CN102533650A - 一种细胞分离介质及细胞分离方法 - Google Patents
一种细胞分离介质及细胞分离方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102533650A CN102533650A CN2011104568782A CN201110456878A CN102533650A CN 102533650 A CN102533650 A CN 102533650A CN 2011104568782 A CN2011104568782 A CN 2011104568782A CN 201110456878 A CN201110456878 A CN 201110456878A CN 102533650 A CN102533650 A CN 102533650A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- separating medium
- lymphocyte
- hydroxyethylamyle
- cell
- medium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000926 separation method Methods 0.000 title claims abstract description 26
- 238000003320 cell separation method Methods 0.000 title 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 109
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 32
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 11
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 claims abstract description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 118
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 65
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 41
- ZEYOIOAKZLALAP-UHFFFAOYSA-M sodium amidotrizoate Chemical compound [Na+].CC(=O)NC1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C([O-])=O)=C1I ZEYOIOAKZLALAP-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 25
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 claims description 23
- FZWBNHMXJMCXLU-UHFFFAOYSA-N 2,3,4,5-tetrahydroxy-6-[3,4,5-trihydroxy-6-[[3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxymethyl]oxan-2-yl]oxyhexanal Chemical group OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 229940119743 dextran 70 Drugs 0.000 claims description 12
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 claims description 12
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 claims description 10
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 9
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 claims description 8
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 6
- 238000012856 packing Methods 0.000 claims description 6
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 claims description 6
- 230000002785 anti-thrombosis Effects 0.000 claims description 5
- 229960004676 antithrombotic agent Drugs 0.000 claims description 5
- 229940119744 dextran 40 Drugs 0.000 claims description 5
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 claims description 5
- MIKKOBKEXMRYFQ-WZTVWXICSA-N meglumine amidotrizoate Chemical compound C[NH2+]C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO.CC(=O)NC1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C([O-])=O)=C1I MIKKOBKEXMRYFQ-WZTVWXICSA-N 0.000 claims description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 239000003855 balanced salt solution Substances 0.000 claims description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 21
- 238000011084 recovery Methods 0.000 abstract description 14
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 11
- 239000002994 raw material Substances 0.000 abstract description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 abstract description 3
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 abstract 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 abstract 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 abstract 1
- 238000007430 reference method Methods 0.000 description 44
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 30
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 23
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 23
- 239000000047 product Substances 0.000 description 22
- 239000012997 ficoll-paque Substances 0.000 description 20
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 17
- 239000000463 material Substances 0.000 description 17
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 15
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 13
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 13
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 13
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 12
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 10
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 description 9
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 9
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 9
