HU189251B - Process for stabilizing tumor necrosis factor - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás tumor nekrózis faktor stabilizálására. A találmány közelebbről eljárás tumor nekrózis faktor (a továbbiakban TNF) stabil vizes oldat vagy stabil por formában történő előál-. lítására.

Carswell és munkatársai fedezték fel a TNF-et. Beszámoltak róla, hogy a TNF immunpotenciátorokkal - pl. Calmette^uérin bacillus (BCG), Corynebacteriumok vagy Zymosan - előkezelt egerek, patkányok vagy nyulak szérumában jelenik meg endotoxin kezelés hatására. Beszámoltak továbbá arról is, hogy a TNF egy sor transzplantált egértumor nekrózisát idézi elő anélkül, hogy ártalmas volna a gazdaszervezetre [Proc. Nat. Acad. Sci. USA 72 (9), 3666-70 (1975)].

Később számos közlemény látott napvilágot az egér és nyúl TNF fizikai és biokémiai tulajdonságairól [pl.: Proc. Nat. Acad. Sci. USA 73 (2) 381-5 (1976); Expl. Cell. Bioi. 47 53-60 (1979); Br. J. Cancer 38 302-9 (1978), valamint uo. 42 416-22 (1980)].

Megjegyzendő, hogy egy citotoxikus faktor, amely feltételezhetően azonos a TNF-el, szintén több közleményben szerepel [Pl.: Infect. Immun. 28 (1) 204-11 (1980)].

A TNF in vitro előállítását is ismertették már. Például Matthews meghatározta és leírta a normál, illetve BCG-vel kezelt nyulak különböző szöveteiből származó egymagvú fagocitákkal való TNF előállítás optimális körülményeit [Br. J. Cancer 44 418-24 (1981)]. A cikk szerint optimális mennyiségű TNF endotoxin jelenlétében állítható elő az egymagvú fagocitákkal, és úgy találták, hogy a leghatásosabb TNF termelők az alveoláris és peritoneális makrofágok.

A cikkből azt is megtudhatjuk, hogy a BCG-vel kezelt nyulak makrofágjai szignifikánsan több TNF-et állítanak elő, mint a kezeletlen állatokból származók. Időközben Mánnel és munkatársai közölték, hogy a BCG-vel fertőzött egerek makrofágban dúsított, hashártya váladékból származó sejtjei in vitro lipopoliszacharid (endotoxin) hatására citotoxikus faktort választanak ki [Infect. Immun. 30 (2) 523-30 (1980) és uo. 33 (1) 156-64 (1981)]. Ami a TNF jellemző tulajdonságait illeti ismertes, hogy a TNF sokféle tumorra gyakorolt nekrotizáló hatását az élőlények fajától függetlenül fejti ki. Például a nyúl TNF nekrózist idéz elő egér tumoroknál. Továbbá ismeretes az is, hogy a TNF in vitro semmilyen toxikus hatással sem rendelkezik a normális sejtekre, viszont citotoxikus hatású bizonyos fajta neoplasztikus sejtvonalakra (pl.: L-M és Meth-A sejtek).

A fentieket összefoglalva, a TNF antitúmor hatású, hatását fajtól függetlenül fejti ki, és a legkevésbé sem ártalmas a normális sejtekre. Ezért a TNF tumorellénes gyógyszerként való klinikai alkalmazásához szakmai körökben igen nagy reményeket fűznek.

Az is ismeretes, hogy emlősökben vagy szövettenyészeteiben csak igen kevés TNF keletkezik. Ennek megfelelően ahhoz, hogy a TNF tumorellenes gyógyszerként széleskörűen és biztonságosan klinikailag alkalmazható legyen, okvetlenül szükséges az emlősökben és szövettenyészetekben keletkező ·>

