CN109792985A - 细胞冻存液 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种细胞冻存液，其特征在于，其组分按体积百分比包括甘油5～10v/v％；人血白蛋白溶液15～20v/v％；18AA复方氨基酸溶液10～15v/v％；右旋糖酐‑40葡萄糖溶液15～54v/v％；混合糖电解质溶液1～42.5v/v％。本发明的细胞冻存液，其不包含二甲基亚砜(DMSO)，对细胞毒性小；其用人血白蛋白代替血清、血浆等成分，具有较高的临床安全性；其可直接使用市售注射液配置，操作简便，成本低廉；其添加成份明确，便于科研分析；其安全性高，对细胞的损伤小；冻存复苏后细胞扩增能力良好；可用于替代含二甲基亚砜(DMSO)的冷冻液。
Description
技术领域
本发明涉及细胞及生物工程学技术领域，具体的，是一种细胞冻存液。
背景技术
细胞冻存是细胞保存的主要方法之一，具体地来说，细胞冻存是指利用冻存技术将细胞置于低温保存，这种技术可以使细胞暂时脱离生长状态，从而将其细胞特性保存起来，在需要的时候可以通过细胞复苏技术，再复苏细胞用于实验或者其他用途。。
目前，实验室常用的细胞冻存液或市售的细胞冻存液中通常需要加入二甲基亚砜和血清。在低温保存细胞时，二甲基亚砜(DMSO)可以有效地防止细胞内冰晶的形成、渗透压的改变、细胞结构紊乱等导致的细胞损伤。虽然，通常认为当浓度小于10％时，二甲基亚砜(DMSO)的毒性作用很小，但是在疾病的治疗过程中，不同浓度的二甲基亚砜(DMSO)依旧会产生许多的副作用，同时二甲基亚砜(DMSO)也被发现对多种细胞具有毒性，例如成牙本质细胞、结肠肿瘤细胞、星形细胞、干细胞等，这可能涉及多种机制，包括膜渗透性的增加，水份的扩散，细胞内脂滴的减少等。而血清作为一种成分尚不明确的物质，具有一定的批次间差异，导致细胞冻存液的效果不稳定，并且临床使用可能会导致过敏的发生。因此，细胞冻存领域一直需要一种高效、安全、稳定的细胞冻存液，也要求该冻存液可以对一些常用于临床的细胞进行冻存，比如免疫细胞细胞、间充质干细胞等。
发明内容
为解决上述技术问题：本发明提供一种细胞冻存液，高效、安全、稳定；其不含二甲基亚砜和血清，并且可以用于冻存常用于临床的免疫细胞和间充质干细胞。
解决上述问题的技术方案是：本发明提供一种细胞冻存液，其组分按体积百分比包括：甘油5～10v/v％；人血白蛋白溶液15～20v/v％；18AA复方氨基酸溶液10～15v/v％；右旋糖酐-40葡萄糖溶液15～54v/v％；混合糖电解质溶液1～42.5v/v％。
在本发明一实施例中，在所述人血白蛋白溶液中，人血白蛋白的质量占比为20％。
在本发明一实施例中，所述18AA复方氨基酸溶液中的组分包括L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-丙氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸；L-门冬氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸盐酸盐、L-赖氨酸盐酸盐、L-缬氨酸、L-苏氨酸、L-组氨酸盐酸盐、L-色氨酸、L-蛋氨酸、L-胱氨酸、甘氨酸、山梨醇、辅料。
