CH656534A5 - Procede pour stabiliser un facteur de necrose tumorale et solution aqueuse ou poudre stables contenant ce facteur. - Google Patents

Description

La présente invention concerne un procédé pour stabiliser un Facteur de Nécrose Tumorale et une solution aqueuse ou une poudre stable contenant ce facteur.

Plus particulièrement, l'invention concerne un procédé pour stabiliser un Facteur de Nécrose Tumorale, dans lequel on ajoute une protéine spécifique à une solution aqueuse ou à une poudre contenant un Facteur de Nécrose Tumorale ainsi qu'une solution aqueuse ou une poudre contenant un Facteur de Nécrose Tumorale et une quantité efficace d'une telle protéine spécifique.

Carswell et coll. ont découvert un Facteur de Nécrose Tumorale (Tumor Necrosis Factor désigné ci-après pour simplifier par l'abréviation «TNF»), Ils ont indiqué que le TNF est une substance présente dans le sérum des souris, des rats ou des lapins traités par une endotoxine, qui ont été sensibilisés avec un immunopotentiateur tel que le bacille de Calmette et Guérin (BCG), des corynébactéries ou du Zymosan, et que le TNF provoque une nécrose de diverses tumeurs transplantées à la souris sans effet toxique sur le receveur portant la tumeur [voir Proc. Nat. Sci. Etats-Unis d'Amérique, 72 (9), 3666-3670 (1975)].

Ensuite, de nombreux articles ont été publiés relativement aux propriétés biochimiques et physiologiques du TNF de souris et du TNF de lapin [voir par exemple Proc. Nat. Acad. Sci. Etats-Unis d'Amérique, 73(2), 381-385 (1976); Expl. Cell. Biol., 47, 53-60

(1979); Br. J. Cancer, 38, 302-309 (1978) et ibid., 42, 416-422

(1980)]. Il convient de noter qu'un facteur cytotoxique qui est une substance suggérée comme étant identique au TNF a été également mentionné par cetains chercheurs [voir par exemple Infect. Immun., 3SÏ1 ), 204-211 (1980)].

La production in vitro de TNF a également été mentionnée. Par exemple, Matthews a déterminé et indiqué les conditions optimales dans lesquelles le TNF est produit in vitro par les phagocytes mononucléaires à partir de divers tissus de lapins normaux et de lapins ayant reçu une injection de BCG [(voir Br. J. Cancer, 44, 418-424

(1981)]. Selon cette publication, les quantités optimales de TNF sont produites par les phagocytes mononucléaires en présence d'une endotoxine et les macrophages alvéolaires et péritonéaux sont les producteurs les plus puissants de TNF. De plus, selon cette publication, les macrophages de lapins ayant reçu une injection de BCG produisent nettement plus de TNF que ceux des animaux normaux. Entretemps, Männel et coll. ont indiqué que les cellules d'exsudat périto-néal enrichi en macrophages de souris ayant reçu une injection de BCG libèrent un facteur cytotoxique lorsqu'on les stimule in vitro avec un lipopolysaccharide (endotoxine) [voir Infect. Immun., 30(2), 523-530 (1980), et ibid., ii(l), 156-164 (1981)].

En ce qui concerne les propriétés caractéristiques du TNF, on sait que le TNF, en plus de son activité d'induction de la nécrose de diverses tumeurs, exerce une activité non spécifique de l'espèce des animaux. Par exemple, le TNF de lapin peut provoquer la nécrose des tumeurs de la souris. De plus, on sait que le TNF in vitro n'exerce aucun effet cytotoxique notable sur les cellules normales et a un effet cytotoxique sur certains types de lignées cellulaires néopla-siques (par exemple les cellules L-M et Meth-A). Comme indiqué ci-dessus, le TNF a une activité antitumorale, exerce une activité non spécifique de l'espèce des animaux et n'exerce aucun effet nuisible notable sur les cellules normales. Donc, les espérances des applications cliniques du TNF comme médicament antitumoral ont été grandes dans l'art.

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On sait également que seule une très petite quantité de TNF est induite chez un mammifère ou un système de culture tissulaire. Par conséquent, pour assurer une application clinique étendue et sans danger du TNF comme médicament antitumoral, il est absolument nécessaire d'isoler et de purifier fortement le TNF brut produit chez un mammifère ou dans un système de culture tissulaire. De plus, lorsqu'on effectue une production à grande échelle de TNF destiné à l'emploi comme médicament antitumoral, il est généralement nécessaire de stocker le TNF fortement purifié sous la forme d'une solution ou d'une masse congelée pendant une période prolongée et de lyophiliser la solution de TNF. Cependant, les titulaires ont découvert que l'activité du TNF fortement purifié diminue nettement lors de son stockage, de sa congélation, de sa décongélation et de sa lyophilisation.

Pour autant que les présents inventeurs le sachent, il n'existe pas de publication dans laquelle la stabilité du TNF fortement purifié ait été étudiée. Dans ces circonstances, une fourniture efficace et régulière de TNF fortement purifié, en particulier à l'échelle industrielle, ne peut pas être assurée, bien que l'on sache que le TNF est un médicament antitumoral efficace.

Pour résoudre la difficulté exposée ci-dessus relative à la stabilité du TNF, les titulaires ont effectué des études importantes et poussées. Elles ont débouché sur la découverte très surprenante que l'addition d'une quantité efficace d'une protéine spécifique comme agent stabilisant à une solution aqueuse ou à une poudre contenant du TNF permet de conserver le TNF pendant une période prolongée sans qu'il perde son activité et rend le TNF stable à la congélation, la décongélation, la lyophilisation et similaires. L'invention repose sur cette découverte.

L'invention a donc pour objets:

de fournir un procédé pour stabiliser le TNF; et — de fournir une solution ou une poudre stables de TNF conservant leur activité pendant une période prolongée et stables à la congélation, la décongélation, la lyophilisation et similaires.

