FR3017299A1 - Composition pharmaceutique comprenant des erythrocytes encapsulant une enzyme a plp et son cofacteur - Google Patents

Abstract

L'invention concerne une composition pharmaceutique contenant une enzyme à PLP, et éventuellement son cofacteur, le pyridoxal phosphate (PLP), et/ou un précurseur phosphaté ou non phosphaté du PLP, son utilisation comme médicament, son procédé de production et une méthode de traitement thérapeutique y afférente. La composition pharmaceutique comprend des érythrocytes et un véhicule pharmaceutiquement acceptable, les érythrocytes encapsulant l'enzyme à PLP. L'enzyme à PLP peut être de la méthioninase, de la tyrosine phénol-lyase, de la tyrosine aminotransférase ou de la cystathionine bêta-synthase .

Description

L'invention concerne une composition pharmaceutique contenant une enzyme à PLP, par exemple de la méthioninase, et éventuellement son cofacteur, le pyridoxal phosphate (PLP), et/ou un précurseur phosphaté ou non phosphaté du PLP, son utilisation comme médicament, son procédé de production et une méthode de traitement thérapeutique y afférente. Le pyridoxal phosphate (PLP), un dérivé de la vitamine B6, est un cofacteur utilisé par une grande variété d'enzymes. Appelées « enzymes à PLP », elles constituent un groupe d'environ 145 enzymes distinctes impliquées pour la plupart dans les voies métaboliques de transformation des acides aminés. Les réactions catalysées par ces enzymes incluent les décarboxylations, les transaminations ou encore les réactions d'éliminations (Percudani et Perrachi, EMBO reports vol. 4 n°9, 2003). Du fait du nombre important d'enzymes appartenant au groupe des enzymes à PLP et des réactions catalysées par ces dernières, leur potentiel d'utilisation en thérapeutique humaine a été investigué. Parmi les différentes opportunités d'intervention thérapeutique associées aux enzymes à PLP, leur utilisation dans le traitement du cancer et de pathologies cardio-vasculaires a fait l'objet de nombreuses études (EI-Sayed et Shindia Targets in gene therapy Prof. Yongping you ed., 2011). Plus particulièrement, la méthioninase aurait un intérêt pour dépléter la méthionine plasmatique et induire l'apoptose de cellules tumorales auxotrophes pour cet acide aminé. Il a été montré que de nombreuses cellules tumorales humaines étaient incapables de proliférer lorsque la méthionine est remplacée par son précurseur l'homocystéine tandis que les cellules normales ont la capacité de proliférer dans un tel milieu. Cette dépendance à la méthionine a été observée notamment pour des lignées cellulaires dérivées de cancers du sein, poumon, côlon, rein, vessie, mélanome et glioblastome (Durando et al., Bull Cancer 2008 ; 95 (1) : 69-76).

Malgré l'intérêt thérapeutique des enzymes à PLP, le développement de traitements basés sur une administration par voie systémique de ces enzymes se heurte à d'importantes limitations : - les enzymes à PLP sont principalement obtenues à partir d'organismes procaryotes et sont de ce fait fortement immunogènes en cas d'administration à l'Homme - leur demi-vie dans le plasma est courte, nécessitant le recours à des administrations fréquentes ou à des doses importantes pour pouvoir obtenir une activité suffisante - la faible biodisponibilité du cofacteur PLP dans le plasma entraîne une chute rapide de leur activité après administration. Ces limitations ont été largement décrites dans le cas de la méthioninase. Sun et al. ont produit une méthioninase recombinante dans la bactérie Escherichia cou à partir du gène codant pour l'enzyme extrait de la bactérie Pseudomonas putida. L'enzyme ainsi obtenue appelée rMETase a été injectée par voie intraveineuse à des souris immunodéficientes.

Vingt-quatre heures après injection, l'activité plasmatique de l'enzyme, déterminée in vitro sans ajout de PLP, était indétectable, signalant sa faible durée d'action (Sun et al. Cancer Research 63, 8377-8383, 2003). Un an plus tard, la même équipe publiait les résultats de l'administration de la rMETase chez le singe macaque (Yang et al. Clinical Cancer Research Vol. 10, 2131-2138, 2004). Dans cette étude, des doses de rMETase de 1000, 2000 et 4000 unités/kg ont été administrées par voie intraveineuse à 6 singes. Une 2ème injection a été effectuée 28 jours après la première et a conduit chez 2 singes à un choc anaphylactique entraînant la mort d'un des deux animaux. L'immunogénicité de la rMETase a par ailleurs entraîné le développement d'anticorps anti-rMETase de type IgG (majoritaire) et IgM pour la majorité des animaux traités (4 sur 6). Le caractère neutralisant de ces anticorps a été démontré in vitro. Pour pallier les limitations de demi-vie courte et d'immunogénicité de leur méthioninase, les mêmes auteurs ont alors proposé de recourir à la pegylation de leur enzyme. Le greffage de groupements PEG est une technique connue pour augmenter la demi-vie et diminuer l'immunogénicité des protéines thérapeutiques. Des dérivés de PEG activés ont été mis en présence de rMETase afin d'obtenir de la PEG-rMETase. Cette modification de l'enzyme a fait passer sa demi-vie chez la souris de 2 h pour l'enzyme libre à 38 h pour la PEG-rMETase. Cette augmentation significative de la demi-vie s'accompagne d'une diminution de l'immunogénicité (Sun et al. Cancer Research 63, 8377-8383, 2003). Si la pegylation a partiellement répondu aux problématiques de demi-vie et d'immunogénicité, une problématique majeure des enzymes à PLP demeure : la faible biodisponibilité du cofacteur dans le plasma. Les enzymes à PLP sont catalytiquement actives en présence de leur cofacteur le PLP, on parle alors d'holoenzyme. Après injection, l'holoenzyme est rapidement convertie en apoenzyme inactive du fait de la perte du cofacteur PLP. Le PLP apporté de manière exogène est rapidement indisponible pour l'enzyme, la demi-vie plasmatique du PLP libre n'étant d'environ que de 15 minutes. Ce phénomène a été démontré dans le cas de l'enzyme à PLP Tyrosine Phenol-Lyase (TPL). Elmer et al. (Cancer Research 38 ; 3663-3667, 1978) ont purifié de la TPL et l'ont injectée à des souris normales. 5 heures après l'injection, des prélèvements de sang ont été effectués afin de doser l'activité de la TPL. Ce dosage d'activité a été réalisé selon 2 conditions : une partie des échantillons a été dosée sans ajout de PLP, l'autre partie a été dosée avec l'ajout d'une quantité optimale de PLP dans le mélange réactionnel pour le dosage (ces 2 conditions reflétant l'activité effectivement mesurée dans le plasma et l'activité potentielle de l'enzyme si elle avait accès à son cofacteur PLP). La comparaison des résultats obtenus montre que seulement 7% de l'activité potentielle de la TPL est effectivement mesurée dans le plasma. Le même test a été conduit avec un groupe de souris dans lequel, concomitamment à l'injection de TPL, une quantité importante de PLP a été administrée, puis des réinjections de PLP ont été effectuées toutes les heures. Dans ce cas de figure, la comparaison des résultats de dosage montre que 37% de l'activité potentielle est effectivement mesurée dans le plasma. La coadministration de PLP a donc permis d'améliorer de manière limitée l'activité de la TPL dans le plasma. Cependant le PLP apporté de manière exogène est rapidement indisponible pour la TPL, la demi-vie plasmatique du PLP libre étant d'environ 15 minutes. Par conséquent l'élévation du niveau de PLP dans le plasma par des injections répétées de PLP en solution n'est pas réalisable. Elmer et al. proposent d'apporter le PLP de manière prolongée dans le temps via un implant composé de spermaceti et d'huile d'arachide injecté par voie intramusculaire au niveau de la hanche. Néanmoins cette solution ne s'avère pas convaincante, elle ne parvient pas à rétablir l'activité effectivement mesurée dans le plasma au-delà de 25% de l'activité potentielle et elle n'améliore pas de manière statistiquement significative l'effet anti-tumoral de la TPL chez des souris implantées avec une tumeur de mélanome B-16.Des observations similaires ont été faites avec la méthioninase. Sun et al. (Cancer Research 63, 8377-8383, 2003) constatent, qu'in vitro, l'holoenzyme PLP-rMETase est relativement stable mais, qu'in vivo, ce complexe se dissocie rapidement conduisant à une perte d'activité de la rMETase. Les auteurs montrent de plus que la durée de déplétion en méthionine obtenue avec de la rMETase ainsi qu'avec de la PEG-rMETase peut être améliorée par une supplémentation en PLP via l'implantation d'une pompe à PLP (pompe administrant le PLP en continu). Néanmoins ce dispositif d'administration continu se heurtera invariablement à la problématique de la faible biodisponibilité du PLP dans le plasma. Par conséquent bien que le potentiel thérapeutique des enzymes à PLP ait fait l'objet de nombreuses recherches ayant conduit en particulier pour la méthioninase à la réalisation d'études cliniques pilotes, aucune démonstration de l'efficacité clinique de ces enzymes n'a pu être apportée. Ainsi dans le but d'exploiter le potentiel thérapeutique des enzymes à PLP, il serait avantageux de disposer d'une solution permettant de maintenir ces enzymes en présence d'une quantité optimale et disponible de PLP.