nyers TNF izolálása és nagymérvű tisztítása. Továbbá midőn a tumorellenes gyógyszerként alkalmazásra kerülő TNF nagyüzemi előállítása megvalósul, általában szükségessé válik a nagytisztaságú TNF hosszabb időn át való tárolása oldat vagy fagyasztott formában, illetőleg a TNF oldat fagyasztva szárítása. A találmány feltalálói azonban úgy találták, hogy a nagytisztaságú TNF aktivitása a tárolás, fagyasztás, olvasztás és fagyasztva szárítás során jelentősen csökken. A feltalálók tudomása szerint eddig még nem jelent meg a nagy tisztaságú TNF stabilitásával foglalkozó közlemény. Ilyen körülmények között a nagytisztaságú TNF-ből megfelelő és állandó ellátás - különösen kereskedelmi méretekben - nem biztosítható, annak ellenére, hogy tudjuk, hogy a TNF hatásos tumorellenes gyógyszer.

A fentiekben vázolt, a TNF instabilitására vonatkozó nehézségek leküzdésére a feltalálók kiterjedt és mélyreható kutatásokat folytattak. Meglepő módon azt tapasztalták, hogy egy bizonyos fehérje megfelelő mennyiségben stabilizáló szerként a TNF tartalmú vizes oldathoz adva lehetővé teszi a TN F aktivitásvesztés nélküli hosszabb ideig történő tárolását és stabilizálja a TNF-et a fagyasztás, olvasztás, fagyasztva szárítás és a hasonló műveletek során is.

A találmány tárgya eljárás TNF stabilizálására.

A találmányt a következő részletes leírással és a mellékelt ábrákkal szemléltetjük:

1. ábra Az emberi szérumalbumin koncentrációjának a +4 ’C-on 7 napig tárolt TNF maradék aktivitására gyakorolt hatását bemutató grafikon.

2. ábra A részlegesen hidrolizált zselatin koncentrációjának a +4 ’C-on 7 napig tárolt TNF maradék aktivitására gyakorolt hatását bemutató grafikon.

3. ábra Az emberi gamma-globulin koncentrációjának a +4 ’C-on 7 napig tárolt TNF maradék aktivitására gyakorolt hatását bemutató grafikon.

4. ábra A lazac protamin szulfát koncentrációjának a +4 ’C-on 7 napig tárolt TNF maradék aktivitására gyakorolt hatását bemutató grafikon.

Az ábrák rovábbi részletes magyarázatára később a 2. példa kapcsán kerül sor.

A találmány eljárást nyújt TNF stabilizálására oly módon, hogy a TNF tartalmú vizes oldathoz legalább egy - albumin, zselatin, globulin, protamin és protaminsó közül választott - stabilizálószer megfelelő mennyiségét adjuk. ¹

Az itt használt TNF megnevezés fiziológiailag aktív anyagot jelent, amely egyrészt oly módon állítható elő, hogy a legalább egy reticulo-endothel ·« rendszert (RÉS) stimulálni képes anyaggal előkezelt emlősökbe Gram-negativ baktériumból származó endotoxint injektálunk, másrészt pedig úgy juthatunk hozzá, hogy emlősökből származó aktivált makrofágokat tartalmazó szövetkultúrákhoz Gram-negativ baktériumból származó endotoxint adunk. A TNF olyan anyag, amely tumoros emlősökbe passzívan bejuttatva némely tumor nekrózisát idézi elő, vagyolyan tetszőleges módon előállított anyag, amely a fentiekben ismertetett fiziológiailag aktív anyaghoz hasonló tulajdonságokkal rehdelkezik.

189 251

A találmány szerinti eljárásban alkalmazásra kerülő TNF előállítására több módszer is ismeretes, így például Matthews és munkatársainak eljárása [Br. J. Cancer 42 416-22 (1980)], valamint a Green és munkatársai által kidolgozott eljárás [J. Natl. Cancer Insti 59 (5) 1519-22 (1977)].

A találmány szerinti eljárásban TNF előállítására a következő jellegzetes eljárásokat alkalmaztuk.