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture de la description détaillée qui suit, faite en regard des dessins annexés, dans lesquels:

la figure 1 est un graphique montrant l'effet de la concentration de la sérum-albumine humaine sur l'activité résiduelle du TNF après 7 jours de conservation à 4 C;

la figure 2 est un graphique montrant l'effet de la concentration de la gélatine partiellement hydrolysée sur l'activité résiduelle du TNF après7 jours de conservation à4 C;

la figure 3 est un graphique montrant l'effet de la concentration de la y-globuline humaine sur l'activité résiduelle du TNF après 7 jours de conservation à 4 C; et la figure 4 est un graphique montrant l'effet de la concentration du sulfate de protamine de saumon sur l'activité résiduelle du TNF après 7 jours de conservation à 4 C.

Une explication détaillée complémentaire des figures est exposée ci-après relativement à l'exemple 2.

Selon un de ses aspects, l'invention fournit un procédé pour stabiliser un TNF qui comprend l'addition à une solution aqueuse ou à une poudre contenant du TNF d'une quantité efficace d'au moins un agent stabilisant choisi parmi le groupe constitué par une albumine, une gélatine, une globuline, une protamine et un sel de protamine. Selon un autre de ses aspects, l'invention fournit une solution aqueuse ou une poudre stables contenant du TNF et une quantité efficace d'au moins un agent stabilisant choisi parmi le groupe constitué par une albumine, une gélatine, une globuline, une protamine et un sel de protamine.

Le terme «TNF» tel qu'on l'emploie ici désigne une substance à activité physiologique qui est produite par l'administration d'au moins une substance capable de stimuler le système réticulo-endo-thélial d'un mammifère, puis injection d'une endotoxine d'une bactérie à Gram négatif au mammifère ou par addition d'une endotoxine d'une bactérie à Gram négatif à un système de culture tissulaire contenant des macrophages activés d'un mammifère, cette substance provoquant la nécrose de certaines tumeurs lorsqu'elle est transférée de façon passive à des mammifères porteurs de tumeur, ou une substance produite selon un procédé quelconque et ayant des propriétés semblables à celles de la substance à activité physiologique ci-dessus. 5 Le TNF que l'on emploie dans l'invention est produit selon plusieurs procédés connus dans l'art, y compris les procédés de Matthews et coll. [voir Br. J. Cancer, 42, 416-422 (1980)] et le procédé de Green et coll. [voir J. Nati. Cancer Inst., 59(5), 1519-1522 (1977)].

Des procédés typiques pour préparer le TNF que l'on emploie io dans la présente invention sont les suivants.

Tout d'abord, on injecte par voie intraveineuse ou intrapérito-néale à un mammifère (par exemple souris, lapin, cobaye, etc.) au moins une substance ayant la capacité de stimuler le système réticu-lo-endothélial. Comme substances ayant la capacité de stimuler le is système rêticulo-endothêlial, on emploie généralement des bactéries à Gram positif, des protozoaires ou des levures, que l'on administre au mammifère à l'état soit de micro-organismes vivants, soit de micro-organismes morts (par exemple après traitement par la chaleur ou traitement avec la formaline), soit un extrait de cellules de micro-20 organismes. Des exemples des bactéries à Gram positif comprennent les propionibactéries telles que Propionibacterium acnes ( Corynebac-terium parvumj et Propionibacterium gramilosum (Corynebacterium granulosum), des mycobactéries telles que le bacille de Calmette et Guérin (BCG) et Mycobacterium smegmatis, et des nocardias telles 25 que Nocardia erythropolis et Nocardia gardneri. Comme protozoaires appropriés, on peut par exemple employer des Plasmodiums ou des toxoplasmes. Comme levure appropriée, on emploie généralement le Zymosan extrait de Saccharomyces cerevisiae ou autres. On peut aussi employer des composés synthétiques de poids moléculaire 30 élevé tels qu'un copolymère de pyranne. Ensuite, 7 à 8 jours après l'administration de la substance précitée ayant la capacité de stimuler le système réticulo-endothélial, on injecte par voie intraveineuse audit mammifère une endotoxine d'une bactérie à Gram négatif, par exemple un lipopolysaccharide dérivé à'Escherichia coli, de Pseudo-35 monas aeruginosa ou de Salmonella typhosa. Enfin, 1,5 à 2 h après l'injection, on prélève des liquides de l'organisme (par exemple le liquide d'ascite, la lymphe, etc.) et/ou du sérum ou du plasma desdits mammifères ou on homogénéise des viscères tels que le foie, la rate, etc., et on les extrait avec une solution salée physiologique. 40 On peut employer ces liquides de l'organisme, sérum, plasma et/ou extrait de viscères comme solution brute de TNF. Cependant, on emploie généralement parmi eux le sérum ou le plasma.

Comme indiqué ci-dessus, le procédé pour préparer le TNF à employer dans l'invention n'est pas limité au procédé ci-dessus. On 45 peut également employer de façon efficace le procédé reposant sur le génie génétique et le procédé de culture tissulaire où on emploie des. cellules capables de produire du .TNF. Il convient de noter que ces procédés peuvent également être appliqués à la production de TNF humain.

50 Le TNF brut produit selon l'un des procédés indiqués ci-dessus peut être purifié selon les techniques biochimiques classiques indiquées ci-dessous isolément ou en combinaison, pour fournir une solution aqueuse purifiée de TNF que l'on lyophilise pour obtenir une poudre purifiée de TNF. Comme techniques biochimiques appro-55 priées de purification du TNF, on peut mentionner par exemple une technique de relargage dans laquelle on emploie du sulfate d'ammonium, une Chromatographie par échange d'ions, dans laquelle on emploie une résine échangeuse d'ions, une technique de filtration sur gel et une technique d'électrophorèse. Lorsque la pureté du TNF 60 s'accroît par la mise en pratique des techniques ci-dessus de purification, on constate que le TNF devient progressivement instable. Par exemple, un échantillon de TNF purifié, pour qu'il ait une activité spécifique de 500000 unités/mg (l'activité spécifique est exprimée en unités d'activité de TNF par mg de protéine; l'unité d'activité du 65 TNF est définie ci-après) est très instable comme le montrent les valeurs indiquées dans les exemples. Même les échantillons de TNF ayant une activité spécifique inférieure à 500000 unités/mg présentent également un certain degré de baisse de l'activité lorsqu'on les

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stocke ou les soumet à une congélation, une décongélation, une lyophilisation ou d'autres opérations.

