CN102308005A - 用于免疫荧光的功能化的微流体装置 - Google Patents

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Abstract

本申请要求保护适用于免疫荧光分析的微流体装置和相应的方法。所述的装置包括两个平面组件，其中一个组件的一个表面上具有凹槽。当这两个平面组件组合时，所述的凹槽变成一个通道。没有凹槽的组件用金属氧化物的纳米粒子进行功能化：在组装所述的装置时被金属氧化物的纳米粒子功能化的这一层构成所述通道的底部。功能化的目的是使细胞更好的粘附在通道底部，以便于进行荧光测试，特别是在所述装置上进行FISH测试。

Description

用于免疫荧光的功能化的微流体装置
技术领域
本发明涉及基于荧光分析检测领域，特别是涉及用于FISH检测的装置。本发明还涉及一种通过使用本发明的装置有效进行所述测试的方法。
背景技术
目前微流控是一种涉及多学科的交叉科学，它处理的液体的体积非常小，从微升降低到飞升。它最早的应用涉及喷墨打印头，但是它被证实特别适合用于生物技术领域中的“实验室芯片”技术的开发，其中样品的特征是都具有非常小的量。分子生物学，酶分析，基因分析，蛋白质组学，临床病理学，诊断学，环境分析等都是微流控被开发的潜在领域。在这种微观层面，流体能够显示出不同于宏观层面的非常不同的特性，当设计微流体装置或使用它们进行试验的时候，这是必须要考虑进去的特点。例如，表面张力，能量损耗，流体阻力和扩散能够很大程度上影响试验的结果。
出于这些因素，这些试验的常规或惯用方案不能直接被用于微流体装置中，而是必须要在试验之前设计专用工艺以替代上述方案。
与微流体的使用有关的优点追溯到了通过这些装置所实现的早期操作中，允许较高的流量控制，分析时间的缩短，随着浓度和分子交互作用获得的高控制性，对于试剂和废弃产品的良好成本节约，因此使得它的使用更加环保并且由于仪器占地面积的减少能够提供处理具有较小空间的更多样品的能力。
上述优点使得使用微流体装置的试验是自动的，这从工业角度看来是非常有益的。
特别是，微芯片生物技术从微流体中获益最大，这要归功于新开发的集成的工作流程。
实验室芯片装置是几平方毫米到几平方厘米的芯片，在其上以微流路的形式在更小的级别上再现生物测试法。
实验室芯片装置或用于所述装置的微流路在以下文献中被广泛地描述。
美国专利第6,613,560号公开了一种用于进行化学和生化工艺的小型化装置，具体地，是一种进行DNA扩增的微反应器；这篇文献面临的问题是在分析时由微反应器的器壁引起的不期望的样品的吸附，并建议制作微反应器所使用的材料应显示对样品中存在的化合物具有较少吸附的材料(或使用表面涂层)。
国际专利申请第WO95/22051号公开了一种流动池装置，在该装置的通道中具有固定化试剂，它们能对包含在测试样品中的分析物产生电学或光学可检测到的响应。
欧洲专利申请第1542010号公开了一种包括反应区的微流体装置，被设计成能够容纳在样品中存在的至少一种成分和被固定在该反应区中的至少一个特定物质之间发生反应，这样能够引起它与一种或多种预定物质(目标成分)进行特异性或非特异性的相互作用。通过之前在所述壁上形成的中间固定薄膜(通常由有机化合物制作)使得特定物质可靠固定在微流路的壁上。
实验室芯片装置已经可用于各种分析技术中，例如电泳，色谱层析，染色，荧光血细胞计数，蛋白质分析，聚合酶链反应，血液分析等等，并进一步的被应用到了荧光原位杂交(FISH)技术中。作为FISH的大体介绍，可以参看例如“Cytogenetic and FISHtechniques in Myeloid Malignancies”，L.J.Campbell，Methods in MolecularMedicine，2006，Vol.125，pp.13-26的文献。
更具体地，FISH是用于基因组改变的检测中的非常敏感的诊断工具。
FISH是用于确定染色体重排或异常的非常有前景的诊断工具，而确定染色体重排或异常用其它常规技术是不能检测到的。例如染色体改变的分析能够预测未来的疾病或预测对治疗的反应。
第一步，FISH技术需要将细胞固定到载体上面，例如显微镜载玻片；然后，细胞经过蛋白消化以去除细胞质蛋白和染色体蛋白，从而进一步“接近”染色体DNA，需要进行变性，例如通过用甲醛基溶液进行培养。在使用乙醇基系列溶液进行细胞脱水之后，添加DNA探针。然后在大约75℃，进行变性2-5分钟并进行培养。用适合的杂交后溶液进行处理，以避免由于交叉杂交导致的非特异性的干扰结合。因此，通过荧光成像染色体序列中的异常位点变得明显。
在FISH方法之前，DNA的分析使用的是几乎没有成本效益的方法，然而，目前FISH使得研究者能够快速研究并了解许多疾病和癌症的原因。