在本发明一实施例中，所述L-脯氨酸的质量浓度为0.5g/L-1.5g/L；所述L-丝氨酸的质量浓度为0.5g/L-1.5g/L；所述L-丙氨酸的质量浓度为1.5g/L-2.5g/L；所述L-异亮氨酸的质量浓度为3g/L-4g/L；所述L-亮氨酸的质量浓度为4.5g/L-5g/L；所述L-门冬氨酸的质量浓度为2g/L-3g/L；所述L-酪氨酸的质量浓度为0.1g/L-0.5g/L；所述L-谷氨酸的质量浓度为0.5g/L-1g/L；所述L-苯丙氨酸的质量浓度为5g/L-6g/L；所述L-精氨酸盐酸盐的质量浓度为4.5g/L-5.5g/L；所述L-赖氨酸盐酸盐的质量浓度为4g/L-5g/L；所述L-缬氨酸的质量浓度为3g/L-4g/L；所述L-苏氨酸的质量浓度为2g/L-3g/L；所述L-组氨酸盐酸盐的质量浓度为2g/L-3g/L；所述L-色氨酸的质量浓度为0.5g/L-1g/L；所述L-蛋氨酸的质量浓度为2g/L-3g/L；所述L-胱氨酸的质量浓度为0.01g/L-0.2g/L；所述甘氨酸的质量浓度为7g/L-8g/L；所述山梨醇的质量浓度为45g/L-55g/L；所述辅料的质量浓度为0.1g/L-1g/L。
在本发明一实施例中，所述辅料为亚硫酸氢钠。
在本发明一实施例中，所述混合糖电解质溶液中的组分包括葡萄糖、乙酸钠、果糖、氯化钙、木糖醇、氯化镁、磷酸氢二钾、氯化钠、硫酸锌、柠檬酸。
在本发明一实施例中，所述右旋糖酐-40葡萄糖溶液中，右旋糖酐-40的质量浓度为0.06g/ml，葡萄糖的质量浓度为0.05g/ml。
本发明的优点是：本发明的细胞冻存液，其不包含二甲基亚砜(DMSO)，对细胞毒性小；其用人血白蛋白代替血清、血浆等成分，具有较高的临床安全性；其可直接使用市售注射液配置，操作简便，成本低廉；其添加成份明确，便于科研分析；其安全性高，对细胞的损伤小；冻存复苏后细胞扩增能力良好；可用于替代含二甲基亚砜(DMSO)的冷冻液。
具体实施方式
以下实施例用以例示本发明可用以实施的特定实施例，用以说明及理解本发明，而非用以限制本发明。
本发明的细胞冻存液，其组分按体积百分比包括：甘油5～10v/v％；人血白蛋白溶液15～20v/v％；18AA复方氨基酸溶液10～15v/v％；右旋糖酐-40葡萄糖溶液15～54v/v％；混合糖电解质溶液1～42.5v/v％。在所述人血白蛋白溶液中，人血白蛋白的质量占比为20％。所述18AA复方氨基酸溶液中的组分包括L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-丙氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸；L-门冬氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸盐酸盐、L-赖氨酸盐酸盐、L-缬氨酸、L-苏氨酸、L-组氨酸盐酸盐、L-色氨酸、L-蛋氨酸、L-胱氨酸、甘氨酸、山梨醇、辅料。其中，所述辅料为亚硫酸氢钠。所述L-脯氨酸的质量浓度为0.5g/L-1.5g/L；所述L-丝氨酸的质量浓度为0.5g/L-1.5g/L；所述L-丙氨酸的质量浓度为1.5g/L-2.5g/L；所述L-异亮氨酸的质量浓度为3g/L-4g/L；所述L-亮氨酸的质量浓度为4.5g/L-5g/L；所述L-门冬氨酸的质量浓度为2g/L-3g/L；所述L-酪氨酸的质量浓度为0.1g/L-0.5g/L；所述L-谷氨酸的质量浓度为0.5g/L-1g/L；所述L-苯丙氨酸的质量浓度为5g/L-6g/L；所述L-精氨酸盐酸盐的质量浓度为4.5g/L-5.5g/L；所述L-赖氨酸盐酸盐的质量浓度为4g/L-5g/L；所述L-缬氨酸的质量浓度为3g/L-4g/L；所述L-苏氨酸的质量浓度为2g/L-3g/L；所述L-组氨酸盐酸盐的质量浓度为2g/L-3g/L；所述L-色氨酸的质量浓度为0.5g/L-1g/L；所述L-蛋氨酸的质量浓度为2g/L-3g/L；所述L-胱氨酸的质量浓度为0.01g/L-0.2g/L；所述甘氨酸的质量浓度为7g/L-8g/L；所述山梨醇的质量浓度为45g/L-55g/L；所述辅料的质量浓度为0.1g/L-1g/L。
