante (e a amostra de controle) foram então usados para análise.
[00122] 100 microlitros do sobrenadante foram removidos e testados quanto à presença do bacteriófago usando o método ágar de duas camadas descrito a seguir. Um volume adicional de 800 microlitros de sobrenadante foi removido e descartado. Um volume de 100 microlitros do agente de concentração decantado foi também testado quanto à presença do bacteriófago.
Método ágar de duas camadas:
[00123] Uma única colônia de bactérias Escherichia coli (ATCC 15597) foi inoculada em 25 mL de caldo de soja tríptico, 3 por cento em peso, esterilizado (Bacto™ Tryptic Soy Broth, Becton Dickinson and Company, Sparks, MD, EUA; preparado de acordo com as instruções do fabricante) e incubada a 37°C em um incubador de agitação (Innova™ 44, New Brunswick Scientific Co., Inc., Edison, NJ, EUA) ajustado a 250 revoluções por minuto (rpm) de um dia para o outro. 750 microlitros dessa cultura formada de um dia para o outro foi usada para inocular 75 mL, 3 por cento em peso, de caldo de soja tríptico esterilizado. A cultura resultante foi incubada a 37°C no incubador de agitação ajustado a 250 rpm para obter células de Escherichia coli na fase exponencial conforme medido pela absorbância a 550 nm (valores de absorbância 0,3-0,6) usando-se um espectrofotômetro SpectraMax M5 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EUA). As células foram incubadas sobre gelo até serem utilizadas para testes.
[00124] Um volume de 100 microlitros com as amostras do teste de bacteriófago descrito acima foi misturado com 75 microlitros das células de Escherichia coli incubadas no gelo (bactérias hospedeiras) e incubado à temperatura ambiente (25°C) durante 5 minutos. As amostras resultantes foram misturadas com 5 mL de ágar do topo derretido esterilizado (3 por cento em peso de caldo de soja tríptico esterilizado, 1,5 por cento em peso de NaCl, 0,6 por cento em peso de ágar; preparado naquele dia e mantido em banho-maria a 48°C). A mistura foi, então, derramada no topo do ágar do fundo (3 por cento em peso de caldo de soja tríptico, 1,5 por cento em peso de NaCl, 1,2 por cento em peso de ágar) em placas de petri. O
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38/39 componente do ágar derretido da mistura foi deixado solidificar durante 5 minutos, e as placas de petri ou placas foram invertidas e incubadas a 37°C. As placas foram inspecionadas visualmente após a incubação de um dia para outro, e as placas contendo agente de concentração decantado (bem como a placa de controle) mostraram a presença de placas do bacteriófago. As eficiências de captura foram calculadas com base nas contagens dos sobrenadantes em placas e seu valor determinado em 96 por cento e 97 por cento para Pt-DE (para as diluições 103 e 102 UFP/mL, respectivamente) e 94 por cento e 95 por cento para AuFe2O3-DE (para as diluições 103 e 102 UFP/mL, respectivamente) (desvio padrão para todas as amostras menor que 10 por cento).
Exemplos 37 e 38 [00125] O suco de maçã foi adquirido em uma mercearia local (Cub Foods, St.
Paul). O suco de maçã (11 g) foi pesado em um prato de vidro e adicionado a 99 mL de uma solução tampão de Butterfield em condições estéreis. A combinação resultante foi misturada por movimentação circular durante 1 minuto e foi injetada com duas culturas bacterianas, cada uma a uma concentração de 1 UFC/mL, usando-se culturas formadas de um dia para o outro durante 18-20 horas (estoques bacterianos) de Salmonella enterica, subespécie Typhimurium enterica serovar (ATCC 35987) e Escherichia coli (ATCC 51813). As diluições seriais dos estoques bacterianos tinham sido feitas em um tampão de adsorção 1X esterilizado conforme descrito acima.
[00126] Usando-se o método de teste de concentração de micro-organismos descrito acima, um volume de 10 mL da amostra de suco de maçã injetado foi adicionado a um tubo de centrifugação cônico de polipropileno de 50 mL esterilizado (BD Falcon™, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EUA) contendo 100 mg de um agente de concentração de terra diatomácea com superfície tratada (ou seja, TiCfe-DE ou Au- Fe2O3-DE) e incubado durante 15 minutos para captura/concentração bacteriana do micro-organismo-alvo, salmonela (na presença de Escherichia coli, um micro-organismo concorrente). O sobrenadante resultante foi removido, e o agente de concentração decantado foi transferido para outro tubo de 50 mL esterilizado contendo 2 mL de caldo de soja tríptico esterilizado, 3 por cento em peso, (Bacto™ Tryptic Soy Broth, Becton Dickinson and Company, Sparks, MD, EUA; preparado de acordo com as instruções do fabricante). O tubo foi fechado de maneira frouxa, e seu conteúdo foi misturado e incubado a 37Ό. Após a incubação de um dia para outro, a mistura do caldo resultante foi
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39/39 testada quanto à presença de salmonela usando-se uma tira de teste RapidChek™ de imunoensaio de fluxo lateral de salmonela disponível junto à SDI (Strategic Diagnostics, Inc., Newark, DE, EUA). A inspeção visual da tira de teste mostrou a presença de salmonela.