例如，已经发现FISH方法可用于骨髓测试血癌例如白血病，淋巴瘤和骨髓瘤，实体瘤的淋巴结和外周血测试，植入前遗传学诊断，产前和产后遗传异常的筛查。
作为一个共同的优点，FISH方法可以直接应用于肿瘤样品，例如活组织切片检查，部分或石蜡包埋的材料，它能够提供高达单细胞水平的分辨率，能够在适合的细胞样品中检测出罕见的事件。尽管由这一技术提供了很多重要的优点，但是它的实际应用目前由于一些缺点受到了阻碍。
第一，FISH方法在实施该方案和进行成像分析所需的试剂费用以及工时和机时都非常昂贵。这一限制阻碍了FISH方法成为一种大规模的筛查方法。
克服这一限制的适合方法就是通过开发微流体装置的特点开发出小型化的方案。
然而，能够被预想出的FISH方案和装置的另一个限制是微流体装置中的细胞粘附的低效率；这是由于这样一个事实，由于微流体通道的横截面是非常有限的，因此相对的高压必须被施加于流体样品以实现它们在该装置内的移动，这反过来又导致相对高的流速。例如，文献“FISH and chips：chromosomal analysis on microfluidic platforms”，V.J.Sieben et al，IET Nanobiotechnologies，2007，1(3)pp.27-35描述了通过细胞离心的标准粘附方案，但是微流体装置通道中目标分析物的保留量仅仅是20％。当查找罕见突变时，这一特点会增加“假阴性”率。
微流体装置能够有效地固定细胞，适合于进行FISH检测，这将有助于扩大该技术的使用面。
一些现有技术的文献已经以改进保留微流体装置的通道中的分析物为任务。
论文“Enforced Adhesion of Hematopoietic Cells to Culture Dish InducesEndomitosis and Polyploidy”，X.Huang et al.，Cell Cycle，4(6)，pages 801-805公开了用聚-D-赖氨酸功能化的底物以用于提高细胞粘附；具有聚-D-赖氨酸涂层的底物可从BD生物科学公司购买，它目前被认为是用于细胞粘附的最先进技术并通常被用于这研究领域。
以Alberta大学名义申请的国际专利申请第WO2008/031228号公开了一种能够将粘附细胞的百分比提高到75％的固定方案。微流体通道中的细胞的固定通过将温度升高到50到95℃一段时间，由人工操作干预确定足以让一定比例的目的细胞固定而实现。结果，尽管改进了粘附细胞的百分比，但是这一文献中提及的方法仍然是受限的，因为固定步骤必须由人工操作进行控制，并且在这一步骤中需要的相对高的温度可能损坏一些细胞。此外，该申请描述了微流体装置的两个实施例，分别被称为“微芯片”和“循环微芯片”。被称为“微芯片”的实施例由0.5mm厚度的装载该微流体的显微镜载玻片和0.17mm厚度的盖玻片制作，声明必须形成用于高分辨率成像的最小工作距离。该装置的这两种组件都非常易碎并需要在组装过程中非常小心的操作，从而阻止该装置简单的成比例放而大应用在工业设备中。被称为“循环微芯片”的实施例由两个1.1mm厚度的显微镜载玻片和0.254mm厚度的中间的PDMS层构成。这一实施例克服了“微芯片”的易碎问题，但是它的厚度对于图像采集来说不能使用100X的镜头，因此阻碍了目前FISH标准需要的高分辨率图像的获得。
欧洲专利申请第1215186号公开了一种用于固定低聚核苷酸的载体，它可用于微流体装置的构件；这一载体具有使用选自HfO2，TiO2，Ta205，ZrO2和它们的混合物中的氧化物进行功能化的表面，在它们沉积之后进行处理以使它们的表面具有亲水性。然而这一文献没有提及细胞的固定。
国际专利申请第WO00/33084号公开了广泛用于诊断学的装置，其中的活性表面用有机化合物进行功能化，或者覆盖了“凝胶网格状”的氧化物。但是这篇文献没有提及关于细胞的实际保留量的任何信息。
因此，需要能够克服现有技术方法中的缺点如经典的微流体的FISH装置和方法。
具体地，需要设计一种装置和方法，它将是便宜的，易于操作的，可成比例放大和实施，能够快速和有效实现的。
发明内容
本发明涉及一种改进的微流体装置，它能够适合并有益地用于荧光分析技术中。本发明还公开了一种使用所述装置的简化方案，获得了惊人和预料不到的结果。
本发明的第一目的是一种微流体装置，包括至少一个载玻片和具有凹槽的一个部件，所述的载玻片和部件这样排列通过它们的接合形成微通道，其特征在于至少所述载玻片面向所述微通道的的一面上的区域被用纳米结构的金属氧化物进行功能化，所述的金属氧化物优选Ti氧化物，Zn氧化物或Zr氧化物。
本发明的另一个目的是使用本发明的装置用于进行荧光分析检测。
作为又一个目的，本发明涉及一种使用本发明的微流体装置进行荧光分析检测的方法。
附图说明
图1显示了典型的微流体部件的平面图和剖面图；
图2显示了在不同组装阶段本发明的经组装的装置；
图3A显示了在本发明的第一实施例中的构成本发明的装置的几个部件；图3B显示了图3A的经组装的装置的剖面图；
