CN105543167B - 骨髓干细胞的保存及运输方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种骨髓干细胞的保存及运输方法，属于生物技术领域。本发明包括如下步骤：按临床常规取得红骨髓；将骨髓加入5倍体积的PBS，离心，获骨髓细胞；在骨髓细胞中加入PBS轻匀制得悬液；将含海藻糖的分离液加入到离心管中，悬液平铺到分离液上，离心，吸取白膜层细胞；将细胞与冻存液等比例混合分装于冻存管中；先‑80℃冷冻，后转入液氮中冻存；从液氮中取出冻存管立即投入恒温水浴箱中轻轻晃动复融；将复融的细胞悬液移至含有3～7℃生理盐水的离心管中，混匀，离心收集骨髓干细胞；在骨髓干细胞中加入含有0.5％海藻糖的保存液中，使用3～7℃恒温保温箱在24小时内运输至使用单位。本发明使细胞在运输过程中保持活性。

Description

骨髓干细胞的保存及运输方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种骨髓干细胞的保存及运输方法。
背景技术
骨髓是人重要的免疫器官，含有大量的免疫细胞，包括干细胞、淋巴细胞等，在临床应用过程中，常见的问题是很难保证提供足够数量的干细胞。目前主要是利用低温冻存技术保存干细胞，在需要时复苏并诱导培养为各种免疫细胞。但在分离、冻存过程中，会对干细胞产生损伤，甚至毒性，尤其是冻存过程中会显著改变细胞的热力学、化学和物理环境，同时伴随生物性损伤的危险。
另一方面，骨髓中含有较多的脂肪，影响分离效果，不能获得足够的干细胞，再加上冻存过程中对细胞产生的损伤，使免疫细胞冻存复苏后的存活率不高。细胞冻存复苏后的存活率通常在70％-90％之间。细胞冻存复苏后的存活率可能会受到细胞采集、分离、冻存等过程的影响。因此，为提供足够量的干细胞，现有技术中细胞冻存复苏后的存活率仍需进一步提高，同时也应避免回输给患者时出现恶心、呕吐或过敏等不良反应，提高安全性。现有技术中，利用淋巴细胞分离液分离干细胞的效果不是很好，而且常规的Ficoll 400分离液对细胞具有一定的毒性，不利于临床应用。
因此，有必要提供一种能够有效提高干细胞分离率和细胞冻存复苏后的存活率、提高回输到患者的细胞的安全性的提取方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种能够有效提高干细胞分离率和细胞冻存复苏后的存活率、提高回输到患者的细胞的安全性的骨髓干细胞的保存及运输方法。
为解决上述技术问题，本发明提供技术方案如下：
一方面，提供一种骨髓干细胞的保存及运输方法，包括如下步骤：
1)按临床常规骨髓穿刺操作取得红骨髓；
2)将骨髓加入5倍体积的PBS轻轻混匀稀释，400g，5min离心，弃上清及脂肪层，获骨髓细胞；在骨髓细胞中加入等体积的PBS轻轻混匀制得骨髓细胞悬液；
3)将含有海藻糖，超低粘度海藻酸钠的分离液加入到离心管中，所述骨髓细胞悬液平铺到所述分离液上，在8-25℃，200g-800g，10～30min条件下离心，吸取白膜层细胞获得骨髓干细胞；
4)将所述骨髓干细胞与含有2％海藻糖+8％丙三醇+10％DMSO+18％自体血浆+62％注射用生理盐水的冻存液等比例混合分装于细胞冻存管中；将所述冻存管管口密封置于装有异丙醇的冻存盒中；先于-80℃冷冻，然后转入液氮中冻存；
5)将恒温水浴箱温度调节至37℃～39℃，从液氮中取出冻存管立即投入恒温水浴箱中轻轻晃动复融；将复融的细胞悬液移至含有3～7℃生理盐水的离心管中，混匀，3-7℃，500g-800g，10～30min条件下离心收集骨髓干细胞；
6)在骨髓干细胞中加入含有0.5％海藻糖的保存液中，调整细胞浓度为1～6×106细胞/ml；检查骨髓干细胞存活率及细菌、内毒素、支原体；进行免疫学检查；移入无菌管或转运袋中，使用3～7℃恒温保温箱在24小时内运输至使用单位。
进一步地，所述分离液的制备方法为：将符合药用标准的右旋糖酐2～3重量份，海藻糖2～4重量份，超低粘度海藻酸钠0.5～0.8重量份，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.04～0.1重量份，L-甲硫氨酸0.003-0.005重量份和泛影葡胺1～3重量份充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100重量份，再经过0.22μm滤膜过滤制得分离液。