本实施例中，在具体配置时，每1000ml所述18AA复方氨基酸溶液中，所述L-脯氨酸(C5H9NO2)为1.00g；所述L-丝氨酸(C3H7NO3)为1.00g；所述L-丙氨酸(C3H7NO2)为2.00g；所述L-异亮氨酸(C6H13NO2)为3.52g；所述L-亮氨酸(C6H13NO2)为4.90g；L-门冬氨酸(C4H7NO4)为2.50g；所述L-酪氨酸(C9H11NO3)为0.25g；所述L-谷氨酸(C5H9NO4)为0.75g；所述L-苯丙氨酸(C9H11NO2)为5.33g；所述L-精氨酸盐酸盐(C6H14N4O2HCl)为5.00g；所述L-赖氨酸盐酸盐(C6H14N4O2HCl)为4.30g；所述L-缬氨酸(C5H11NO2)为3.60g；所述L-苏氨酸(C4H9NO3)为2.50g；所述L-组氨酸盐酸盐(C6H9N3O2HClH2O)为2.50g；所述L-色氨酸(C11H12N2O2)为0.90g；所述L-蛋氨酸(C15H11NO2S)为2.25g；所述L-胱氨酸(C6H12N2O4S2)为0.10g；所述甘氨酸(C2H5NO2)为7.60g；所述山梨醇(C6H14O6)为50.00g；所述亚硫酸氢钠(NaHSO3)为0.5g。
所述混合糖电解质溶液中的组分包括葡萄糖、乙酸钠、果糖、氯化钙、木糖醇、氯化镁、磷酸氢二钾、氯化钠、硫酸锌、柠檬酸。所述混合糖电解质溶液中，每500ml混合糖电解质溶液含所述葡萄糖30g、所述乙酸钠0.410g、所述果糖15g、所述氯化钙0.185g、所述木糖醇7.5g、所述氯化镁0.255g、所述磷酸氢二钾0.870g、所述氯化钠0.730g、所述硫酸锌0.700mg、所述柠檬酸根据实际需要调配；注射用水500ml。
所述右旋糖酐-40葡萄糖溶液中，右旋糖酐-40的质量浓度为0.06g/ml，葡萄糖的质量浓度为0.05g/ml。所述右旋糖酐-40葡萄糖溶液为葡萄糖的无菌水溶液。可以用市售右旋糖酐-40葡萄糖注射液代替。
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
实施例1
一种细胞冻存液，其组分按体积百分比包括：甘油10v/v％；人血白蛋白溶液20v/v％；18AA复方氨基酸溶液15v/v％；右旋糖酐-40葡萄糖溶液54v/v％；混合糖电解质溶液1v/v％。
实施例2
一种细胞冻存液，其组分按体积百分比包括：甘油7.5v/v％；人血白蛋白溶液20v/v％；18AA复方氨基酸溶液15v/v％；右旋糖酐-40葡萄糖溶液42.5v/v％；混合糖电解质溶液15v/v％。
实施例3
一种细胞冻存液，其组分按体积百分比包括：甘油7.5v/v％；人血白蛋白溶液20v/v％；18AA复方氨基酸溶液15v/v％；右旋糖酐-40葡萄糖溶液15v/v％；混合糖电解质溶液42.5v/v％。
实施例4
一种细胞冻存液，其组分按体积百分比包括：甘油5v/v％；人血白蛋白溶液20v/v％；18AA复方氨基酸溶液15v/v％；右旋糖酐-40葡萄糖溶液30v/v％；混合糖电解质溶液30v/v％。
比较例1
第一冻存液：含有胎牛血清、二甲基亚砜，其中所述胎牛血清、二甲基亚砜的体积比为1:9。
比较例2
第二冻存液：百恩维生物公司(Biowit)市售的无二甲基亚砜(DMSO)冻存液。
实验试剂：
人脐带来源间充质干细胞血清替代物(AventaCell BioMedical公司)
人CIK细胞无血清培养基(上海倍谙基生物科技有限公司)
间充质干细胞培养基：包含人间充质干细胞血清替代物的αMEM培养基。
成骨诱导培养基：包含体积百分比为10％的胎牛血清(FBS)、0.1μmol/L地塞米松、50μmol/L抗坏血酸、10mmol/Lβ-甘油磷酸钠的DMEM培养基。