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 8
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 8
- 231100000284 endotoxic Toxicity 0.000 description 7
- 230000002346 endotoxic effect Effects 0.000 description 7
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 7
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 7
- 239000008227 sterile water for injection Substances 0.000 description 7
- 238000012549 training Methods 0.000 description 7
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 5
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 5
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 5
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 210000004405 cytokine-induced killer cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 230000000527 lymphocytic effect Effects 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 229920006158 high molecular weight polymer Polymers 0.000 description 3
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 2
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 2
- 206010021137 Hypovolaemia Diseases 0.000 description 2
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 2
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- GGGDNPWHMNJRFN-UHFFFAOYSA-N metrizoic acid Chemical compound CC(=O)N(C)C1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C(O)=O)=C1I GGGDNPWHMNJRFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 2
- WXMKPNITSTVMEF-UHFFFAOYSA-M sodium benzoate Chemical class [Na+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 WXMKPNITSTVMEF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 235000010234 sodium benzoate Nutrition 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 2
- LRWZZZWJMFNZIK-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-3-methyloxirane Chemical compound CC1OC1Cl LRWZZZWJMFNZIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- 101100515516 Arabidopsis thaliana XI-H gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- UGVYFAXWTHLNHM-UHFFFAOYSA-N CC(=O)NC1=C(C=CC(=C1O)[As](=O)(O)O)I Chemical compound CC(=O)NC1=C(C=CC(=C1O)[As](=O)(O)O)I UGVYFAXWTHLNHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- 206010019233 Headaches Diseases 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010021138 Hypovolaemic shock Diseases 0.000 description 1
- 241000239218 Limulus Species 0.000 description 1
- 206010053159 Organ failure Diseases 0.000 description 1
- 241000194019 Streptococcus mutans Species 0.000 description 1
- 208000010513 Stupor Diseases 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 1
- DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N [Na].[Cl] Chemical compound [Na].[Cl] DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RXDLGFMMQFNVLI-UHFFFAOYSA-N [Na].[Na].[Ca] Chemical compound [Na].[Na].[Ca] RXDLGFMMQFNVLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000009056 active transport Effects 0.000 description 1
- 238000011047 acute toxicity test Methods 0.000 description 1
- 230000000274 adsorptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 1
- 238000002583 angiography Methods 0.000 description 1
- 230000000118 anti-neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010960 commercial process Methods 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 230000009514 concussion Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000002872 contrast media Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 229960005423 diatrizoate Drugs 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 230000001435 haemodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000869 headache Toxicity 0.000 description 1
- 210000003677 hemocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940000351 hemocyte Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- -1 hydroxyethyl groups Chemical group 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 230000000873 masking effect Effects 0.000 description 1
- 231100000647 material safety data sheet Toxicity 0.000 description 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 1
- 230000004089 microcirculation Effects 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 210000000865 mononuclear phagocyte system Anatomy 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000000419 plant extract Substances 0.000 description 1