Először is legalább egy, a reticulo-endothel rendszer (RÉS) stimulálására képes anyagot injektáltunk intravénásán vagy intraperitoneálisan emlősbe (pl. egér, nyúl, tengeri malac stb.). A RES-t stimuláló anyagként általában Gram-pozitív baktériumok, protozoonok vagy élesztők alkalmasak, amelyek egyaránt lehetnek élő vagy elölt (pl. hő-, illetve formalinos kezeléssel) mikroorganizmusok, vagy mikrobasejt kivonatok. Gram-pozitív baktériumként például Propionibacteriumok így Propionibacterium acnes (Corynebacterium parvum) és Propionibacterium granulosum (Corynebacterium granulosum), Mycobacteriumok, így a CalmetteGuérin (BCG) bacillus és Mycobacterium smegmatis, valamint Nocardiák, így Nocardia erythropolis és Nocardia gardneri alkalmasak. Megfelelő protozoonok például a Plamodium és Toxoplasma fajok, az élesztőkre pedig egyebek között jó példa a Saccharomyces cerevisiaeből extrahált Zymosan. Erre a célra egyébként szintetikus makromolekulák (igy például pirán-kopolimer) is alkalmazhatók.

Másodszor, 7-15 nappal az említett RES-t stimuláló anyaggal történt kezelést követően Gramnegatív baktériumból származó endotoxint (pl. Escherichia coliból, Pseudomonas aeruginosából vagy Salmonella typhosából származó lipopoliszacharidot) injektáltunk intravénásán az emlősbe.

Harmadszor, 1,5-2 órával az injektálás után kinyerjük az emlős testnedveit (pl. hasvíz, nyirok stb.) és/vagy szérumját vagy plazmáját; vagy pedig homogenizáltuk és fiziológiás sóoldattal extraháltuk a belső szerveket (pl. máj, lép stb.). Ezek a testnedvek, szérum, plazma és/vagy belső szerv kivonatok szolgáltak nyers TNF oldatként. Közülük mégis általában a szérum vagy a plazma használatos.

A találmány szerinti eljárásban alkalmazott TN F előállítási módszere azonban - mint már említettük - nem korlátozódik a fenti eljárásra. A génmanipuláción vagy a szövettenyésztésen alapuló, TNF termelő sejteket hasznosító eljárások szintén s eredményesen alkalmazhatók. Megjegyzendő, hogy ezek a módszerek humán TNF előállítására is alkalmasak.

_t A nyers TNF, amint a fenti módszerek bármelyikével állítottak elő, a következő szokványos biokémiai műveletekkel külön-külön, vagy azok kombinálásával tisztítható és ennek eredményeként tisztított TNF oldatot, ezt fagyasztva szárítva pedig tisztított TNF port kapunk.

A TNF tisztítására alkalmas biokémiai műveletekként a következők említhetők: ammónium-szulfátos kisózás, ioncserés kromatográfia anioncserélő gyantán, gélszűrés és elektroforézis. Ezeknek a módszereknek az alkalmazása során a TNF tisztasága növekszik, de fokozatos stabilitáscsökkenés észlelhető. Például egy 500 ezer egység/mg fehétje fajlagos aktivitásig tisztított (a TNF aktivitás egység fogalmát később definiáljuk) TNF minta már meglehetősen instabil, amint ezt a példákban közölt adatokból látszik. Még az ennél alacsonyabb ⁵ fajlagos aktivitású minták is némileg veszítenek aktivitásukból, ha tárolják, fagyasztják, olvasztják, fagyasztva szárítják őket, vagy egyéb műveleteket végeznek velük.

Ennek megfelelően a találmány célja a nagy tisz¹⁰ taságú és igy instabillá vált TNF stabilizálása. Előnyös, ha a stabilizálandó TNF készítmény oldat.

A találmány értelmében előnyös, ha a stabilizálandó TNF oldat pH-ja állandóan 5- és 10 közötti érték, továbbá, ha az oldószer valamilyen alkalmas ¹⁵ puffer. Ilyen alkalmas pufferként említhető például a foszfátpuffer, valamint a trisz(hidroximetil)amino-metán (HCl puffer). Kívánt esetben sót, például nátrium- vagy kálium-kloridot adunk a TNFoldathoz. Sót adunk például a TNF oldathoz, ha ²⁰ injekció készítéséhez izotóniás oldatot kívánunk előállítani, de nem csupán e célból történhet sóadagolás. A TNF oldat sókoncentrációját a sóadagolás céljának megfelelően választjuk meg. Ha például a TNF oldatból injekció készül, akkor 0,15 mó²⁵ los izotóniás nátrium-klorid oldatot készítünk belőle.