Par conséquent, l'invention concerne la stabilisation du TNF que l'on a purifié à un degré élevé et que l'on a rendu instable. Le TNF à stabiliser selon l'invention peut être soit sous la forme d'une solution, soit sous la forme d'une poudre. Cependant, on préfère que le TNF' stabilisé soit sous la forme d'une solution.

On préfère que la solution de TNF à stabiliser selon l'invention ait constamment un pH de 5 à 10 et, de plus, on préfère que le solvant de la solution de TNF soit stabilisé par un tampon approprié. Comme tampon approprié, on peut mentionner par exemple un tampon phosphate et un tampon tris(hydroxyméthyl)-aminomé-thane-HCI. A la demande, on ajoute à la solution de TNF un sel tel que le chlorure de sodium et le chlorure de potassium. Par exemple, o'n ajoute un sel à la solution de TNF pour préparer une solution isotonique lorsque la solution de TNF est utilisée pour l'injection. Ce n'est pas le seul but de l'addition d'un sel. La concentration d'un tel sel dans la solution de TNF peut être déterminée selon le but de l'addition du sel. Par exemple, lorsque la finale de TNF est utilisée pour l'injection, on prépare une solution isotonique à partir de la solution de TNF par addition de chlorure de sodium jusqu'à une concentration de 0,15M.

Selon le procédé de l'invention, on ajoute une quantité efficace d'au moins un agent stabilisant choisi parmi le groupe constitué par une albumine, une gélatine, une globuline, une protamine et un sel de protamine à une solution aqueuse ou à une poudre contenant du TNF.

Comme albumine appropriée, on peut mentionner les albumines de divers animaux, tels que les bovins, les chevaux, les moutons, les chèvres, les poulets et l'homme. Comme exemples spécifiques d'albumine appropriée, on peut mentionner la sérum-albumine bovine, la sérum-albumine humaine, l'albumine d'œuf de poule, la lactalbu-mine bovine et la lactalbumine humaine. On n'observe pas de différence significative en ce qui concerne la capacité de stabiliser le TNF entre les albumines précitées. Cependant, comme agent de stabilisation des préparations injectables, on préfère tout particulièrement la sérum-albumine humaine.

Comme gélatine appropriée, on peut mentionner une gélatine ordinaire produite selon des procédés courants et une gélatine partiellement hydrolysée. Le poids moléculaire de la gélatine n'a pas d'importance stricte. Cependant, comme agent stabilisant pour les préparations injectables, on préfère particulièrement une gélatine partiellement hydrolysée soluble dans l'eau. La gélatine partiellement hydrolysée est obtenue par hydrolyse enzymatique d'une gélatine au moyen d'une enzyme protéolytique, telle que la papaïne ou par hydrolyse catalysée par un acide ou un alcali d'une gélatine.

Comme globuline appropriée, on peut mentionner les globulines sériques de divers mammifères, tels que les bovins, les chevaux, les moutons, les chèvres et l'homme et leurs dérivés. On n'observe pas de différence notable en ce qui concerne la capacité de stabiliser le TNF entre les globulines précitées. Cependant, parmi elles, on préfère tout particulièrement une y-globuline et un dérivé correspondant obtenu par traitement enzymatique ou modification chimique de la globuline de départ. Comme agent stabilisant pour les préparations injectables, on préfère tout particulièrement une y-globuline humaine et ses dérivés tels qu'une y-globuline humaine traitée par la fibrinolysine ou traitée par la pepsine et une y-globuline humaine sulfonée.

Comme protamine appropriée, on peut mentionner les protami-nes provenant d'espèces de poissons appropriées, telles que le saumon, le hareng et le maquereau. Comme sel de protamine approprié, on peut mentionner les chlorhydrates, sulfates et phosphates de protamines. On n'observe pas de différence notable en ce qui concerne la capacité de stabiliser le TNF entre les protamines et leurs sels précités.

Les agents stabilisants que l'on emploie dans l'invention peuvent être utilisés isolément ou en mélange.

L'agent stabilisant que l'on emploie dans l'invention est ajouté à raison d'environ 1 |ig ou plus, de préférence de 10 |ig ou plus, en particulier de 100 (ig ou plus par ml de la solution de TNF ayant une activité de TNF de 10- à 10(J unités/ml (l'unité d'activité est définie plus loin). La limite supérieure de la quantité d'agent stabilisant est généralement déterminée du point de vue de la solubilité de l'agent stabilisant et de la viscosité de la solution obtenue et du point de vue économique. La limite supérieure de la quantité d'agent stabilisant est généralement de 50 mg, de préférence de 10 mg par ml de la solution de TNF. Lorsque le TNF est stabilisé sous la forme d'une poudre, on ajoute l'agent stabilisant en une quantité telle que la solution aqueuse obtenue par dissolution du TNF en poudre, présentant une activité de 102 à 10° unités/ml, présente les concentrations précitées de l'agent stabilisant.

La façon dont on ajoute l'agent stabilisant n'a pas d'importance stricte. Par exemple, l'agent stabilisant sous la forme d'une poudre peut être ajouté directement à la solution de TNF. Sinon, la poudre de l'agent stabilisant peut être préalablement dissoute dans de l'eau ou un tampon approprié et ajoutée à la solution de TNF. De plus, on peut également mélanger la poudre de l'agent stabilisant avec la poudre de TNF. L'addition de l'agent stabilisant peut être effectuée en un moment quelconque du stade de purification ou du stade de fabrication des préparations pharmaceutiques.

Lorsqu'on emploie deux ou plusieurs types différents d'agents stabilisants, on les ajoute en une quantité telle que leur quantité totale soit comprise dans la gamme des quantités définie ci-dessus.

On préfère que la conservation, la purification et la fabrication de préparations pharmaceutiques à partir de la solution de TNF à laquelle est incorporé un agent stabilisant selon l'invention, lorsqu'on la maintient sous la forme d'une solution, soient effectuées à une température de 0 à 30 C et mieux de 0 à 10 C. Lorsque la solution de TNF est conservée à l'état congelé, on préfère que la température de conservation soit maintenue en dessous de 0 C et mieux en dessous de —20 C.