- 239000003058 plasma substitute Substances 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000012852 risk material Substances 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 206010040560 shock Diseases 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 1
- 125000005630 sialyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000004299 sodium benzoate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- YEENEYXBHNNNGV-XEHWZWQGSA-M sodium;3-acetamido-5-[acetyl(methyl)amino]-2,4,6-triiodobenzoate;(2r,3r,4s,5s,6r)-2-[(2r,3s,4s,5r)-3,4-dihydroxy-2,5-bis(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound [Na+].CC(=O)N(C)C1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C([O-])=O)=C1I.O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 YEENEYXBHNNNGV-XEHWZWQGSA-M 0.000 description 1
- PVGBHEUCHKGFQP-UHFFFAOYSA-N sodium;n-[5-amino-2-(4-aminophenyl)sulfonylphenyl]sulfonylacetamide Chemical compound [Na+].CC(=O)NS(=O)(=O)C1=CC(N)=CC=C1S(=O)(=O)C1=CC=C(N)C=C1 PVGBHEUCHKGFQP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000009168 stem cell therapy Methods 0.000 description 1
- 238000009580 stem-cell therapy Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 231100000456 subacute toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 229960001814 trypan blue Drugs 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种用于单个核细胞分离的组合物及复方淋巴细胞分离介质。本发明所述复方淋巴细胞分离介质配方中的全部原料均符合静注级原料药标准,原料安全性高,回收的淋巴细胞纯度及淋巴细胞回收率与常规分离介质对照组无显著性差异;经分离得到的淋巴细胞,在增殖、形态学、表面标记物及杀瘤活性测试四项指标中均与对照组有相当的效果,具有良好的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,特别涉及一种复方细胞分离介质及细胞分离方法。
背景技术
细胞治疗技术如免疫细胞治疗、干细胞治疗极大的推动了现代医学技术的发展。在细胞治疗过程中,目标细胞的采集与分离是的一个重要步骤。高纯度目标细胞的获取是得到优良质量的细胞终产品即效应细胞的前提。在细胞治疗过程中,除了需要用到治疗用的效应细胞外,还有一类为获取效应细胞而用到的辅助产品即细胞治疗辅料,用于效应细胞的分离、生长、存储、运输及输注等诸多环节,由于不在细胞治疗的终产品中出现,其重要性通常被忽略。
密度梯度离心法(Density Gradient Centrifugation)作为一种传统的分离技术,用于细胞分离已经存在了半个世纪。基于密度梯度离心法的细胞分离介质产品即细胞治疗辅料,例如GE公司的Ficoll-PaquePLUS,已成为利用密度梯度离心法进行细胞分离的常规介质,特别是用于淋巴细胞的分离,其说明书推荐的相应操作步骤也已成为本领域技术人员公知的操作步骤。一般步骤包括:在离心管中加入一定体积的淋巴细胞分离介质,待分离的血液样品平铺于分离介质上,接着对其在恒定温度下进行低速离心。样品中各细胞群将由于密度差异分布在离心管的不同部位,例如,如果分离介质具有与目标细胞群相同的密度,目标细胞将富集在分离介质层与样本层的交界面,用吸管将该层细胞吸出就达到了对目标细胞群的分离。由于Ficoll-Paque PLUS本身并不在终产物中出现,其属于一种典型的细胞治疗辅料。
淋巴细胞作为一种效应细胞,广泛存在于人外周血液、骨髓或人脐带血中。高纯度的淋巴细胞的获取对于疾病的细胞学诊断、成分输血、治疗用细胞产品的制备等具有非常重要的意义。淋巴细胞分离介质是具有恒定密度、渗透压及pH值的混合体系。国际上传统的分离介质包括GE Healthcare公司的产品Ficoll-PaqueTM PLUS、Ficoll-PaqueTM PREMIUM;Axis-Shield公司的产品LymphoprepTM;Sigma公司的产品Histopaque以及Mediatech公司的产品Lymphocyte Separation Medium(LSM)等。上述商品化的淋巴细胞分离介质以Ficoll 400(聚蔗糖400)和泛影酸钠为主要成分,密度在1.073g/cm3和1.084g/cm3之间,渗透压在280mOsmol/kg和310mOsmol/kg之间,pH在6和9之间。为了提高产品的技术标准以适应细胞治疗特殊行业要求,GE Healthcare公司在2005年推出的产品Ficoll-PaqueTMPREMIUM不仅依据ISO13485:2003将生产在受到严格控制的环境中进行,更是根据欧洲GMP附件1中“无菌医药产品的制造”和美国药典USP<1043>关于细胞治疗辅料的建议,将内毒素控制在了0.12EU/ml的范围内,这个标准符合了静脉注射用药物对内毒素含量的要求。尽管如此,截至目前全球仍没有一种分离介质宣称可以用于临床治疗用途;上述产品的包装说明书和使用指导中均明确指出该产品的适用范围为研究而非体外诊断和治疗用途。
除法规因素外,产品特性不明确是限制其临床使用的另一个重要因素。在淋巴细胞的工业化生产过程中,细胞分离介质是仅次于培养基外,与细胞接触时间最久的外源物质。在标准的分离过程中,细胞必须与分离液接触15-45分钟的时间,以达到最佳分离效果。在这段时间内,分离液中各组分可能通过被动扩散、细胞的主动运输、胞吞/胞饮作用、表面黏附等途径,在细胞内部蓄积,且此部分蓄积成分,很难通过常规的洗涤从分离得到的目标细胞(例如淋巴细胞)中完全去除。尽管常规理化指标及菌落、内毒素等生化指标外已达到较高标准,但原料组分的不确定性给细胞分离介质的临床应用带来了极大的障碍。例如,Ficoll-PaqueTM是一套密度为1.077g/cm3的均质混合体系,每100ml混合液中含有:5.7g聚蔗糖400(Polysaccharide 400,即Ficoll400)、9g泛影酸钠(sodium diatrizoate)、0.0231g EDTA(calcium disodium ethylenediamintetraacetic)。体系中的泛影酸钠和EDTA分别被用于血管造影及治疗血铅中毒,其药学相关数据已被阐明,安全性得到了保证。然而,Ficoll-PaqueTM临床应用的最大障碍源于体系中的主体成分聚蔗糖400(Ficoll 400),Ficoll 400并无临床应用,其毒理学、药物代谢动力学特性均没有相关数据支撑。
密度梯度离心法分离淋巴细胞已成为生物医学诸多领域中不可缺少的试验技术之一,而分离介质的配方选择是密度梯度离心法中的技术核心。早在1968年等人逐步建立了以Ficoll 400和甲泛影钠(2,4,6-三碘-3-乙酰氨基-4-(N-甲乙酰氨基)苯甲酸钠)为主配方的混合分离体系(A.Scand J Clin Lab Invest 21Suppl,1968,97:77-89;A.Scand J Clin Lab Invest 21Suppl,1968,97:31-50;A.Scand J Clin Lab Invest 21Suppl,1976,5:9-15;),同时开发了密度梯度离心这一简单快速的纯化细胞的方法,并成功将它们用于分离人血液样本中的白细胞。基于等人的先驱工作成果,许多研究者将Ficoll 400-碘化密度梯度介质的混合体系进一步完善并最终该确立了利用泛影酸钠(2,4,6-三碘-3,5-二乙酰氨基苯甲酸钠)替代甲泛影钠组成Ficoll 400-泛影酸钠优化体系,该分离介质配方在世界范围内广泛得以应用。
Ficoll 400和泛影酸钠的选择并不是偶然的。Ficoll 400是由蔗糖和环氧氯丙烷通过化学合成而得到的高分子量聚合物,可溶于水,其化学结构高度分支化形成球型,斯托克斯半径为5nm左右。其化学结构决定了Ficoll 400具有分离介质适宜的特性,比如相对密度和特性粘度。Ficoll 400最大水溶液密度可达1.23g/cm3(陈培刚,实验室仪器,1990,4:9-15),这已大于血细胞中密度最大的红细胞,因此分离谱广泛;而特性粘度则较低,为17ml/g,使分离过程更加高效。泛影酸钠则是一种适宜与Ficoll 400形成低粘度高密度溶液的化合物,在医学上用作X光造影剂。