图4A显示了在本发明的第二实施例中的构成本发明的装置的几个部件；图4B显示了图4A的经组装的装置的剖面图；
图5A显示了在本发明的第三实施例中的构成本发明的装置的几个部件；图5B显示了图5A的经组装的装置的剖面图；
图6示意性地显示了在根据本发明的功能化的载玻片以及在不是本发明的载玻片上培养细胞(U937)的粘附试验的结果；
图7示意性地显示了在完成微流体运行之后(延长剪切力程序)，在根据本发明的功能化的载玻片以及在不是本发明的载玻片上培养细胞(U937)的粘附试验的结果；
图8A，8B和8C示意性地显示了在根据本发明的用不同的纳米结构的金属氧化物进行功能化的载玻片上以及在没有本发明的金属氧化物的载玻片上的原发性造血干细胞的粘附试验的结果；
图9显示了在本发明的两种装置上的粘附试验的结果；
图10和11显示了使用本发明的装置在微通道中进行FISH检测之后的培养细胞(U937)。
具体实施例
在本发明的第一方面，本发明涉及一种微流体装置。发现本发明的装置可以应用在荧光分析检测领域中，特别是它能够用于进行FISH检测。
相对于已知的装置，本发明公开的装置具有许多优点，这将被本领域的技术人员所理解。
本发明的改进的微流体装置通过将至少一个载玻片和在其中存在凹槽的一个部件进行接合形成的，这(至少)两种元件之间的接合限定了该装置中的一个微通道。虽然能够设计其它的结构，但是这些装置最共同的结构是凹槽不沿存在凹槽的该部件的全长延伸，并且通过所述部件中形成的通孔(或在构成完整装置的其它可能的元件中)该微通道可以到达该装置的顶部表面；本说明书的其它部分将参考这一共同结构进行描述。
在本发明中，能够使用任何适合的载玻片，例如由玻璃，石英或某些塑料的透明材料制作的载玻片。特别地，由于玻璃的化学惰性，透明度，低成本，低多孔性，亲水性和长期的稳定性，因此玻璃是优选的材料。为了方便，使用的可以是标准显微镜载玻片，优选例如硼硅酸盐，石英玻璃或碱石灰的玻璃的薄片形式，尺寸大约25X76X1mm。
用于本发明中的载玻片具有至少在完整装置中形成微通道的壁的区域，其用纳米结构的金属氧化物进行功能化以改进细胞粘附；在下文，纳米结构的金属氧化物将被称为ns-MOx，其中M表示金属。
在ns-MOx中，优选的金属氧化物是Zn氧化物(ns-ZnO)，Zr氧化物(ns-ZrO2)并且特别优选的是纳米结构的薄膜形式的Ti氧化物(ns-TiO2)。
使用透射电子显微镜(TEM)和原子力显微镜(AFM)观察，这些氧化物薄膜由具有2到50nm，优选5到15nm的粒度分布的纳米粒子构成。
使用石英晶体微天平(QCM)和AFM测量，纳米粒子随机组合以产生具有相当于块状氧化物(bulk oxide)的质量密度1/2到1/10质量密度的多孔结构；在ns-TiO2的情况时，该质量密度通常是致密TiO2的质量密度的大约1/7。
通过TEM和X-射线衍射(XRD)显示这些材料由纳米晶体和非晶纳米粒子组成。在ns-TiO2的情况时，已经观察到锐钛矿和金红石相的共存(Raman光谱)。
具有50nm厚度的薄膜在可见区域中的波长是透明的。
特别是在ns-TiO2的情况时，在UV区域(UV-VIS光谱)，大约320nm光吸收变得明显。通过吸收端特点，估计光学带隙在3.2到3.6eV之间(Tauc模型)。ns-TiO2的折射率值是1.6到1.8之间，由于纳米孔隙度(Lorentz-Lorenz模型)，其大大低于体相TiO2中任一种(锐钛矿2.5，金红石2.9)。
本发明的纳米结构的薄膜具有20nm到200nm的厚度，优选40nm到60nm，具有2nm到30nm，优选5nm到15nm的表面粗糙度。
这种ns-MOx的薄膜通过多种技术被沉积在基底载玻片上，例如溅射法或脉冲激光沉积(PLD)；但是优选的技术是通过使用脉冲微等离子体簇源(PMCS)的技术。这一技术允许纳米结构的薄膜的沉积并且它基于位于该源中的阴极的材料的烧蚀，通过注入到所述源室内气流与真空系统的界面产生的等离子区。该源和真空室之间的压差允许产生纳米粒子。PMCS技术的常用参考文献可以参看例如欧洲专利申请第EP1031639号或Journal of Physics D，32(1999)，L105-109。PMCS是优选的技术，因为已证明它能确保沉积材料上产生需要的孔隙度特点。
当通过PMCS制备时，ns-MOx薄膜的表面特点符合弹道学聚集生长过程，特别是显示出取决于厚度的表面粗糙度。对于40-60nm的厚度，表面粗糙度是5nm-15nm之间，优选是8nm-12nm(AFM)之间。
优选在沉积之后用氧等离子体处理该ns-MOx薄膜(100W处理150秒)，以增加润湿能力并改善微通道的毛细管作用，从而有利于该微通道内部的自发液体流动。
