CN109912726A - 木蹄层孔菌多糖衍生物、制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种木蹄层孔菌多糖衍生物、制备方法及其应用，涉及菌类技术领域。本发明的木蹄层孔菌多糖衍生物，包括所述木蹄层孔菌多糖经过磷酸化修饰得到的磷酸化多糖、经过硫酸化修饰得到的硫酸化多糖以及经过硒化修饰的硒化多糖。本发明的木蹄层孔菌多糖衍生物的生活活性高于未修饰前的木蹄层孔菌多糖，具有较高的抗氧化活性，可用于制备化妆品、功能性食品及相关药物。

Description

木蹄层孔菌多糖衍生物、制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及菌类技术领域，尤其涉及一种木蹄层孔菌多糖衍生物、制备方法及其应用。

背景技术

真菌多糖是一类从真菌子实体、发酵液及菌丝体中分离提取出来的活性物质，它是一种由10个以上的单糖以糖苷键相连接而成的高分子聚合物。真菌多糖能够控制细胞生长分化，具有很强的抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、降糖降脂和提高免疫力等多种生物活性，在国际上被称为“生物反应调节(BRM)”，是现今医学药品行业与食品行业所共同关注的焦点。近20 年以来随着科学的进步与发展，各种新技术和新方法的应用，越来越多的真菌多糖被发掘出来并加以利用，用在开发各种保健食品和药品新资源中。真菌多糖某些生物活性具有抑制脂质过氧化活性、清除自由基化和提高抗氧化酶活性的作用，因此可以起到保护生物膜和延缓衰老的作用；真菌多糖是一种可以调节免疫系统的免疫调节剂，它不但可以激活免疫细胞和分泌细胞因子，并且还参与到宿主机体的非特异性免疫和特异性免疫中，从而使机体免疫功能得到提高和免疫系统得到调节；真菌多糖具有较显著的降低血压，血糖和血脂的功效，并且可以有效增强血管弹性，防止血栓生成，调节心血管系统，预防动脉硬化，降低血压和血脂，是“三高”人群的良好调节剂，疗效好毒副作用小；真菌多糖有抗肿瘤作用，是因为它对患者的免疫功能有增强和恢复的作用，并且真菌多糖的毒性小，抗肿瘤作用强，还具有非常强的生物活性，所以在医学抗肿瘤方面起到很大的作用；真菌多糖有抗细菌、抗病毒的作用，它主要是通过提高宿主免疫功能，激活和提高网状内皮细胞和巨噬细胞的吞噬能力，从而使真菌多糖起到直接抗细菌和抗病毒的作用；

木蹄层孔菌(拉丁学名：Fomes fomentarius(L.:Fr.)Kick.)是广泛分布于各地的一类腐生性真菌，其子实体多年生；木质，半球形至马蹄形，或呈吊钟形，厚约3-20cm，无柄，侧生，菌盖光滑，无毛，有坚硬的皮壳，鼠灰色、灰褐色至灰黑色，断面黑褐色，有光泽，有明显的同心环棱，盖缘钝，黄褐色，菌肉暗黄色至锈色、红褐色，分层，软木栓质，厚0.5-3.5cm，无光泽，。菌管多层，层次明显，每层厚0.5-2.5cm，管壁较厚，灰褐色；管口圆形，较小，每1mm间3-4个，管口面灰色至肉桂色，凹陷，孢子长椭圆形至棱形，表面平滑，无色， (10-18)μm×(5-6)μm。

大量研究表明多糖是木蹄层孔菌中的一种很重要的活性成分，多糖具有很多药理学作用，包括抗疲劳、抗炎、增强免疫及降血糖活性等；国内外学者对木蹄层孔菌的研究主要集中在其代谢产物对抗肿瘤活性方面，但对其生物活性机理的研究及如何进一步提高木蹄层孔菌多糖生物活性的公开报道较少。

发明内容

有鉴于此，本发明实施例提供了一种木蹄层孔菌多糖衍生物、制备方法及其应用，主要目的是提高木蹄层孔菌多糖的生物活性。

为达到上述目的，本发明主要提供了如下技术方案：

一方面，本发明实施例提供了一种木蹄层孔菌多糖衍生物，所述木蹄层孔菌多糖衍生物包括所述木蹄层孔菌多糖经过磷酸化修饰得到的磷酸化多糖、经过硫酸化修饰得到的硫酸化多糖以及经过硒化修饰的硒化多糖。