本发明采用的右旋糖酐(Dextran)是一种分支化的葡聚糖，其通过一些乳酸菌合成，典型地包括串珠菌和变形链球菌。临床上常用的有中分子右旋糖酐，主要用作血浆代用品；海藻糖又称漏芦糖、蕈糖等，是一种安全、可靠的天然糖类；由两个葡萄糖分子以1,1-糖苷键构成的非还原性糖，对多种生物活性物质具有非特异性保护作用，对单个核细胞起到一定的保护作用；超低粘度海藻酸钠具有较低的粘度，较多的羟基有助于骨髓干细胞的分离；聚二烯丙基二甲基氯化铵为强阳离子聚电解质有助于骨髓干细胞的分离；本发明的分离液中的各组分配比合理从而起到良好的分离效果。
进一步地，所述分离液的制备方法为：将符合药用标准的右旋糖酐2.5～3重量份，海藻糖2.5～3.5重量份，超低粘度海藻酸钠0.6～0.8重量份，泛影葡胺1.5～2.5重量份，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.05～0.08重量份和L-甲硫氨酸0.003-0.005重量份充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100重量份，再经过0.22μm滤膜过滤制得分离液。
优选地，所述分离液的制备方法为：右旋糖酐2.8重量份，海藻糖3重量份，超低粘度海藻酸钠0.7重量份，泛影葡胺2重量份，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.07重量份，L-甲硫氨酸0.004重量份充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100重量份，再经过0.22μm滤膜过滤制得分离液。
优选地，所述右旋糖酐为Dextran70。
进一步地，所述分离液的密度为1.070～1.090g/cm3，渗透压为275～300smol/kg，pH为6～9，粘度为3.0～5.0cp。
进一步地，所述分离液为无菌状态。
综上所述，本发明的有益效果表现为：
本发明从预处理到分离再到冻存均选用符合静注级原料药标准的原料，原料不确定性小，安全性高；本发明的分离液对骨髓干细胞进行离心处理后，骨髓干细胞在分离介质和血浆的交界面形成比较明显的云雾状细胞条带；本发明采用的右旋糖酐(Dextran)是一种分支化的葡聚糖，其通过一些乳酸菌合成，典型地包括串珠菌和变形链球菌。临床上常用的有中分子右旋糖酐，主要用作血浆代用品；海藻糖又称漏芦糖、蕈糖等，是一种安全、可靠的天然糖类；由两个葡萄糖分子以1,1-糖苷键构成的非还原性糖，对多种生物活性物质具有非特异性保护作用，对单个核细胞起到一定的保护作用；超低粘度海藻酸钠具有较低的粘度，较多的羟基有助于骨髓干细胞的分离；聚二烯丙基二甲基氯化铵为强阳离子聚电解质有助于骨髓干细胞的分离；本发明配方中的全部原料均符合静注级原料药标准，原料不确定性小，安全性高；本发明使用自体血浆用于骨髓干细胞冻存液的一部分，有效减少回输过程的免疫排斥反应；使用DMSO、海藻糖降低低温对细胞的伤害，而且分离液的组分与冻存液组分部分接近，进一步减少外源物质对细胞的伤害，提高安全性；本发明在保存液中加入0.5％的海藻糖进一步保护细胞，使细胞在运输过程中保持活性。
具体实施方式
为使本发明的实施例要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述。但本发明绝非限于这些例子。以下所述仅为本发明较好的实施例，仅仅用以解释本发明，并不能因此而理解为本发明专利范围的限制。应当指出的是，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
实施例一
骨髓干细胞的保存及运输方法，包括如下步骤：
1)按临床常规骨髓穿刺操作取得红骨髓；
2)将骨髓加入5倍体积的PBS轻轻混匀稀释，400g，5min离心，弃上清及脂肪层，获骨髓细胞；在骨髓细胞中加入等体积的PBS轻轻混匀制得骨髓细胞悬液；
3)将含有海藻糖，超低粘度海藻酸钠的分离液加入到离心管中，骨髓细胞悬液平铺到分离液上，在8-25℃，200g-800g，10～30min条件下离心，吸取白膜层细胞获得骨髓干细胞；
4)将骨髓干细胞与含有2％海藻糖+8％丙三醇+10％DMSO+18％自体血浆+62％注射用生理盐水的冻存液等比例混合分装于细胞冻存管中；将冻存管管口密封置于装有异丙醇的冻存盒中；先于-80℃冷冻，然后转入液氮中冻存；