Divers procédés ont été décrits pour permettre l'incorporation de principes actifs dans les érythrocytes. Parmi ces procédés, la technique dite de lyse-rescellement est la plus répandue. Cette technique comprend trois variantes, qui sont la dialyse hypotonique, la « preswelling » hypotonique et la dilution hypotonique, toutes basées sur la différence de pression osmotique entre l'intérieur et l'extérieur des érythrocytes. Ces variantes ont en commun les cinq étapes suivantes : un culot globulaire est lavé et centrifugé une ou plusieurs fois avec un tampon physiologique, les érythrocytes sont mis en contact avec un milieu liquide hypotonique aboutissant à l'ouverture de pores dans la membrane érythrocytaire, le principe actif entre dans les érythrocytes, les pores sont refermés (« rescellés ») à l'aide d'un tampon hypertonique, enfermant le principe actif à l'intérieur des érythrocytes, puis ceux-ci sont mis en suspension dans une solution de conservation. La technique de dialyse hypotonique est la plus intéressante et a fait l'objet de développements industriels. Celle décrite dans EP 1 773 452 est la plus performante actuellement, elle présente l'avantage d'être reproductible et d'améliorer le rendement d'encapsulation du principe actif. L'encapsulation d'enzymes dans des érythrocytes, en vue de limiter les risques liés à l'immunogénicité de l'enzyme et à prolonger sa demi-vie, a déjà été proposée dans des travaux qui ont fait l'objet de publications scientifiques. L'encapsulation d'une enzyme, la L- asparaginase a été décrite dans EP 1 773 452, de même que l'arginine déiminase dans EP 1 874 341. Les travaux antérieurs ne concernent pas une enzyme à cofacteur et n'abordent pas la complexité liée à la cinétique d'une enzyme à PLP et de son cofacteur PLP.

Un objectif de l'invention est de fournir une composition pharmaceutique contenant une enzyme à PLP , qui permette de limiter les risques liés à l'immunogénicité de l'enzyme, de prolonger sa demi-vie tout en mettant l'enzyme en présence d'une quantité optimale et disponible de son cofacteur PLP. L'invention a ainsi pour objet une suspension d'érythrocytes dans un véhicule pharmaceutiquement acceptable ou une composition pharmaceutique comprenant des érythrocytes et un véhicule pharmaceutiquement acceptable, les érythrocytes encapsulant une enzyme à PLP. On parlera ci-après de composition pour désigner indifféremment la suspension et la composition pharmaceutique. Par « encapsulant », on entend que le principe actif (enzyme et éventuellement cofacteur et/ou autre molécule) est présent essentiellement ou totalement à l'intérieur. « Essentiellement » signifie qu'une proportion minoritaire du principe actif peut néanmoins se trouver piégée dans la membrane. La composition contient notamment de 0,01 à 30, de préférence de 0,05 à 10 mg d'enzyme à PLP par ml de globules rouges. Suivant un premier mode de réalisation, l'enzyme à PLP est la méthioninase, encore appelée, entre autres, L-méthioninase, Méthionine Gamma Lyase MGL, numéro EC 4.4.1.11, numéro CAS 42616-25-1. Pour connaître des sources de méthioninase utilisables selon l'invention on peut notamment se référer à la publication El Sayed A, Applied Microbiol. Biotechnol. (2010) 86 :445-467. Suivant un deuxième mode de réalisation, l'enzyme à PLP est la Tyrosine Phenol- Lyase ou TPL, EC 4.1.99.2, CAS 9059-31-8. On peut se référer à H. Kumagai et al., J. Biol. Chem. 245, 7 : 1767-72 et 245, 7 : 1773-7.

Suivant un troisième mode de réalisation, l'enzyme à PLP est la tyrosine aminotransférase (hTATase), EC 2.6.1.5, CAS 9014-55-5. On peut se référer à R. Rettenmeier et al., Nucleic Acids Res. 1990, 18, 13 : 3583-61. Suivant un quatrième mode de réalisation, l'enzyme à PLP est la cystathionine bêta- synthéthase ou synthase, EC 4.2.1.22, CAS 9023-99-8. On peut se référer à J. Kraus et al., J. Biol. Chem. 1978, 253, 18 : 6523-8. La composition peut comprendre, en outre, du cofacteur de l'enzyme, à savoir le PLP, et/ou un précurseur de celui-ci, qui peut être un précurseur non phosphaté, tel qu'une forme non phosphatée de la vitamine B6, et/ou un précurseur phosphaté, tel que la pyridoxine phosphate (PNP). La vitamine B6 existe sous différentes formes, phosphatées et non phosphatées. Le phosphate de pyridoxine (PNP), le phosphate de pyridoxal (PLP) et le phosphate de pyridoxamine (PMP) en sont les formes phosphatées. Les formes non phosphatées correspondantes sont la pyridoxine (PN), le pyridoxal (PL), et la pyridoxamine (PM). Les formes non phosphatées de vitamine B6 peuvent traverser la membrane érythrocytaire, ce que les formes phosphatées peuvent difficilement. Suivant la voie prédominante, la pyridoxine (PN), est transformée en PNP sous l'effet de PN-kinase, la PNP est ensuite transformée en PLP sous l'effet de la PNP-oxydase. Le PLP peut ensuite être transformé en pyridoxal (PL) sous l'effet de la PLP-phosphatase. On comprend aisément que le précurseur apporté est susceptible de subir des transformations dans les érythrocytes lors du procédé de préparation ou lors du stockage de la composition. Par forme non phosphatée de vitamine B6, on entendra ici l'un des trois « vitamères » de la vitamine B6 ou un mélange de 2 ou des 3 vitamères : PL, PN et PM. On préfère la forme PN. Ils peuvent être sous forme de sel également.

Dans un mode de réalisation, la composition comprend donc du pyridoxal phosphate (PLP) et/ou une forme non phosphatée de vitamine B6 et/ou un précurseur phosphaté, la pyridoxine phosphate (PNP) et/ou le phosphate de pyridoxamine. La composition comprend notamment de 0,05 à 600, notamment de 0,5 à 100, de préférence de 5 à 50 pmoles de PLP et/ou de PNP et/ou de PMP, encapsulé par litre (L) de globules rouges. Les compositions selon l'invention ont de préférence un hématocrite supérieur ou égal à 35%, 40% ou 45%. Suivant un mode de réalisation, la composition comprend, d'une part, des érythrocytes et un véhicule pharmaceutiquement acceptable, les érythrocytes encapsulant de l'enzyme à PLP, e.g. de la méthioninase, et, d'autre part, de la vitamine B6 sous une forme non phosphatée, de préférence PN, pour une administration simultanée, séparée ou séquentielle. La composition peut notamment être sous forme de kit, comprenant, séparément, les érythrocytes (suspension) et la vitamine B6 sous une forme non phosphatée, de préférence PN (solution). Suivant un mode de réalisation, le véhicule pharmaceutiquement acceptable est une « solution de conservation » pour érythrocytes, à savoir une solution dans laquelle les érythrocytes encapsulant un principe actif sont mis en suspension sous leur forme adaptée à être stockée en attendant leur injection. Une solution de conservation comprend de préférence au moins un agent favorisant la conservation des érythrocytes, notamment choisi parmi glucose, dextrose, adénine et mannitol. Avantageusement la solution de conservation contient du phosphate inorganique permettant l'inhibition de l'enzyme PLP-phosphatase intra-érythrocytaire.

La solution de conservation peut être une solution aqueuse comprenant du NaCI, de l'adénine et au moins un composé parmi glucose, dextrose et mannitol. Suivant une caractéristique, elle comprend en outre du phosphate inorganique. La solution de conservation peut comprendre NaCI, adénine et dextrose, de préférence milieu AS3. Suivant une caractéristique, elle comprend en outre du phosphate inorganique. La solution de conservation peut comprendre NaCI, adénine, glucose et mannitol, de préférence milieu SAG-Mannitol ou ADsol. Suivant une caractéristique, elle comprend en outre du phosphate inorganique. En particulier, la composition ou suspension, en solution de conservation, se caractérise par un taux d'hémoglobine extracellulaire maintenu égal ou inférieur à 0,5, en particulier à 0,3, notamment à 0,2, de préférence à 0,15, mieux encore à 0,1 g/dl à 72 h et conservation à une température comprise entre 2 et 8°C. En particulier, la composition ou suspension, en solution de conservation, se caractérise par un taux d'hémoglobine extracellulaire maintenu égal ou inférieur à 0,5, en particulier à 0,3, notamment à 0,2, de préférence à 0,15, mieux encore à 0,1 g/dl pendant une durée comprise entre 24 h et 20 jours, notamment entre 24 et 72 h et conservation à une température comprise entre 2 et 8°C. Le taux d'hémoglobine extracellulaire est avantageusement mesuré par la méthode manuelle de référence décrite dans G.B. Blakney et A.J. Dinwoodie, Clin. Biochem. 8, 96- 102, 1975. Des automates existent aussi qui permettent également de faire cette mesure, avec une sensibilité qui leur est propre. En particulier, la composition ou suspension, en solution de conservation, se caractérise par un taux d'hémolyse maintenu égal ou inférieur à 2, notamment à 1,5, de préférence à 1 % à 72 h et conservation à une température comprise entre 2 et 8°C.

En particulier, la composition ou suspension, en solution de conservation, se caractérise par un taux d'hémolyse maintenu égal ou inférieur à 2, notamment à 1,5, de préférence à 1 % pendant une durée comprise entre 24 h et 20 jours, notamment entre 24 et 72 h et à une température comprise entre 2 et 8°C. En particulier, l'hématocrite de la suspension est égal ou supérieur à 35%, 40%, 45%. Selon une modalité particulière, le métabolisme de la vitamine B6 dans les érythrocytes est modifié afin d'augmenter la concentration intra-érythrocytaire du PLP par l'augmentation des taux intra-érythrocytaires de PN-kinase et PNP-oxydase et/ou la diminution du taux intra-érythrocytaire de PLP-phosphatase Suivant une caractéristique, la composition comprend, en plus de l'enzyme à PLP, e.g. la méthioninase, et du PLP ou un précurseur de celui-ci, de la PN-kinase et/ou de la PNP-oxydase et/ou un agent inhibant la PLP-phosphatase. Ces enzymes ou agents peuvent se trouver encapsulés dans les érythrocytes ou se trouver en extra- et intra-érythrocytaire. Ce ou ces enzymes ou agents peuvent aussi être administrés séparément, en étént notamment mélangés à la formulation de vitamine B6 non phosphatée lorsqu'elle est séparée de la suspension d'érythrocytes.