作为优选，所述磷酸化多糖的胞外磷酸基取代度为0.1-0.2，所述磷酸化多糖的子实体磷酸基取代度为0.05-0.18；所述硫酸化多糖的胞外硫酸基取代度为0.15-0.30，所述硫酸化多糖的子实体硫酸基取代度为0.15-0.20；所述硒化多糖的胞外硒取代度为0.02-0.06，所述硒化多糖的子实体硒取代度为0.02-0.05。

作为优选，所述磷酸化多糖的羟基自由基的清除率为59.5％；所述硫酸化多糖的羟基自由基的清除率为53.6％；所述硒化多糖的羟基自由基的清除率为46.0％。

作为优选，所述磷酸化多糖的超氧根阴离子的清除率为68.8％；所述硫酸化多糖的超氧根阴离子的清除率为57.5％；所述硒化多糖的超氧根阴离子的清除率为50.5％。

作为优选，所述磷酸化多糖的脂质过氧化的抑制率为43.5％；所述硫酸化多糖的脂质过氧化的抑制率为53.6％；所述硒化多糖的脂质过氧化的抑制率为33.6％。

作为优选，所述磷酸化多糖的DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)的清除率为52.3％；所述硫酸化多糖的DPPH的清除率为66.4％；所述硒化多糖的DPPH的清除率为58.5％。

作为优选，所述磷酸化多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制率为49.9％；所述硫酸化多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制率为64.8％；所述硒化多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制率为55.5％。

另一方面，本发明实施例提供了上述木蹄层孔菌多糖衍生物的制备方法，所述方法包括以下步骤：

磷酸化多糖：将提取的木蹄层孔菌多糖、三聚磷酸钠、三偏磷酸钠、硫酸钠和双氧水混合后置于75℃-85℃的恒温水浴中，再加入乙醇，静置、离心、收取沉淀、用蒸馏水溶解和透析沉淀、过滤、冷冻干燥后得到所述磷酸化多糖；

硫酸化多糖：将吡啶溶解于三氧化硫-吡啶复合物中并加热至85℃-95℃时，加入提取的木蹄层孔菌多糖并恒温搅拌，调pH为中性，加乙醇，离心、收集沉淀、用蒸馏水溶解和透析沉淀、浓缩冻干后得到所述硫酸化多糖；

硒化多糖：将提取的木蹄层孔菌多糖加入硝酸溶液中并搅拌溶解，再加入氯化钡和亚硒酸钠，55℃-65℃恒温搅拌，调pH值至7-8，加入硫酸钠，离心去除沉淀，收取上清液并经透析袋蒸馏透析，采用抗坏血酸法除去溶液中亚硒酸钠后浓缩冻干，获得所述硒化多糖。

作为优选，所述磷酸化多糖的制备过程中，所述三聚磷酸钠、所述三偏磷酸钠和所述木蹄层孔菌多糖的质量比为8:1:1；

所述吡啶、所述三氧化硫-吡啶复合物和所述木蹄层孔菌多糖的添加比例为60mL:5g:1g；

所述硒化多糖的制备过程中，所述木蹄层孔菌多糖和所述亚硒酸钠的质量比为1:1；

所述木蹄层孔菌多糖是从所述木蹄层孔菌的胞外和子实体中分别提取的多糖的混合物，并经过纯化后得到的木蹄层孔菌多糖纯品。

又一方面，本发明实施例提供了上述木蹄层孔菌多糖衍生物在制备化妆品、功能性食品及药物中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明对木蹄层孔菌多糖进行了硫酸化、磷酸化和硒化修饰，并研究了上述多糖衍生物的结构特点，分别将修饰前后的产物进行体外抗氧化比较，发现通过本发明的上述化学修饰后提高了蹄层孔菌多糖的生物活性，为研究多糖类功能性食品、药物的开发提供一定的理论基础。