5)将恒温水浴箱温度调节至37℃～39℃，从液氮中取出冻存管立即投入恒温水浴箱中轻轻晃动复融；将复融的细胞悬液移至含有3～7℃生理盐水的离心管中，混匀，3-7℃，500g-800g，10～30min条件下离心收集骨髓干细胞；
6)在骨髓干细胞中加入含有0.5％海藻糖的保存液中，调整细胞浓度为1～6×106细胞/ml；检查骨髓干细胞存活率及细菌、内毒素、支原体；进行免疫学检查；移入无菌管或转运袋中，使用3～7℃恒温保温箱在24小时内运输至使用单位。
其中，分离液的制备方法为：在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的右旋糖酐2g，海藻糖4g，超低粘度海藻酸钠0.5g，泛影葡胺1g，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.1g和L-甲硫氨酸0.005g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
实施例二
骨髓干细胞的保存及运输方法，包括如下步骤：
1)按临床常规骨髓穿刺操作取得红骨髓；
2)将骨髓加入5倍体积的PBS轻轻混匀稀释，400g，5min离心，弃上清及脂肪层，获骨髓细胞；在骨髓细胞中加入等体积的PBS轻轻混匀制得骨髓细胞悬液；
3)将含有海藻糖，超低粘度海藻酸钠的分离液加入到离心管中，骨髓细胞悬液平铺到分离液上，在8-25℃，200g-800g，10～30min条件下离心，吸取白膜层细胞获得骨髓干细胞；
4)将骨髓干细胞与含有2％海藻糖+8％丙三醇+10％DMSO+18％自体血浆+62％注射用生理盐水的冻存液等比例混合分装于细胞冻存管中；将冻存管管口密封置于装有异丙醇的冻存盒中；先于-80℃冷冻，然后转入液氮中冻存；
5)将恒温水浴箱温度调节至37℃～39℃，从液氮中取出冻存管立即投入恒温水浴箱中轻轻晃动复融；将复融的细胞悬液移至含有3～7℃生理盐水的离心管中，混匀，3-7℃，500g-800g，10～30min条件下离心收集骨髓干细胞；
6)在骨髓干细胞中加入含有0.5％海藻糖的保存液中，调整细胞浓度为1～6×106细胞/ml；检查骨髓干细胞存活率及细菌、内毒素、支原体；进行免疫学检查；移入无菌管或转运袋中，使用3～7℃恒温保温箱在24小时内运输至使用单位。
其中，分离液的制备方法为：在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的右旋糖酐3g，海藻糖2g，超低粘度海藻酸钠0.8g，泛影葡胺3g，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.04g和L-甲硫氨酸0.003g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
实施例三
骨髓干细胞的保存及运输方法，包括如下步骤：
1)按临床常规骨髓穿刺操作取得红骨髓；
2)将骨髓加入5倍体积的PBS轻轻混匀稀释，400g，5min离心，弃上清及脂肪层，获骨髓细胞；在骨髓细胞中加入等体积的PBS轻轻混匀制得骨髓细胞悬液；
3)将含有海藻糖，超低粘度海藻酸钠的分离液加入到离心管中，骨髓细胞悬液平铺到分离液上，在8-25℃，200g-800g，10～30min条件下离心，吸取白膜层细胞获得骨髓干细胞；
4)将骨髓干细胞与含有2％海藻糖+8％丙三醇+10％DMSO+18％自体血浆+62％注射用生理盐水的冻存液等比例混合分装于细胞冻存管中；将冻存管管口密封置于装有异丙醇的冻存盒中；先于-80℃冷冻，然后转入液氮中冻存；
5)将恒温水浴箱温度调节至37℃～39℃，从液氮中取出冻存管立即投入恒温水浴箱中轻轻晃动复融；将复融的细胞悬液移至含有3～7℃生理盐水的离心管中，混匀，3-7℃，500g-800g，10～30min条件下离心收集骨髓干细胞；
6)在骨髓干细胞中加入含有0.5％海藻糖的保存液中，调整细胞浓度为1～6×106细胞/ml；检查骨髓干细胞存活率及细菌、内毒素、支原体；进行免疫学检查；移入无菌管或转运袋中，使用3～7℃恒温保温箱在24小时内运输至使用单位。