L'invention a ainsi pour objet de telles compositions, pour une utilisation comme médicament. L'invention a notamment pour objet un médicament permettant d'apporter, à un patient qui en a besoin, une enzyme à PLP et son cofacteur, dans des conditions de bonne biodisponibilité, ce qui signifie que l'enzyme et son cofacteur sont disponibles l'un pour l'autre et en quantité efficace pour que l'enzyme soit active et efficace dans une application thérapeutique. Le médicament vise notamment à dépléter ou diminuer la concentration plasmatique ou circulante et/ou au niveau d'un organe, d'un substrat de l'enzyme. Suivant un premier sous-objet, le médicament comprend de la méthioninase et permet de dépléter ou diminuer la méthionine plasmatique ou circulante chez un patient qui en a besoin. Le médicament est un anticancéreux, il permet le traitement d'un cancer, notamment un cancer comprenant des cellules tumorales auxotrophes pour la méthionine, notamment cancers du sein, poumon, côlon, rein, vessie, mélanome et glioblastome. Suivant un deuxième sous-objet, le médicament comprend de la méthioninase et permet de dépléter ou diminuer l'homocystéine plasmatique ou circulante et/ou hépatique chez un patient qui en a besoin. Le médicament permet de traiter l'homocystéinurie et/ou une hyperhomocystéinémie et/ou les pathologies associées, telles que maladie cardio-vasculaire, du système nerveux central, du système oculaire et/ou du squelette (EI-Sayed et Shindia Targets in gene therapy Prof. Yongping you ed., 2011). Suivant un troisième sous-objet de l'invention, le médicament contient de la TPL et permet de dépléter ou diminuer la tyrosine plasmatique ou circulante chez un patient qui en a besoin. Le médicament est un anticancéreux, il permet le traitement d'un cancer, notamment un cancer comprenant des cellules tumorales auxotrophes pour la tyrosine, notamment le mélanome. Suivant un quatrième sous-objet de l'invention, le médicament contient de l'hTATase, et permet de dépléter ou diminuer la tyrosine plasmatique ou circulante et/ou hépatique chez un patient qui en a besoin. Le médicament permet de traiter une maladie rare liée à une déficience en cette enzyme à PLP, notamment le syndrome de Richner-Hanhart (tyrosinémie de type Il). Suivant un cinquième sous-objet de l'invention, le médicament contient de la cystathionine bêta-synthase et permet de dépléter ou diminuer l'homocystéine plasmatique ou circulante et/ou hépatique chez un patient qui en a besoin. Le médicament permet de traiter l'homocystéinurie et/ou une hyperhomocystéinémie et/ou les pathologies associées, telles que maladie cardio-vasculaire, du système nerveux central, du système oculaire et/ou du squelette L'invention concerne aussi un procédé de préparation d'une composition pharmaceutique comprenant des érythrocytes encapsulant une enzyme à PLP, e.g. de la méthioninase, un véhicule pharmaceutiquement acceptable, et du pyridoxal phosphate (PLP) et/ou un précurseur phosphaté ou non phosphaté de PLP, procédé comprenant les étapes suivantes : optionnellement, et de préférence, un culot d'érythrocytes est lavé et centrifugé une ou plusieurs fois avec un tampon physiologique ; la suspension d'érythrocytes est mise en contact avec un milieu liquide hypotonique aboutissant à l'ouverture de pores dans la membrane érythrocytaire ; la suspension d'érythrocytes est mise en contact avec l'enzyme à PLP, e.g. la méthioninase, avant ou après l'ouverture des pores ; l'enzyme à PLP, e.g. méthioninase, entre dans les érythrocytes ; les pores sont refermés à l'aide d'un tampon isotonique ou hypertonique, avantageusement hypertonique et l'on recueille une suspension d'érythrocytes rescellés renfermant l'enzyme à PLP, e.g. méthioninase; optionnellement la suspension d'érythrocytes est incubée pour éliminer les érythrocytes les plus fragiles ; la suspension d'érythrocytes est lavée et conditionnée avec une solution de conservation ; procédé dans lequel : - le PLP et/ou, le cas échéant, un précurseur phosphaté de PLP, est co-encapsulé avec l'enzyme à PLP, e.g. méthioninase, - le cas échéant, le précurseur non phosphaté de PLP est ajouté à la suspension d'érythrocytes avant ou après l'ouverture des pores, et/ou - le cas échéant, le précurseur non phosphaté de PLP est ajouté lors de l'incubation ou à la solution de conservation.

La suspension d'érythrocytes est mise en contact avec un milieu liquide hypotonique aboutissant à l'ouverture de pores dans la membrane érythrocytaire. On a vu qu'il existe trois variantes dans la technique de lyse-rescellement, qui sont la dialyse hypotonique, la « preswelling » hypotonique et la dilution hypotonique, toutes basées sur la différence de pression osmotique entre l'intérieur et l'extérieur des érythrocytes. On préfère la dialyse hypotonique. La suspension d'érythrocytes encapsulant l'enzyme à PLP, e.g. méthioninase, et éventuellement du PLP et/ou un précurseur de PLP est notamment susceptible d'être obtenue par le procédé suivant: 1 - mise en suspension d'un culot d'érythrocytes dans une solution isotonique à un taux d'hématocrite égal ou supérieur à 65 %, réfrigération entre + 1 et + 8 °C, 2 - procédure de lyse, à une température maintenue entre + 1 et + 8 °C, comprenant le passage de la suspension d'érythrocytes à un taux d'hématocrite égal ou supérieur à 65 % et d'une solution de lyse hypotonique réfrigérée entre + 1 et + 8 °C, dans un dispositif de dialyse, tel qu'un boudin ou une cartouche de dialyse (la cartouche est préférée) ; 3 - procédure d'encapsulation par ajout, de préférence progressif, du ou des principes actifs à encapsuler (notamment en solution préconstituée) dans la suspension avant ou pendant la lyse, à température maintenue entre + 1 et + 8°C; et 4 - procédure de rescellement conduite en présence d'une solution isotonique ou hypertonique, avantageusement hypertonique, à une température plus élevée, notamment comprise entre + 30 et + 42 °C. En variante préférée, on peut s'inspirer de la méthode décrite dans WO-A20 2006/016247 (EP 1 773 452): 1 - mise en suspension d'un culot d'érythrocytes dans une solution isotonique à un taux d'hématocrite égal ou supérieur à 65 %, réfrigération entre + 1 et + 8°C, 2 - mesure de la fragilité osmotique à partir d'un échantillon d'érythrocytes de ce même culot, 25 3 - procédure de lyse, à une température maintenue entre + 1 et + 8°C, comprenant le passage de la suspension d'érythrocytes à un taux d'hématocrite égal ou supérieur à 65 % et d'une solution de lyse hypotonique réfrigérée entre + 1 et + 8°C, dans un dispositif de dialyse, tel qu'un boudin ou une cartouche de dialyse (la cartouche est préférée); les paramètres de lyse étant ajustés en fonction de la fragilité osmotique mesurée 30 précédemment; notamment, en fonction de la fragilité osmotique mesurée, on ajuste le débit de la suspension d'érythrocytes passant dans le dispositif de dialyse ou l'on ajuste l'osmolarité de la solution de lyse ; et 4 - procédure d'encapsulation par ajout, de préférence progressif, du ou des principes actifs à encapsuler (notamment en solution préconstituée) dans la suspension 35 avant ou pendant la lyse, à température maintenue entre + 1 et + 8°C; et 5 - procédure de rescellement conduite en présence d'une solution isotonique ou hypertonique, avantageusement hypertonique, à une température plus élevée, notamment comprise entre + 30 et + 42 °C. Notamment, pour la dialyse, le culot d'érythrocytes est mis en suspension dans une solution isotonique à un taux d'hématocrite élevé, égal ou supérieur à 65 %, et de préférence égal ou supérieur à 70 %, et cette suspension est réfrigérée entre + 1 et + 8°C, de préférence entre + 2 et + 6°C, typiquement aux alentours de + 4°C. Suivant une modalité particulière, le taux d'hématocrite est compris entre 65 et 80 %, de préférence entre 70 et 80 %.