A találmány értelmében eljárva legalább egy albumin, zselatin, globulin, protamin és protaminsó közül választott - stabilizálószer megfelelő ³⁰ mennyiségét adjuk a TNF-et tartalmazó vizes oldathoz.

Alkalmas albuminként különböző állatokról (pl. marha, ló, birka, kecske, csirke) és emberből származó albuminokat említhetjük. A megfelelő albu³θ min konkrét példái a következők: marha szérumalbumin, humán szérumalbumin, csirke tojásalbumin, marha laktalbumin és humán laktalbumin. Az említett albuminok között nem észleltek számottevő különbséget a TNF stabilizáló képesség tekinte⁴⁰ tében. Injekció készítésére azonban a legelőnyösebb stabilizálószer a humán szérumalbumin.

Alkalmas zselatinként a szokásos módon előállított közönséges zselatint, valamint a részlegesen hidrolizált zselatint említhetjük. A zselatin moleku⁴⁵ lasúlya nem lényeges. Injekció készítéséhez azonban a részlegesen hidrolizált, vízoldható zselatin a legelőnyösebb stabilizálószer. A részlegesen hidrolizált zselatin proteolitikus enzimekkel (pl. papain) végzett enzimatikus hidrolízissel, vagy savas vagy lúgos hidrolízissel állítható elő.

Alkalmas globulinként különböző emlősökből (pl. marha, ló, birka, kecske) származó, valamint emberi eredetű globulinok és származékaik említhetők. A felsorolt globulinok között a TNF stabili55 záló képesség vonatkozásában számottevő különbség nem észlelhető. Előnyösen közülük mégis gamma-globulint, illetve ennek enzimes kezeléssel vagy kémiai módosítással előállított származékát használhatjuk, injekció készítéséhez pedig stabilizátor60 ként legelőnyösebbek a humán gamma-globulin, valamint származékai, mint például a plazminnal vagy pepszinnel kezelt humán gamma-globulin vagy a szulfonált humán gamma-globulin. Alkalmas protaminként megfelelő halfajok (pl. lazac. 65 hering, makréla) protaminjai említhetők. Alkalmas

189 251 protamin sóként pedig a protaminok sósavas, kénsavas és foszforsavas sói jöhetnek szóba. A felsorolt protaminok és protamimók között nem észlelhető számottevő különbség a TNF stabilizáló képesség tekintetében. A találmány szerinti stabilizá- ⁵ ló szerek külön-külön vagy keverékként is alkalmazhatók.

A találmány értelmében a hozzáadott stabilizátor mennyisége 10 pg és 5 mg között van a TNF oldatban milliliterenként, amelynek TNF aktivitá- ¹⁰ sa 10² és 10’ egység/ml közötti (az aktivitás egységét később definiáljuk).

A stabilizálószer alkalmazható maximális menynyiségét a stabilizálószer oldhatósága, a keletkező oldat viszkozitása, valamint gazdasági megfontolá- ¹⁵ sok szabják meg.

A stabilizálószer hozzáadásának módja nem lényeges. Poralakú stabilizátor például közvetlenül hozzáadható a TNF oldathoz. Úgy is eljárhatunk, · hogy a stabilizálószer porát előbb feloldjuk vízben ²⁰ vagy valamilyen alkalmas puflferben és így adjuk a TNF oldathoz. A stabilizátor a tisztítási eljárás bármely lépésekor vagy a gyógyszerkészités során is hozzáadható. Ha két vagy több különböző stabilizátort alkalmazunk, akkor együttes mennyiségük- ²⁵ nek kell a fentiekben ismertetett koncentráció határok közé esni.