La solution de TNF à laquelle est incorporée une quantité efficace d'au moins un agent stabilisant selon l'invention conserve son activité de TNF pendant la conservation, qu'elle soit sous la forme d'une solution ou sous une forme congelée et également pendant les stades de purification et de fabrication des préparations pharmaceutiques.

De plus, le procédé pour stabiliser le TNF selon l'invention s'applique également à la lyophilisation. Généralement, lorsqu'on lyophilise des solutions de TN F (en particulier dans le cas de TNF très purifié), leur activité diminue nettement. Cependant, les solutions de TNF contenant une quantité efficace d'au moins un agent stabilisant selon l'invention peuvent être lyophilisées sans perte de l'activité pour fournir une poudre de TNF. La poudre de TNF peut être dissoute pour former une solution aqueuse stable de TNF dans laquelle les concentrations de l'agent stabilisant et du TNF sont comprises dans les gammes définies ci-dessus. L'agent stabilisant comme défini dans l'invention peut sinon être incorporé aux préparations lyophilisées de TNF. Lorsque le TNF est conservé sous la forme d'une poudre, on préfère que la température de conservation soit maintenue à 25 C ou moins.

Pour déterminer l'activité du TNF, on emploie généralement deux procédés, le procédé in vivo dans lequel on mesure in vivo l'effet de nécrose tumorale et le procédé in vitro dans lequel on mesure in vitro reflet cytotoxique sur des cellules nêoplasiques.

Comme procédé in vivo, on peut mentionner par exemple le procédé de Carswell et coll. [voir Proc. Nat. Acad. Sci. Etats-Unis d'Amérique, 7.2(9), 3666-3670 (1975)]. Selon ce procédé, on transplante des cellules Meth A de sarcome de BALB/c (2 x 105 cellules) par voie intradermique dans l'aisselle de souris (BALB/c x C57BL/6)F, et, 7 jours plus tard, on choisit pour l'évaluation des souris porteuses de tumeurs de 7 à 8 mm de diamètre bien vasculari-sées et sans nécrose centrale spontanée. On injecte dans la veine de la queue de chacune des souris un échantillon de TNF (0,5 ml) dilué

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uvee une solution salce physiologique. On évalue l'activité de l'échantillon de TNF- après 24 h selon les critères suivants.

( — ) : pas de changement ( + ) : légère nécrose hémorragique

(+ +): nécrose hémorragique modérée (nécrose centrale atteignant environ 50% de la surface tumorale)

(+ + +): nécrose hémorragique nette (nécrose massive laissant un petit anneau viable sur le pourtour de la tumeur)

Comme procédé in vitro de détermination de l'activité du TNF, on peut mentionner par exemple le procédé de RufTet coll. [voir Lymphokines, vol. 2, édité par E. Pick, Academic Press, N.Y., 245-248 (1980)] et le procédé de Kull et coll. [voir J. Immunol., 126(4), 1279-1283 (1981)].

Le procédé in vitro que les titulaires ont employé pour la détermination de l'activité du TNF a été mis au point par amélioration des procédés classiques précités. Dans le procédé in vitro des titulaires où on mesure l'activité cytotoxique du TNF vis-à-vis de cellules L-M (American Type Culture Collection CCL 1.2), on opère comme suit. Comme récipient de culture, on emploie des plaques de microtitrage à 96 cupulcs produites par Flow Laboratories, Inc. (Etats-Unis d'Amérique) et on cultive les cellules L-M dans du milieu essentiel minimal de Eagle [voir Science, 130, 432-437 (1959)] contenant 10% v/v de sérum de veau fœtal inactivé par chauffage. On dilue en série un échantillon de 0,1 ml de TNF et on mélange la suspension de cellules L-M (0,1 ml; I x 104 cellules) dans chaque cupule des plaques et on incube les plaques à 37 C pendant 48 h dans de l'air contenant 5% de gaz carbonique. A la fin de la période de culture, on ajoute 20 [il d'une solution aqueuse à 20% de glutaraldêhyde pour fixer les cellules. Après la fixation, on lave les plaques avec de l'eau distillée et on laisse sécher, puis on ajoute 0,1 ml de bleu de méthylène à 0,05% pour colorer les cellules vivantes. On lave à fond les plaques avec de l'eau distillée pour éliminer l'excès de colorant et on laisse sécher. On ajoute 0,2 ml d'acide chlorhydrique à 3% dans chaque cupule pour extraire le colorant des cellules colorées. On mesure l'absorbance de chaque cupule à 665 nm avec un Titertek Multiskan produit par Flow Laboratories, Inc. L'absorbance est proportionnelle au nombre de cellules vivantes. L'activité du TNF, unité(U)/ml, est définie par l'inverse de la dilution du TNF qui provoque une cytotoxicité de 50% et on peut l'obtenir par établissement d'un graphique de la dilution en fonction de l'absorbance. Toutes les activités de TNF déterminées selon le procédé in vitro qui sont indiquées ci-après sont exprimées au moyen de l'unité déterminée ci-dessus.

Le procédé de l'invention permet la fourniture efficace et régulière à l'échelle commerciale de TNF très purifié que l'on estime être un médicament antitumoral efficace applicable en clinique, grâce au fait que l'activité du TNF est maintenue pendant la conservation, que le TNF soit sous la forme d'une solution, d'une masse congelée ou d'une préparation lyophilisée, et pendant les stades de purification et de fabrication des préparations pharmaceutiques.

Les titulaires ont également découvert que la solution ou poudre de TNF à laquelle est incorporé au moins un agent stabilisant choisi parmi la sérum-albumine humaine, une gélatine, une y-globuline humaine, un dérivé de y-globuline humaine, une protamine et un sel de protamine, peut être administrée sans danger à l'organisme humain et que, par conséquent, la nouvelle composition de l'invention est particulièrement utile lors de l'application clinique du TNF comme médicament antitumoral.