Lorsqu'elle est mesurée, la fragilité osmotique est avantageusement mesurée sur les érythrocytes juste avant l'étape de lyse, en présence ou en l'absence, de préférence en présence, du ou des principes actifs à encapsuler. Les érythrocytes ou la suspension les contenant sont avantageusement à une température proche de, ou identique à la température sélectionnée pour la lyse. Selon une autre caractéristique avantageuse de l'invention, la mesure de la fragilité osmotique effectuée est rapidement exploitée, c'est-à- dire que la procédure de lyse est réalisée à bref délai après la prise d'échantillon. De préférence, ce laps de temps entre prise d'échantillon et début de lyse est inférieur ou égal à 30 minutes, mieux encore inférieur ou égal à 25 et même à 20 minutes. Concernant la manière d'opérer la procédure de lyse-rescellement, avec mesure et prise en compte de la fragilité osmotique, l'homme du métier pourra se référer pour plus de détails à WO-A-2006/016247. Ce document est incorporé ici par référence. Un perfectionnement des techniques d'encapsulation a été décrit dans FR 1354204 déposée le 7 mai 2013, auquel l'homme du métier peut se référer et qui est incorporé ici par référence. Ainsi, suivant un mode de réalisation, les érythrocytes encapsulant le principe actif, à savoir enzyme à PLP, e.g. méthioninase, et éventuellement un ou plusieurs autres principes actifs tels que du PLP et/ou un précurseur de PLP, sont obtenus par un procédé comprenant l'encapsulation du principe actif à l'intérieur d'érythrocytes par lyse-rescellement, l'obtention d'une suspension ou d'un culot comprenant des érythrocytes incorporant le principe actif et une solution à une osmolalité supérieure ou égale à 280 mOsmol/kg, en particulier entre environ 280 et environ 380 mOsmol/kg, de préférence entre environ 290 et environ 330 mOsmol/kg, l'incubation du culot ou de la suspension en l'état ou après ajout d'une solution d'incubation, à une osmolalité supérieure ou égale à 280 mOsmol/kg, en particulier entre environ 280 et environ 380 mOsmol/kg, de préférence entre environ 290 et environ 330 mOsmol/kg. L'incubation est effectuée notamment pendant une durée supérieure ou égale à 30 minutes, en particulier supérieure ou égale à 1 h. On procède ensuite à l'élimination du milieu liquide de la suspension incubée et la mise en suspension des érythrocytes obtenus dans une solution permettant l'injection de la suspension à un patient, de préférence une solution de conservation permettant l'injection de la suspension à un patient. L'osmolalité indiquée est celle de la solution dans laquelle les érythrocytes sont en suspension ou en culot au moment considéré. Suivant une modalité particulière, on apporte au cours du procédé de production ou de stockage ou dans la formulation finale un précurseur non phosphaté de PLP, notamment une forme non phosphatée de vitamine B6. Ce composé peut par exemple être incorporé à la solution d'incubation ou à la solution de conservation, ou encore à la formulation avant injection lorque l'on effectue une dilution pré-injection. Suivant une caractéristique, on apporte au cours du procédé de production ou de stockage ou dans la formulation finale notamment de 0,1 à 250, de préférence de 1 à 50 mM de PN et/ou de PL et/ou de PM. Comme décrit ci-dessus une fraction de ces dérivés non phosphatés de la vitamine B6 sera convertie en PLP dans les globules rouges. Par « suspension d'érythrocytes stabilisée », on entend notamment une suspension ayant une teneur d'hémoglobine extracellulaire qui reste inférieure ou égale à 0,2 g/dL jusqu'à son utilisation chez l'homme, celle-ci pouvant intervenir notamment de 1 à 72 heures après la production du lot d'érythrocytes incorporant le principe actif. Par « suspension d'érythrocytes stabilisée prête-à-l'emploi », on entend la suspension stabilisée dans une solution permettant l'injection à un patient, notamment en solution de conservation. Son hématocrite est généralement égal ou supérieur à 35%, 40% 20 ou 45%. Par « culot d'érythrocytes », on entend un concentrat ou concentré d'érythrocytes recueilli après séparation des érythrocytes du milieu liquide dans lequel ils étaient en suspension auparavant. La séparation peut se faire par filtration ou par centrifugation. La centrifugation est le moyen généralement employé pour une telle séparation. Un culot 25 comprend une certaine proportion du milieu liquide. Généralement, le culot a un hématocrite compris entre 70 et 85 %. Par « solution d'incubation », on entend la solution dans laquelle les érythrocytes encapsulant un principe actif sont présents lors de l'étape d'incubation. L'incubation peut se faire sur une large plage d'hématocrite, notamment entre 10 et 85 % d'hématocrite. 30 Par « érythrocytes fragiles », on entend les érythrocytes issus de la procédure d'incorporation qui sont susceptibles, une fois en suspension dans une solution de conservation, d'être lyses lorsque la suspension est conservée entre 2 et 8°C, notamment au bout d' 1 à 72 h. Par « hématocrite initial », on entend l'hématocrite avant perte cellulaire due à la lyse 35 des érythrocytes fragiles lors de l'incubation. Le procédé peut notamment comprendre les étapes suivantes : (a) encapsulation du ou des principes actifs à encapsuler (enzyme à PLP, e.g. méthioninase, et éventuellement du PLP et/ou un précurseur de PLP) à l'intérieur d'érythrocytes, comprenant la mise en contact des érythrocytes avec un milieu hypotonique (permettant l'ouverture de pores dans la membrane des érythrocytes), la mise en contact avec le principe actif (pour permettre son entrée dans les érythrocytes), le rescellement des érythrocytes, notamment à l'aide d'un milieu isotonique ou hypertonique, avantageusement hypertonique, (b) obtention ou préparation d'une suspension ou d'un culot comprenant des érythrocytes incorporant le principe actif et une solution à une osmolalité supérieure ou égale à 280 mOsmol/kg, en particulier entre environ 280 et environ 380 mOsmol/kg, de préférence entre environ 290 et environ 330 mOsmol/kg, (c) incubation du culot ou de la suspension de l'étape (b) en l'état ou après ajout d'une solution d'incubation, à une osmolalité supérieure ou égale à 280 mOsmol/kg, en particulier entre environ 280 et environ 380 mOsmol/kg, de préférence entre environ 290 et environ 330 mOsmol/kg, pendant une durée supérieure ou égale à 30 minutes, notamment supérieure ou égale à 1 h, (d) élimination du milieu liquide de la suspension incubée de l'étape (c), (e) mise en suspension des érythrocytes obtenus sous (d) dans une solution permettant l'injection de la suspension à un patient, de préférence une solution de conservation permettant l'injection de la suspension à un patient.

La vitamine B6 sous une forme non phosphatée peut être ajoutée lors de l'étape d'encapsulation à l'étape (a) ou lors de l'incubation à l'étape (c) ou encore dans la solution de conservation. Suivant une première modalité, l'étape suivant l'encapsulation par lyse-rescellement, notamment l'étape (b), comporte au moins 1 cycle de lavage, de préférence 2 ou 3 cycles de lavage, par dilution de la suspension ou du culot obtenu à l'étape de lyse-rescellement ou l'étape (a) dans une solution, à une osmolalité supérieure ou égale à 280 mOsmol/kg, en particulier entre environ 280 et environ 380 mOsmol/kg, de préférence entre environ 290 et environ 330 mOsmol/kg, puis obtention d'un culot d'érythrocytes ou d'une suspension. Ce culot ou cette suspension comprend des érythrocytes incorporant le principe actif et une solution à une osmolalité supérieure ou égale à 280 mOsmol/kg, en particulier entre environ 280 et environ 380 mOsmol/kg, de préférence entre environ 290 et environ 330 mOsmol/kg. On applique ensuite les étapes suivantes, e.g. (c), (d) et (e). Suivant une deuxième modalité, à l'étape de lyse-rescellement ou l'étape (a), le rescellement des érythrocytes à l'aide d'un milieu isotonique ou hypertonique produit la suspension d'érythrocytes pouvant ensuite subir l'incubation, e.g. la suspension de l'étape (b), dans une solution à une osmolalité supérieure ou égale à 280 mOsmol/kg, en particulier entre environ 280 et environ 380 mOsmol/kg, de préférence entre environ 290 et environ 330 mOsmol/kg. En d'autres termes, l'étape de lyse-rescellement ou l'étape (a) comporte une étape de rescellement des érythrocytes dans laquelle les érythrocytes en suspension encapsulant un principe actif, sont mélangés à une solution de rescellement isotonique ou hypertonique, avantageusement hypertonique, produisant une suspension d'érythrocytes à une osmolalité supérieure ou égale à 280 mOsmol/kg, en particulier entre environ 280 et environ 380 mOsmol/kg, de préférence entre environ 290 et environ 330 mOsmol/kg. Dans cette modalité, l'étape d'incubation ou l'étape (c) comprend l'incubation de la suspension issue du rescellement. L'incubation est réalisée pendant une durée supérieure ou égale à 30 minutes, notamment supérieure ou égale à 1 h. On applique ensuite les étapes suivantes, e.g. (d) et (e). Les étapes suivant la lyse-rescellement, e.g. (b) à (e), sont conduites dans des conditions aboutissant à la lyse des érythrocytes fragiles, ou d'une majorité d'entre eux, notamment plus de 50, 60, 70, 80 ou 90 %, ou plus. Pour ce faire, on peut jouer sur la durée d'incubation, la température d'incubation et sur l'osmolalité de la solution dans laquelle les érythrocytes sont en suspension. Plus l'osmolalité est élevée, plus la durée d'incubation peut être importante. Plus l'osmolalité est basse, plus l'incubation peut être courte pour obtenir le même effet. De même, plus la température est élevée, plus la durée d'incubation peut être courte, et inversement. Un ou plusieurs cycles de lavage permettront ensuite d'éliminer les débris cellulaires et l'hémoglobine extracellulaire, ainsi que le principe actif extracellulaire.

Selon l'invention, un cycle de lavage comprend la dilution de la suspension ou du culot d'érythrocytes, puis la séparation entre les érythrocytes et la solution de lavage. De préférence, une étape de lavage comprend de préférence 2 ou 3 cycles dilution-séparation. La séparation peut être réalisée par tout moyen approprié, tel que filtration et centrifugation. La centrifugation est préférée.

L'incubation n'est pas limitée par l'hématocrite de la suspension. C'est ainsi que l'on peut incuber une suspension ayant un hématocrite initial compris généralement entre 10 et 85 %, notamment entre 40 et 80 %. On parle plutôt de culot à partir de 70% et de suspension en dessous de cette valeur. L'étape d'élimination ou (d) vise à «éliminer la partie liquide de la suspension ou du culot incubé, afin d'éliminer notamment les débris cellulaires et l'hémoglobine extracellulaire, ainsi que, par voie de conséquence, le principe actif extracellulaire. Suivant une première modalité de l'étape d'élimination ou (d), on effectue une séparation, notamment centrifugation, ceci étant notamment applicable à une suspension. Cette séparation peut être suivie d'un ou plusieurs, par exemple 2 ou 3, cycles de lavage, par dilution en solution isotonique, puis séparation, notamment par centrifugation. Suivant une deuxième modalité de l'étape d'élimination ou (d), on effectue une dilution, avant une séparation, notamment centrifugation, ceci étant applicable à une suspension ou à un culot. La dilution peut être effectuée notamment avec une solution de lavage isotonique ou avec une solution de conservation. L'étape finale ou (e) consiste à préparer la suspension finale telle qu'elle pourra être administrée au patient, sans autre traitement.