对载玻片进行功能化的优选材料是化学计量或非化学计量的ns-TiO2，优选通过PMCS技术获得。二氧化钛是高生物相容性和生物活性的材料；事实上，所述的材料被证明是不会干扰正常细胞活性的，例如细胞生长，并且是不与用于细胞培养的制备中的试剂互相作用的。此外，纳米结构的二氧化钛显示出了非常低的荧光背景信号(自体荧光)，这改进了在荧光测定中的信/噪比。
纳米结构的二氧化钛涂层以本申请人的名义公开于WO 2007/009994中。这篇文献公开了用于固定病毒或细胞的底物；但是这篇文献没有提到在微流体领域中的应用，并且没有给出与其它用于这一特定领域的已知的粘附力促进材料相比ns-MOx可具有优越性能的事实的技术启示。
存在凹槽的部件可以是使用不同的柔软材料制作的衬垫，通常是例如硅树脂或氯丁二烯橡胶或PDMS(聚二甲基硅氧烷)的聚合物；或者它可以是坚硬材料的薄片，通常是例如玻璃，石英等的无机材料。
该凹槽通常具有毫米级的长度和几十或几百微米级的横向尺寸的横截面；孔和其它可能的腔还具有低于1mm的尺寸。这些特征通常由蚀刻产生，可以用现有技术中已知的不同技术制作，例如喷粉，化学蚀刻(例如HF蚀刻)，深反应离子蚀刻或等离子体蚀刻，使用或不使用蚀刻掩膜。在聚合物衬垫的情况下，例如模制或铸造的其它技术能够可用于形成该凹槽。
根据需要，该凹槽可以具有不同的几何横截面，例如正方形，圆形，六边形等；最常见的横截面是矩形。它还可以由不同数量的微通道组成。
根据本发明优选的具有凹槽的部件是聚合物衬垫。具有微米凹槽的衬垫的例子在图1中显示；具体地，在该图中，图1a)显示了该衬垫的俯视图，图1b)显示了同一个衬垫的仰视图，和图c)显示了该衬垫的侧视图，沿平行于和包括凹槽的平面获得的剖面。
该实施例的衬垫尺寸是75.6x 25.0x 1.0mm，实施例的凹槽尺寸是300μm x 50μmx 10mm；用于试剂，气体和样品注入的通孔的直径是0.7mm。
使用取代平面载玻片的微流体装置作为最先进的技术获得了进行检测所需的低量试剂。具体地，只需要非常低量的昂贵的FISH探针，这也是环境更安全的。
此外，在根据本发明的微流体装置中，用于粘附的表面与该微通道的底面具有相同的尺寸。这一表面比标准FISH检测中的功能化的相应的表面更小：如果为本发明的细胞粘附提供了涂层，相似数量的细胞变得可用于分析并且需要很短的时间就获得了结果图像，从而减少了由于机时分配产生的费用。
为了实现小型化的FISH检测，具有不同粘度和密度的水基(或水溶)试剂必须连续使用：因为该反应在微通道中进行，微通道的毛细管作用是试剂流动和进行正确分析的必要的前提条件。这一条件可以通过制作含有疏水材料的衬垫或厚片(其中获得了微通道)，或通过使用疏水ns-MOx薄膜将基底载玻片进行功能化而实现。
在本发明的优选实施例中，衬垫使用已知疏水的PDMS或硅树脂制作，以避免该微通道中的液体的自发流动。因此，必须对ns-MOx涂层进行后处理，为了提供这样的疏水性，只要被沉积的薄膜是疏水的就可以，并由此利于该微通道中的水性试剂的流动。
通过对ns-MOx的后处理，优选通过增加表面电荷(例如在100W，通过等离子氧处理150秒)，通过接触角分析测量，获得了具有高润湿度的ns-MOx涂层(在等离子处理过的涂层中，本发明人已经获得了一致的不大于10°的接触角)。本发明人已经观察到了这种处理能够在上下文中提及的微通道中呈现出毛细管作用，并且证明了液体在该微通道中的流动是自发的，不需要泵的辅助抽吸，从而证明了该装置的毛细管作用。
本发明的微流体装置的第一个最简单的实施例包括结合有PDMS或硅树脂衬垫的功能化的显微镜载玻片，其中该衬垫具有微米级凹槽。该结合可以在PDMS或硅树脂和玻璃之间产生至少部分的自发粘附。但是这种粘附是可逆的，允许在检测结束时将两个部件轻易的分离。
进行该组装使得该微通道与该载玻片表面的功能化区域相对应。由于载玻片和衬垫之间可逆的结合，衬垫可以在杂交阶段的最后被去除，从而在载玻片上直接获得荧光成像，而不需要对样品进行必要的进一步的处理。
出乎意料地，已经观察到了所述第一步的结合和所述后面的分离步骤在进行FISH检测之前或之后都不影响细胞粘附到载玻片的功能化层的程度。
一旦分离，该载玻片可以直接被放置在显微镜“下面”，显微镜的物镜朝向固定样品的载玻片一侧。这可以正确地设定工作距离，使用100X的物镜进行图像采集，从而获得了FISH常用标准需要的图像分辨率。
同时，例如，可以使用1mm厚度的标准显微镜载玻片以获得坚固的足以容易操作的装置。
如上述所公开的，图2显示了本发明的经组装的装置在不同组装阶段的俯视图。在该图中，图a)表示基底；图b)表示具有该功能化的载玻片的基底，其中以较深阴影表示的中间区域是功能化的区域；图c)是具有该功能化的载玻片以及微流体衬垫的基底，其中该微流体衬垫位于载玻片的上面；图d)是最终经组装的装置，在该微流体的入口处设置封口。