其中，分离液的制备方法为：在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的右旋糖酐2.5g，海藻糖3.5g，超低粘度海藻酸钠0.6g，泛影葡胺2.5g，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.08g和L-甲硫氨酸0.004g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
实施例四
骨髓干细胞的保存及运输方法，包括如下步骤：
1)按临床常规骨髓穿刺操作取得红骨髓；
2)将骨髓加入5倍体积的PBS轻轻混匀稀释，400g，5min离心，弃上清及脂肪层，获骨髓细胞；在骨髓细胞中加入等体积的PBS轻轻混匀制得骨髓细胞悬液；
3)将含有海藻糖，超低粘度海藻酸钠的分离液加入到离心管中，骨髓细胞悬液平铺到分离液上，在8-25℃，200g-800g，10～30min条件下离心，吸取白膜层细胞获得骨髓干细胞；
4)将骨髓干细胞与含有2％海藻糖+8％丙三醇+10％DMSO+18％自体血浆+62％注射用生理盐水的冻存液等比例混合分装于细胞冻存管中；将冻存管管口密封置于装有异丙醇的冻存盒中；先于-80℃冷冻，然后转入液氮中冻存；
5)将恒温水浴箱温度调节至37℃～39℃，从液氮中取出冻存管立即投入恒温水浴箱中轻轻晃动复融；将复融的细胞悬液移至含有3～7℃生理盐水的离心管中，混匀，3-7℃，500g-800g，10～30min条件下离心收集骨髓干细胞；
6)在骨髓干细胞中加入含有0.5％海藻糖的保存液中，调整细胞浓度为1～6×106细胞/ml；检查骨髓干细胞存活率及细菌、内毒素、支原体；进行免疫学检查；移入无菌管或转运袋中，使用3～7℃恒温保温箱在24小时内运输至使用单位。
其中，分离液的制备方法为：在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的右旋糖酐3g，海藻糖2.5g，超低粘度海藻酸钠0.8g，泛影葡胺1.5g，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.05g和L-甲硫氨酸0.003g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
实施例五
骨髓干细胞的保存及运输方法，包括如下步骤：
1)按临床常规骨髓穿刺操作取得红骨髓；
2)将骨髓加入5倍体积的PBS轻轻混匀稀释，400g，5min离心，弃上清及脂肪层，获骨髓细胞；在骨髓细胞中加入等体积的PBS轻轻混匀制得骨髓细胞悬液；
3)将含有海藻糖，超低粘度海藻酸钠的分离液加入到离心管中，骨髓细胞悬液平铺到分离液上，在8-25℃，200g-800g，10～30min条件下离心，吸取白膜层细胞获得骨髓干细胞；
4)将骨髓干细胞与含有2％海藻糖+8％丙三醇+10％DMSO+18％自体血浆+62％注射用生理盐水的冻存液等比例混合分装于细胞冻存管中；将冻存管管口密封置于装有异丙醇的冻存盒中；先于-80℃冷冻，然后转入液氮中冻存；
5)将恒温水浴箱温度调节至37℃～39℃，从液氮中取出冻存管立即投入恒温水浴箱中轻轻晃动复融；将复融的细胞悬液移至含有3～7℃生理盐水的离心管中，混匀，3-7℃，500g-800g，10～30min条件下离心收集骨髓干细胞；
6)在骨髓干细胞中加入含有0.5％海藻糖的保存液中，调整细胞浓度为1～6×106细胞/ml；检查骨髓干细胞存活率及细菌、内毒素、支原体；进行免疫学检查；移入无菌管或转运袋中，使用3～7℃恒温保温箱在24小时内运输至使用单位。
其中，分离液的制备方法为：在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的右旋糖酐2.6g，海藻糖3.3g，超低粘度海藻酸钠0.9g，泛影葡胺2.2g，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.07g和L-甲硫氨酸0.005g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
实施例六
骨髓干细胞的保存及运输方法，包括如下步骤：
1)按临床常规骨髓穿刺操作取得红骨髓；
2)将骨髓加入5倍体积的PBS轻轻混匀稀释，400g，5min离心，弃上清及脂肪层，获骨髓细胞；在骨髓细胞中加入等体积的PBS轻轻混匀制得骨髓细胞悬液；