Suivant une première modalité de cette étape, on effectue une dilution du culot d'érythrocytes issu de l'étape d'élimination ou (d) avec la solution d'injection, notamment de conservation. Suivant une deuxième modalité de cette étape, on effectue un ou plusieurs cycles de lavage du culot d'érythrocytes issu de l'étape d'élimination ou (d) avec la solution d'injection, notamment de conservation, par dilution suivie de séparation. Après lavage, on remet les érythrocytes en suspension dans la solution d'injection, notamment de conservation. Le procédé de l'invention peut comprendre en outre une, plusieurs ou la totalité des caractéristiques suivantes : - l'étape d'incubation ou (c) est réalisée à une température comprise entre environ 2 et environ 39 °C, sur une durée suffisante pour assurer la lyse des érythrocytes fragiles ; - l'étape d'incubation ou (c) est réalisée à basse température, notamment comprise entre environ 2 et environ 10 °C, en particulier entre environ 2 et environ 8 °C, et dure d'environ 1 h à environ 72 h, notamment d'environ 6 h à environ 48 h, de préférence d'environ 19 h à environ 30 h ; - l'étape d'incubation ou (c) est conduite à une température plus élevée comprise entre environ 20 et environ 39 °C, notamment à la température ambiante (25 °C ± 5 °C) et dure d'environ 30 min à environ 10 h, notamment d'environ 1 h à environ 6 h, de préférence d'environ 2 h à environ 4 h ; on peut travailler à température encore plus élevée que la température ambiante, mais cela peu avoir un impact négatif sur le rendement cellulaire, la P50 et/ou la teneur en 2,3-DPG ; - à l'étape d'incubation ou (c), la suspension est à un hématocrite initial compris entre 10 et 85 (:)/0, notamment entre 40 et 80 %; on peut incuber un culot issu de séparation ayant par exemple un hématocrite entre 70 et environ 85 (:)/0, ou un culot dilué ayant un hématocrite compris entre environ 40 et 70 % ; - l'étape d'incubation comprend une agitation de la suspension ; - l'étape d'incubation ne comprend pas d'agitation ; - comme solution pour le lavage et/ou l'incubation, on utilise une solution aqueuse de NaCI dosée pour obtenir l'osmolalité souhaitée ; à titre d'exemple, une solution peut ainsi comprendre 0,9% de NaCI; cette solution peut aussi comprendre, notamment en plus du NaCI, du glucose, notamment du glucose monohydrate, du phosphate monosodique dihydraté, du phosphate disodique dodecahydraté ; à titre d'exemple, une composition comprend : NaCI 0,9%, glucose monohydrate 0,2%, phosphate monosodique dihydraté 0,034%, phosphate disodique dodecahydraté 0,2%; - le lavage à l'étape finale ou (e) est réalisé avec la solution de conservation ; - l'osmolalité de la solution (partie liquide) dans la suspension prête-à-l'emploi ou pouvant être injectée au patient est comprise entre environ 280 et environ 380 mOsmol/kg, de préférence entre environ 290 et environ 330 mOsmol/kg ; - l'hématocrite de la suspension prête-à-l'emploi ou pouvant être injectée au patient est égal ou supérieur à 35%, 40% ou 45%; - on effectue toutes les étapes de lavage, incubation avec la solution de conservation ; - la solution de lavage de l'étape (b) et/ou la solution de lavage de l'étape (e) et la solution de conservation sont de même composition et comprennent un ou des composés favorisant la conservation des érythrocytes ; - la solution de conservation (et la ou les solutions de lavage ou d'incubation le cas échéant) est une solution aqueuse comprenant du NaCI, de l'adénine et au moins un composé parmi glucose, dextrose et mannitol ; - la solution de conservation (et la ou les solutions de lavage ou d'incubation le cas échéant) comprend NaCI, adénine et dextrose, de préférence milieu AS3 ; - la solution de conservation (et la ou les solutions de lavage ou d'incubation le cas échéant) comprend NaCI, adénine, glucose et mannitol, de préférence milieu SAG-Mannitol ou ADsol.

Les procédés selon l'invention comprennent notamment l'étape suivante : (a) encapsulation d'un principe actif à l'intérieur d'érythrocytes, comprenant la mise en contact avec un milieu hypotonique permettant l'ouverture de pores dans la membrane des érythrocytes, la mise en contact avec le principe actif pour permettre son entrée dans les érythrocytes, le rescellement des érythrocytes à l'aide d'un milieu isotonique ou hypertonique. A noter que le principe actif peut être présent dans la suspension d'érythrocytes avant la lyse de ces derniers, ou encore être ajouté pendant la lyse ou après la lyse, mais toujours avant le rescellement. Dans un mode de réalisation de cette étape (a), le procédé comprend les sous-étapes suivantes : (al) disposer d'une suspension d'érythrocytes à un hématocrite égal ou supérieur à 60 ou 30 65%, (a2) mesure de la fragilité osmotique des érythrocytes dans cette suspension, (a3) procédure de lyse et d'internalisation du ou des principe(s) actif(s), comprenant le passage de la suspension d'érythrocytes dans un dispositif de dialyse, notamment une cartouche de dialyse, à contre-courant d'une solution de lyse, ajustement du débit de la 35 suspension d'érythrocytes ou ajustement du débit de la solution de lyse ou ajustement de l'osmolarité de la solution de lyse, en fonction de la fragilité osmotique mesurée sous (a2), (a4) procédure de rescellement des érythrocytes.

Un autre objet de l'invention est une méthode de traitement thérapeutique destinée à apporter, à un patient qui en a besoin, une enzyme à PLP et son cofacteur, dans des conditions de bonne biodisponibilité, ce qui signifie que l'enzyme et son cofacteur sont disponibles l'un pour l'autre et en quantité efficace pour que l'enzyme soit active et efficace dans une application thérapeutique. Cette méthode vise notamment à dépléter ou diminuer la concentration plasmatique ou circulante et/ou au niveau d'un organe, d'un substrat de l'enzyme. Cette méthode comprend l'administration d'une quantité efficace d'une composition selon l'invention ou l'utilisation d'un kit selon l'invention. Suivant un premier sous-objet, l'invention est une méthode de traitement thérapeutique permettant de dépléter ou diminuer la méthionine plasmatique ou circulante chez un patient qui en a besoin. Cette méthode comprend l'administration d'une quantité efficace d'une composition selon l'invention ou l'utilisation d'un kit selon l'invention, comprenant de la méthioninase et son cofacteur. La méthode est une méthode de traitement d'un cancer, notamment un cancer comprenant des cellules tumorales auxotrophes pour la méthionine, notamment cancers du sein, poumon, côlon, rein, vessie, mélanome et glioblastome. Suivant un deuxième sous-objet, l'invention est une méthode de traitement thérapeutique permettant de dépléter ou diminuer l'homocystéine plasmatique ou circulante et/ou hépatique chez un patient qui en a besoin. Cette méthode comprend l'administration d'une quantité efficace d'une composition selon l'invention ou l'utilisation d'un kit selon l'invention, comprenant de la méthioninase et son cofacteur. La méthode est une méthode de traitement de l'homocystéinurie et/ou d'une hyperhomocystéinémie et/ou des pathologies associées à une hyperhomocystéinémie, telles que maladie cardio-vasculaire, du système nerveux central, du système oculaire et/ou du squelette.

Suivant un troisième sous-objet de l'invention, l'invention est une méthode de traitement thérapeutique permettant de dépléter ou diminuer la tyrosine plasmatique ou circulante chez un patient qui en a besoin. Cette méthode comprend l'administration d'une quantité efficace d'une composition selon l'invention ou l'utilisation d'un kit selon l'invention, comprenant de la TPL et son cofacteur. La méthode est une méthode de traitement d'un cancer, notamment un cancer comprenant des cellules tumorales auxotrophes pour la tyrosine, notamment mélanome. Suivant un quatrième sous-objet de l'invention, l'invention est une méthode de traitement thérapeutique permettant de dépléter ou diminuer la tyrosine plasmatique ou circulante et/ou hépatique chez un patient qui en a besoin. Cette méthode comprend l'administration d'une quantité efficace d'une composition selon l'invention ou l'utilisation d'un kit selon l'invention, comprenant de l'hTATase et son cofacteur. La méthode est une méthode de traitement d'une maladie rare liée à une déficience en cette enzyme à PLP, notamment le syndrome de Richner-Hanhart (tyrosinémie de type Il). Suivant un cinquième sous-objet de l'invention, l'invention est une méthode de traitement thérapeutique permettant de dépléter ou diminuer l'homocystéine plasmatique ou circulante et/ou hépatique chez un patient qui en a besoin. Cette méthode comprend l'administration d'une quantité efficace d'une composition selon l'invention ou l'utilisation d'un kit selon l'invention, comprenant de cystathionine bêta-synthase et son cofacteur. La méthode est une méthode de traitement de l'homocystéinurie et/ou d'une hyperhomocystéinémie et/ou des pathologies associées à une hyperhomocystéinémie, telles que maladie cardio-vasculaire, du système nerveux central, du système oculaire et/ou du squelette. La composition utilisée dans ces applications thérapeutiques peut comprendre, en outre, du cofacteur de cette enzyme à PLP, à savoir le PLP, et/ou un précurseur de celui-ci, qui peut être un précurseur non phosphaté, tel qu'une forme non phosphatée de la vitamine B6, et/ou un précurseur phosphaté, tel que la pyridoxine phosphate (PNP). La composition peut aussi comprendre de la PN-kinase, de la PNP-oxydase, un agent inhibant la PLPphosphatase. Plus généralement, la méthode de traitement pourra comprendre l'administration d'une composition ou d'un kit tels que décrits ci-dessus. On administre au patient, en une ou plusieurs doses notamment une ou 2, par mois de traitement, de 50 à 300 ml de suspension ou composition d'hématocrite supérieur ou égal à 35%, 40% ou 45% en une ou plusieurs injections. On administre notamment par injection intraveineuse ou intraartérielle, notamment par perfusion. En variante, on administre séparément, au même patient, une quantité efficace d'une composition comprenant des érythrocytes encapsulant de l'enzyme à PLP, e.g. de la méthioninase, et une quantité efficace d'une solution contenant une forme non phosphatée de vitamine B6, de préférence PN. Cette forme non phosphatée de vitamine B6 peut être administrée par injection, simultanément ou séparément avec la suspension d'érythrocytes, ou par toute autre voie, notamment voie orale. Dans un premier mode de réalisation de cette méthode, on injecte au patient une suspension d'érythrocytes encapsulant le ou les principe(s) actif(s) préparée entre 1 et 72 h, notamment entre 10 et 72 h avant injection. Cette suspension a un hématocrite égal ou supérieur à 35%, 40% ou 45%. Elle se trouve dans une solution de conservation. Le taux d'hémoglobine extracellulaire est égal ou inférieur à 0,5, en particulier à 0,3, notamment à 0,2, de préférence à 0,15, mieux encore à 0,1 g/dl, et/ou le taux d'hémolyse égal ou inférieur à 2, notamment à 1,5, de préférence à 1 %. La suspension n'est pas lavée ou similaire avant injection.