附图说明

图1是本发明实施例提供的木蹄层孔菌多糖衍生物的磷酸基标准曲线图；

图2是本发明实施例提供的木蹄层孔菌多糖衍生物的硫酸基标准曲线图；

图3是本发明实施例提供的木蹄层孔菌多糖衍生物的硒化标准曲线图；

图4是本发明实施例提供的木蹄层孔菌多糖衍生物对羟基自由基的清除率曲线图；

图5是本发明实施例提供的木蹄层孔菌多糖衍生物对超氧根阴离子的清除率曲线图；

图6是本发明实施例提供的木蹄层孔菌多糖衍生物对脂质过氧化的抑制率曲线图；

图7是本发明实施例提供的木蹄层孔菌多糖衍生物对DPPH自由基的清除率曲线图；

图8是本发明实施例提供的木蹄层孔菌多糖衍生物对α-葡萄糖苷酶的抑制率曲线图；

图9是本发明实施例提供的木蹄层孔菌多糖衍生物还原力曲线图。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效,以下以较佳实施例，对依据本发明申请的具体实施方式、技术方案、特征及其功效，详细说明如后。下述说明中的多个实施例中的特定特征、结构、或特点可由任何合适形式组合。

实施例1(制备多糖衍生物)

材料：木蹄层孔菌菌株是由本发明人分离并保存于北方民族大学生物科学与工程学院微生物资源实验室，备用；本实施例1使用的木蹄层孔菌子实体购于吉林省长白山；

(本实施例1使用的木蹄层孔菌菌株可从现有渠道获取，例如从国家认可的微生物保藏机构获取，或从涉及木蹄层孔菌菌株研究机构获取，其菌株均可用于本发明的制备方法中获得本发明的最终产品；或者本申请人也可承诺在专利保护20年内向公众公开本实验室保存的木蹄层孔菌菌株)

实验试剂见表1；

表1.实验材料及药品

实验仪器及设备见表2；

表2.实验仪器及设备

实验方法：提取木蹄层孔菌胞外、子实体多糖：在木蹄层孔菌(F.fomentarius)母种木粉培养基上取一块约0.5cm²大小的菌块置于PDA平板培养皿上，28℃培养7天，得到活化的菌种。用打孔器将活化的菌种打成直径为5-8mm的菌块，然后接种活化后的活化菌种15块到装有50ml液体种子培养基的100ml锥形瓶中，摇床培养，转速150rpm，25℃振荡培养 7天，得到种子培养液；再将种子液接种到装有100ml液体种子培养基的250ml锥形瓶中，接种量20.0％，培养条件同上；最后将发酵液进行过滤、浓缩、醇沉、脱蛋白、脱色、透析和冻干，即得木蹄层孔菌粗多糖；将木蹄层孔菌子实体进行粉碎成粉末，采用热水浸提法提取木蹄层孔菌子实体粗多糖。

分离、纯化：将脱蛋白后冷冻干燥的粗多糖样品溶解后，利用葡聚糖凝胶G-100离子交换柱用超纯水进行洗脱；收集洗脱液，以苯酚-硫酸法跟踪检测每管洗脱液，并收集高峰液，减压浓缩，冷冻干燥获得纯品。

多糖的磷酸化修饰：将8.57g三聚磷酸钠与1.43g三偏磷酸钠混匀后和5.0g的硫酸钠溶解于100mL双蒸水，之后加入1.0g多糖，用NaHCO3调pH至9.0，80℃恒温水浴5.0h后，加入5倍体积95％C₂H₅OH，室温静置24h，离心，收集沉淀，用蒸馏水溶解沉淀，用蒸馏水透析(截留分子量为13,000Da，下同)2d，过滤，冷冻干燥得到磷酸化多糖。

多糖的硫酸化修饰：在三颈瓶中加入90mL吡啶缓慢溶解7.5g三氧化硫-吡啶复合物，并在三颈瓶上方附冷凝管和温度计，用电磁加热搅拌器搅拌。当加热至90℃时加入1.5g多糖，恒温搅拌1h后，停止加热，冷却至室温。用3mol/LNaOH溶液将反应液调至中性后，加入5倍体积95％乙醇，室温静置24h，离心，收集沉淀，用蒸馏水溶解沉淀。用蒸馏水透析进行2d，浓缩冻干获得硫酸化多糖。