在典型的分离淋巴细胞的操作中,采用等量的平衡盐溶液对抗凝剂(比如肝素、枸橼酸钠)处理过的血样进行稀释,然后将其小心铺在装入离心管的分离介质层上,维持界面清晰。在室温下进行短时低速离心(比如400g,30-40min)后,密度为1.077g/cm3的淋巴细胞、单核细胞由于无法穿透密度更高的分离介质层而在血浆与分离介质层交界面处富集,而红细胞和粒细胞则由于密度较大而沉降在离心管底部。因此,淋巴细胞和单核细胞将在血浆层和分离介质层交界面的细胞条带处收获,继而通过对收获的细胞洗涤和离心,以除去少量的血小板、血浆和分离介质本身,得到高纯度的淋巴细胞和单核细胞。
在此过程中,Ficoll 400还将起到另外的关键性作用,即对红细胞的凝集作用。红细胞凝集的分子基础为红细胞的表面电荷。红细胞表面分布的唾液酸(Sialic Acid)水解呈负电性,使红细胞表面带有负电荷,因此在等渗溶液中,红细胞膜周围会屏蔽一层带相反电荷的离子层(双电层),并产生细胞间的静电斥力。当双电层被大分子的吸附作用所破坏时,这种静电斥力也会被降低从而促使红细胞凝集。(李萍,魏岩山,徐维家,等.,中国检验医学与临床,2001,8(4):175-176.)红细胞对悬液体系中的大分子有吸附作用,吸附量与大分子的种类和浓度都密切相关,当溶液中含有合适的大小、电荷分布的大分子时,相邻红细胞将破坏红细胞间固有的静电斥力而出现凝集现象,凝集会随着大分子浓度升高而增多,并会出现饱和现象。一般而言,分子量越大,凝集现象越显著(盛佳,曾衍钧,庄逢源,力学进展,1999,29(1):105-111),综上可知Ficoll 400具有较强的这种凝集作用。由于在全血样品中,红细胞比白细胞的数量高约1000倍,淋巴细胞纯度和产量在很大程度上依赖于对红细胞去除的有效性,例如,红细胞沉降速度过快,一些淋巴细胞将被非特异性地捕获进入红细胞的凝块之中,导致淋巴细胞收率降低;而红细胞沉降速度过慢,将导致淋巴细胞产品中的红细胞污染,或进而通过继续延长的离心操作而导致白细胞收率降低。因此,高分子-泛影酸钠分离介质体系中的高分子种类选择是至关重要的,特别地,其应该具有合适的凝集红细胞的作用,这种凝集作用必须是使红细胞凝集速度适宜的。
Ficoll 400用于构建整个体系的密度。Ficoll是一种中性的、高分支化合成蔗糖聚合物,具有高密度、低渗透压等特点,配制Ficoll-PaqueTM所使用的Ficoll一般分子量在400kD左右,即Ficoll 400。Ficoll 400在分离中不表现出对细胞的毒性,但化学品安全说明书(MSDS)中的数据显示,慢毒试验中Ficoll 400表现出一定毒性,包括恶心、呕吐、头痛甚至昏迷,皮肤严重红肿、水肿等。更重要是高分子量聚合物通常会引起血流动力学和血液流变学性质的改变(Nadia Antonova,Zdravko Lazarov,Clinical Hemorheology and Microcirculation,2004,30(3-4):381-390;李福龙,刘艳凯,牛春丽等,中国临床康复,2006,10(24):91-93.等)。此外,高分子量聚合物还可能起致敏反应,并且分子量越大,抗原性越强。Ficoll 400还作为半抗原载体,以增强小鼠对弱抗原的免疫应答反应,例如McMasters,P.R.B.等,Immunochemistry,1977,14:189.;Inman,J.K.,J.Immunol,1975,114:704.;Xue,B.等,J.Exp.Med.,1984,159:103-113.;DeHeer,D.H.,Edgington,R.S.,Mol.Immunol.,1980,,17:1231-1236.等。最重要地,由于Ficoll 400本身并非药用分子,其药学相关数据,尤其是毒理学、药物代谢动力学等数据尚无文献报道。
上述潜在的风险和未知因素的存在导致Ficoll 400必需受到最严格的控制以防进入人体。由于分离介质不可避免的会存在最终细胞产品中,必须有严格的洗脱步骤及残留量检测以证明Ficoll 400降到足够低的水平;这些步骤提高了成本、拉长了生产周期,提高了工业化细胞生产的复杂度。美国药典USP<1043>关于细胞、基因和组织工程产品辅料的描述中明确将此类缺乏临床医用经历的物料划分为中等风险(Moderate Risk)范畴,而将符合治疗用药物和生物制品的物料划分为低风险(Low Risk)范畴。在细胞生产过程中,低风险的材料使用具有最高优先级。如果能应对Ficoll 400生物安全性不足的问题,寻找新的替代,建设出一套符合USP<1043>要求的低风险的分离体系,将大大提高细胞治疗产业中细胞分离这一步骤的安全性和规范度。
发明内容
为了寻求安全性更高,分离效果更优的配方,本发明的一个主要方面是提供了一种用于单个核细胞分离的组合物,由分子量大于40kD的右旋糖酐、药学上可接受的羟乙基淀粉与泛影酸钠或泛影葡胺组成。
以分子量大于40kD的右旋糖酐和药学上可接受的羟乙基淀粉以组合形式替代淋巴细胞分离介质中高分子Ficoll 400的选择,而本发明中分离介质的另一种主要原料则为泛影酸钠或泛影葡胺。这种替代的原因在于,常规分离介质配方中的另一种组分Ficoll 400没有任何临床应用,原料不确定性大,安全性低,因此常规分离介质难以真正用于临床并得到法律法规的认可。例如,以细胞治疗为代表的多种临床应用均对淋巴细胞分离介质有较大的依赖性。
作为优选,所述分子量大于40kD的右旋糖酐为Dextran 70或Dextran 40。
更优选地,所述羟乙基淀粉为羟乙基淀粉200/0.5或羟乙基淀粉130/0.4。
右旋糖酐(Dextran)是一种分支化的葡聚糖,其通过一些乳酸菌合成,典型地包括串珠菌和变形链球菌。Dextran分支度大约为5%,其长度在3~2000kD间变化,分支长度大约为1~2个葡萄糖单位长度。Dextran主链通过α-1,6糖苷键连接葡萄糖分子,而支链则通过α-1,3糖苷键相连。斯托克斯半径在2~27nm之间。
Dextran70的斯托克斯半径为5.8nm,临床常用的制剂为6%中分子右旋糖酐含0.9%氯化钠制剂,平均分子量为70kD(60kD~100kD),分子量最接近血浆蛋白的重量。其分子的大小范围较广,排出复杂,在血管内半衰期约6~8h。它能从组织中吸收水分,适用于补充血容量,6%右旋糖酐500ml可增加血浆容量450~500ml,其扩容作用可持续4h(5~7h)。临床上主要用于防治低血容量性休克,失血量在总血容量20%以内者可全部用右旋糖酐作补充,不需输血。
羟乙基淀粉200/0.5由高分支支链淀粉经酸水解、羟乙基化后制得,属中分子量低取代度羟乙基淀粉,是一种电中性球状分子。C2位置上的羟乙基基团对血清淀粉酶的降解具有特别强的抵抗力。分子结构与糖原相似,平均分子量(MW=200kD),能引起红细胞聚集。羟乙基淀粉200/0.5可增加血浆容量,从而改善心排血量和氧输送值,可改善低血容量和休克患者的血液动力学和氧输送;并能够降低红细胞压积,降低血液和血浆粘滞度,同时羟乙基淀粉200/0.5还具有减少受损毛细血管中的血浆渗漏和水肿的独特药理作用,这有利于将发生或已发生器官衰竭的危重患者。它具有起效快而强的扩容作用,能维持中等强度的扩容作用达4小时,能较完全地从肾脏清除,在血浆和组织中的蓄积较少。羟乙基淀粉200/0.5(HES200/0.5)注射液是欧洲目前最常用的血浆代用品,为治疗和预防低血容量和休克的首选药物。羟乙基淀粉200/0.5对小鼠的半数致死量(LD50)超过6g/kg,相当于将420g的羟乙基淀粉用于体重为70kg的患者,此剂量远超过临床常用剂量。狗的慢性及亚急性毒性实验结果表明,按体重每日4g/kg的羟乙基淀粉用量,除引起脏器重量增加及组织病理显示暂时性网状内皮系统空泡样变性外,对肝、脾、肺、淋巴结没有不可逆性的毒副作用,其没有致畸性。
本发明用特定比例的两种功能分子提供了适宜的红细胞凝集速度,也因此实现了良好的淋巴细胞纯度和淋巴细胞回收率。这种适宜的红细胞凝集速度是两种分子中单一的某一种分子所无法实现的,即,Dextran 70对红细胞几乎没有凝集作用,这将导致细胞产品中大量红细胞的污染;而羟乙基淀粉200/0.5有很强的红细胞凝集作用,这将导致红细胞沉降速度过快,一些淋巴细胞将被非特异性地捕获进入红细胞的凝块之中,导致淋巴细胞收率降低。
单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。用本发明所述单个核细胞分离的组合物配成生理溶液状态的分离介质,对血样样品进行离心处理后,淋巴细胞与单核细胞将在分离介质和血浆的交界面形成比较明显的云雾状细胞条带,而红细胞、粒细胞等其它细胞将主要分布在离心管底和分离介质层。在本发明的具体实施方式中提供的用于淋巴细胞分离的组合物Dextran 70、羟乙基淀粉200/0.5的质量比为1∶1、2∶1或3∶1。
在本发明的另一个具体实施方式中提供的用于淋巴细胞分离的组合物Dextran 70、羟乙基淀粉130/0.4的质量比为1∶1。
在本发明的另一个具体实施方式中提供的用于淋巴细胞分离的组合物Dextran 40、羟乙基淀粉200/0.5的质量比为1∶1。
在本发明的一方面提供了一种复方淋巴细胞分离介质,用于通过密度梯度离心法分离多种样本(人脐带血、外周血、骨髓等)中的淋巴细胞,其特点在于全部原料均符合临床医用静注级标准,具有极小的生物学毒性,并且安全性较含Ficoll 400的传统淋巴细胞分离介质有显著的提高,具有潜在的临床应用价值。
本发明提供的复方淋巴细胞分离介质,含有分子量大于40kD的右旋糖酐、药学上接受的羟乙基淀粉与泛影酸钠或泛影葡胺,该分离介质为生理溶液,其密度在1.060g/cm3和1.090g/cm3之间,渗透压在280mOsmol/kg和310mOsmol/kg之间,pH在6和9之间,黏度为3.0-5.0cp。本发明由上述原料以任意比例混合,并通过搅拌和过滤除菌后而得,使其保持生理溶液状态,即密度在1.060g/cm3和1.090g/cm3之间,渗透压在280mOsmol/kg和310mOsmol/kg之间,pH在6和9之间。
作为优选,本发明所述复方淋巴细胞分离介质的配方为含有0-6%(w/w)的右旋糖酐70、0-10%(w/w)的泛影酸钠、0-6%(w/w)的羟乙基淀粉200/0.5。
更优选地,其含有1-3%(w/w)的右旋糖酐70、5-10%(w/w)的泛影酸钠、1-3%(w/w)的羟乙基淀粉(200/0.5)。