由于PDMS或硅树脂和玻璃之间的自发粘附，如果使用由由上述聚合物中的一种来制作的微流体衬垫，该描述的组装可能是不必要的。但是，如果没有使用这类聚合物，必须在各部件之间提供压紧，特别是对于下面的本发明的实施例，例如下面将要描述的并被称为“垫片1”，“垫片2”和“垫片3”的那些实施例。
图3A和3B中表示了“垫片1”实施例。图3A显示出根据第一实施例构成的微流体装置的三个元件，即上面的载玻片31，其设置有试剂和样品注入的微流体的入口(这可以使用任何适合的有机或无机硬质材料，例如玻璃来实现)；衬垫32，在其中设置开口；以及部件33，部件33是功能化的载玻片。图3B显示了通过将图3A的元件31，32和33连接获得的装置30的剖面图，所述剖面是指沿着垂直于该装置的微通道中的流体的流动方向的平面。对于图3B的构造，载玻片31和衬垫32的组装定义了凹槽，并且载玻片31可以轻微地压紧在衬垫32上，从而作为垫片，确保液体能够被紧密地密封到该装置中。具体地，所述衬垫32可以由聚合物材料，例如PDMS，硅树脂或氯丁二烯橡胶实现。
进行本发明的装置的组装，使得载玻片33的功能化的区域与衬垫32的开口对应。
图4A和4B显示了被称为“垫片2”的本发明的微流体装置的又一个特定的实施例(图4B中的装置40)；图4A和图4B中的视图之间的关系与图3A和3B中的视图之间的关系相同。在这个例子中，微通道在图4A中的载玻片41中实现。
在这一实施例中，功能化的载玻片43与设置有凹槽和用于进入微通道的开口的载玻片41接合。为了使液体紧密的密封在载玻片41和43之间，在它们之间存在密封件42。具体地，所述密封件以例如PDMS，硅树脂或氯丁二烯橡胶的聚合物材料实现。所述密封件42设置有适合的孔，从而不会覆盖图4A中的载玻片43的功能化的区域。
进行组装，使得载玻片41的微通道与载玻片43的功能化的区域对应。
图5A和5B显示了被称为“垫片3”的本发明的微流体装置的再一个的实施例(图5B中的装置50)；同样，图5A和图5B中的视图之间的关系与图3A和3B中的视图之间的关系相同。在这个例子中，该装置由图5A中所示的第一载玻片51和功能化的载玻片53形成；载玻片51设置有凹槽和用于试剂，气体和样品注入的孔。通过薄的聚合物层(52，在图5A中未示出)获得载玻片51和53之间的液体的紧密密封，所述连接到载玻片51的薄的聚合物层优选几微米厚，并且不会覆盖具有凹槽的载玻片的凹槽部分。
用于上述实施例的所有的载玻片可以是任何适合的载玻片，例如像显微镜载玻片的玻璃载玻片。
在所有实施例中的本发明的装置出乎意料地被证实解决了现有技术中所公开的主要的技术问题。
事实上，被证明90％或更多的最初细胞粘附在该功能化的基底上，这相对于现有最先进的技术水平是惊人的。出乎意料地，当处理例如U937的造血细胞时，也已经获得了这样的粘附百分比，造血细胞是淋巴瘤细胞，通常被定义为非粘附细胞。因此，甚至可以使用具有低数量细胞的样品，都将具有合理预期的再现性和足够信息的采集。
这是最应关注的，特别是当不能处理大量样品时，例如循环肿瘤细胞样品。
此外，由于在处理过程中，样品细胞的损失非常有限，因此同样可以确定罕见细胞突变，从而减少了假阴性的风险。
此外，由于粘附到载玻片上的细胞保持着它们的3D构象，而不是像传统方法一样分散和按压到载玻片上，可以通过收集来自样品的不同距离的数据获得3D图像。当处理罕见细胞突变或低细胞数量的样品时这一优点也是主要关注的，同样在Z轴获得了识别信号，从而不会由于几何学问题忽视潜在的有价值的信息。
作为本发明的第二个目的，提供了一种在荧光分析检测，特别是在进行FISH检测中使用本发明的装置的方法。
为了本发明的这一目的，特别是，可以使用细胞悬液，由来自生物样品，体外培养的，从组织或体液中提取的细胞构成。
已经实施了简化的方案，相对于任何其它的所使用的现有方法和/或材料获得了意外的且惊人的效果。
事实上，该方法可以分析非常小尺寸和低密度的样品，浓度大约10细胞/ml左右。
具体地，该检测可在不同种类的细胞上进行，例如肿瘤细胞，循环肿瘤细胞，造血细胞，上皮细胞，羊水和通常任何的培养细胞或哺乳动物和非哺乳动物种类的细胞，活的或之前使用任何适合的细胞固定剂固定的细胞，通常如上述的被分类为粘附或非粘附细胞。活的或固定的，粘附或非粘附细胞可以不同程度被固定到功能化的载玻片上。
在优选的实施例中，本发明的荧光分析检测是在U937活细胞上进行的，该细胞通常被定义为非粘附细胞。
通过活的细胞悬液的使用，本发明的方法不需要使用固定试剂预处理细胞也不用裂解细胞，因此可以使用完整细胞。在时间，费用和毒性试剂的体积方面是特别关注的；此外，可以进行细胞的生理学条件的分析。
在本发明中公开的方法特别适合使用本发明的装置进行。
本发明将通过下面的例子进行进一步的说明。
例1
这个例子是根据本发明制备和组装具有微通道的微流体装置。
a)用ns-MOx将基础载玻片功能化