多糖的硒化修饰：采用HNO₃-Na₂SeO₃方法制备硒化多糖，100mg多糖加入到20mL的5％HNO3溶液，搅拌至完全溶解，加入0.1g BaCl₂，100mgNa₂SeO₃(多糖和Na2SeO3质量比为1:1)，恒温60℃搅拌反应5h。反应结束后，冷却至室温，用饱和碳酸钠溶液调至pH＝7～8，加入适量的硫酸钠，除去Ba2+，并离心除去沉淀[16]。上清液采用14000Da透析袋蒸馏透析，采用抗坏血酸法，每间隔6h检测Na₂SeO₃，直至不含Na₂SeO₃,浓缩冻干，获得硒化多糖。

实施例2(检测实施例1制备的多糖的磷酸基取代度)

Tris缓冲溶液：称取六水合氯化镁120mg、三羟甲基氨基甲烷(Tris)3.6g溶解于300mL 蒸馏水中，用1mol/LHCl调至pH＝7，即得；

定磷试剂：分别取相同体积的20％维生素C(VC)水溶液、3mol/L硫酸溶液和3％钼酸铵水溶液，混合均匀即得；

准确称取1.0000gKH₂PO₄溶于100.00mL水中，将上述溶液稀释100倍，可以得到0.1mg/mL的磷酸基标准液；

准确吸取上述磷酸基标准液0、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00、4.50、 5.00mL，分别移入比色管中，蒸馏水补充至5.00mL，加入Tris缓冲溶液3mL，摇匀后加入定磷试剂3mL，45℃恒温水浴30min，之后在660nm处测定吸光值，以磷酸根浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制磷酸基标准曲线，如图1所示；

采用钼蓝比色法来磷酸基测定：取样品0.1g于烧杯中，加入浓硫酸1mL和浓硝酸1mL，加热至冒烟，冷却后加入30％H₂O₂溶液1mL，再缓慢加热，重复以上步骤直至烧杯内不再冒烟，溶液呈无色透明或淡黄色，冷却，加入6mol/LHCl1mL并加热使酸彻底分解，转移并定容至50mL^[19]。取5mL(含0.01g多糖)上述溶液，按照上述标准曲线操作方法测定其吸光度，根据标准曲线回归方程计算磷酸基含量；

多糖磷酸基含量C可表示为M_Sub·DS/[162–DS+M_Sub]，所以硫酸取代度计算公式为：

DS＝[162·C﹢M_Sub·C]/[M_Sub﹢C] (2.1)

其中，162：一个单糖残基的相对分子质量；

M_Sub：＝M(-PO₃H)＝80；

由图1可知标准曲线方程为：y＝32.42727x-0.03873,R²＝0.9969；根据上述公式计算出多糖的磷酸基取代度：胞外多糖磷酸基取代度为0.155，子实体多糖磷酸基取代度为0.110。

实施例3(检测实施例1制备的多糖的硫酸基取代度)

精确称取108.75mg105℃干燥至恒重的K₂SO₄，用1mol/L的HCl溶解，定容至100mL容量瓶中，摇匀即得0.6mg/mL硫酸根标准贮备液；

准确吸取硫酸根标准贮备液0.04、0.08、0.12、0.16、0.20mL，均用1mol/LHCl溶液补至0.20mL，同时用1mol/LHCl溶液0.20mL作为空白，加入3％三氯乙酸3.8mL和氯化钡- 明胶溶液(用0.5％明胶溶液配制BaCl₂含量为1％的溶液)1.0mL，摇匀，室温静置15min 后，在360nm测定其吸光度A₁，以1.0mL0.5％明胶溶液代替氯化钡-明胶溶液重复上述操作，测定其吸光度A₂，以硫酸根毫浓度为横坐标，吸光度差值(A₁–A₂)为纵坐标，绘制标准曲线，如图2所示；

硫酸基含量测定(氯化钡-明胶法)：将3mg硫酸化多糖溶于3mL1mol/L HCl溶液，100℃沸水浴1h后吸取0.2mL，按标准曲线的制作方法，测定A1和A2，根据标准曲线回归方程计算硫酸基含量。