L'invention va être décrite de façon plus détaillée, par l'exemple de référence, les exemples et les exemples comparatifs suivants qui ne limitent en rien la portée de l'invention.

Dans les exemples suivants, les noms des agents stabilisants sont abrégés comme suit:

HSA: sérum-albumine humaine BSA: sérum-albumine bovine

PHG-1 : gélatine partiellement hydrolysée obtenue par hydrolyse catalysée par un alcali de la gélatine (poids moléculaire moyen: environ 7000)

HGG: y-globuline humaine SPS : sulfate de protamine de saumon HPS: sulfate de protamine de hareng BGG: y-globulinc bovine CEA : albumine d'oeuf de poule BLA: a-lactalbumine bovine

PHG-2: gélatine partiellement hydrolysée obtenue par hydrolyse catalysée par un acide de la gélatine (poids moléculaire moyen: environ 7000)

PHG-3: gélatine partiellement hydrolysée ayant une faible solidité de gel

PG: gélatine purifiée SPF: protamine de saumon (base libre)

SPP: phosphate de protamine de saumon EDTA: acide éthylènediaminetétraacétique

Exemple de référence

On injecte par voie intraveineuse à des lapins pesant 2 à 3 kg 75 mg de cellules tuées par la formaline de Propionibacterium acnes (Corynebacterium parrum: Welcome Research Laboratories, Angleterre). Huit jours plus tard, on injecte par voie intraveineuse à chaque lapine 100 n d'endotoxine (lipopolysaccharide d'Escherichia coli 026:B6, produit par Difco Laboratories, Etats-Unis d'Amérique). On prélève le sang de chaque lapine par ponction cardiaque 2 h après l'injection d'endotoxine et on mélange le sang obtenu avec une petite quantité d'héparine. On centrifuge le sang à 3000 tr/min pendant 15 min. On obtient ainsi un plasma ayant une activité de TNF de 2500 U/ml.

On dilue le plasma ainsi obtenu (101) contenant du TNF avec 5 1 de tampdn phosphate 0,03 M (pH 7,8). On applique le plasma dilué à une colonne (10 x 42 cm) de DEAE-Sepharose CL-6B (fabriqué et vendu par Pharmacia Fine Chemicals AB, Suède) équilibrée avec du tampon phosphate 0,03 M (ph 7,8) 0,13 M en NaCl. On lave la colonne avec 2,5 1 de tampon phosphate 0,03 M (pH 7,8), 0,13 M en NaCl et on élue le TNF adsorbé avec un gradient linéaire de chlorure de sodium obtenu avec 5,0 1 de tampon phosphate 0,03 M (pH 7,8), 0,15 M en NaCl et 5,0 I de tampon phosphate 0,03 M (pH 7,8), 0,3 M en NaCl. Le débit est de 230 ml/'h et on recueille des fractions de 45 ml. On observe l'activité de TNF dans les fractions éluées avec le NaCl 0,20-0,24 M. On regroupe les fractions à activité de TNF et on les dialyse pendant une nuit contre du tampon Tris-HC1 0,03 M (pH 7,2) 0,13 M en NaCl.

On rechromatographie la solution dialysèe de TNF sur une colonne de DEAE-Sepharose CL-6B (3,0 x 30 cm) équilibrée avec du tampon Tris-HCI 0,03 M (pH 7,2) 0,15 M en NaCl. On élue le TNF adsorbé avec un gradient linéaire de chlorure de sodium obtenu avec 500 ml du tampon d'équilibrage et 500 ml de tampon Tris-HCI 0,03 M (pH 7,8) 0,3 M en NaCl. Le débit est de 40 ml/h et on recueille des fractions de 10 ml. On regroupe et concentre les fractions ayant une activité de TNF.

On soumet le concentré à une lillration sur gel avec une colonne (5 x 100 cm) de Sephacryl S-200 (fabriqué et vendu par Pharmacia) équilibrée avec du tampon phosphate 5 mM (pH 7,0) 0,15 M en NaCl. On effectue l'élution avec le tampon d'équilibrage. Le débit est de 80 ml/h et on recueille des fractions de 13 ml. On regroupe les fractions ayant une activité de TNF et on concentre par ultrafiltra-tion.

La solution de TNF ainsi obtenue se révèle avoir une activité spécifique de 5,0 x 10s U/'mg de protéines et une pureté 10000 fois supérieure à celle observée dans le plasma.

On soumet la solution de TNF ainsi obtenue à une nouvelle Chromatographie sur la même colonne (Sephacryl S-200) en utilisant le même tampon pour obtenir une solution de TNF ayant une activité spécifique de 1,0 x 106 U/mg de protéines.

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Exemple 1

On dilue avec du tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0) 0,15 M en chlorure de sodium du TNF de lapin ayant une activité spécifique de 5,0 x 105 U/mg obtenu selon le mode opératoire décrit dans l'exemple de référence pour obtenir une solution de TNF ayant une activité de TNF de 1200 U/ml. A des portions de la solution de TNF ainsi obtenue, on ajoute séparément comme agents stabilisants de la HSA (sérum-albumine humaine), de la BSA (sérum-albumine bovine), de la PHG-1 (gélatine partiellement hydrolysée), de la HGG (y-globu-linc humaine) et du SPS (sulfate de protamine de saumon) pour former dans chaque cas deux solutions différentes ayant une concentration de 0,1 mg/ml ou de 1,0 mg/ml.

Pour chacune des solutions obtenues, on détermine l'activité résiduelle relativement 1) aux échantillons obtenus par conservation respectivement pendant 2 jours, 7 jours et 30 jours à 40 C, 2) aux échantillons soumis respectivement à 1 cycle et 3 cycles de congélation ( — 70 C') et de décongélation et 3) à l'échantillon soumis à une congélation à —70 C, une lyophilisation et une conservation pendant 7 jours à 25 C. Pour effectuer l'essai ci-dessus, on emploie comme témoin la solution de TNF à laquelle on n'a pas incorporé d'agent stabilisant. En ce qui concerne la préparation lyophilisée [voir 3)], on la dissout dans de l'eau distillée stérile, puis on la soumet à la détermination de l'activité du TNF.