L'invention va être maintenant décrite plus en détail à l'aide de modes de réalisation pris à titre d'exemples non limitatifs et se référant au dessin dans lequel : Figures 1 et 2. Comparaison des concentrations intra-érythrocytaires (figure 1) et extracellulaires (figure 2) de PLP après incubation d'une suspension de GR-MGL-PLP avec de la pyridoxine (PN) à différentes concentrations. La suspension de GR-MGL-PLP incubée 3h et 24h à température ambiante en absence de pyridoxine (0 mM) présente un taux basal de PLP d'environ 3,9 pM. L'incubation des suspensions avec de la pyridoxine à 2 mM et 4 mM permet d'augmenter la concentration intra-érythrocytaire de PLP à 8 pM après 3h d'incubation (barres gris clair) et permet d'atteindre des taux considérablement plus élevés (11pM et 14 pM respectivement) après 24h d'incubation (barres gris foncé). Figure 3. Pharmacocinétique des GR chargés en complexe MGL-PLP. Le produit GR-MGL-PLP2 est obtenu par lyse-rescellement d'une suspension contenant 3 mg/ml de MGL et -30 pM de PLP. Le produit GR-MGL-PLP3 est obtenu par lyse-rescellement d'une suspension contenant 3 mg/ml de MGL et -125 pM de PLP. Le marquage fluorescent des produits (CFSE) permet une traçabilité des GR in vivo. Les produits injectés en intraveineuse aux souris CD1 (8 ml/kg) présentent une excellente stabilité avec une survie des GR injectés supérieure à 80% à 120h, soit 5 jours après leur administration. Figure 4. Pharmacodynamie des GR-MGL-PLP. Le produit GR-MGL-PLP2 est obtenu par lyse-rescellement d'une suspension contenant 3 mg/ml de MGL et -30 pM de PLP. Le produit GR-MGL-PLP3 est obtenu par lyse-rescellement d'une suspension contenant 3 mg/ml de MGL et -125 pM de PLP. Les deux produits sont administrés en intraveineuse (IV) aux souris CD1 (8 ml/kg) avec supplémentation IV en pyridoxine 6h après pour les souris receveuses de GR-MGL-PLP2. Le taux de L-méthionine plasmatique est mesuré par HPLC-MS-MS. Le taux de L-Met dans les CD1 non traitées a été évalué à 82pM. Les deux produits GR-MGL-PLP2 et GR-MGL-PLP3 conduisent à une déplétion rapide 15 min après leur administration réduisant le taux de L-Met à 22 pM et environ 30 pM respectivement, puis maintiennent une déplétion plus modéré à 35pM mais stable entre 48h et 120h. Exemple 1. Mode d'obtention et caractérisation de la Méthionine Gamma Lyase (MGL) Production de la souche et isolation d'un clone hyper-producteur : la séquence naturelle de MGL de Pseudomonas putida (GenBank: D88554.1) a été optimisée par modification des codons rares (afin d'adapter la séquence issue de P. putida à la souche de production Escherichia coli) et suppression de trois promoteurs bactériens putatifs dans la séquence codante (boite -35, boite -10 et un site de fixation d'un facteur de transcription en position 56). La souche de production E. coli HMS174 (DE3) a été transformée avec le vecteur d'expression pGTPc502_MGL (promoteur T7) contenant la séquence optimisée et un clone producteur a été sélectionné. Le clone producteur est mis en préculture en milieu GY + 0,5% glucose + kanamycine pendant 6-8 h (préculture 1) et 16h (préculture 2) à 37°C. Fermentation : la production est ensuite réalisée en fermenteur en milieu GY, sous agitation, pression et pH contrôlés à partir de la préculture 2 à une densité optique de 0,02.

La phase de croissance se déroule jusqu'à obtention d'une densité optique de 10 et l'induction d'expression est réalisée par ajout d'IPTG 1 mM dans le milieu de culture. La croissance bactérienne est contrôlée sur 20 h et un culot est recueilli après passage sur fibre creuse 500 kDa et centrifugation à 15900 x g. Purification : Le culot cellulaire est ensuite lysé en deux étapes par homogénéisation haute pression (1000, puis 600 bars) en tampon de lyse, à 10°C. Le lysat cellulaire subit ensuite une clarification à 10°C par ajout de PEI 0,2% et centrifugation à 15900 x g et une précipitation au sulfate d'ammonium à 6°C sur 20 h. Deux étapes de cristallisation sont réalisées sur le culot resolubilisé par précipitation au PEG-6000 10% + sulfate d'ammonium 10%, puis au PEG-6000 12% + NaCI 0,2M à 30°C. Après centrifugation 15900 x g, le culot contenant la protéine MGL est resuspendu en tampon de solubilisation et passé sur filtre 0,45 pm avant de subir deux chromatographies échangeuses d'ions (DEAE sépharose FF). La protéine purifiée est ensuite passée sur capsule de chromatographie Mustang Q (polishing) pour éliminer les différents contaminants (endotoxines, HCP host cell protein). Enfin, la MGL purifiée est concentrée et diafiltrée en cassette de filtration tangentielle en flux 10 kDa et lyophilisée sous pression et température contrôlées à raison de - 50 mg de protéine par tube. Caractérisation : L'activité spécifique de l'enzyme est déterminée par mesure du NH3 produit comme décrit dans l'exemple 4. La pureté est déterminée par SDS-PAGE. Le taux de PLP après reprise dans l'eau a été évalué selon la méthode décrite dans l'exemple 5.

L'osmolarité est mesurée avec un osmomètre. Le tableau suivant récapitule les principales caractéristiques de la MGL produite : MGL de P. putida Formulation Lyophilisée (quantité par tube : 49,2mg). Caractéristiques après reprise dans 625 biL eau : 78,7 mg/mL, -622 pM PLP, 50 mM phosphate de Na pH 7,2, Osmolarité 300 mOsmol/kg. Activité spécifique 13,2 Ul/mg Pureté > 98% Exemple 2. Co-encapsulation de MGL et de PLP dans les érythrocytes murins. Du sang total de souris CD1 (Charles River) est centrifugé à 1000 x g, 10 min, 4°C pour éliminer le plasma et le buffy coat. Les GR sont lavés trois fois avec du NaCI 0,9% (v :v). La MGL lyophilisée est resuspendue en eau à une concentration de 78,7 mg/ml et ajoutée à la suspension érythrocytaire pour obtenir une suspension finale à 70% hématocrite contenant différentes concentrations de MGL et de PLP. La suspension est ensuite chargée sur un hémodialyseur à un débit de 120 ml/h et dialysée contre une solution hypotonique à un débit de 15 ml/min en contre-courant. La suspension est ensuite rescellée avec une solution hypertonique, puis incubée 30 min à 37°C. Après 3 lavages en NaCI 0,9% glucose 0,2%, la suspension est reprise dans une solution de conservation SAG-Mannitol supplémentée avec de la BSA 6%. Les produits obtenus sont caractérisés à JO (dans les 2h suivant leur préparation) et à J1 (soit après -18h-24h de conservation à 2-8°C. Les caractéristiques hématologiques sont obtenues avec un automate vétérinaire (Sysmex, PocH-100iV).

L'activité de MGL retrouvée dans les produits finis augmente avec la quantité de MGL introduite dans le procédé. On peut donc facilement encapsuler jusqu'à 32 UI de MGL par ml de produit fini tout en maintenant une bonne stabilité. Trois produits finis murins GR-MGL-PLP1, GR-MGL-PLP2 et GR-MGL-PLP3 ont été préparés selon les modalités suivantes : GR-MGL-PLP1 : co-encapsulation de MGL et de PLP à partir d'une suspension contenant 3 mg/ml de MGL et -30 pM de PLP. Le produit final a été repris en SAG-Mannitol BSA 6% supplémenté avec 10 pM final de PLP. GR-MGL-PLP2: co-encapsulation de MGL et de PLP à partir d'une suspension contenant 3 mg/ml de MGL et -30 pM de PLP. Le produit fini a été repris en SAG-Mannitol BSA 6%.