在本发明的具体实施方式中提供的用于淋巴细胞分离的复方淋巴细胞分离介质中Dextran 70、羟乙基淀粉200/0.5、泛影酸钠的质量百分比为2.25%、2.25%、9.0%或3.0%、1.5%、9.0%或2.45%、2.45%、9.0%或3.6%、1.3%、9.0%或2.85%、2.85%、9.0%,形成澄清透明的无色或微黄色水溶液,该溶液在20℃条件下为生理溶液状态,该混合水溶液的主要特征密度在1.060g/cm3和1.090g/cm3之间,渗透压在280mOsmol/kg和310mOsmol/kg之间,pH在6和9之间。
在本发明的另一个具体实施方式中提供的用于淋巴细胞分离的复方淋巴细胞分离介质中Dextran 40、羟乙基淀粉200/0.5、泛影酸钠的质量百分比分别为2.45%、2.45%、9.0%。在本发明的另一个具体实施方式中提供的用于淋巴细胞分离的复方淋巴细胞分离介质中Dextran 70、羟乙基淀粉130/0.4、泛影酸钠的质量百分比分别为2.45%、2.45%、9.0%。
作为优选,还含有0-0.9%(w/w)的NaCl。
作为优选,其为无菌状态,内毒素含量<0.5EU/ml。
本发明所述复方淋巴细胞分离介质回收的淋巴细胞纯度及淋巴细胞回收率与Ficoll-Paque PremiumTM对照组无显著性差异;经分离得到的淋巴细胞,在经过典型的CIK细胞培养后,在增殖、形态学、表面标记物CD3+CD56+及对A549细胞的杀瘤活性测试四项指标中均与Ficoll-Paque PremiumTM对照组有相当的效果,说明其安全、有效。
在本发明的另一方面还提供了所述复方淋巴细胞分离介质分离样本细胞的方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤1:将0-80ml所述淋巴细胞分离介质加入离心管;
步骤2:再将利用抗凝剂处理过的平衡盐溶液或无血清培养基稀释后的样品铺在淋巴细胞分离介质上,在温度为4℃-30℃进行离心。
作为优选,步骤1为15ml离心管中装入3-5ml分离介质,或50ml离心管中装入20-30ml分离介质。
作为优选,步骤2所述稀释的稀释比例为1∶2-2∶1,优选为1∶1-1∶1.5;步骤2所述离心的温度为20-25℃,在100-800g的条件下进行离心;优选的离心条件为300-500g,离心时间为15-30min。
更优选地,所述样品选自外周血、脐带血或骨髓。
淋巴细胞将在分离介质和血浆的交界面形成比较明显的云雾状细胞条带,而红细胞、粒细胞等其它细胞将主要分布在离心管底和分离介质层。任选地,淋巴细胞通过一定方式(比如利用移液管或其它移液器吸取)取出,并任选地经过0-2次平衡盐溶液或无血清培养基的洗涤和离心,优选地经过1次无血清培养基洗涤和离心;最终获得纯度较高的淋巴细胞悬液。分离收获的淋巴细胞可通过进一步处理达到其它目的,例如通过典型的CIK细胞培养流程进行培养,并最终用于对抗肿瘤的细胞治疗。
本发明还提供复方淋巴细胞分离介质在疾病的细胞学诊断、成分输血、细胞治疗、细胞产品的制备等现代生物技术领域和医学领域的用途。典型地,本发明尤其适用于CIK细胞的培养和相关的细胞培养和相关的细胞治疗,优选地,本发明适用于用于肿瘤治疗的CIK细胞培养前的淋巴细胞富集。
本发明配方中的全部原料均有符合静注级原料药可以购得,原料不确定性小,安全性高,且分离效果与常规分离介质没有显著性差异。因此,本发明为临床医用级淋巴细胞分离介质的诞生起到了巨大的推动作用。
术语与定义:
如在本说明书中所用的,无论在过渡性短语或权利要求书的主体中,术语“包含”被解释为不定额的意义。即,术语被解释为与短语“具有至少”或“包括至少”同义。当用于方法,术语“包含”意思是该方法包括至少列举出的步骤,但还可包括另外的步骤。当用于化合物或组合物,术语“包含”意思是化合物或组合物包括列举出的特征或组分,但还可包括另外的特征或组分。
本文所用的术语“任选”或“任选地”意思是随后描述的事件或状况可能,但不必需发生,该描述包括事件或状况发生的情况或不发生的情况。
本文所用的,对于变量的数值范围的列举是为了表达本发明可实行变量等于在该范围内的任何值。因此,对于本质上是非连续的变量,变量可以等于数值范围的任何整数值,包括范围的终点。同样地,对于本质上是连续的变量,变量可以等于数值范围的任何实际值,包括范围的终点。举例来说,所述的值在0和2之间的变量,对于本质上是非连续的变量可以是0、1或2,对于本质上是连续的变量可以是0.0、0.1、0.01、0.001或任何实际值。
细胞治疗:是指应用人的自体、同种异体或异种的成体或胚胎细胞经体外操作后回输人体的治疗方法。
密度梯度离心法:在密度梯度离心法中,需要将一种具有特定密度的分离介质预先铺在离心管底,然后将待分离的样本小心铺在该介质上,随后将离心管在一定离心条件下离心一段时间并取出,样品中各细胞群将由于密度差异分布在离心管的不同部位,例如,如果分离介质具有与目标细胞群相同的密度,目标细胞将富集在分离介质层与样本层的交界面,用吸管将该层细胞吸出就达到了对目标细胞群的分离。
淋巴细胞分离介质:在上述描述中,用于分离淋巴细胞的分离介质称为淋巴细胞分离介质。
静注级原料药:原料药由化学合成、植物提取或者生物技术所制备的各种用来作为药用的粉末、结晶、浸膏等,用于生产各类制剂的原料药物,是制剂中的有效成分,但病人无法直接服用的物质。静注级原料药指用于制备静注制剂的有效成分。
CIK细胞:全称为Cytokine Induced Killer cells,即细胞因子诱导的杀伤细胞,其由供体分离而得到的单个核细胞(MNC)在体外用多种细胞因子共同培养一段时间获得的一群异质细胞,其主要效应细胞是CD3+CD56+双阳性细胞,具有较强的对肿瘤细胞的杀伤作用。
附图说明
图1显示实施例1-7制备的复方分离介质的密度;
图2显示实施例1-7制备的复方分离介质的渗透压;
图3显示本发明所述复方分离介质用离心管分离人脐带血的细胞分层;
图4显示实施例1-7制备的复方分离介质分离人脐带血的淋巴细胞回收率;
图5显示实施例1-7制备的复方分离介质分离人脐带血的淋巴细胞纯度;
图6显示实施例4-5制备的复方分离介质分离人外周血的淋巴细胞回收率;
图7显示实施例4-5制备的复方分离介质分离人外周血的淋巴细胞纯度;
图8显示实施例4配制的分离介质分离人脐带血中的淋巴细胞的增殖曲线;
图9显示实施例4配制的分离介质分离人脐带血中的淋巴细胞对A549细胞在效靶比为10∶1条件下的杀伤率。
具体实施方式
本发明公开了一种复方淋巴细胞分离介质及其应用,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的复方淋巴细胞分离介质及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案,下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1、配方A分离介质的配制
在具备局部百级层流净化条件的环境中,在20℃下,经过无菌技术培训的本领域技术人员使用常规方法分别将符合药用标准的、质量比为1∶1Dextran 70、羟乙基淀粉(200/0.5)与一定量的泛影酸钠充分溶解于灭菌注射用水,形成澄清透明的无色或微黄色水溶液,三种物质的质量分数分别为2.25%、2.25%、9.0%,再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
在20℃条件下,该混合水溶液的主要特征参数包括:(1)密度为1.074g/cm3(见图1,参照方法<1>);(2)渗透压为生理渗透压(见图2,285mOsm/kg至310mOsm/kg之间)(参照方法<2>);(3)pH在6.0至9.0之间;(4)黏度为3.0-5.0cp(参照方法<4>);
此外,该混合水溶液的特征还包括:(5)无菌(参照方法<5>);(6)内毒素<0.5EU/ml(参照方法<6>)。
本实施例中所引用的参照6种方法适用于下面所有实施例中相应的描述,所引用的参照方法包括:
<1>采用U型震荡管法测定密度,参见美国药典USP<841>Specific Gravity MethodII;
<2>采用冰点降低法测定渗透压,参见《中华人民共和国药典》2010年版附录IX G“渗透压摩尔浓度测定法”;
<3>采用电位法测定pH值,参见《中华人民共和国药典》2010年版附录VIH“pH值测定法”;
<4>采用落球法测定动力粘度;
<5>参见《中华人民共和国药典》2010年版附录XI H“无菌检查法”;
<6>采用鲎试剂法测定细菌内毒素,参见《中华人民共和国药典》2010年版附录X III D“细菌内毒素检查法”;
<7>细胞计数板法测定细胞数量,使用25×16规格的细胞计数板,由本领域技术人员按照标准流程进行操作。
实施例2、配方B分离介质的配制
在具备局部百级层流净化条件的环境中,在20℃下,经过无菌技术培训的本领域技术人员使用常规方法分别将符合药用标准的、质量比为2∶1的Dextran 70、羟乙基淀粉(200/0.5)与一定量的泛影酸钠充分溶解于灭菌注射用水,形成澄清透明的无色或微黄色水溶液,三种物质的质量分数分别为3.0%、1.5%、9.0%,再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
在20℃条件下,该混合水溶液的主要特征参数包括:(1)密度为1.074g/cm3(见图1,参照方法<1>);(2)渗透压为生理渗透压(见图2,285mOsm/kg至310mOsm/kg之间)(参照方法<2>);(3)pH在6.0至9.0之间(见图3,参照方法<3>);(4)黏度为3.0-5.0cp(参照方法<4>);
此外,该混合水溶液的特征还包括:(5)无菌(参照方法<5>);(6)内毒素<0.5EU/ml(参照方法<6>)。
实施例3、配方C分离介质的配制