多糖硫酸基含量C可表示为M_Sub·DS/[162–DS+M_Sub]，所以硫酸取代度计算公式为：

DS＝[162·C﹢M_Sub·C]/[M_Sub﹢C] (2.2)

其中，162：一个单糖残基的相对分子质量；

M_Sub：＝M(-SO₃H)＝81。

由图2可知标准曲线方程为：y＝3.81x+0.0358,R²＝0.9990；根据上述公式计算出多糖的硫酸基取代度：胞外多糖硫酸基取代度为0.299，子实体多糖硫酸基取代度为0.201。

实施例4(检测实施例1制备的多糖的硒化取代度)

采用原子荧光光谱法应用原子荧光光度计测定硒化多糖中硒含量；

取代度计算公式为DS＝(162+M)·C/(M+C)

其中，162：一个单糖残基的相对分子质量；

M_Sub：＝M(-SeO₂H)＝112；C：取代基含量。

由图3可知标准曲线方程为：y＝170.4x-66,R²＝0.9991；根据上述公式计算出多糖的硒化取代度：胞外硒化多糖取代度为0.04，子实体硒化多糖取代度为0.03。

实施例5(检测实施例1制备的多糖的羟基自由基的清除活性)

吸取不同浓度(0.2、0.4、0.8、1.6、2.0、2.5mg/mL)多糖溶液1mL与0.75mmol/L 1,10- 邻二氮杂菲1.0mL，0.2mol/L磷酸盐缓冲剂(pH＝7.4)2mL以及现配的0.75mmol/LFeSO₄1mL 混和均匀，向混合物中加入0.01％H₂O₂(v/v)1mL，在37℃水浴下启动反应，反应60min；最后，在510nm处测定其吸光值并根据下述公式计算多糖的清除羟基自由基能力；同时，以维生素C作为阳性对照组。

计算公式：清除率(％)＝[(A₁-A₀)/(A₁′-A₀)]×100％

其中，A₀是空白对照组(以蒸馏水代替多糖或维生素C)后的吸光值；A₁′是以蒸馏水代替H₂O₂和样品(多糖或维生素C)后的吸光值。

以维生素C(Vc)为阳性对照，对多糖(FFEP)、磷酸化多糖(PFFEP)、硫酸化多糖(SFFEP) 和硒化多糖(SeFFEP)进行羟基自由基的清除实验，结果如图4所示，由图4可知，FFEP、 PFFEP、SFFEP和SeFFEP对羟基自由基的清除作用逐渐增强。当浓度小于0.2mg/mL时，FFEP、PFFEP、SFFEP和SeFFEP的差别较小；当浓度大于0.5mg/mL时，PFFEP、SFFEP 和SeFFEP对羟基自由基的清除率大于FFEP，并且差别逐渐增大。但是，FFEP、PFFEP、 SFFEP和SeFFEP对羟基自由基的清除率均小于对照组Vc。

实施例6(检测实施例1制备的多糖的O^2ˉ·的清除活性)

在弱碱性条件下，连苯三酚可以自氧化产生的超氧阴离子；在每支试管中加入50mmol/L Tirs-HCl(pH＝8.2)缓冲液3mL及不同浓度(50、100、150、200、250和300mg/L)的多糖1 mL，混合均匀后，25℃放置20min，然后加入25℃下预热的7mmol/L邻苯三酚0.3mL，准确反应4min后，加入10mmol/L HCl1mL终止反应，在318nm处测吸光度值A₁；以水代替反应试剂的吸光度值A₁′，以水代替样品溶液的吸光度值A₀。同时，以维生素C作为阳性对照组。

计算公式：O₂ˉ·清除率(％)＝[1-(A₁-A₁′)/A0]×100％；

其中，A₁是实验组(加多糖溶液)后的吸光值，A₁′是以水代替反应试剂后的吸光值，A₀是空白组(以水代替多糖溶液)后的吸光值。

以Vc为阳性对照，对FFEP、PFFEP、SFFEP和SeFFEP进行O₂ˉ·的清除实验，结果如图5所示。由图5可知，FFEP、PFFEP、SFFEP和SeFFEP对O₂ˉ·清除作用逐渐增强。当浓度小于0.2mg/mL时，FFEP、PFFEP、SFFEP和SeFFEP的差别较小；当浓度大于0.2mg/mL 时，PFFEP、SFFEP和SeFFEP对O₂ˉ·的清除率大于FFEP，并且差别逐渐增大。但是，FFEP、 PFFEP、SFFEP和SeFFEP对O₂ˉ·的清除率均小于对照组Vc。