3)将含有海藻糖，超低粘度海藻酸钠的分离液加入到离心管中，骨髓细胞悬液平铺到分离液上，在8-25℃，200g-800g，10～30min条件下离心，吸取白膜层细胞获得骨髓干细胞；
4)将骨髓干细胞与含有2％海藻糖+8％丙三醇+10％DMSO+18％自体血浆+62％注射用生理盐水的冻存液等比例混合分装于细胞冻存管中；将冻存管管口密封置于装有异丙醇的冻存盒中；先于-80℃冷冻，然后转入液氮中冻存；
5)将恒温水浴箱温度调节至37℃～39℃，从液氮中取出冻存管立即投入恒温水浴箱中轻轻晃动复融；将复融的细胞悬液移至含有3～7℃生理盐水的离心管中，混匀，3-7℃，500g-800g，10～30min条件下离心收集骨髓干细胞；
6)在骨髓干细胞中加入含有0.5％海藻糖的保存液中，调整细胞浓度为1～6×106细胞/ml；检查骨髓干细胞存活率及细菌、内毒素、支原体；进行免疫学检查；移入无菌管或转运袋中，使用3～7℃恒温保温箱在24小时内运输至使用单位。
其中，分离液的制备方法为：在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的右旋糖酐2.8g，海藻糖2.8g，超低粘度海藻酸钠0.6g，泛影葡胺1.8g，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.05g和L-甲硫氨酸0.004g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
实施例七
骨髓干细胞的保存及运输方法，包括如下步骤：
1)按临床常规骨髓穿刺操作取得红骨髓；
2)将骨髓加入5倍体积的PBS轻轻混匀稀释，400g，5min离心，弃上清及脂肪层，获骨髓细胞；在骨髓细胞中加入等体积的PBS轻轻混匀制得骨髓细胞悬液；
3)将含有海藻糖，超低粘度海藻酸钠的分离液加入到离心管中，骨髓细胞悬液平铺到分离液上，在8-25℃，200g-800g，10～30min条件下离心，吸取白膜层细胞获得骨髓干细胞；
4)将骨髓干细胞与含有2％海藻糖+8％丙三醇+10％DMSO+18％自体血浆+62％注射用生理盐水的冻存液等比例混合分装于细胞冻存管中；将冻存管管口密封置于装有异丙醇的冻存盒中；先于-80℃冷冻，然后转入液氮中冻存；
5)将恒温水浴箱温度调节至37℃～39℃，从液氮中取出冻存管立即投入恒温水浴箱中轻轻晃动复融；将复融的细胞悬液移至含有3～7℃生理盐水的离心管中，混匀，3-7℃，500g-800g，10～30min条件下离心收集骨髓干细胞；
6)在骨髓干细胞中加入含有0.5％海藻糖的保存液中，调整细胞浓度为1～6×106细胞/ml；检查骨髓干细胞存活率及细菌、内毒素、支原体；进行免疫学检查；移入无菌管或转运袋中，使用3～7℃恒温保温箱在24小时内运输至使用单位。
其中，分离液的制备方法为：在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的右旋糖酐2.5g，海藻糖3.4g，超低粘度海藻酸钠0.8g，泛影葡胺1.5g，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.06g和L-甲硫氨酸0.005g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
实施例八
骨髓干细胞的保存及运输方法，包括如下步骤：
1)按临床常规骨髓穿刺操作取得红骨髓；
2)将骨髓加入5倍体积的PBS轻轻混匀稀释，400g，5min离心，弃上清及脂肪层，获骨髓细胞；在骨髓细胞中加入等体积的PBS轻轻混匀制得骨髓细胞悬液；
3)将含有海藻糖，超低粘度海藻酸钠的分离液加入到离心管中，骨髓细胞悬液平铺到分离液上，在8-25℃，200g-800g，10～30min条件下离心，吸取白膜层细胞获得骨髓干细胞；
4)将骨髓干细胞与含有2％海藻糖+8％丙三醇+10％DMSO+18％自体血浆+62％注射用生理盐水的冻存液等比例混合分装于细胞冻存管中；将冻存管管口密封置于装有异丙醇的冻存盒中；先于-80℃冷冻，然后转入液氮中冻存；
5)将恒温水浴箱温度调节至37℃～39℃，从液氮中取出冻存管立即投入恒温水浴箱中轻轻晃动复融；将复融的细胞悬液移至含有3～7℃生理盐水的离心管中，混匀，3-7℃，500g-800g，10～30min条件下离心收集骨髓干细胞；