Kívánatos, hogy a stabilizálószert tartalmazó TNF oldat tárolása, tisztítása és a belőle való gyógyszerkészítés 0 és 30 ’C, előnyösen 0 és 10 ’C ³⁰ közötti hőmérsékleten történjen. Ha a TNF oldatot fagyasztva tároljuk, akkor a tárolási hőmérséklet előnyösen 0 ’C alatti, még előnyösebben pedig - 20 °C alatti legyen.

A TNF oldat, amely a találmány értelmében ³⁵ legalább egy stabilizálószert tartalmaz, megtartja aktivitását a tárolás, tisztítás és gyógyszerkészités során, akár oldat formájában van, akár pedig fagyasztott állapotban.

A találmány értelmében a TNF stabilizálására ⁴⁰ szolgáló eljárás alkalmazható a fagyasztva szárítás során is. Példaként említettük, hogy a fagyasztva szárítás során a TNF oldat (különösen hogyha nagy tisztaságú TNF-ről van szó) aktivitása általában jelentősen csökken. Azok a TNF oldatok ⁴⁵ azonban, amelyek a találmány értelmében legalább, egy stabilizálószer fent említett mennyiségét tartalmazzák, aktivitásveszteség nélkül fagyasztva száríthatok TNF porrá. Stabil TNF oldat készíthető az olyan TNF por vizes oldásával, amelynek ⁵⁰ TNF és stabilizátor koncentrációja a fent meghatározott tartományba esik. A találmány szerint a stabilizálószert a fagyasztva szárított készítmények is tartalmazhatják. Ha a TNF poralakban kerül tárolásra, akkor a tárolási hőmérséklet előnyösen ⁵⁵ 25 ’C vagy alacsonyabb legyen. ·

A TNF aktivitásának meghatározására általában két módszer használatos; az in vivő módszer, amelynek során a tumor nekrotizáló hatást in vivő mérik; valamint az in vitro eljárás, amelynél a neo- 60 plasztikus sejtekre gyakorolt citotoxikus hatást in vitro mérik.

In vivő módszerként említhetjük például a Carswell és munkatársai által alkalmazott eljárást [Proc. Nat. Acad. Sci. USA 72 (9) 3666-70 (1975)]. 65

E módszer szerint BALB/C Szarkóma Meth A sejteket (2x10* sejt) intradermálisan átültetnek (BALB/C x C57BL(6)F, egerek hónaljába, majd 7 nap elteltével a 7-8 mm átmérőjű, jó vérellátású, spontán központi nekrózistól mentes tumorral rendelkező egereket választják ki az értékeléshez. Fiziológiás sóoldattal hígított TNF mintát (0,5 ml) injektálnak mindegyik egér farokvénájába. A TNF minta aktivitását 24 óra elteltével az alábbi kritériumok szerint értékelik:

(-): nincs változás (+): enyhe haemorrhagiás nekrózis (+ +): mérsékelt haemorrhagiás nekrózis (a tumor felületének kb. 50%-ára kiterjedő központi nekrózis) (+ + +): jelentős haemorrhagiás nekrózis (erőteljes nekrózis, amely csak a tumor peremén hagy keskeny életképes szegélyt).

TNF aktivitás mérésinek in vitro módszerei közül például a RufT és munkatársai'[Lymphokines, Vol. Z. Ed. by E. Pick, Academic Press, New York, 245-8 (1980)], valamint a Kuli és munkatársai [J. Immunoi. 126 (4) 1279-83 (1981)] által alkalmazott eljárásokat említhetjük.