实施例7(检测实施例1制备的多糖的脂质过氧化的抑制作用)

采用硫代巴比妥酸方法测定多糖对脂质过氧化的抑制作用。将4mg/mL卵磷脂悬液10.0mL与不同浓度(0.2、0.4、0.8、1.6、2.0、2.5mg/mL)多糖溶液1mL，现配的 10mmol/LFeSO₄0.4mL以及PBS1mL混匀后，于37℃孵育1h。滴加10％三氯乙酸(v/v)1mL 和0.4％硫代巴比妥酸1mL终止反应，并于100℃水浴15min后，冷却、离心^[23]。吸取上层清液于532nm处测定吸光值。以二叔丁基对甲酚(BHT)作为阳性对照组；

计算公式：脂质过氧化的抑制率(％)＝[1-A₁/A₀]×100％

其中，A₁是实验组(加多糖溶液)后的吸光值，A₀是空白组(以水代替多糖溶液)后的吸光值；

以BHT为阳性对照，对FFEP、PFFEP、SFFEP和SeFFEP进行脂质过氧化的抑制实验，结果如图6所示；由图6可知，FFEP、PFFEP、SFFEP和SeFFEP对脂质过氧化的抑制作用逐渐增强。当浓度小于0.2mg/mL时，FFEP、PFFEP、SFFEP和SeFFEP的差别较小；当浓度大于0.2mg/mL时，PFFEP、SFFEP和SeFFEP对脂质过氧化的抑制率大于FFEP，并且差别逐渐增大。但是，FFEP、PFFEP、SFFEP和SeFFEP对脂质过氧化的抑制率均小于对照组 BHT。

实施例8(检测实施例1制备的多糖的DPPH·自由基的清除活性)

配制0.1mmol/L的DPPH·无水乙醇溶液，取DPPH·溶液1mL，与不同浓度(50、100、150、200、250和300mg/L)的多糖溶液3mL混匀，避光放置30min后,在517nm处测定吸光度A₁。同时，测定无水乙醇溶液的吸光度A₀，作为空白对照。同时，以维生素C作为阳性对照组；

计算公式：DPPH·清除率(％)＝[(A₀-A₁)/A₀]×100％；

其中，A₁是实验组(加多糖溶液)后的吸光值，A₀是空白组(以无水乙醇代替多糖溶液)后的吸光值。

以Vc为阳性对照，对FFEP、PFFEP、SFFEP和SeFFEP进行DPPH·自由基的清除实验，结果如图7所示。由图7可知，FFEP、PFFEP、SFFEP和SeFFEP对DPPH·自由基的清除作用逐渐增强。当浓度小于0.5mg/mL时，FFEP、PFFEP、SFFEP和SeFFEP的差别较小；当浓度大于0.5mg/mL时，PFFEP、SFFEP和SeFFEP对DPPH·自由基的清除率大于FFEP，并且差别逐渐增大；但是，FFEP、PFFEP、SFFEP和SeFFEP对DPPH·自由基的清除率均小于对照组Vc。

实施例9(检测实施例1制备的多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用)

取不同浓度(5、10、15、20、25、30、35mg/mL)的多糖溶液100μL与1mg/mL的谷胱甘肽50μL和20mg/mLα-葡萄糖苷酶3.5μL混匀，37℃预热15min。加入0.116mol/L对硝基苯-α-d-吡喃葡萄糖苷(pNPG)50μL，将反应溶液37℃孵育30min，最后，加入1mol/LNa₂CO₃溶液2mL终止反应，并检测405nm处吸光值^[25]。阿卡波糖代替多糖溶液作为阳性对照组；

计算公式：抑制率(％)＝[1-(A₁-A₁′)/A₀]×100％；

其中，A₁是实验组(加入多糖溶液或者阿卡波糖溶液和pNPG)后的吸光值；A₁′是对照组(加入多糖溶液或者阿卡波糖溶液，不加pNPG)后的吸光值；A₀是空白对照组(不加多糖溶液或者阿卡波糖溶液)后的吸光值。