[00127] A detecção de ácido nucléico por reação em cadeia de polimerase (PCR) foi realizada também para a mistura do caldo contendo micro-organismos. 1 mL do caldo contendo agente de concentração incubado de um dia para o outro conforme descrito acima, foi testado como amostra de teste quanto à presença de salmonela utilizando-se o kit de detecção TaqMan™ ABI de Salmonella enterica, disponível junto à Applied Biosystems (Foster City, CA, EUA). Como amostra de controle, foi testado também um volume de 1 mL da cultura formada de um dia para o outro durante 18-20 horas (estoque) de Salmonella enterica, subespécie Typhimurium enterica serovar (ATCC 35987). O teste de PCR foi conduzido em um sistema Stratagene Mx3005P™ QPCR (PCR quantitativo) (Stratagene Corporation, La Jolla, CA, EUA) utilizando-se as seguintes condições de ciclo por ciclo durante 45 ciclos: 25°C durante 30 segundos, 95°C durante 10 minutos, 95°C durante 15 segundos, e 60°C durante 1 minuto. Foi obtido um valor limite de ciclo médio (n=2) (valor CT) de 17,71 para a amostra de controle. Foram obtidos valores CT médios (n=2) de 20,44 e 16,53 para as amostras de teste contendo T1O2-DE ou Au- Fe2O3-DE, respectivamente, indicando uma reação positiva ao teste de PCR e confirmando a presença de salmonela.
[00128] As descrições aqui referidas e contidas nas patentes, documentos de patente e publicações citadas no presente documento estão aqui incorporadas a título de referência em sua totalidade como se cada uma fosse incorporada individualmente. Várias modificações e alterações imprevisíveis desta invenção se tornarão evidentes aos versados na técnica sem divergir do escopo e do espírito desta invenção. Deve-se compreender que esta invenção não tenciona ser desnecessariamente limitada pelas modalidades e exemplos ilustrativos aqui apresentados e que tais exemplos e modalidades são apresentados somente a título de exemplo, tendo 0 escopo da invenção a intenção de ser limitado apenas pelas reivindicações aqui apresentadas da seguinte forma.
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Claims (7)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Processo CARACTERIZADO por compreender (a) fornecer um agente de concentração particulado que compreende um suporte de terra diatomácea, em ao menos uma porção de sua superfície, um tratamento de superfície compreendendo um modificador de superfície compreendendo dióxido de titânio, ouro ou platina em nanoescala fina, ou uma combinação dos mesmos; (b) fornecer uma amostra compreendendo pelo menos uma cepa de microrganismo, em que pelo menos a dita cepa de microrganismo é selecionada a partir de cepas de bactérias, fungos, leveduras, protozoários, vírus, endósporos bacterianos, e combinações dos mesmos; e (c) colocar em contato o dito agente de concentração com a dita amostra de modo que ao menos uma porção de ao menos uma dita cepa de microorganismo seja ligada ao dito agente de concentração ou capturada pelo dito agente de concentração.
  2. 2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO por compreender ainda detectar a presença de pelo menos uma cepa de micro-organismo ligada.
  3. 3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato do dito modificador de superfície ser selecionado a partir de ouro em nanoescala fina, platina em nanoescala fina, ouro em nanoescala fina em combinação com pelo menos um óxido metálico, dióxido de titânio, dióxido de titânio em combinação com pelo menos um outro óxido metálico, e combinações dos mesmos.
  4. 4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato da dita amostra estar na forma de um fluido.
  5. 5. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato do dito contato ser realizado misturando-se o dito agente de concentração e a dita amostra; e/ou do dito processo compreender ainda segregar o agente de concentração resultante ligado ao micro-organismo.
  6. 6. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato do dito modificador de superfície ser selecionado a partir de ouro em nanoescala fina, platina em nanoescala fina, ouro em nanoescala fina em combinação com óxido férrico ou dióxido de titânio, dióxido de titânio, dióxido de titânio em combinação com óxido férrico, e combinações
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    2/2 dos mesmos; e em que pelo menos uma dita cepa de micro-organismo é selecionada a partir de bactérias, leveduras, vírus, endósporos bacterianos, e combinações dos mesmos.
  7. 7. Kit CARACTERIZADO por compreender (a) um agente de concentração que compreende um suporte de terra diatomácea, em ao menos uma porção de sua superfície, um tratamento de superfície compreendendo um modificador de superfície compreendendo dióxido de titânio, ouro ou platina em nanoescala fina, ou uma combinação dos mesmos; e (b) um recipiente de teste para uso na realização do processo, conforme definido na reivindicação 1.
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