GR-MGL-PLP3: co-encapsulation de MGL et de PLP à partir d'une suspension contenant 3 mg/ml de MGL et -124 pM de PLP. Le produit final a été repris en SAG-Mannitol BSA 6%. Les caractéristiques hématologiques et biochimiques des trois produits finis à JO (après leur préparation) sont détaillées dans le tableau ci-dessous. Les rendements d'encapsulation sont satisfaisants et varient de 18,6% à 30,5%. GR- MGL- PLP1 GR- MGL- PLP2 GRMG LPLP3 Données Hématocrite (%) 50,0 49,6 50,0 Volume globulaire (fL) 46,3 46,5 46,8 Hémoglobine corpusculaire (g/dL) 24,7 24,0 24,2 hématologiques Concentration de GR (106/pL) 6,5 6,9 6,6 Hémoglobine totale (g/dL) 14,8 15,4 15,0 Hb extracellulaire (g/dL) 0,1 0,1 0,1 MGL Concentration intra-érythrocytaire de MGL (mg/mL de GR) 0,97 0,94 0,67 Activité intra-érythrocytaire de MGL 12,8 12,4 8,8 (Ul/mL de GR)* Activité extracellulaire (%) 0,92% 0,97% 1,32% Activité intracellulaire (%) 99,08% 99,03% 98,68% Rendement d'encapsulation de MGL (%) 18,6% 30,5% 19,9% PLP Concentration intra-érythrocytaire de PLP (pmoles/L de GR) Non détermi né 13,4 71,4 Fraction de PLP intracellulaire (%) Non détermi né 99,5 98,7 Fraction de PLP extracellulaire (%) Non détermi né 0,5 1,3 Rendement d'encapsulation de PLP (%) Non détermi né 44,8 57,4 *Calculée avec l'activité spécifique de 13.2 Ul/mg Exemple 3. Production de GR humains encapsulant de la Methionine Gamma Lyase et du PLP selon le procédé industriel Une poche de GR humains déplétés en leucocytes (fournie par l'Etablissement Français du Sang) est soumise à un cycle de 3 lavages en NaCI 0,9% (laveur Cobe 2991). La MGL lyophilisée est remise en suspension avec du NaCI 0,7% et ajoutée à la suspension érythrocytaire pour obtenir une suspension finale à 70% hématocrite contenant 3 mg/ml de MGL et -30 pM de PLP (issu de la formulation de la MGL). La suspension est homogénéisée et on procède à l'encapsulation selon le procédé décrit dans EP1 773 452. La suspension issue du rescellement est ensuite incubée pendant 3h à température ambiante pour éliminer les GR les plus fragiles. La suspension est lavée 3 fois avec une solution de NaCI 0,9% Glucose 0,2% (laveur Cobe 2991) puis remise en suspension avec 80 ml de solution de conservation (AS-3). Le taux de MGL encapsulé est dosé comme dans l'exemple 4. JO J1 J7 Hématocrite (%) 52,0 51,6 52,7 Volume globulaire (fL) 91,0 92,0 88,0 Hémoglobine corpusculaire (g/dL) 30,3 29,8 31,6 Concentration de GR (106/pL) 6,00 5,92 5,98 Hémoglobine totale (g/dL) 16,4 16,2 16,6 Hb extracellulaire (g/dL) 0,119 0,197 0,280 Fragilité osmotique (g/L) 1,17 Hémolyse (%) 0,7% 1,2% 1,7% Concentration totale MGL (mg/mL) 0,36 0,35 Concentration du surnageant MGL (mg/mL) 0,01 0,01 Concentration intra érythrocytaire MGL (mg/mL 100% Ht) 0,68 0,67 Activité Extracellulaire (%) 1,3% 1,4% Activité Intracellulaire (%) 98,7% 98,6% Rendement d'encapsulation (%) 19,7% Exemple 4. Dosage de la MGL encapsulée dans les GR Le dosage de l'activité de la MGL dans les suspensions cellulaires (GR totaux) et dans les surnageants repose sur une mesure du NH3 produit par la MGL. Les ions NH3 sont dosés de manière indirecte par action enzymatique de la glutamate déshydrogénase (GLDH) selon le kit commercialisé par Roche Diagnostics (11877984).

Préparation des standards : des standards de MGL à différentes concentrations sont préparés en matrices (GR totaux ou surnageants) ou en solution aqueuse. - Pour les standards en solution aqueuse, la MGL est préparée à des concentrations variant de 0 à 12 pg/ml en présence de 20 pM PLP en tampon phosphate 100 mM, pH 7,2. - Pour les standards en matrice GR totaux, 10 pl de GR-LR sont lysés avec 90 pl d'une solution contenant 260 pM de PLP et de la MGL à des concentrations variant de 0 à 100 pg/ml. Les STD « GR totaux » sont ensuite dilués 20 fois avec du tampon phosphate 100 mM, pH 7,2. - Pour les standards en matrice surnageants, 10 pl de surnageants de GR-LR sont lysés avec 50 pl d'une solution contenant 6,4 pM de PLP et de la MGL à des concentrations variant de 0 à 20 pg/ml.

Pré-traitement des échantillons : les échantillons à doser (10 pl) sont pré-traités de la même manière que les standards (ajout de PLP et dilutions identiques mais sans ajout de MGL). Dosage de la MGL : 7,5 pl de standards (STD) ou d'échantillons sont introduits dans les puits d'une plaque UV. 94 pl de réactif R1(kit Roche) et 56 pl de réactif R2 (kit Roche) contenant de l'a-cétoglutarate en solution tamponnée, du NADPH et de la GLDH sont ajoutés pour éliminer les ions NH3 endogènes des échantillons. Après 10 min d'incubation, 75 pl de L-méthionine à 78,3 mM sont introduits et les mélanges réactionnels sont incubés pendant 30 min. La dégradation du NADPH en NADP+ est suivie en continu par mesure de la densité optique à 340 nm. Pour les standards et les échantillons, la valeur de ADO/min est calculée sur le domaine linéaire des courbes de D.O. obtenues à 340 nm. Une courbe d'étalonnage ADO/min = f(concentration ou activité de MGL dans les standards) est ensuite tracée. Les paramètres de régression permettent de déterminer la concentration de MGL dans les échantillons. Ce résultat peut être exprimé en mg/ml ou en Ul/ml (l'activité spécifique de la MGL étant évaluée pour chaque lot). Le taux de MGL intra-érythrocytaire est obtenu par calcul avec la formule suivante : [MGL ]intra-érythrocytaire = ([MGL]totaux ([MGL]surnageants x (1- hématocrite/100)) / (hématocrite/100). Exemple 5. Dosage du PLP dans les échantillons sanquins par méthode HPLC Le dosage du PLP dans les suspensions cellulaires (GR totaux) et dans les surnageants est une adaptation de la méthode décrite par Van de Kamp et al. Nutrition Research 15, 415-422, 1995. Le dosage est réalisé par RP-HPLC (UFLC Shimadzu) avec détection par fluorimétrie (instrument RF-10AXL, excitation : 300 nm, émission : 400 nm). Le PLP contenu dans les échantillons est extrait avec de l'acide trichloro-acétique (TCA) 6% final. Après centrifugation (15 000 x g, 10 min), les surnageants sont collectés, puis dilués en phase mobile A. Un volume de 50p1 d'échantillon est injecté sur une colonne 5p C-18 Gemini, 250 x 4,6 mm (Phenomenex). La phase mobile A est composée de 33 mM potassium phosphate monobasique, de 8 mM de sodium 1-octanesulfonate supplémentée avec du bisulfite de sodium (0,5 g/L) pour intensifier le signal du PLP et la phase mobile B de 33 mM potassium phosphate monobasique et de 17% (v :v) de 2-propanol. Le gradient utilisé est de la phase mobile A (100%) avec des proportions croissantes de phase mobile B : augmentation de 0% à 8% de B sur une période de 8 min. Le débit à travers la colonne est maintenu à 1m1/min. La concentration de PLP dans les échantillons est déterminée avec une gamme étalon externe de PLP soumis au même traitement TCA que les échantillons. Le temps de rétention du PLP est de -3,4 min. Le taux de PLP intra-érythrocytaire est obtenu par calcul avec la formule suivante : [PLP lintra-érythrocytaire = ([PLP]totaux ([PLP]surnageants X (1- hématocrite/100)) / (hématocrite/100).

Exemple 6. Augmentation du taux de PLP dans les GR par co-encapsulation de PLP avec de la MGL Des suspensions de GR murins sont soumises au procédé d'encapsulation de la MGL et de PLP comme décrit dans l'exemple 2. Le dosage du PLP intracellulaire est effectué selon la méthode décrite dans l'exemple 5 Une suspension de GR humains est soumise au procédé d'encapsulation de la MGL et du PLP comme décrit dans l'exemple 3. Avant l'étape d'incubation à température ambiante, une partie des GR-MGL-PLP humain est prélevée pour réaliser un dosage du PLP intracellulaire selon la méthode décrite dans l'exemple 5.

Le tableau suivant compare les taux physiologiques de PLP dans les érythrocytes humains ou murins avec le taux atteint par co-encapsulation de ce dernier avec la MGL. GR humains GR murins Taux physiologique de PLP 0,11 pM 2,4 pM* (Fonda) (Natta & Reynolds) Taux de PLP Conditions avant - 3,90 pM - 13,4 pM dans les GR-MGL-PLP1 ou GR-MGL-PLP2 dialyse: - 3 mg/mL MGL - - 30 pM PLP Taux de PLP Conditions avant - - 71,4 pM dans les GR-MGL-PLP3 dialyse: - 3 mg/mL MGL - - 125 pM PLP * détail du calcul : 7,5 nmoles/g Hb - 2,4 pM (en prenant un CCMH de 32 g/dl). Exemple 7. Démonstration de l'augmentation de la concentration de PLP dans les GR-MGL par incubation in vitro avec de la pyridoxine. Une suspension de GR humains est soumise au procédé d'encapsulation de la MGL comme décrit dans l'exemple 3. Avant l'étape d'incubation de 3h, une partie des GR est prélevée et séparée en trois pour une incubation volume à volume avec de la pyridoxine à différentes concentrations (0 mM, 2 mM et 4 mM). Après homogénéisation, ces suspensions sont incubées à température ambiante (TA). Après 3h et 24h d'incubation, des échantillons des suspensions cellulaires et des surnageants (obtenus après centrifugation des suspensions à 1000 x g, à 4°C, pendant 10 min) sont préparés et congelés pour une mesure de la concentration en PLP par HPLC comme décrit dans l'exemple 5. Les résultats obtenus sont présentés aux Figures 1 et 2. En l'absence de pyridoxine, le taux de PLP intra-érythrocytaire est de 3,9 pM (PLP issu de la co-encapsulation de MGL et de PLP). Cette concentration de PLP reste constante après 3h et 24h d'incubation. Une légère diminution de la concentration en PLP est observée à 24h et est concomitante avec une apparition de PLP extracellulaire qui peut s'expliquer par de l'hémolyse en fin d'incubation. En présence de pyridoxine (à 2 mM ou à 4 mM), les GR-MGL sont enrichis en PLP avec des concentrations intra-érythrocytaires augmentées d'un facteur 2 après 3h d'incubation (-8 pM de PLP) et près d'un facteur 3 après 24h d'incubation avec apparition d'un effet dose (11 pM et 14 pM pour des concentrations de pyridoxine respectives de 2 mM et 4 mM). Ce résultat montre qu'une incubation d'une suspension de GR encapsulant une enzyme PLP-dépendante avec de la pyridoxine est capable d'augmenter le taux de PLP intracellulaire de manière durable. Exemple 8. Pharmacocinétique de GR encapsulant de la MGL-PLP chez la souris. Les produits murins GR-MGL-PLP2 et GR-MGL-PLP3 préparés et caractérisés comme dans l'exemple 2 et marqués au CFSE (fluorescent) sont injectés par voie intraveineuse à des souris CD1 à une dose de 8 ml/kg. Après différents temps (T + 24h, T + 48h et T + 120h), les souris sont sacrifiées et le sang est recueilli sur tube héparinate de lithium conservé à +4°C à l'abri de la lumière pour la détermination de la pharmacocinétique. La proportion de globules rouges marqués au CFSE dans le sang total est déterminée par une méthode de cytométrie en flux. Cinq microlitres de sang total sont dilué dans 1mL de PBS 0,5% BSA et chaque échantillon est passé en triplicat (comptage de 10 000 cellules en FL-1 ; cytomètre FC500, Beckman Coulter). L'évaluation de la survie des globules rouges chargés en MGL est obtenue en rapportant la proportion de GR marqués au CFSE aux différents temps (T + 24h, T + 48h et T + 120h) à la proportion de GR marqués au CFSE à TO + 15 min (contrôle 100%). Les différents pourcentages obtenus pour chaque temps sont reportés sur un graphique (figure 3) représentant la proportion de GR chargés en MGL en circulation en fonction du temps.