Pour déterminer l'activité résiduelle, on mesure l'activité de chaque échantillon in vitro ou in vivo selon les procédés décrits précédemment. Dans le procédé in vitro, on calcule l'activité résiduelle (%) à partir de la valeur de dosage selon l'équation suivante:

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Activité résiduelle (%) = — x 100

D

où A est l'activité de TNF de l'échantillon après conservation ou traitement physique et B est l'activité de TNF de l'échantillon avant conservation ou traitement physique.

Dans le procédé in vivo, on concentre chaque échantillon de solution pour que la concentration soit 20 fois supérieure à celle de départ au moyen du minimodule NM-3 (marque du commerce de l'appareil d'ultrafiltration fabriqué et vendu par Asahi Chemical In-dustry Co. Ltd., Japon). On injecte ensuite 0,5 ml de chacune des solutions de TNF ainsi concentrées dans la veine de la queue à un groupe de 5 souris porteuses de tumeurs. On détermine l'activité du TNF 24 h après selon le critère précédemment décrit. Les résultats obtenus figurent dans le tableau 1.

(Tableau en page suivante)

Exemple 2

A des portions de solution de TNF ayant la même activité de TNF que celle employée dans l'exemple 1, on ajoute séparément de la HSA, de la PHG-1, de la HGG et du SPS (ces protéines sont les mêmes que celles employées dans l'exemple 1) comme agent stabilisant à diverses concentrations. On conserve chacune des solutions obtenues à 4 C pendant 7 jours, puis on les soumet à la détermination de l'activité du TNF selon le procédé in vitro. On calcule l'activité résiduelle du TNF (%) de la même façon que dans l'exemple 1. Les résultats obtenus sont illustrés par les figures 1 à 4.

Exemple 3

On dilue avec du tampon phosphate 0,1 M (pH 7,0) 0,15 M en chlorure de sodium, du TNF de lapin ayant une activité spécifique de 1,0 x 106 U/mg, obtenu selon les modes opératoires décrits dans l'exemple de référence pour obtenir une solution de TNF ayant une activité de TNF de 1000 U/ml. A des portions de la solution de TNF ainsi obtenue, on ajoute conjointement deux types différents d'agents stabilisants choisis parmi diverses albumines, globulines, protamines et gélatines, à diverses concentrations comme indiqué dans le tableau 2. On conserve chacune des solutions obtenues à 4 C pendant 7 jours et on les soumet à une détermination de l'activité de TNF selon le procédé d'essai in vitro. On calcule l'activité

résiduelle du TNF (%) de la même façon que dans l'exemple I. Les résultats obtenus figurent dans le tableau 2.

Tableau 2

Effet stabilisant de divers agents stabilisants

Agent stabilisant (concentration, mg;m!)

Activité résiduelle du TNF, % conservation à 4 C pendant 7 jours

Néant (témoin)

5

BSA (0,05) +HSA (0,05)

96

HSA (0,01) +PHG-1 (0,05)

90

11 PS (0,1) + PHG-1 (0,05)

95

BGG (1,0) + CEA (1,0)

93

HGG (0,I) + SPS(0,1)

94

Nota: Comme BSA, HSA, PHG-I, HGG et SPS, on utilise les mêmes matières que celles employées dans l'exemple 1. HPS: produit de Sigma Chemical Co.

BGG: produit de Sigma Chemical Co.

CEA: produit de Nutritional Biochemicals Corp.

Exemple 4

A des portions de solution de TNF ayant la même activité de TNF que celle employée dans l'exemple 3, on ajoute séparément comme agent stabilisant diverses albumines indiquées dans le tableau 3 en une quantité telle que la solution obtenue ait une concentration de 1,0 mg/ml. On conserve chacune des solutions obtenues à 4 C pendant 7 jours et on les soumet à une détermination de l'activité du TNF selon le procédé d'essai in vitro. On calcule l'activité résiduelle (%) de la même façon que dans l'exemple 1. Les résultats obtenus figurent dans le tableau 3.

Tableau 3 Effet stabilisant de diverses albumines

Agent stabilisant

Activité résiduelle du TNF, % conservation à 4 C pendant 7 jours

Néant (témoin)

5

HSA

98

Fraction de HSA

97

BSA

98

Fraction de BSA

98

CEA

-90

BLA

91

Nota: Comme HSA, BSA et CEA, on utilise les mêmes matières que celles employées dans les exemples 1 et 3.

Fraction de HSA: fraction de sérum-albumine humaine (fraction V de Cohn), produit de Sigma Chemical Co.

Fraction de BSA : fraction de sérum-albumine bovine (fraction V de Cohn), produit de Sigma Chemical Co. BLA: produit de Sigma Chemical Co.

Exemple 5

A des portions de solution de TNF ayant la même activité de TNF que celle employée dans l'exemple 3, on ajoute séparément comme agent stabilisant diverses gélatines comme indiqué dans le tableau 4 en une quantité telle que la solution obtenue ait une concentration de 1,0 mg/ml. On conserve chacune des solutions obtenues à 4 C pendant 7 jours et on détermine l'activité de TNF selon le procédé d'essai in vitro. On calcule l'activité résiduelle du TNF (%) de la même façon que dans l'exemple 1. Les résultats obtenus figurent dans le tableau 4.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Tableau 1

Effet stabilisant de HSA, BSA, PHG-1, HGG et SPS

Condition

Témoin avant conservation (ou traitement physique)

Conservation à 4'C (solution)

Congélation-décongélation

Conservation à 25 C (préparation lyophilisée)

Procédé de détermination de l'activité

in vitro in vivo in vitro in vivo in vitro in vitro in vivo

Agent stabilisant

Concentration (mg/ml)

Jours

Jours

Répétition

Jours

Jours

2

7

30

7

1

3

7

7

Témoin (sans agent stabilisant)