经超声波清洁的显微镜玻璃载玻片(例如Schott Nexterion D)被放入装备有PMCS的真空系统的沉积室中。载玻片暴露于由PMCS产生的团簇束，这通过位于PMCS源和载玻片之间的合适的模板掩膜产生，以允许所需的材料仅仅沉积在该载玻片上的有限区域。为了获得具有相同厚度的沉积层，该载玻片被不断在团簇束的前面进行栅格化；为了监控生长层的厚度，同样将石英晶体微天平(QCM)暴露于团簇束。沉积在室温进行，通常10-6托的压力，并在每个载玻片持续大约1分钟，设置的源-载玻片之间的距离大约是1m。对载玻片进行功能化所选择的材料是TiO2。
得到的ns-TiO2薄膜具有大约50nm的平均厚度。
在沉积阶段之后，载玻片被暴露在100W的氧等离子中150秒。
b)将凹槽与载玻片接合
提供图1所示种类的PDMS衬垫，其中具有微米级凹槽，具有1cm的长度，300μm的宽度和50的μm高度。使用适合的机械中心定位器(centerer)接合衬垫和功能化的载玻片，将凹槽的位置设置在载玻片的功能化的区域上，从而形成根据本发明的微通道。
通过施加轻微的压力获得这两个部件之间的粘附。
例2(对照例)
通过将在例1中使用的一样的PDMS衬垫和非功能化的显微镜玻璃载玻片接合制作微流体装置；在这个例子中，通过简单地对这两个部件施加轻微的压力获得该衬垫和载玻片之间的粘附。
例3(对照例)
重复例2的步骤，在这个例子中，载玻片用致密的，非纳米结构的TiO2薄膜功能化，该薄膜是通过标准溅射沉积方法获得的；得到的薄膜具有大约50nm的厚度。在这个例子中，通过按压这两个部件获得该衬垫和载玻片之间的粘附。
例4(对照例)
重复例2的步骤，在这一例子中使用了用聚-D-赖氨酸层功能化的载玻片，其通过将载玻片在室温用15μg/ml的聚-D-赖氨酸(SIGMA公司)溶液处理30分钟，然后用1X杜氏磷酸缓冲液(DPBS)冲洗，空气干燥并用于此试验；在这个例子中，通过按压这两个部件获得该衬垫和载玻片之间的粘附。
例5
这一例子显示了在例1-4的微流体装置上进行的细胞粘附试验的结果。
该微流体装置在37℃的热板的顶部预处理2分钟。
为了制备测试样品，将培养的U937细胞(1ml的指数生长的细胞)放置在1.5ml的试管中并使用1XDPBS清洗3次，计数并最后以10000细胞/μl的浓度重悬浮。1.5μl的细胞悬液被装入每个微流体装置的微通道的入口，同时使用注射泵(KDS120，KD Scientific公司)以1.7μl/s的速度从该微通道的出口进行抽吸；然后，细胞粘附到微通道的底部几分钟并立刻通过添加3∶1比例的甲醇/乙酸溶液进行固定。在粘附之后，添加1XDPBS以冲洗该固定剂，同时使用真空泵进行抽吸；这一方法使细胞受到有限的剪应力。在该方法的最后，将衬垫移除，该载玻片使用DAPI(4，6-二脒基-2-苯基吲哚，SIGMA公司)染色，并安装用于显微镜分析。在分析中，对固定在载玻片上的细胞数量进行计数。结果在图6中显示：由这张图中清楚的可见，在试验条件下，粘附到对照例2-4的载玻片表面的U937细胞的数量是相似的，并且相当于大约600个固定的细胞，即，大约上样细胞的40％；另一方面，粘附到本发明(例1)的功能化的载玻片上的细胞数量大约是1400，也就是说，高于对照例载玻片的130％，相当于上样细胞大约93％。
例6
这一例子显示了在比例5更大的剪应力的条件下，在例1-4的微流体装置上进行的第二细胞粘附试验的结果。
重复例5的方法直到使用3∶1的甲醇/乙酸溶液的固定步骤；然后将该样品进行下面的称为“延长的剪应力”步骤，该步骤包括将固定在载玻片上的细胞与用于生物学检测中的若干试剂接触。具体地，用吸量管顺序量取下面的溶液，在所示时间和温度进行培养并用真空泵抽吸：2X生理盐水柠檬酸钠缓冲液(SSC)，30分钟，37℃；具有酶的缓冲液(0.005％胃蛋白酶，0.01N的HCl，SIGMA公司)，15分钟，37℃；1XDPBS，5分钟，室温(RT)；后固定剂(50mM的MgCl 2，SIGMA公司)；1XDPBS中0.95％的甲醛(SIGMA公司)，5分钟，室温；1XDPBS，5分钟，室温；用70％，85％和100％(BDH)的EtOH进行三次连续冲洗，每次1分钟，室温；变性溶液(70％的甲酰胺，SIGMA公司，2x SSC SIGMA公司)，5分钟，75℃；用70％，85％和100％的EtOH进行三次连续冲洗，每次1分钟，室温。