6)在骨髓干细胞中加入含有0.5％海藻糖的保存液中，调整细胞浓度为1～6×106细胞/ml；检查骨髓干细胞存活率及细菌、内毒素、支原体；进行免疫学检查；移入无菌管或转运袋中，使用3～7℃恒温保温箱在24小时内运输至使用单位。
其中，分离液的制备方法为：在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的右旋糖酐2.8g，海藻糖3g，超低粘度海藻酸钠0.7g，泛影葡胺2g，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.07g和L-甲硫氨酸0.004g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
对比例一
骨髓干细胞的保存及运输方法，包括如下步骤：
1)按临床常规骨髓穿刺操作取得红骨髓；
2)将骨髓加入5倍体积的PBS轻轻混匀稀释，400g，5min离心，弃上清及脂肪层，获骨髓细胞；在骨髓细胞中加入等体积的PBS轻轻混匀制得骨髓细胞悬液；
3)将分离液加入到离心管中，骨髓细胞悬液平铺到分离液上，在8-25℃，200g-800g，10～30min条件下离心，吸取白膜层细胞获得骨髓干细胞；
4)将骨髓干细胞与含有10％丙三醇+10％DMSO+18％自体血浆+62％注射用生理盐水的冻存液等比例混合分装于细胞冻存管中；将冻存管管口密封置于装有异丙醇的冻存盒中；先于-80℃冷冻，然后转入液氮中冻存；
5)将恒温水浴箱温度调节至37℃～39℃，从液氮中取出冻存管立即投入恒温水浴箱中轻轻晃动复融；将复融的细胞悬液移至含有3～7℃生理盐水的离心管中，混匀，3-7℃，500g-800g，10～30min条件下离心收集骨髓干细胞；
6)在骨髓干细胞中加入保存液中，调整细胞浓度为1～6×106细胞/ml；检查骨髓干细胞存活率及细菌、内毒素、支原体；进行免疫学检查；移入无菌管或转运袋中，使用3～7℃恒温保温箱在24小时内运输至使用单位。
其中，分离液的制备方法为：在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的右旋糖酐3.6g，羟乙基淀粉1.3g和泛影葡胺9g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
对比例二
骨髓干细胞的保存及运输方法，包括如下步骤：
1)按临床常规骨髓穿刺操作取得红骨髓；
2)将骨髓加入5倍体积的PBS轻轻混匀稀释，400g，5min离心，弃上清及脂肪层，获骨髓细胞；在骨髓细胞中加入等体积的PBS轻轻混匀制得骨髓细胞悬液；
3)将分离液加入到离心管中，骨髓细胞悬液平铺到分离液上，在8-25℃，200g-800g，10～30min条件下离心，吸取白膜层细胞获得骨髓干细胞；
4)将骨髓干细胞与含有10％丙三醇+10％DMSO+18％自体血浆+62％注射用生理盐水的冻存液等比例混合分装于细胞冻存管中；将冻存管管口密封置于装有异丙醇的冻存盒中；先于-80℃冷冻，然后转入液氮中冻存；
5)将恒温水浴箱温度调节至37℃～39℃，从液氮中取出冻存管立即投入恒温水浴箱中轻轻晃动复融；将复融的细胞悬液移至含有3～7℃生理盐水的离心管中，混匀，3-7℃，500g-800g，10～30min条件下离心收集骨髓干细胞；
6)在骨髓干细胞中加入保存液中，调整细胞浓度为1～6×106细胞/ml；检查骨髓干细胞存活率及细菌、内毒素、支原体；进行免疫学检查；移入无菌管或转运袋中，使用3～7℃恒温保温箱在24小时内运输至使用单位。
其中，分离液的制备方法为：在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的右旋糖酐3.6g，超低粘度海藻酸钠1.3g和泛影葡胺9g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
对比例三
骨髓干细胞的保存及运输方法，包括如下步骤：
1)按临床常规骨髓穿刺操作取得红骨髓；
2)将骨髓加入5倍体积的PBS轻轻混匀稀释，400g，5min离心，弃上清及脂肪层，获骨髓细胞；在骨髓细胞中加入等体积的PBS轻轻混匀制得骨髓细胞悬液；