-

100

+ + +4, + + 1

52

26

4

+ 3, -2

30

8

40

+ 4, -1

HSA

0,1 1,0

100 100

+ + +4, + + 1 + + + 4, + -{-1

102 100

95 - 98

90 92

+ + +3, ++2 + + +4, +1

90 100

82 94

95 102

+ + +3, ++2 + + +4, + + 1

BSA

1,0

100

+ + + 4, + +1

99

98

93

+ + +4, +1

102

96

96

+ + + 3, + + 2

PHG-1

0,1 1,0

100 100

+ + +4, + + 1 + + + 4, + +1

96 103

94 97

88 91

+ + +3, ++2 + + + 4, + +1

95 101

85 93

97 100

+ + +4, + + 1 + + + 5

HGG

0,1 1,0

100 100

+ + +4, + + 1 + + + 4, + + 1

94 102

90 97

87 90

+ + +3, +2 + + + 3, +4-2

88 100

80 90

93 98

+ + +3, + +2 + + + 3, + + 2

SPS

0,1 1,0

100 100

+ + + 4, + +1 + + +4, + + 1

95 101

90 96

87 90

+ + + 3, + +2 + + +4, +1

93 100

80 92

90 97

+ + +3, ++2 + + +4, + + 1

Nota: Les valeurs dans les colonnes marquées «in vitro» représentent l'activité résiduelle comme précédemment défini.

Les valeurs dans les colonnes marquées «in vivo» représentent le nombre de souris. La signification des symboles ( —, +, + +, etc.) a été précédemment indiquée.

HSA: produit de Sigma Chemical Co., Etats-Unis d'Amérique

BSA : produit de Armour Pharmaceutical Co., Etats-Unis d'Amérique

PHG-1 : produit de Nippi Co., Ltd. j Japan (High'Grade gelatili)

HGG: produit de Nutritional Biochemicals Corp., Etats-Unis d'Amérique

SPS: produit de Sigma Chemical Co., Etats-Unis d'Amérique

656 534

8

Tableau 4 Effet stabilisant de diverses gélatines

Agent stabilisant

Activité résiduelle du TNF, % conservation à 4 C pendant 7 jours

Néant (témoin)

4

PHG-1

97

PHG-2

99

PHG-3

99

PG

96

Nota: Comme PHG-I, on emploie la même matière que celle employée dans l'exemple 1.

PHG-1 : produit de Nippi Co., Ltd.

PHG-2: produit de Sigma Chemicals Co., (Gélatine type IV: environ 60 Bloom)

PG: produit de Nakarai Chemicals Co., Ltd. Japon.

Exemple 6

■ A des portions de solution de TNF ayant la même activité de TNF que celle employée dans l'exemple 2, on ajoute séparément diverses globulines comme indiqué dans le tableau 5 en une quantité telle que la solution obtenue ail une concentration de 1,0 mg/ml. On conserve chacune des solutions obtenues à 4 C pendant 7 jours et on les soumet à la détermination de l'activité du TNF selon le procédé d'essai in vitro. On calcule l'activité résiduelle du TNF (%) de la même façon que dans l'exemple 1. Les résultats obtenus figurent dans le tableau 5.

Tableau 5 Effet stabilisant de diverses globulines

Agent stabilisant

Activité résiduelle du TNF, % conservation à 4 C pendant 7 jours

Néant (témoin)

4

HGG

97

BGG

95

HGG traitée par la fibrinolysine

93

HGG traitée par la pepsine

94

HGG sulfonée

91

Fraction de HGG

99

Nota: Comme HGG et BGG, on emploie les mêmes matières que celles utilisées dans les exemples 1 et 3.

HGG traitée par la fibrinolysine: Venoglobulin (marque de commerce), produit de The Green Cross Corporation, Japon

HGG traitée par la pepsine: Gamma-Venin (marque du commerce), produit par Hoechst Japan Ltd.

HGG sulfoné: Venilon (marque du commerce), produit de Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute, Japon

Fraction de HGG: fraction de y-globuline humaine (fraction II de Cohn), produit de Sigma Chemical Co.

Exempte 7

A des portions de solution de TNF ayant la même activité de TNF que celle employée dans l'exemple 3, on ajoute séparément comme agent stabilisant diverses protamines comme indiqué dans le tableau 6 en une quantité telle que la solution obtenue ait une concentration de 1,0 mg/ml. On conserve chacune des solutions obtenues à 4 C pendant 7 jours et on les soumet à la détermination de l'activité du TNF selon le procédé in vitro. On calcule l'activité résiduelle du TNF (%) de la même façon que dans l'exemple 1. Les résultats obtenus figurent dans le tableau 6.

Tableau 6 .

Effet stabilisant de diverses protamines

Agent stabilisant

Activité résiduelle du TNF, % conservation à 4 C pendant 7 jours

Néant (témoin)

6

SPS

96

SPF

93

SPP

95

H PS

93

Nota: Comme SPS et HPS, on emploie les mêmes matières que celles utilisées dans les exemples 1 et 3.

SPF: produit de Sigma Chemical Co.

SPP: produit de Sigma Chemical Co.

Exemple 8

On dilue avec du tampon phosphate 0,1 M (pi 1 7,0) 0,15 M en chlorure de sodium du TNF de lapin ayant une activité spécifique de 1,0 x 10° U/mg, obtenu selon les modes opératoires décrits dans l'exemple de référence pour préparer des solutions de TNF ayant respectivement des activités de TNF de 100 U/ml, 1000 U/ml, 10000 U/ml et 100000 U/ml. A une portion de chacune des solutions de TNF ainsi préparées, on ajoute de la HSA en une quantité telle que la solution obtenue ait une concentration de 1,0 mg/ml. On conserve chacune des solutions de TNF obtenues à 4 C pendant 7 jours et on les soumet à une détermination de l'activité du TNF selon le procédé d'essai in vitro. On calcule l'activité résiduelle du TNF (%) de la même façon que dans l'exemple 1. Comme témoins, on soumet une autre portion de chacune des solutions de TNF auxquelles on n'a pas incorporé de HSA à la détermination de l'activité du TNF. Les résultats obtenus figurent dans le tableau 7.

Tableau 7 Effet stabilisant de la HSA

Concentration du TNF (U/ml)

Concentration de la HSA (mg/ml)

0 (témoin)

1,0

100

3

85

1000

5

98

10000

45

101

100000

48

99

Les valeurs représentent l'activité résiduelle du TNF (%).