在纯的EtOH被完全吸入之后，载玻片被放置于60℃，2分钟以完全干燥，并且用0.3μl的杂交混合物装载(15ml∶7.5ml的超纯甲酰胺，6.0ml的25％的硫酸葡聚糖，1.5ml20x SSC)。然后，将微通道井口用一滴矿物油(SIGMA公司)密封以防止蒸发，并在37℃培养10分钟。在培养之后，去除衬垫并且载玻片在含有冲洗液A(0.3％的NP40，非离子物质，非变性清洁剂辛基苯氧基聚乙烯醇(octyl phenoxylpolyethoxylethanol)，0.4x SSC(SIGMA公司))的染色缸中在73℃浸泡2分钟，并在冲洗液B(0.1％NP40，2x SSC)中室温浸泡1分钟，空气干燥并加入DAPI II(Abbot t Molecular公司)用于显微镜分析。为了进行细胞计数，每个载玻片用DAPI滤波器成像并用Scan^R采集，用于成像扫描的显微镜自动化平台(Olympus Europa，德国)装配有Hamamatsu ORCA-AG型摄像机，使用10X物镜扫描13个相邻的图像；然后在设定适合的端值并排除15-75平方像素范围以外的物体之后，使用ImageJ软件“分析粒子”函数对细胞进行计数。使用Excel软件输出并分析数据。
该结果在图7中的图表中显示。由该图中可见，在SiO2载玻片上的细胞数量明显减少到大约100细胞/微通道，而在涂覆有ns-TiO2和聚-D-赖氨酸的载玻片上的细胞数量未明显变化。但是，由于原始细胞固定的效率不同(见例5)，在延长的剪应力试验的最后，总细胞数量在ns-TiO2和聚-D-赖氨酸之间是明显不同的(1400细胞对600细胞)，是涂覆有ns-TiO2的载玻片上2倍多。
例7
这个例子显示了在与例6相同的条件下，在例1-4的微流体装置上进行的第三细胞粘附试验的结果，在这个例子中，使用了来自人体捐赠的造血细胞的样品。
与例5一样，微流体装置在热板的顶部在37℃预处理2分钟。
为了制备测试样品，正常捐赠者的1等份外周血液(PB)(0.5-1ml)用红细胞裂解(RBL)缓冲液(SIGMA公司的0.15M NH4Cl，9.93mM的KHCO3，0.13mM的EDTA)处理获得10ml的总体积；该悬液在4℃保持5分钟，然后以1500rpm的转速离心5分钟。去掉上清液并将被分离出的造血细胞重悬在10ml的RBL缓冲液中，然后以1800rpm的转速离心5分钟。细胞重悬在1ml的1XDPBS中并被转移到1.5ml的试管中，在1XDPBS中冲洗两次，并最后以15000-25000细胞/μl的浓度重悬浮。1.5μl的由此获得的悬液被装入每个微流体装置的微通道的入口中。
20μl的Carnoy固定剂(3∶1的甲醇(SIGMA公司)/乙酸(Carlo Erba公司))被添加到入口并扩散进入以固定细胞。在2分钟之后细胞被固定。然后微通道受到例6中所示的方法的延长的剪应力。试验结果在图8中显示：保持在本发明的装置上面的细胞数量范围是保留在对照装置上面的细胞数量的1.8到2.5倍。
例8
这是关于本发明的装置性能的对照例，其中在沉积之后，该ns-TiO2薄膜经过后处理后或未经处理的。
如例1的点a)描述的所制作的载玻片的功能化表面在100W受到氧等离子的处理150秒。
因此处理后的载玻片和未经过后处理的载玻片与例1中的PDMS衬垫组装，然后进行例6的方法，在这个例子中使用固定细胞(U937)作为试验样品。试验结果在图9中显示，并显示出了本发明的两种装置表现为细胞的高保有度，但是在经过后处理的ns-TiO2薄膜例子中，细胞更均匀分布在对应于微通道的底部的表面上。这有利于数据的解释。
例9
这是关于使用本发明的微流体装置实施完整FISH检测方案的例子。
根据例1制作的微流体装置用于根据本发明的方案进行FISH检测。
1等份的U937细胞(ATCC American Type Culture Collection)以600rpm的转速离心5分钟并在37℃在1x DPBS中悬浮达到10000细胞/μl的细胞浓度。
使用标准试验室吸量管将细胞悬液手动移液到装置中并培养4分钟。
添加含有乙醇和弱羧酸的固定剂(甲醇/乙酸3∶1)，并且固定进行2分钟；然后使用真空泵进行抽吸。
将37℃预加热的30μl的2x SSC溶液(由20x SSC的浓缩液，3.0M的NaCL，0.3M的柠檬酸钠制备)移液进入微通道并在37℃加热的热板上培养15分钟。
在培养之后，含有0.005％的胃蛋白酶的溶液被移液并在热板上培养15分钟进入该微通道。
胃蛋白酶溶液被泵出，1x DPBS(磷酸缓冲液，Lonza Group)被移液，培养5分钟，然后含有甲醛的溶液(对于50ml的溶液：1.3ml的37％的甲醛，0.23g的MgCl2，48.7ml的PBS)被培养5分钟，用1x DPBS冲洗并培养5分钟。DPBS从该微通道被泵出，进行干燥。
70％，85％和100％的系列乙醇溶液被顺序移液并且每种溶液被培养1分钟。
73℃预加热的变性溶液(对于50ml的溶液：35ml的37％的甲醛，5ml的20x SSC，pH值7-8的10ml的H20)被移液，在73℃加热的热板上进行5分钟的培养。
然后该装置从热板去除并冷却，随后将变性溶液泵出，重复使用乙醇溶液进行处理。
该装置被放置于45℃的热板上并且通过泵出将乙醇在1分钟内完全去除。
该装置从热板去除并装载上标记有Cy3的变性探针。然后该微通用一滴矿物油(Sigma公司)密封并在保持在37℃的平板上隔夜培养。