成脂诱导培养基：包含体积百分比为10％的胎牛血清(FBS)、1μmol/L地塞米松、0.5mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、10mmol/L胰岛素、200μmol/L吲哚美辛的DMEM培养基。
胎牛血清、胰蛋白酶(GIBCO公司)
二甲基亚砜(DMSO)、油红O、茜素红、地塞米松、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、胰岛素、吲哚美辛(Sigma公司)
细胞冻存液的效果验证
将本发明实施例1～7所制备的细胞冻存液与比较例1的第一冻存液、比较例2的第二冻存液分别用下述方法进行细胞冻存和复苏实验：
人脐带来源间充质干细胞冻存：培养生长成单层的人脐带来源间充质干细胞，在对数生长期时，将人脐带来源间充质干细胞用胰蛋白酶液消化4分钟，加入15ml的间充质干细胞培养基，用吸管轻轻吹打使人脐带来源间充质干细胞均匀，用离心机以1000rpm的转速离心5分钟，弃上清，分别加入实施例1-4和比较例1-2所制备的细胞冻存液，混均。以1×106cells/ml的浓度，1ml的体系置入1.5ml的冻存管中；4℃保存30min，-20℃保存2h后转移到-80℃冰箱，隔天转移到液氮中长期保存，冻存85天。
CIK细胞冻存：用吸管轻轻吹打使人CIK细胞均匀，用离心机以1500rpm离心5分钟，弃上清，分别加入实施例7和比较例1-2所制备的细胞冻存液，混均。以1×107cells/ml的浓度，1ml的体系置入1.5ml的冻存管中；4℃保存30min，-20℃保存2h后转移到-80℃冰箱，隔天转移到液氮中长期保存。冻存100天。
人脐带来源间充质干细胞复苏：将人脐带来源间充质干细胞从-80℃的冰箱中取出，快速转移到37℃水浴锅中解冻，随后将人脐带来源间充质干细胞移到1.5ml EP管中，用1000r/min离心5min，经间充质干细胞培养基悬后以5000个/孔接种到到24孔板。
CIK细胞复苏：将人CIK细胞从-80℃冰箱中取出，快速转移到37℃水浴锅中解冻，随后将人CIK细胞移到1.5ml EP管中，用1500r/min离心5min，经人CIK细胞无血清培养基重悬后以500000个/孔接种到48孔板。
人脐带来源间充质干细胞多向分化潜能检测：取复苏后的人脐带来源间充质干细胞，按1×104/孔接种于24孔板，置于含有浓度为5％的CO2、温度为37℃的培养箱中，24h后分别更换为成骨及成脂诱导培养基，每隔2天更换培养基。21天后，诱导成骨的细胞用茜素红染色，诱导成脂的细胞用油红O染色。
冻存85天后人脐带来源间充质干细胞的存活率见表1。
表1：冻存85天后人脐带来源间充质干细胞的存活率
| 细胞存活率(100％) | |
| 冻存前 | 93.00％ |
| 实施例1的冻存液 | 85.71％ |
| 实施例2的冻存液 | 71.43％ |
| 实施例3的冻存液 | 62.50％ |
| 实施例4的冻存液 | 50.00％ |
| 比较例1的冻存液 | 83.95％ |
| 比较例2的冻存液 | 75.86％ |
冻存100天后人CIK细胞的存活率见表2。
表2：冻存100天后人CIK细胞的存活率
冻存85天后人脐带来源间充质干细胞复苏4天后的扩增倍数见表3。
表3：冻存85天后人脐带来源间充质干细胞复苏4天后的扩增倍数
| 细胞扩增倍数 | |
| 实施例1的冻存液 | 20.6 |
| 实施例2的冻存液 | 35.2 |
| 比较例1的冻存液 | 46.4 |
| 比较例2的冻存液 | 25.2 |