3)将分离液加入到离心管中，骨髓细胞悬液平铺到分离液上，在8-25℃，200g-800g，10～30min条件下离心，吸取白膜层细胞获得骨髓干细胞；
4)将骨髓干细胞与含有10％丙三醇+10％DMSO+18％自体血浆+62％注射用生理盐水的冻存液等比例混合分装于细胞冻存管中；将冻存管管口密封置于装有异丙醇的冻存盒中；先于-80℃冷冻，然后转入液氮中冻存；
5)将恒温水浴箱温度调节至37℃～39℃，从液氮中取出冻存管立即投入恒温水浴箱中轻轻晃动复融；将复融的细胞悬液移至含有3～7℃生理盐水的离心管中，混匀，3-7℃，500g-800g，10～30min条件下离心收集骨髓干细胞；
6)在骨髓干细胞中加入保存液中，调整细胞浓度为1～6×106细胞/ml；检查骨髓干细胞存活率及细菌、内毒素、支原体；进行免疫学检查；移入无菌管或转运袋中，使用3～7℃恒温保温箱在24小时内运输至使用单位。
其中，分离液的制备方法为：在具备局部百级层流净化条件的环境下，在20℃下，将符合药用标准的葡聚糖T50020g，羟乙基淀粉2g，泛影葡胺2.5g，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.1g和聚乙烯吡咯烷酮2.5g充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100mL，再经过0.22μm滤膜过滤至一支无菌、无内毒素的容器内。
对比例四
骨髓干细胞的保存及运输方法，包括如下步骤：
1)按临床常规骨髓穿刺操作取得红骨髓；
2)将骨髓加入5倍体积的PBS轻轻混匀稀释，400g，5min离心，弃上清及脂肪层，获骨髓细胞；在骨髓细胞中加入等体积的PBS轻轻混匀制得骨髓细胞悬液；
3)将常规Ficoll 400分离液分离液加入到离心管中，骨髓细胞悬液平铺到分离液上，在8-25℃，200g-800g，10～30min条件下离心，吸取白膜层细胞获得骨髓干细胞；
4)将骨髓干细胞与含有10％丙三醇+10％DMSO+18％自体血浆+62％注射用生理盐水的冻存液等比例混合分装于细胞冻存管中；将冻存管管口密封置于装有异丙醇的冻存盒中；先于-80℃冷冻，然后转入液氮中冻存；
5)将恒温水浴箱温度调节至37℃～39℃，从液氮中取出冻存管立即投入恒温水浴箱中轻轻晃动复融；将复融的细胞悬液移至含有3～7℃生理盐水的离心管中，混匀，3-7℃，500g-800g，10～30min条件下离心收集骨髓干细胞；
6)在骨髓干细胞中加入保存液中，调整细胞浓度为1～6×106细胞/ml；检查骨髓干细胞存活率及细菌、内毒素、支原体；进行免疫学检查；移入无菌管或转运袋中，使用3～7℃恒温保温箱在24小时内运输至使用单位。
在上述实施例中，分离液的主要特征参数均在以下范围内：密度为1.070～1.090g/cm3，渗透压为275～300smol/kg，pH为6～9，粘度为3.0～5.0cp。对比例一至四的分离液的主要特征参数均在以下范围内：密度为1.065～1.090g/cm3，渗透压为275～320smol/kg，pH为6～9，粘度为3.0～5.0cp。可以将本发明配制的分离液贮藏于密闭的无菌玻璃或塑料容器内避光保存备用。
为了验证本发明的复苏后运输18h的免疫细胞的存活率，取少量细胞检测免疫细胞的存活率，结果表明实施例一至八的免疫细胞存活率均在95％以上，纯度在93％以上，而对比例一至四的免疫细胞存活率均在82％以下，纯度低于90％。而分离过程中实施例一至八的免疫细胞分离率95％以上，对比例一至四的免疫细胞分离率均在87％以下，而对比例2比对比例1的淋巴细胞分离率低40％。
上述超低粘度海藻酸钠属低分子化合物，粘度较低，1％的水溶液的粘度与水接近，在医药领域具有降压、降脂的功效。
本发明从预处理到分离再到冻存均选用符合静注级原料药标准的原料，原料不确定性小，安全性高；本发明的分离液对骨髓干细胞进行离心处理后，骨髓干细胞在分离介质和血浆的交界面形成比较明显的云雾状细胞条带；本发明采用的右旋糖酐(Dextran)是一种分支化的葡聚糖，其通过一些乳酸菌合成，典型地包括串珠菌和变形链球菌。