La détermination de la proportion de GR marqués au CFSE dans le sang circulant à différents temps montre une excellente stabilité des produits GR-MGL-PLP2 et GR-MGL- PLP3 in vivo chez la souris, jusqu'à 120 h post injection (83,5 ± 0,6 % et 94,7 ± 0,6 % de survie, respectivement). Exemple 9. Déplétion en L-méthionine à 24h Les produits murins GR-MGL-PLP1, GR-MGL-PLP2 et GR-MGL-PLP3 préparés et caractérisés comme dans l'exemple 2 sont injectés par voie intraveineuse à des souris CD1 à une dose de 8 ml/kg. Au bout de 6h, -0,09 mg de pyridoxine (soit 150 pL d'une solution à 2,9 mM de chlorhydrate de pyridoxine) ont été injectés aux souris receveuse de GR-MGLPLP2. Le taux plasmatique de L-Met a été évalué à 24h par HPLC-MS-MS (Piraud M. et al., Rapid Commun. Mass Spectrum. 19, 3287-97, 2005). Le tableau suivant présente la déplétion obtenue dans les différents groupes de souris injectées. Produit administré Modalités d'apport du co-enzyme PLP Taux de L-Met plasmatique (pM) % de déplétion - -Alimentation 82,7 ± 22,5 - GR-MGL- -Alimentation 46,3 ± 3,5 44% PLP1 - PLP dans le produit fini (- 5 pmoles/L GR) - PLP dans la solution de conservation du produit fini (10 pM) GR-MGL- -Alimentation 22,3 ± 4,9 73% PLP2 - PLP encapsulé dans le produit fini (- + pyridoxine 13,4 pmoles/L GR) - Injection IV de -0,09 mg de pyridoxine GR-MGL- -Alimentation 29,7 ± 4,6 64% PLP3 - PLP encapsulé dans le produit fini (- 71,4 pmoles/L GR) Le taux de L-Met plasmatique a été évalué à 82,7 ± 22,5 pM dans les souris contrôles. Le produit GR-MGL-PLP1 contenant de la MGL encapsulée avec une faible concentration de PLP conduit à une déplétion de 44% de la L-Met, 24h après administration du produit. Nous avons émis l'hypothèse que le PLP ajouté dans la solution de conservation du produit n'est pas disponible pour l'enzyme MGL car 1) il est majoritairement lié à la BSA présent dans la solution de conservation et 2) il ne peut pas passer la membrane du GR. Les résultats montrent qu'un apport plus conséquent de PLP dans le globule rouge soit par injection IV de pyridoxine (GR-MGL-PLP2) soit par encapsulation de PLP à plus forte concentration permet d'obtenir des déplétions de L-Met -1,5 fois plus importantes (73% et 64% de déplétion respectives). Exemple 10. Pharmacodynamie des GR-MGL Les produits murins GR-MGL-PLP2 et GR-MGL-PLP3 préparés et caractérisés comme dans l'exemple 2 sont injectés par voie intraveineuse à des souris CD1 à une dose de 8 ml/kg. Au bout de 6h, -0,09 mg de pyridoxine (soit 150 pL d'une solution à 2,9 mM de chlorhydrate de pyridoxine) ont été injectés aux souris receveuse de GR-MGL-PLP2. Le taux plasmatique de L-Met a été évalué à 15 min, 24h, 48h, et 120h par HPLC-MS-MS (Piraud M. et al.,). La figure 4 présente la déplétion obtenue dans les différents groupes de souris injectées. Les résultats montrent dans les deux groupes expérimentaux une déplétion en L-méthionine stabilisée à 35 pM et maintenue dans le temps (de 48 h jusqu'à 120 h post injection). Ces résultats indiquent qu'une supplémentation en PLP ou en son précurseur (pyridoxine) permet de maintenir une activité de la MGL encapsulée en GR pendant au moins 120 h après injection chez la souris.

Claims (14)

1. REVENDICATIONS1. Composition pharmaceutique comprenant des érythrocytes et un véhicule pharmaceutiquement acceptable, les érythrocytes encapsulant une enzyme à PLP (phosphate de pyridoxal).
2. 2. Composition selon- la revendication 1, comprenant -de la méthioninase, tle la tyrosine phénol-lyase, de la tyrosine aminotransférase ou de la cystathionine bêta-sy' nthase.
3. 3. Composition selon la revendication 1 ou 2, comprenant de 0,01 à 30, de préférence de 0,05 à 10 mg d'enzyme à PLP par mL de globules rouges.
4. 4. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, comprenant en outre du PLP et/ou un précurseur phosphaté ou non phosphaté de PLP.
5. 5. Composition selon la revendication 4, comprenant de 0,05 à 600, notamment de 0,5 à 100, de préférence de 5 à 50 pmoles de PLP et/ou de PNP (phosphate de pyridoxine) et/ou de PMP (phosphate de pyridoxamine), encapsulé par litre (L) de globules rouges.
6. 6. Composition selon la revendication 5, comprenant, en tant que forme non phosphatée de précurseur de PLP, du pyridoxal, de la pyridoxine et/ou de la pyridoxamine, encapsulée et/ou non encapsulée.
7. 7. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant en outre de la pyridoxine kinase (PN-kinase), de la pyridoxine phosphate oxydase (PNP- oxydase), et/ou un agent inhibant la PLP-phosphatase.
8. 8. Composition selon la revendication 1 ou 2, comprenant, d'une part, des érythrocytes et un véhicule pharmaceutiquement acceptable, les érythrocytes encapsulant une enzyme à PLP et, d'autre part, une forme non phosphatée de vitamine B6.
9. 9. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, pour une utilisation comme médicament.
10. 10. Composition selon la revendication 9, comprenant de la méthioninase, comme médicament anticancéreux, notamment contre un cancer comprenant des cellules tumorales auxotrophes pour la méthionine, ou comme médicament permet de traiter une homocystéinurie ou une hyperhomocystéinémie ou une maladie cardio-vasculaire associée.
11. 11. Composition selon la revendication 9, comprenant de la tyrosine phénol-lyase, comme médicament anticancéreux, notamment contre un cancer comprenant -des cellules tumorales auxotrophes pour la tyrosine..
12. 12. Composition selon la Tevendication 9, comprenant de la tyrosine aminotransférase, comme médicament contre le syndrome de Richner-Hanhart (tyrosinémie de type li).
13. 13. Composition selon la revendication 9, comprenant de la cystathionine bêtasynthase, comme médicament permet de traiter une homocystéinurie ou une hyperhomocystéinémie ou une maladie cardio-vasculaire associée.
14. 14. Procédé de préparation d'une composition pharmaceutique comprenant des érythrocytes encapsulant une enzyme à PLP, un véhicule pharmaceutiquement acceptable, et du pyridoxal phosphate (PLP) et/ou un précurseur phosphaté ou non phosphaté de PLP, procédé comprenant les étapes suivantes : optionnellement un culot d'érythrocytes est lavé et centrifugé une ou plusieurs fois avec un tampon physiologique ; la suspension d'érythrocytes est mise en contact avec un milieu liquide hypotonique aboutissant à l'ouverture de pores dans la membrane érythrocytaire ; la suspension d'érythrocytes est4nise en contact avec l'enzyme à PLP avant ou après l'ouverture des pores ; l'enzyme entre dans les érythrocytes ; les pores sont refermés à l'aide d'un tampon hypertonique et l'on recueille une suspension d'érythrocytes rescellés renfermant l'enzyme; optionnellement la suspension d'érythrocytes est incubée pour éliminer les érythrocytes les plus fragiles ; la suspension d'érythrocytes est lavée et conditionnée avec une solution de conservation ; procédé dans lequel : - le PLP et/ou, le cas échéant, un précurseur phosphaté de PLP, est co-encapsulé avec l'enzyme à PLP, - le cas échéant, le précurseur non phosphaté de PLP est ajouté à la suspension d'érythrocytes avant ou après l'ouverture des pores, et/ou - le cas échéant, le précurseur non phosphaté de PLP est ajouté lors de l'incubation ou à la solution de conservation.