以阿卡波糖(Acarbose)为阳性对照，对FFEP、PFFEP、SFFEP和SeFFEP进行对α- 葡萄糖苷酶的抑制作用实验，结果如图8所示；由图8可知，FFEP、PFFEP、SFFEP和SeFFEP 对α-葡糖糖苷酶的抑制作用逐渐增强。当浓度小于0.5mg/mL时，FFEP、PFFEP、SFFEP和 SeFFEP的差别较小；当浓度大于0.5mg/mL时，PFFEP、SFFEP和SeFFEP对对α-葡萄糖苷酶的抑制作用率大于FFEP，并且差别逐渐增大。但是，FFEP、PFFEP、SFFEP和SeFFEP 对α-葡萄糖苷酶的抑制作用率均小于对照组Acarbose。

实施例10(检测实施例1制备的多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用)

取不同浓度(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL)的多糖溶液1mL与1％的K₃[Fe(CN)₆]0.5 mL和0.2mol/L的PBS(pH＝6.6)0.2mL置于试管中，混匀，50℃水浴20min，冷却至室温，然后加入10％的三氯乙酸1mL，最后，3000r/min离心10min，取上清液1.5mL，加入蒸馏水3mL和1％FeCl₃溶液0.2mL摇匀，放置5min，以蒸馏水作为空白对照调零，在700nm处测定吸光度(A₇₀₀)。吸光度越大，表示待测物的还原能力越强。相同浓度的Vc作为阳性对照。以多糖浓度为横坐标，A₇₀₀值为纵坐标，绘出其还原力曲线。

以Vc为阳性对照，对FFEP、PFFEP、SFFEP和SeFFEP进行还原力测定的实验，结果如图9所示；由图9可知，FFEP、PFFEP、SFFEP和SeFFEP的还原力作用逐渐增强。当浓度小于2.0mg/mL时，FFEP、PFFEP、SFFEP和SeFFEP的差别较小；当浓度大于2.0mg/mL 时，PFFEP、SFFEP和SeFFEP的还原力大于FFEP，并且差别逐渐增大。但是，FFEP、PFFEP、 SFFEP和SeFFEP的还原力均小于对照组Vc。

通过上述实施例1-实施例9可知：

(1)将木蹄层孔菌多糖进行磷酸化修饰、硫酸修饰和硒化修饰得到磷酸化多糖、硫酸化多糖和硒化多糖；

(2)磷酸基标准曲线方程为：y＝32.42727x-0.03873,R²＝0.9969；胞外磷酸化多糖 DS＝0.155，子实体磷酸化多糖DS＝0.110；

(3)硫酸基标准曲线方程为：y＝3.81x+0.0358,R²＝0.9990；胞外硫酸化多糖DS＝0.299，子实体硫酸化多糖DS＝0.201；

(4)硒化标准曲线方程为：y＝170.4x-66,R²＝0.9991；胞外硒化多糖DS＝0.04，子实体硒化多糖DS＝0.03；

(5)对多糖、磷酸化多糖、硫酸化多糖和硒化多糖进行体外抗氧化活性测定，可知多糖、磷酸化多糖、硫酸化多糖和硒化多糖对羟基自由基、O₂ˉ·、DPPH·都有清除活性；对脂质过氧化和α-葡萄糖苷酶有抑制作用；多糖、磷酸化多糖、硫酸化多糖和硒化多糖的还原力随着浓度的增大而增大。

在评价抗氧化能力的方法中,对羟基自由基、O₂ˉ·、DPPH·自由基清除能力、脂质过氧化抑制作用和α-葡萄糖苷酶的抑制作用为判定木蹄层孔菌多糖是否具有抗氧化能力的重要指标。本发明对木蹄层孔菌多糖进行上述化学修饰后，大大提高了多糖的生物活性，为多糖应用于化妆品、功能性食品和药物的开发提供了一定的理论基础。

本发明实施例中未尽之处，本领域技术人员均可从现有技术中选用。

以上公开的仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以上述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.木蹄层孔菌多糖衍生物，其特征在于，所述木蹄层孔菌多糖衍生物包括木蹄层孔菌多糖经过磷酸化修饰得到的磷酸化多糖、经过硫酸化修饰得到的硫酸化多糖以及经过硒化修饰的硒化多糖。