临床上常用的有中分子右旋糖酐，主要用作血浆代用品；海藻糖又称漏芦糖、蕈糖等，是一种安全、可靠的天然糖类；由两个葡萄糖分子以1,1-糖苷键构成的非还原性糖，对多种生物活性物质具有非特异性保护作用，对单个核细胞起到一定的保护作用；超低粘度海藻酸钠具有较低的粘度，较多的羟基有助于骨髓干细胞的分离；聚二烯丙基二甲基氯化铵为强阳离子聚电解质有助于骨髓干细胞的分离；本发明的分离液中的各组分配比合理从而起到良好的分离效果；本发明配方中的全部原料均符合静注级原料药标准，原料不确定性小，安全性高；本发明使用自体血浆用于骨髓干细胞冻存液的一部分，有效减少回输过程的免疫排斥反应；使用DMSO、海藻糖降低低温对细胞的伤害，而且分离液的组分与冻存液组分部分接近，进一步减少外源物质对细胞的伤害，提高安全性；本发明在保存液中加入0.5％的海藻糖进一步保护细胞，使细胞在运输过程中保持活性。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种骨髓干细胞的保存及运输方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)按临床常规骨髓穿刺操作取得红骨髓；
2)将骨髓加入5倍体积的PBS轻轻混匀稀释，400g，5min离心，弃上清及脂肪层，获骨髓细胞；在骨髓细胞中加入等体积的PBS轻轻混匀制得骨髓细胞悬液；
3)将含有海藻糖，超低粘度海藻酸钠的分离液加入到离心管中，所述骨髓细胞悬液平铺到所述分离液上，在8-25℃，200g-800g，10～30min条件下离心，吸取白膜层细胞获得骨髓干细胞；
4)将所述骨髓干细胞与含有2％海藻糖+8％丙三醇+10％DMSO+18％自体血浆+62％注射用生理盐水的冻存液等比例混合分装于细胞冻存管中；将所述冻存管管口密封置于装有异丙醇的冻存盒中；先于-80℃冷冻，然后转入液氮中冻存；
5)将恒温水浴箱温度调节至37℃～39℃，从液氮中取出冻存管立即投入恒温水浴箱中轻轻晃动复融；将复融的细胞悬液移至含有3～7℃生理盐水的离心管中，混匀，3-7℃，500g-800g，10～30min条件下离心收集骨髓干细胞；
6)在骨髓干细胞中加入含有0.5％海藻糖的保存液中，调整细胞浓度为1～6×106细胞/ml；检查骨髓干细胞存活率及细菌、内毒素、支原体；进行免疫学检查；移入无菌管或转运袋中，使用3～7℃恒温保温箱在24小时内运输至使用单位；
其中，所述分离液的制备方法为：将符合药用标准的右旋糖酐2～3重量份，海藻糖2～4重量份，超低粘度海藻酸钠0.5～0.8重量份，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.04～0.1重量份，L-甲硫氨酸0.003-0.005重量份和泛影葡胺1～3重量份充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100重量份，再经过0.22μm滤膜过滤制得分离液。
2.根据权利要求1所述的骨髓干细胞的保存及运输方法，其特征在于，所述分离液的制备方法为：将符合药用标准的右旋糖酐2.5～3重量份，海藻糖2.5～3.5重量份，超低粘度海藻酸钠0.6～0.8重量份，泛影葡胺1.5～2.5重量份，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.05～0.08重量份和L-甲硫氨酸0.003-0.005重量份充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100重量份，再经过0.22μm滤膜过滤制得分离液。
3.根据权利要求2所述的骨髓干细胞的保存及运输方法，其特征在于，所述分离液的制备方法为：右旋糖酐2.8重量份，海藻糖3重量份，超低粘度海藻酸钠0.7重量份，泛影葡胺2重量份，聚二烯丙基二甲基氯化铵0.07重量份，L-甲硫氨酸0.004重量份充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100重量份，再经过0.22μm滤膜过滤制得分离液。
4.根据权利要求1至3任一所述的骨髓干细胞的保存及运输方法，其特征在于，所述右旋糖酐为Dextran70。
5.根据权利要求4所述的骨髓干细胞的保存及运输方法，其特征在于，所述分离液的密度为1.070～1.090g/cm3，渗透压为275～300smol/kg，pH为6～9，粘度为3.0～5.0cp。
6.根据权利要求5所述的骨髓干细胞的保存及运输方法，其特征在于，所述分离液为无菌状态。
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