在具备局部百级层流净化条件的环境中,在20℃下,经过无菌技术培训的本领域技术人员使用常规方法分别将符合药用标准的、质量比为1∶1的Dextran 70、羟乙基淀粉(200/0.5)与一定量的泛影酸钠充分溶解于灭菌注射用水,形成三种物质的质量分数分别为2.45%、2.45%、9.0%的澄清透明的无色或微黄色水溶液,再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
在20℃条件下,该混合水溶液的主要特征参数包括:(1)密度为1.075g/cm3(见图1,参照方法<1>);(2)渗透压为生理渗透压(见图2,285mOsm/kg至310mOsm/kg之间)(参照方法<2>);(3)pH在6.0至9.0之间(见图3,参照方法<3>);(4)黏度为3.0-5.0cp(参照方法<4>);
此外,该混合水溶液的特征还包括:(5)无菌(参照方法<5>);(6)内毒素<0.5EU/ml(参照方法<6>)。
实施例4、配方D分离介质的配制
在具备局部百级层流净化条件的环境中,在20℃下,经过无菌技术培训的本领域技术人员使用常规方法分别将符合药用标准的、质量比约为3∶1的Dextran 70、羟乙基淀粉(200/0.5)与一定量的泛影酸钠充分溶解于灭菌注射用水,形成三种物质的质量分数分别为3.6%、1.3%、9.0%的澄清透明的无色或微黄色水溶液,再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
在20℃条件下,该混合水溶液的主要特征参数包括:(1)密度为1.075g/cm3(见图1,参照方法<1>);(2)渗透压为生理渗透压(见图2,285mOsm/kg至310mOsm/kg之间)(参照方法<2>);(3)pH在6.0至9.0之间(见图3,参照方法<3>);(4)黏度为3.0-5.0cp(参照方法<4>);
此外,该混合水溶液的特征还包括:(5)无菌(参照方法<5>);(6)内毒素<0.5EU/ml(参照方法<6>)。
实施例5、配方E分离介质的配制
在具备局部百级层流净化条件的环境中,在20℃下,经过无菌技术培训的本领域技术人员使用常规方法分别将符合药用标准的、质量比为1∶1的Dextran 70、羟乙基淀粉(200/0.5)与一定量的泛影酸钠充分溶解于灭菌注射用水,形成三种物质的质量分数分别为2.85%、2.85%、9.0%的澄清透明的无色或微黄色水溶液,再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
在20℃条件下,该混合水溶液的主要特征参数包括:(1)密度为1.078g/cm3(见图1,参照方法<1>);(2)渗透压为生理渗透压(见图2,285mOsm/kg至310mOsm/kg之间)(参照方法<2>);(3)pH在6.0至9.0之间(见图3,参照方法<3>);(4)黏度为3.0-5.0cp(参照方法<4>);
此外,该混合水溶液的特征还包括:(5)无菌(参照方法<5>);(6)内毒素<0.5EU/ml(参照方法<6>)。
实施例6、配方F分离介质的配制
在具备局部百级层流净化条件的环境中,在20℃下,经过无菌技术培训的本领域技术人员使用常规方法分别将符合药用标准的、质量比为1∶1的Dextran 40、羟乙基淀粉(200/0.5)与一定量的泛影酸钠充分溶解于灭菌注射用水,形成三种物质的质量分数分别为2.45%、2.45%、9.0%的澄清透明的无色或微黄色水溶液,再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
在20℃条件下,该混合水溶液的主要特征参数包括:(1)密度为1.075g/cm3(见图1,参照方法<1>);(2)渗透压为生理渗透压(见图2,285mOsm/kg至310mOsm/kg之间)(参照方法<2>);(3)pH在6.0至9.0之间(见图3,参照方法<3>);(4)黏度为3.0-5.0cp(参照方法<4>);
此外,该混合水溶液的特征还包括:(5)无菌(参照方法<5>);(6)内毒素<0.5EU/ml(参照方法<6>)。
实施例7、配方G分离介质的配制
在具备局部百级层流净化条件的环境中,在20℃下,经过无菌技术培训的本领域技术人员使用常规方法分别将符合药用标准的、质量比为1∶1的Dextran 70、羟乙基淀粉130/0.4与一定量的泛影酸钠充分溶解于灭菌注射用水,形成三种物质的质量分数分别为2.45%、2.45%、9.0%的澄清透明的无色或微黄色水溶液,再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
在20℃条件下,该混合水溶液的主要特征参数包括:(1)密度为1.075g/cm3(见图1,参照方法<1>);(2)渗透压为生理渗透压(见图2,285mOsm/kg至310mOsm/kg之间)(参照方法<2>);(3)pH在6.0至9.0之间(见图3,参照方法<3>);(4)黏度为3.0-5.0cp(参照方法<4>);
此外,该混合水溶液的特征还包括:(5)无菌(参照方法<5>);(6)内毒素<0.5EU/ml(参照方法<6>)。
实施例8、分离介质的贮藏
在具备局部百级层流净化条件的环境中,在20℃条件下,所有配制而成的分离介质样品均贮藏于密闭的无菌玻璃或塑料容器内,并在锡箔纸包装遮光的条件下,于常温(参照《中华人民共和国药典》2010年版凡例二十一)进行保存。
实施例9、利用所配制的分离介质分离人脐带血中的淋巴细胞及分离效果的评价
按照实施例8对所配制的复方淋巴细胞分离介质进行贮藏,将5ml上述淋巴细胞分离介质或作为对照组的Ficoll-Paque PremiumTM分离介质(美国GE Healthcare公司)加入到15ml离心管(美国BD公司),再将5ml利用抗凝剂处理过的RPMI 1640(美国Life Technologies公司)1∶1稀释后的脐带血样本沿管壁小心铺在淋巴细胞分离介质上;在温度为20℃和400g的条件下进行离心(美国Thermo Scientific公司)30min,后停止离心,淋巴细胞与单核细胞将在分离介质和血浆的交界面形成比较明显的云雾状细胞条带,而红细胞、粒细胞等其它细胞将主要分布在离心管底和分离介质层(见图3)。利用移液管将血清层吸出并弃置不用,再利用移液管小心将云雾状细胞条带吸出,利用无血清培养基对收获的淋巴细胞进行洗涤和离心,最终获得纯度较高的淋巴细胞悬液,将该淋巴细胞悬液进行CD45和CD14荧光标记抗体(美国BD公司)检测,利用细胞计数板对收获的细胞进行计数(参照方法<7>),计算各分离介质组淋巴细胞回收率和淋巴细胞纯度,并分别与Ficoll-Paque PremiumTM分离介质的结果进行比较,计算各分离介质组淋巴细胞回收率和淋巴细胞纯度占相应的Ficoll-Paque PremiumTM分离介质结果的比例,作为分离效果的评价指标(见图4、图5),特别说明为每组Ficoll-Paque PremiumTM分离介质淋巴细胞回收率和淋巴细胞纯度所占比例均记为100%、100%。对试验结果选用恰当的统计学方法(t检验)进行分析可知,配方A、B、C、D的淋巴细胞纯度与Ficoll-Paque PremiumTM对照组无显著性差异,配方A、D、E、G的淋巴细胞回收率指标与Ficoll-Paque PremiumTM对照组有相当的效果。
实施例10、利用所配制的分离介质分离人外周血中的淋巴细胞及分离效果的评价
按照实施例8对所配制的复方淋巴细胞分离介质进行贮藏,将5ml上述淋巴细胞分离介质或作为对照组的Ficoll-Paque PremiumTM分离介质(美国GE Healthcare公司)加入到15ml离心管(美国BD公司),再将5ml利用抗凝剂处理过的RPMI 1640(美国Life Technologies公司)1∶1稀释后的新鲜人外周血样本沿管壁小心铺在淋巴细胞分离介质上;在温度为20℃和400g的条件下进行离心(美国Thermo Scientific公司)30min,后停止离心,淋巴细胞与单核细胞将在分离介质和血浆的交界面形成比较明显的云雾状细胞条带,而红细胞、粒细胞等其它细胞将主要分布在离心管底和分离介质层。利用移液管将血清层吸出并弃置不用,再利用移液管小心将云雾状细胞条带吸出,利用无血清培养基对收获的淋巴细胞进行洗涤和离心,最终获得纯度较高的淋巴细胞悬液,将该淋巴细胞悬液进行CD45和CD14荧光标记抗体(美国BD公司)检测,利用细胞计数板对收获的细胞进行计数(参照方法<7>),计算各分离介质组淋巴细胞回收率和淋巴细胞纯度,并分别与Ficoll-Paque PremiumTM分离介质的结果进行比较,计算各分离介质组淋巴细胞回收率和淋巴细胞纯度占相应的Ficoll-Paque PremiumTM分离介质结果的比例,作为分离效果的评价指标(见图6、图7),特别说明为每组Ficoll-Paque PremiumTM分离介质淋巴细胞回收率和淋巴细胞纯度所占比例均记为100%、100%。由试验结果可知,配方D在淋巴细胞纯度和淋巴细胞回收率两项指标中均与Ficoll-Paque PremiumTM对照组有相当的效果,配方E的淋巴细胞回收率指标优于Ficoll-PaquePremiumTM对照组。
实施例11、利用所配制的分离介质分离人脐带血而得的淋巴细胞的体外培养与观察
将分离收获的淋巴细胞接种于6孔板(美国CELLSTAR公司)上,通过典型的CIK细胞培养流程进行培养,培养持续14至28天。期间,利用细胞计数板对生长期间的细胞进行计数(台盼蓝排除法)并绘制增殖曲线(见图8);利用显微镜进行形态学观察,并拍照存档;对达到预设培养时间的细胞产品进行CD3和CD56,及PI荧光标记抗体(美国BD公司)检测,同时对A549细胞进行杀瘤活性测试,CD3+CD56+双阳性细胞群比例和效靶比为10∶1条件下的杀伤率(见图9)作为培养的评价指标。由试验结果可知,配方D分离而得的淋巴细胞,在经过典型的CIK细胞培养后,在增殖、形态学(细胞形态、增殖团出现时间与大小)、表面标记物(CD3+CD56+双阳性细胞比例)及杀瘤活性测试四项指标中均与Ficoll-Paque PremiumTM对照组有相当的效果,是一种安全、有效的产品。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (16)