从以上的实验结果(表1-表3)可以看出，与实验室常用的自配的第一冻存液和市售的无二甲基亚砜(DMSO)的第二冻存液相比，本发明的细胞冻存液，冻存复苏后的细胞形态不变，存活率高，复苏后细胞扩增情况良好，并且复苏后的间充质干细胞可以保持其多向分化能力。本发明的冻存液既不包含二甲基亚砜(DMSO)，安全无毒，不会给实验人员的健康和环境带来危害；也不包含血清等不能直接临床输注的成分。因此，本发明冻存液可以用临床注射液直接配置，十分便利，成分简单明确，价格低廉，可广泛用于细胞冻存技术领域，具有较好的应用前景。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种细胞冻存液，其特征在于，其组分按体积百分比包括：
2.根据权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于，在所述人血白蛋白溶液中，人血白蛋白的质量占比为20％。
3.根据权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于，所述18AA复方氨基酸溶液中的组分包括L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-丙氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸；L-门冬氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸盐酸盐、L-赖氨酸盐酸盐、L-缬氨酸、L-苏氨酸、L-组氨酸盐酸盐、L-色氨酸、L-蛋氨酸、L-胱氨酸、甘氨酸、山梨醇、辅料。
4.根据权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于，所述L-脯氨酸的质量浓度为0.5g/L-1.5g/L；所述L-丝氨酸的质量浓度为0.5g/L-1.5g/L；所述L-丙氨酸的质量浓度为1.5g/L-2.5g/L；所述L-异亮氨酸的质量浓度为3g/L-4g/L；所述L-亮氨酸的质量浓度为4.5g/L-5g/L；所述L-门冬氨酸的质量浓度为2g/L-3g/L；所述L-酪氨酸的质量浓度为0.1g/L-0.5g/L；所述L-谷氨酸的质量浓度为0.5g/L-1g/L；所述L-苯丙氨酸的质量浓度为5g/L-6g/L；所述L-精氨酸盐酸盐的质量浓度为4.5g/L-5.5g/L；所述L-赖氨酸盐酸盐的质量浓度为4g/L-5g/L；所述L-缬氨酸的质量浓度为3g/L-4g/L；所述L-苏氨酸的质量浓度为2g/L-3g/L；所述L-组氨酸盐酸盐的质量浓度为2g/L-3g/L；所述L-色氨酸的质量浓度为0.5g/L-1g/L；所述L-蛋氨酸的质量浓度为2g/L-3g/L；所述L-胱氨酸的质量浓度为0.01g/L-0.2g/L；所述甘氨酸的质量浓度为7g/L-8g/L；所述山梨醇的质量浓度为45g/L-55g/L；所述辅料的质量浓度为0.1g/L-1g/L。
5.根据权利要求3所述的细胞冻存液，其特征在于，所述辅料为亚硫酸氢钠。
6.根据权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于，所述混合糖电解质溶液中的组分包括葡萄糖、乙酸钠、果糖、氯化钙、木糖醇、氯化镁、磷酸氢二钾、氯化钠、硫酸锌、柠檬酸。
7.根据权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于，所述右旋糖酐-40葡萄糖溶液中，右旋糖酐-40的质量浓度为0.06g/ml，葡萄糖的质量浓度为0.05g/ml。
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