在培养之后，衬垫与载玻片分离：然后载玻片在染色缸中用含有0.4x SSC和0.3％的NP40的溶液冲洗，所述溶液在73℃预加热；然后在室温使用含有2x SSC和0.1％的NP40的溶液冲洗1分钟。最后，载玻片被空气干燥1分钟。
然后玻璃盖玻片使用含有DAPI(4，6-二脒基-2-苯基吲哚，SIGMA公司)的溶液处理。
这样载玻片可用于使用油浸100x物镜采集图像(见图10和图11)。
图10显示通过FISH检测由Cy2标记的特异性位置探针(见两个亮点/核)对染色体的细胞核的精确检测，甚至对于基因检测使用了低丰度序列探针，都证实了测试的有效性。
图11显示通过FISH检测由Cy3标记的着丝粒特异性探针(见两个亮点/核)对染色体的细胞核的精确检测，证实了测试的最佳性能。

Claims (22)

1.一种微流体装置，包括载玻片和其中至少存在一个凹槽的部件，所述载玻片和所述部件存在的方式是通过它们的接合形成微通道，其特征在于，至少所述载玻片面向所述微通道的表面区域被纳米结构的金属氧化物功能化。
2.根据权利要求1所述的微流体装置，其中所述的纳米结构的金属氧化物由具有2-50nm，优选5-15nm范围的尺寸分布的纳米粒子组成。
3.根据权利要求1所述的微流体装置，其中所述的金属氧化物选自Ti氧化物，Zn氧化物或Zr氧化物。
4.根据权利要求1所述的微流体装置，其中所述的纳米结构的金属氧化物是薄膜形式。
5.根据权利要求4所述的微流体装置，其中所述的薄膜具有20nm-200nm之间的厚度。
6.根据权利要求5所述的微流体装置，其中所述的薄膜具有40nm-60nm之间的厚度并具有5nm-15nm之间的表面粗糙度。
7.根据权利要求1所述的微流体装置，其中所述的纳米结构的金属氧化物具有多孔结构，其质量密度是相应的块状氧化物的质量密度的1/2-1/10。
8.根据权利要求7所述的微流体装置，其中所述的氧化物是Ti氧化物，其质量密度是致密TiO2质量密度的1/7，光学带隙在3.2-3.6eV之间，以及折射率在1.6-1.8之间。
9.根据权利要求4所述的微流体装置，其中所述的薄膜通过PMCS技术进行沉积。
10.根据权利要求1所述的微流体装置，其中所述的氧化物通过等离子处理使其具有亲水性。
11.根据权利要求1所述的微流体装置，其中具有凹槽的所述部件是由软质材料制作的衬垫或是硬质材料制作的薄板。
12.根据权利要求11所述的微流体装置，其中所述的部件是由硅树脂，氯丁二烯橡胶或聚二甲基硅氧烷(PDMS)制作的衬垫。
13.根据权利要求12所述的微流体装置，其中所述的衬垫与所述载玻片可逆地接合。
14.根据权利要求1所述的微流体装置(30)，包括上载玻片(31)，所述上载玻片(31)设置有用于试剂，气体和样品注入的微流体进入孔，包括衬垫(32)，所述衬垫(32)中具有开口，和包括功能化的载玻片(33)，使所述的上载玻片和衬垫(32)的组装限定所述的凹槽，并且所述衬垫作为垫片确保液体紧密地密封到所述装置中。
15.根据权利要求1所述的微流体装置(40)，包括载玻片(41)，所述载玻片(41)设置有凹槽和用于进入所述微通道的开口，包括功能化的载玻片(43)和位于所述载玻片之间的密封件(42)，所述的密封件与设置有凹槽的载玻片中的适合的腔匹配并且所述的密封件上设置有孔从而不能覆盖所述的功能化的载玻片的功能化区域。
16.根据权利要求1所述的微流体装置(50)，包括设置有凹槽和用于进入所述微通道的开口的载玻片(51)，和包括功能化的载玻片(53)，其中聚合物层(52)被粘附到具有凹槽的载玻片上凹槽存在的一面，所述的聚合物层设置有孔，从而不能覆盖所述的功能化的载玻片的功能化区域。
17.根据前述权利要求中任何一项所述的微流体装置在荧光分析检测中的用途。
18.根据权利要求17所述的用途，其中所述的检测是FISH检测法。
19.根据权利要求18所述的用途，其中所述的FISH检测法根据包括以下步骤的方案进行：
a)将细胞样品装载到权利要求1-16中任意一项所述的微流体装置的所述微通道中；
b)培养所述的细胞；
c)用乙醇和弱羧酸的溶液固定所述的细胞；
d)用SSC冲洗；
e)用胃蛋白酶溶液冲洗；
f)用甲醛溶液后序固定；
g)加入一系列乙醇溶液；
h)加入变性剂溶液；
i)重复一次步骤g)；
j)加入标记探针并进行培养；
k)从所述载玻片上移除构成所述微通道的所述部件；
i)用含有SSC和NP40的溶液进行冲洗，
其中所述的细胞样品是细胞悬液的形式。
20.根据权利要求19所述的用途，其中所述的细胞悬液是非粘附细胞的悬液。
21.根据权利要求19或20所述的用途，其中所述的非粘附细胞是活细胞。
22.根据权利要求21所述的用途，其中所述的细胞是固定细胞。
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