1.一种用于单个核细胞分离的组合物,由分子量大于40kD的右旋糖酐、药学上可接受的羟乙基淀粉与泛影酸钠或泛影葡胺组成。
2.根据权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述右旋糖酐为Dextran 70或Dextran 40。
3.根据权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述羟乙基淀粉为羟乙基淀粉200/0.5或羟乙基淀粉130/0.4。
4.根据权利要求2或3所述的组合物,其特征在于,右旋糖酐、羟乙基淀粉质量比为1∶1、2∶1或3∶1。
5.根据权利要求1-4任一项所述的组合物,其特征在于,所述单个核细胞为单核细胞或淋巴细胞。
6.一种复方淋巴细胞分离介质,其特征在于,含有分子量大于40kD的右旋糖酐、药学上可接受的羟乙基淀粉与泛影酸钠或泛影葡胺,该分离介质为生理溶液,其密度在1.060g/cm3和1.090g/cm3之间,渗透压在280mOsmol/kg和310mOsmol/kg之间,pH在6和9之间,黏度为3.0-5.0cp。
7.根据权利要求6所述的复方淋巴细胞分离介质,其特征在于,含有0-6%(w/w)的右旋糖酐70、0-10%(w/w)的泛影酸钠、0-6%(w/w)的羟乙基淀粉200/0.5。
8.根据权利要求7所述的复方淋巴细胞分离介质,其特征在于,含有1-3%(w/w)的右旋糖酐70、5-10%(w/w)的泛影酸钠、1-3%(w/w)的羟乙基淀粉(200/0.5)。
9.根据权利要求6所述的复方淋巴细胞分离介质,其特征在于,还含有0-0.9%(w/w)的NaCl。
10.根据权利要求6-9任一项所述的复方淋巴细胞分离介质,其特征在于,其为无菌状态。
11.根据权利要求6-9任一项所述的复方淋巴细胞分离介质,其特征在于,其内毒素含量<0.5EU/ml。
12.一种分离样品细胞的方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤1:将0-80ml权利要求6-11任一项所述淋巴细胞分离介质加入离心管;
步骤2:再将利用抗凝剂处理过的平衡盐溶液或无血清培养基稀释后的样品铺在淋巴细胞分离介质上,在温度为4℃-30℃进行离心。
13.根据权利要求12所述的方法,其特征在于,步骤1为15ml离心管中装入3-5ml分离介质,或50ml离心管中装入20-30ml分离介质。
14.根据权利要求12所述的方法,其特征在于,步骤2所述稀释的稀释比例为1∶2-2∶1,优选为1∶1-1∶1.5。
15.根据权利要求12所述的方法,其特征在于,步骤2所述离心的温度为20-25℃,在100-800g的条件下进行离心;优选的离心条件为300-500g,离心时间为15-30min。
16.根据权利要求12所述的方法,其特征在于,所述样品选自外周血、脐带血或骨髓。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201110456878.2A CN102533650B (zh) | 2011-12-30 | 2011-12-30 | 一种细胞分离介质及细胞分离方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201110456878.2A CN102533650B (zh) | 2011-12-30 | 2011-12-30 | 一种细胞分离介质及细胞分离方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN102533650A true CN102533650A (zh) | 2012-07-04 |
CN102533650B CN102533650B (zh) | 2014-05-21 |
Family
ID=46341687
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201110456878.2A Expired - Fee Related CN102533650B (zh) | 2011-12-30 | 2011-12-30 | 一种细胞分离介质及细胞分离方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN102533650B (zh) |
Cited By (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103667174A (zh) * | 2012-09-07 | 2014-03-26 | 北京东方华辉生物医药科技有限公司 | 一种用于处理生物样本的组合物 |
CN105462920A (zh) * | 2015-12-31 | 2016-04-06 | 北京弘润天源生物技术股份有限公司 | 从外周血提取免疫细胞的方法 |
CN105505867A (zh) * | 2015-12-31 | 2016-04-20 | 北京弘润天源生物技术股份有限公司 | 用于分离淋巴细胞的组合物及其分离液 |
CN105505868A (zh) * | 2015-12-31 | 2016-04-20 | 北京弘润天源生物技术股份有限公司 | 分离外周血免疫细胞的分离方法 |
CN105543168A (zh) * | 2015-12-31 | 2016-05-04 | 北京弘润天源生物技术股份有限公司 | 免疫细胞的储存及运输方法 |
CN105543167A (zh) * | 2015-12-31 | 2016-05-04 | 北京弘润天源生物技术股份有限公司 | 骨髓干细胞的保存及运输方法 |
CN105567632A (zh) * | 2015-12-31 | 2016-05-11 | 北京弘润天源生物技术股份有限公司 | 分离淋巴细胞的分离方法 |
CN106749710A (zh) * | 2016-12-27 | 2017-05-31 | 武汉华科大生命科技有限公司 | 一种窄分布羟乙基淀粉及其应用 |
CN107267454A (zh) * | 2016-04-07 | 2017-10-20 | 北京京蒙高科干细胞技术有限公司 | 一种脐血nk细胞的体外扩增方法及其试剂盒与应用 |
WO2018137186A1 (en) * | 2017-01-25 | 2018-08-02 | Yantai Ausbio Laboratories Co., Ltd. | Equipment and methods for automated sample processing for diagnostic purposes |
CN108517311A (zh) * | 2018-04-20 | 2018-09-11 | 麦克奥迪(厦门)医疗诊断系统有限公司 | 用于分离和富集细胞的分离液、试剂盒及其应用 |
CN114350605A (zh) * | 2021-12-30 | 2022-04-15 | 武汉赛维尔生物科技有限公司 | 一种外周血淋巴细胞分离液及其应用 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1920012A (zh) * | 2006-08-07 | 2007-02-28 | 王怀林 | 一种有核细胞体外分离试剂盒及其应用方法 |
CN1948467A (zh) * | 2006-11-10 | 2007-04-18 | 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 | 用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒 |
CN101560495A (zh) * | 2008-04-14 | 2009-10-21 | 深圳市北科生物科技有限公司 | 一种分离单个核细胞的方法和装置 |
CN101864396A (zh) * | 2010-05-17 | 2010-10-20 | 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 | 一种体外诱导巨核祖细胞和巨核细胞的方法 |
CN102250839A (zh) * | 2011-06-16 | 2011-11-23 | 崔慧斐 | 一种通用型细胞处理试剂盒及其应用方法 |
-
2011
- 2011-12-30 CN CN201110456878.2A patent/CN102533650B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1920012A (zh) * | 2006-08-07 | 2007-02-28 | 王怀林 | 一种有核细胞体外分离试剂盒及其应用方法 |
CN1948467A (zh) * | 2006-11-10 | 2007-04-18 | 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 | 用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒 |
CN101560495A (zh) * | 2008-04-14 | 2009-10-21 | 深圳市北科生物科技有限公司 | 一种分离单个核细胞的方法和装置 |
CN101864396A (zh) * | 2010-05-17 | 2010-10-20 | 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 | 一种体外诱导巨核祖细胞和巨核细胞的方法 |
CN102250839A (zh) * | 2011-06-16 | 2011-11-23 | 崔慧斐 | 一种通用型细胞处理试剂盒及其应用方法 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
张威等: "免疫磁珠分离脐血CD133阳性细胞的方法研究", 《中国微循环》 * |