2.如权利要求1所述的木蹄层孔菌多糖衍生物，其特征在于，所述磷酸化多糖的胞外磷酸基取代度为0.1-0.2，所述磷酸化多糖的子实体磷酸基取代度为0.05-0.18；所述硫酸化多糖的胞外硫酸基取代度为0.15-0.30，所述硫酸化多糖的子实体硫酸基取代度为0.15-0.20；所述硒化多糖的胞外硒取代度为0.02-0.06，所述硒化多糖的子实体硒取代度为0.02-0.05。

3.如权利要求1所述的木蹄层孔菌多糖衍生物，其特征在于，所述磷酸化多糖的羟基自由基的清除率为59.5％；所述硫酸化多糖的羟基自由基的清除率为53.6％；所述硒化多糖的羟基自由基的清除率为46.0％。

4.如权利要求1所述的木蹄层孔菌多糖衍生物，其特征在于，所述磷酸化多糖的超氧根阴离子的清除率为68.8％；所述硫酸化多糖的超氧根阴离子的清除率为57.5％；所述硒化多糖的超氧根阴离子的清除率为50.5％。

5.如权利要求1所述的木蹄层孔菌多糖衍生物，其特征在于，所述磷酸化多糖的脂质过氧化的抑制率为43.5％；所述硫酸化多糖的脂质过氧化的抑制率为53.6％；所述硒化多糖的脂质过氧化的抑制率为33.6％。

6.如权利要求1所述的木蹄层孔菌多糖衍生物，其特征在于，所述磷酸化多糖的DPPH的清除率为52.3％；所述硫酸化多糖的DPPH的清除率为66.4％；所述硒化多糖的DPPH的清除率为58.5％。

7.如权利要求1所述的木蹄层孔菌多糖衍生物，其特征在于，所述磷酸化多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制率为49.9％；所述硫酸化多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制率为64.8％；所述硒化多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制率为55.5％。

8.权利要求1-7任一项所述的木蹄层孔菌多糖衍生物的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

磷酸化多糖：将提取的木蹄层孔菌多糖、三聚磷酸钠、三偏磷酸钠、硫酸钠和双氧水混合后置于75℃-85℃的恒温水浴中，再加入乙醇，静置、离心、收取沉淀、用蒸馏水溶解和透析沉淀、过滤、冷冻干燥后得到所述磷酸化多糖；

硫酸化多糖：将吡啶溶解于三氧化硫-吡啶复合物中并加热至85℃-95℃时，加入提取的木蹄层孔菌多糖并恒温搅拌，调pH为中性，加乙醇，离心、收集沉淀、用蒸馏水溶解和透析沉淀、浓缩冻干后得到所述硫酸化多糖；

硒化多糖：将提取的木蹄层孔菌多糖加入硝酸溶液中并搅拌溶解，再加入氯化钡和亚硒酸钠，55℃-65℃恒温搅拌，调pH值至7-8，加入硫酸钠，离心去除沉淀，收取上清液并经透析袋蒸馏透析，采用抗坏血酸法除去溶液中亚硒酸钠后浓缩冻干，获得所述硒化多糖。

9.如权利要求8所述的木蹄层孔菌多糖衍生物的制备方法，其特征在于，所述磷酸化多糖的制备过程中，所述三聚磷酸钠、所述三偏磷酸钠和所述木蹄层孔菌多糖的质量比为8:1:1；

所述硫酸化多糖的制备过程中，所述吡啶、所述三氧化硫-吡啶复合物和所述木蹄层孔菌多糖的添加比例为60mL:5g:1g；

所述硒化多糖的制备过程中，所述木蹄层孔菌多糖和所述亚硒酸钠的质量比为1:1；

所述木蹄层孔菌多糖是从所述木蹄层孔菌的胞外和子实体中分别提取的多糖的混合物，并经过纯化后得到的木蹄层孔菌多糖纯品。

10.权利要求1-9任一项所述的木蹄层孔菌多糖衍生物在制备化妆品、功能性食品及药物中的应用。