Exemple comparatif

A des portions de solution de TNF ayant la même activité de TNF que celle employée dans l'exemple 1, on ajoute séparément à diverses concentrations, comme indiqué dans le tableau 8, chacun de divers aminoacides, sels métalliques et agents chélatants qui sont des agents stabilisants bien connus des solutions des substances ordinaires à activité physiologique. On conserve chacune des solutions obtenues à 4 C pendant 7 jours et on les soumet à une détermination de l'activité du TNF selon le procédé d'essai in vitro. On calcule l'activité résiduelle du TNF (%) de la même façon que dans l'exemple I. Les résultats obtenus figurent dans le tableau 8.

Tableau 8

Comparaison de l'effet stabilisant de divers agents stabilisants

Agent stabilisant

Concentration

Activité résiduelle du TNF, % conservation à 4 C pendant 7 jours

Néant (témoin) HSA

1,0 (mg/ml)

26 98

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Tableau 8 (suite)

Agent stabilisant

Concentration

Activité résiduelle du TNF, % conservation à 4 C pendant 7 jours

PHG-1

1,0 (mg/ml)

97

HGG

1,0 (mg/ml)

97

SPS

1,0 (mg/ml)

90

Glycine

0,1 (M)

30

L-lysine

0,1 (M)

28

L-arginine

0,1 (M)

24

Acide L-glutamique

0,1 (M)

23

CaCl2

1 (raM)

32

MgCl,

1 (mM)

32

EDTA

1 (mM)

26

Nota: Comme HSA, PHG-1, HGG et SPS, on emploie les mêmes matières que celles utilisées dans l'exemple 1.

Bien entendu, diverses modifications peuvent être apportées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui viennent d'être décrits uniquement à titre d'exemples non limitatifs sans sortir du cadre de l'invention.

Claims (22)

656 534

1. Procédé pour stabiliser un Facteur de Nécrose Tumorale, caractérisé en ce qu'il comprend l'addition à une solution aqueuse ou à une poudre contenant un Facteur de Nécrose Tumorale d'une quantité efficace d'au moins un agent stabilisant choisi parmi le groupe constitué par une albumine, une gélatine, une globuline, une Protamine et un sel de protamine.

2. Procédé selon la revendication I, caractérisé en ce que ledit agent stabilisant est une albumine.

2

REVENDICATIONS

3. Procédé scion la revendication 2, caractérisé en ce que ladite albumine est une sérum-albumine humaine.

4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit agent stabilisant est une gélatine.

5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que ladite gélatine est une gélatine partiellement hydrolysée soluble dans l'eau.

6. Procédé selon la revendication I, caractérisé en ce que ledit agent stabilisant est une globuline.

7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que ladite globuline est une y-globuline humaine ou un de ses dérivés.

8. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit agent stabilisant est une protamine ou un sel de protamine.

9. Procédé selon l'une des revendications I à 8, caractérisé en ce que ledit agent stabilisant est ajouté en quantité de 10 (.ig à 50 mg/ml de la solution aqueuse contenant le Facteur de Nécrose Tumorale, ladite solution aqueuse ayant une activité de TNF de 102 à 10° unités/ml.

10 mg/ml de la solution aqueuse contenant le Facteur de Nécrose Tumorale, ladite solution aqueuse ayant une activité de TNF de 102 à I0Q unités/ml.

10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que ledit agent stabilisant est ajouté en une quantité de 100 |ig à

11. Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il consiste de plus à soumettre à une lyophilisation la solution aqueuse obtenue à laquelle ledit agent stabilisant est ajouté.

12. Solution aqueuse ou poudre stable préparée par le procédé selon la revendication I, caractérisée en ce qu'elle contient un Facteur de Nécrose Tumorale et une quantité efficace d'au moins un agent stabilisant choisi parmi le groupe constitué par une albumine, une gélatine, une globuline, une protamine el un sel de protamine.

13. Solution aqueuse ou poudre stable selon la revendication 12, caractérisée en ce que ledit agent stabilisant est une albumine.

14. Solution aqueuse ou poudre stable selon la revendication 13, caractérisée en ce que ladite albumine est une sérum-albumine humaine.

15. Solution aqueuse ou poudre stable selon la revendication 12, caractérisée en ce que ledit agent stabilisant est une gélatine.

16. Solution aqueuse ou poudre stable selon la revendication 15, caractérisée en ce que ladite gélatine est une gélatine partiellement hydrolysée soluble dans l'eau.

17. Solution aqueuse ou poudre stable selon la revendication 12, caractérisée en ce que ledit agent stabilisant est une globuline.

18. Solution aqueuse ou poudre stable selon la revendication 17, caractérisée en ce que ladite globuline est une y-globuline humaine ou un de ses dérivés.

19. Solution aqueuse ou poudre stable selon la revendication 12, caractérisée en ce que ledit agent stabilisant est une protamine ou un sel de protamine.

20. Solution aqueuse ou poudre stable selon l'une des revendications 12 à 19, caractérisée en ce que ledit agent stabilisant est contenu en une quantité de 10 ng à 50 mg/ml de la solution aqueuse contenant le Facteur de Nécrose Tumorale, ladite solution aqueuse ayant une activité de TNF de 102 à 10" unités/ml ou est contenue en une quantité d'environ 10 (.ig à 50 mg/ml d'une solution aqueuse ayant une activité de TNF de 102 à 10° unités/ml.

21. Solution aqueuse ou poudre stable selon l'une des revendications 12 à 19, caractérisée en ce que ledit agent stabilisant est contenu en une quantité de 100 ng à 10 mg/ml de la solution aqueuse contenant le Facteur de Nécrose Tumorale, ladite solution aqueuse ayant une activité de TNF de I02 à 10'' unités/ml ou est contenue en une quantité de 100 ng à 10 mg/ml d'une solution aqueuse ayant une activité de TNF de 102 à 10'' unités/ml.

22. Médicament antitumoral, caractérisé en ce qu'il consiste en une solution aqueuse ou une poudre selon l'une des revendications 12 à 21.