郭继强等: "两步法分离人脐血单个核细胞的最佳条件", 《中国组织工程研究与临床康复》 * |
Cited By (22)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103667174B (zh) * | 2012-09-07 | 2016-06-22 | 北京东方华辉生物医药科技有限公司 | 一种用于处理生物样本的组合物 |
CN103667174A (zh) * | 2012-09-07 | 2014-03-26 | 北京东方华辉生物医药科技有限公司 | 一种用于处理生物样本的组合物 |
CN105543168B (zh) * | 2015-12-31 | 2019-01-22 | 北京弘润天源基因生物技术有限公司 | 免疫细胞的储存及运输方法 |
CN105462920A (zh) * | 2015-12-31 | 2016-04-06 | 北京弘润天源生物技术股份有限公司 | 从外周血提取免疫细胞的方法 |
CN105543168A (zh) * | 2015-12-31 | 2016-05-04 | 北京弘润天源生物技术股份有限公司 | 免疫细胞的储存及运输方法 |
CN105543167A (zh) * | 2015-12-31 | 2016-05-04 | 北京弘润天源生物技术股份有限公司 | 骨髓干细胞的保存及运输方法 |
CN105567632A (zh) * | 2015-12-31 | 2016-05-11 | 北京弘润天源生物技术股份有限公司 | 分离淋巴细胞的分离方法 |
CN105505867A (zh) * | 2015-12-31 | 2016-04-20 | 北京弘润天源生物技术股份有限公司 | 用于分离淋巴细胞的组合物及其分离液 |
CN105462920B (zh) * | 2015-12-31 | 2019-09-13 | 北京弘润天源基因生物技术有限公司 | 从外周血提取免疫细胞的方法 |
CN105505868B (zh) * | 2015-12-31 | 2019-02-15 | 北京弘润天源基因生物技术有限公司 | 分离外周血免疫细胞的分离方法 |
CN105505868A (zh) * | 2015-12-31 | 2016-04-20 | 北京弘润天源生物技术股份有限公司 | 分离外周血免疫细胞的分离方法 |
CN105505867B (zh) * | 2015-12-31 | 2019-01-22 | 北京弘润天源基因生物技术有限公司 | 用于分离淋巴细胞的组合物及其分离液 |
CN105543167B (zh) * | 2015-12-31 | 2019-01-22 | 北京弘润天源基因生物技术有限公司 | 骨髓干细胞的保存及运输方法 |
CN105567632B (zh) * | 2015-12-31 | 2019-01-22 | 北京弘润天源基因生物技术有限公司 | 分离淋巴细胞的分离方法 |
CN107267454A (zh) * | 2016-04-07 | 2017-10-20 | 北京京蒙高科干细胞技术有限公司 | 一种脐血nk细胞的体外扩增方法及其试剂盒与应用 |
CN106749710A (zh) * | 2016-12-27 | 2017-05-31 | 武汉华科大生命科技有限公司 | 一种窄分布羟乙基淀粉及其应用 |
WO2018137186A1 (en) * | 2017-01-25 | 2018-08-02 | Yantai Ausbio Laboratories Co., Ltd. | Equipment and methods for automated sample processing for diagnostic purposes |
EP3573759A4 (en) * | 2017-01-25 | 2020-07-29 | Yantai AusBio Laboratories Co., Ltd. | EQUIPMENT AND METHOD FOR AUTOMATIC SAMPLING FOR DIAGNOSTIC PURPOSES |
US11883817B2 (en) | 2017-01-25 | 2024-01-30 | Yantai Ausbio Laboratories Co., Ltd. | Equipment and methods for automated sample processing for diagnostic purposes |
CN108517311A (zh) * | 2018-04-20 | 2018-09-11 | 麦克奥迪(厦门)医疗诊断系统有限公司 | 用于分离和富集细胞的分离液、试剂盒及其应用 |
CN114350605A (zh) * | 2021-12-30 | 2022-04-15 | 武汉赛维尔生物科技有限公司 | 一种外周血淋巴细胞分离液及其应用 |
CN114350605B (zh) * | 2021-12-30 | 2024-03-29 | 武汉赛维尔生物科技有限公司 | 一种外周血淋巴细胞分离液及其应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN102533650B (zh) | 2014-05-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN102533650B (zh) | 一种细胞分离介质及细胞分离方法 | |
Carvalhal et al. | Antithrombotics from the sea: Polysaccharides and beyond | |
Sonin et al. | Biological safety and biodistribution of chitosan nanoparticles | |
Rodey et al. | Defective bactericidal activity of monocytes in fatal granulomatous disease | |
Shahriari-Khalaji et al. | Bacterial nanocellulose-enhanced alginate double-network hydrogels cross-linked with six metal cations for antibacterial wound dressing | |
CN105543168A (zh) | 免疫细胞的储存及运输方法 | |
CN105532644B (zh) | 淋巴细胞的冻存方法 | |
de Melo et al. | Centrifugation conditions in the L-PRP preparation affect soluble factors release and mesenchymal stem cell proliferation in fibrin nanofibers | |
CN107722131B (zh) | 一种具有显著辅助抗肿瘤活性的全灵芝孢子粉精制多糖及其制备方法和应用 | |
CN101293012B (zh) | 一种抗病毒金银花中药复方制剂及制备工艺 | |
CN105462920B (zh) | 从外周血提取免疫细胞的方法 | |
Yermak et al. | Inhibitory effects of carrageenans on endotoxin-induced inflammation | |
CN102327228A (zh) | 壳聚糖新城疫疫苗纳米粒的制备方法 | |
Zheng et al. | Lung-targeted delivery of cepharanthine by an erythrocyte-anchoring strategy for the treatment of acute lung injury | |
Yermak et al. | Liposomal form of the echinochrome-carrageenan complex | |
CN103558392B (zh) | 一种基于炎症反应的抗动脉粥样硬化药效评价方法 | |
CN105250295B (zh) | 一种联合用药物及其作为免疫调节剂的应用 | |
CN105505867B (zh) | 用于分离淋巴细胞的组合物及其分离液 | |
CN1666998A (zh) | 一种褐藻多糖硫酸酯及其用途 | |
Guo et al. | Synthesis of chitosan oligosaccharide-loaded glycyrrhetinic acid functionalized mesoporous silica nanoparticles and in vitro verification of the treatment of APAP-induced liver injury | |
CN103667174A (zh) | 一种用于处理生物样本的组合物 | |
CN105106950B (zh) | 一种兽用疫苗的免疫佐剂、制备方法及其应用 | |
TW201619390A (zh) | 一種製備具有抗凝血活性的海藻寡糖的方法 | |
Fan et al. | Preparation of Phosphorylated Auricularia cornea var. Li. Polysaccharide Liposome Gel and Analysis of Its In Vitro Antioxidant Activity | |
CN102697808A (zh) | 一种体外抗鸭病毒性肝炎转移因子的制备方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20140521 |
|
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |