CN105062892A - 水中浮游生活微型异养鞭毛虫的分离纯化方法 - Google Patents

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蓝文陆
潘科
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Guangxi Zhuang Autonomous Region Marine Environmental Monitoring Junction Centre
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Abstract

本发明公开了一种水中浮游生活微型异养鞭毛虫的分离纯化方法，主要包括自制微量吸管、鞭毛虫样品的采集、鞭毛虫单体的分离和鞭毛虫单体的纯化等步骤。应用本发明从水体中分离纯化微型异养鞭毛虫，由于是在一个微液滴中确认鞭毛虫数量，所以辨认过程比较简单，通常鞭毛虫的形态表现为一个移动速度很快的小圆点，而本法的部分操作不需要在显微镜视野中进行，大大减少了折断毛细管的情况。同时，本发明的方法简便易学、分离速度快，为微型异养鞭毛虫的研究提供了有效可靠的技术支持。

Description

水中浮游生活微型异养鞭毛虫的分离纯化方法
技术领域
本发明属于微生物提取领域，尤其涉及一种水中浮游生活微型异养鞭毛虫的分离纯化方法。
背景技术
水体中微型鞭毛虫是微型食物环(网)中的一个重要类群，异养鞭毛虫的分离、纯化与培养工作具有十分重要的意义。首先，这是研究它们的种类特征、营养类型、生理生化特征、摄食率、生长率和总生长效率的重要前提；再者，获得稳定培养的种类不但具有重要的科学研究意义，而且具有一定的商业价值；最后，藻类和原生动物的种类保存在生物多样性保护中也是一项非常有意义的工作。
藻类和细菌可以使用琼脂平板分离法分离。然而，自由生活的异养鞭毛虫的分离纯化目前还无法使用琼脂平板分离法。另外，由于异养鞭毛虫的个体十分微小(主要为＜20μm，大部分＜5μm)，体内通常无色素体，运动能力又强，在解剖镜下不容易观察和捕捉它们，一些适合大个体原生动物的分离方法也不适用于微型甚至超微型鞭毛虫。因此，有效分离水体中自由生活的微型异养鞭毛虫并不是一件容易的工作，急需一种有效分离筛选纯化培养的方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种简便易学、分离速度快的水中浮游生活微型异养鞭毛虫的分离纯化方法。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：水中浮游生活微型异养鞭毛虫的分离纯化方法，包括以下步骤：
(1)自制微量吸管
将长嘴吸管的嘴部放在酒精灯上加热，待玻璃变红，迅速将吸管的末端受热位置均匀拉细成毛细管，即得微量吸管；
(2)鞭毛虫样品的采集
用广口瓶、大口三角烧瓶野外采集异养鞭毛虫水样，采集后用纱布包裹瓶口，带回实验室进行加富培养；
(3)鞭毛虫单体的分离
取少量的加富培养后的水样滴加适量在玻片一侧；在显微镜(100×)下，从玻片的另一侧找到一片空白区域并在镜头下确认该区域的位置；用自制微量吸管从水样中吸取微量液体小心滴在镜头下既定区域；立即在显微镜视野中找到该液滴，反复调节焦距，直至确认液滴中的鞭毛虫数量；如果液滴中只有一个鞭毛虫，那么迅速将微量吸管靠近液滴，利用吸管的毛细作用重新吸回液滴，然后将液滴转移到预先准备好的菌液中；如果液滴中有多个不同的鞭毛虫，则放弃该液滴，重复吸取液滴观察操作；
(4)鞭毛虫单体的纯化
将挑好的鞭毛虫个体放在20～25℃下培养，约3～4天后取样，在400倍和1000倍显微镜视野下观察，确认是否成功分离出纯种；如果分出的鞭毛虫不纯，可以进行第二次分离，直到分离到纯化种类为止。
步骤(1)中的毛细管管口内径小于50大于20μm，毛细管的整体长度在1～2cm左右。
步骤(2)中的加富培养添加酵母提取物或蛋白胨并在光照培养箱25℃中培养3～7天。
步骤(3)中的玻片有两个凹槽。
针对目前缺乏有效分离纯化微型异养鞭毛虫的手段，发明人建立了一种水中浮游生活微型异养鞭毛虫的分离纯化方法，主要包括自制微量吸管、鞭毛虫样品的采集、鞭毛虫单体的分离和鞭毛虫单体的纯化等步骤。应用本发明从水体中分离纯化微型异养鞭毛虫，由于是在一个微液滴中确认鞭毛虫数量，所以辨认过程比较简单，通常鞭毛虫的形态表现为一个移动速度很快的小圆点，而本法的部分操作不需要在显微镜视野中进行，大大减少了折断毛细管的情况。同时，本发明的方法简便易学、分离速度快，为微型异养鞭毛虫的研究提供了有效可靠的技术支持。
附图说明
图1是应用本发明的方法分离出的异养鞭毛虫，图中：a和b分别表示两种不同的微型异养鞭毛虫。
图2是应用本发明的方法分离出的异养鞭毛虫或藻，图中：a和b分别表示两种不同的鞭毛藻，c和d分别是异养的原多甲藻和环沟藻。
具体实施方式
本发明建立的水中浮游生活微型异养鞭毛虫的分离纯化方法，包括以下步骤：
(1)自制微量吸管
将长嘴吸管的嘴部放在酒精灯上加热，待玻璃变红一瞬间，迅速将吸管的末端受热位置均匀拉细成毛细管，即得微量吸管；要求尽量拉细，拉成丝状亦可；毛细管管口最好平直，因此初制备的拉细毛细管需进行修整，可用剪刀修整，剪刀越锋利越好，可以使用解剖剪、眼科剪等；管口的大小应根据分离的对象的大小进行调整，分离目标越大，管口要相应增大；微型异养鞭毛虫一般在20μm以下，因此，所述毛细管管口内径小于50大于20μm，毛细管的整体长度在1～2cm左右，长度过长则操作时吸管容易折断或者造成操作不灵活；
(2)鞭毛虫样品的采集
用广口瓶、大口三角烧瓶野外采集异养鞭毛虫水样，采集后用纱布包裹瓶口，带回实验室进行加富培养；加富培养添加适量的培养基或有机物(如酵母提取物(yeastextract)或蛋白胨)，以增加水中的细菌和藻类等食物的浓度，水样在有利的条件下进行培养，最好在光照培养箱25℃中培养3～7天，保证异养鞭毛虫的密度迅速加富，并处于指数生长期，以便进行下一步分离、筛选操作；
(3)鞭毛虫单体的分离
一周后，取少量的加富培养后的水样滴加适量在玻片(优选有两个凹槽的玻片，便于添加水样)一侧；在显微镜(100×)下，从玻片的另一侧找到一片空白区域并在镜头下确认该区域的位置；用自制微量吸管从水样中吸取微量液体小心滴在镜头下既定区域(该步骤可不在视野中操作)；立即在显微镜视野中找到该液滴，反复调节焦距，直至确认液滴中的鞭毛虫数量；如果液滴中只有一个鞭毛虫，那么迅速将微量吸管靠近液滴，利用吸管的毛细作用重新吸回液滴，然后将液滴转移到预先准备好的菌液或者根据培养目的选择其他培养液中；如果液滴中有多个不同的鞭毛虫，则放弃该液滴，重复吸取液滴观察操作；
(4)鞭毛虫单体的纯化
将挑好的鞭毛虫个体放在20～25℃下培养，约3～4天后取样，在400和1000倍显微镜视野下观察，确认是否成功分离出纯种；如果分出的鞭毛虫不纯，可以进行第二次分离，直到分离到纯化种类为止，通常分离2～3次后能达到纯化的效果；
分离纯化确认是纯种培养后，可进行直接纯培养；也可以重复前述纯化步骤直到分离出单个细胞进行克隆培养。
经过反复实践上述分离纯化方法，发明人已从近岸海水中成功分离出多种异养鞭毛虫，包括一些接近3μm的个体，该法同样适用于分离微型异养甲藻和纤毛虫。如在厦门某大学分离出两株异养鞭毛虫(图1)；在厦门某研究所分离出两株绿藻(图2)；在广西北海某监测中心站实验室分离出2株异养甲藻(图2)，分别是原多甲藻和环沟藻。

Claims (4)

1.一种水中浮游生活微型异养鞭毛虫的分离纯化方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)自制微量吸管
将长嘴吸管的嘴部放在酒精灯上加热，待玻璃变红，迅速将吸管的末端受热位置均匀拉细成毛细管，即得微量吸管；
(2)鞭毛虫样品的采集
用广口瓶、大口三角烧瓶野外采集异养鞭毛虫水样，采集后用纱布包裹瓶口，带回实验室进行加富培养；
(3)鞭毛虫单体的分离
取少量的加富培养后的水样滴加适量在玻片一侧；在显微镜(100×)下，从玻片的另一侧找到一片空白区域并在镜头下确认该区域的位置；用自制微量吸管从水样中吸取微量液体小心滴在镜头下既定区域；立即在显微镜视野中找到该液滴，反复调节焦距，直至确认液滴中的鞭毛虫数量；如果液滴中只有一个鞭毛虫，那么迅速将微量吸管靠近液滴，利用吸管的毛细作用重新吸回液滴，然后将液滴转移到预先准备好的菌液中；如果液滴中有多个不同的鞭毛虫，则放弃该液滴，重复吸取液滴观察操作；
(4)鞭毛虫单体的纯化
将挑好的鞭毛虫个体放在20～25℃下培养，约3～4天后取样，在400倍和1000倍显微镜视野下观察，确认是否成功分离出纯种；如果分出的鞭毛虫不纯，可以进行第二次分离，直到分离到纯化种类为止。
2.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于步骤(1)中的毛细管管口内径小于50大于20μm，毛细管的整体长度在1～2cm左右。
3.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于步骤(2)中的加富培养添加酵母提取物或蛋白胨并在光照培养箱25℃中培养3～7天。
4.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于步骤(3)中的玻片有两个凹槽。
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