A feltalálók által használt, a TNF aktivitását in vitro mérő módszert a fent említett hagyományos módszerek tökéletesítésével fejlesztették ki. Ez az in vitro eljárás, amely az L-M sejtekre (ATCC CCL

1. 2) gyakorolt citotoxikus TNF aktivitást méri a következőképpen végzendő el. Tenyészrésre szolgáló edényként 96 lyuku mikroliter tálcákban (Floww Laboratories Inc. USA), 10% hőinaktivált magzati borjúszérumot tartalmazó Eagle minimál táptalajon [Science 130 432-7 (1959)] szaporítjuk el az L-M sejteket. A TNF mintákból (0,1 ml) sorozathigitásokat készítünk a táptalajjal és L-M sejtszuszpenzióval (0,1 ml, 1 x 10* sejt)elegyítjük őket a tálcák lyukjaiban, majd a tálcákat 37 ’C-on, 5% széndioxid tartalmú légtérben 48 órán át inkubáljuk. A tenyésztési periódus befejeztével 20 μΐ 20%os vizes glutáraldehid oldatot adagolunk a lyukakba a sejtek rögzítésére. A rögzítés után a tálcákat desztillált vízzel mossuk, azután száradni hagyjuk őket, majd 0,05%-os metilénkék oldat (0,1 ml) hozzáadásával megfestjük az élő sejteket. A színezék feleslegét alapos, desztillált vizes mosással eltávolítjuk, majd a tálcákat száradni hagyjuk. A megfestett sejtekből ezután extraháljuk a színezéket a lyukakba 3%-os sósavoldatot (0,2 ml) juttatva. A minták adszorpcióját 665 nm-en megmérve (Titertek Multiscan, gyártja Flow Laboratories Inc.) az élő sejtek számával arányos jelet kapunk.

A TNF aktivitást [egység (E)/ml] az 50%-os citotoxicitást eredményező hígítás reciprokaként definiáljuk és oly módon kapjuk meg grafikusan a mérési eredményekből, hogy a hígítást az adszorpció függvényében ábrázoljuk. Valamennyi, a későbbiekben közölt, in vitro módszerrel meghatározott TNF aktivitás az így definiált egységben értendő.

A találmány szerinti módszerrel a klinikailag alkalmazható hatásos antitumor gyógyszernek tartott nagytisztaságú TNF-ből megfelelő és állandó kereskedelmi ellátás biztosítható, mivel ennek alapján lehetővé válik a TNF aktivitásának megőrzése a tárolás (oldat, fagyasztott vagy fagysztva szárított készítményként), tisztítás és gyógyszerkészítés során. Ezen kívül úgy találtuk, hogy a TNF oldat vagy por, amely legalább egy - humán szérumalbumin, zselatin, humán gamma globulin vagy ennek származéka, protamin vagy protaminsó közül választott - stabilizáló szert tartalmaz, biztonsággal bejuttatható az emberi szervezetbe, és ennek következtében a találmány szerinti új összetételű készítmény különösen előnyös midőn a TNF-et antitumor gyógyszerként klinikailag kívánják alkalmazni. A találmányt a következő példákban részletesen ismertetjük, anélkül azonban, hogy a találmány tárgykörét ezzel korlátoznánk.

A példákban használt rövidítések:

A következő példákban a stabilizálószerek rövidítései:

HSA: humán szérumalbumin

BSA: marha szérumalbumin

PHG-1: részlegesen hidrolizált zselatin, amelyet a zselatin lúgos hidrolízisével kaptunk (átlagmólsúly: kb. 7000)

HGG: humán gamma-globulin *”

SPS: lazac protamin-szulfát

HPS: hering protamin-szulfát

BGG: marha gamma-globulin

CEA: csirke tojásalbumin

BLA: marha a-laktalbumin

PHG-2: részlegesen hidrolizált zselatin, amelyet a zselatin savas hidrolízisével kaptunk (átlagmólsúly kb. 7000)

PHG-3: alacsony polimerizációs fokú részlegesen hidrolizált zselatin

PG: tisztított zselatin

SPF: lazac protamin (szabad bázis)

SPP: lazac protamin-foszfát EDTA: etilén-diamin-tetraecetsav

Referencia példa

2-3 kg súlyú nőstény nyulakba 75-75 mg formaiinnal elölt Propionibacterium acnes (Corynebacterium parvum; Wellcome Research Laboratories, England) sejttömeget injektáltunk intravénásán. Nyolc nap elteltével a nyulakba intravénásán 100-100 pg endotoxint (Escherichia coli 026 : B6 lipopoliszacharidot, a Dífco Laboratories, USA terméke) injektáltunk. Két órával ezután a nyulaktól szívből vért vettünk, kévés heparint kevertünk hozzá, majd 3000/perc fordulaton 15 percen át centrifugáltuk. így 2500 E/ml TNF aktivitású plazmát kaptunk. Ezt a TNF tartalmú plazmát (10 liter) 5 liter mól/l-es foszfátpufferrel (pH 7,8) hígítottuk és 0,13 mól/1 NaCl tartalmú 0,03 mól/l-es foszfátpufferrel (pH 7,8) egyensúlyba hozott DEAE - Sepharose CL-6B (Pharmacia Fine Chemicals AB , Svédország terméke) oszlopra (10 * 42 cm) vittük. Az oszlopot 2,5 liter 0,03 mól/l-es foszfátpufferrel (ph 7,8) mostuk, majd a megkötött TNF elucióját lineáris NaCl gradienssel végeztük a következő két oldattal: 5,0 liter 0,15 mól/I NaCl tartalmú 0,03 mól/l-es foszfátpuffer (pH 7,8), illetve 5,0 liter 0,3 mól/1 NaCl tartalmú 0,03 mól/l-es foszfátpuffer (pH 7,8). Az átfolyási sebesség 230 ml/óra volt és 45 ml-es frakciókat szedtünk. A TNF aktivitás a 0,20 és 0,24 mól/1 NaCl koncentrációtartományban lejövő frankciókban volt. Ezeket egyesítettük és éjszakán át 0,13 mól/1 NÁCI tartalmú ⁵ 0,03 mól/1 Tris/HCl pufferrel (pH 7,2) szemben dializáltuk.

A dializált TNF oldatot újra kromatografáltuk 0,15 mól/1 NaCl tartalmú 0,03 mól/l-es Tris/HCI pufferrel (pH 7,2) ekvilibrált DEAE-Sepharose CL-6B oszlopon (3,0x30 cm). Az adszorbeált TNF-et lineáris NaCl gradienssel eluáltuk, a határoldatok: 500 ml ekvilibráló puffer, illetve 0,3 mól/l NaCl tartalmú 0,03 mól/l-es Tris/HCl puffer (pH 7,8). Az átfolyási sebesség 40 ml/óra volt és 10 ¹⁵ ml-es frakciókat gyűjtöttünk. A TNF aktivitással rendelkező frakciókat egyesítettük és töményítettük. Ezt a koncentrátumot 0,15 mól/1 NaCl tartalmú 5 mól/l-es foszfátpufferrel (pH 7,0) ekvilibrált Sephacryl S-200 (Pharmacia termék) oszlopon ²⁰ (5 x 100 cm) gélszűrtük. Az eluciót a kiegyenlítő pufferrel végeztük. Az átfolyási sebesség 80 ml/óra volt és 13 ml-es frakciókat szedtünk. A TNF aktivitást tartalmazó frakciókat egyesítettük és ultraszűréssel töményítettük.

²⁵ Az így kapott TNF oldat 5,0 x 10^s E/mg fehérje fajlagos aktivitású és a plazmához viszonyítva tízezerszeres tisztaságú.

Ezt a TNF oldatot ugyanazon az oszlopon (Sephacryl S-200) ugyanazzal a pufferrel újra kro³⁰ matografálva 1 x 10* E/mg fehérje fajlagos aktivitású TNF oldatot kaptunk.

, /. példa

5,0 x 10⁵ E/mg fajlagos aktivitású, a referencia példa szerinti módon előállított nyúl TNF-ből 0,15 mól/1 NaCl tartalmú 0,1 mól/l-es foszfátpufferrel (pH 7,0) 1200 E/ml aktivitású TNF oldatot készí⁴⁰ tünk. Az így kapott oldat alikvotjáihoz különkülön stabilizálőszereket (HSA, BSA, PHG-1, HGG és SPS) adtunk kétféle koncentrációban (0,1, illetve 1,0 mg/ml).

Az oldatok maradék aktivitását a következő ke45 zelések után meghatároztuk;

í) tárolás 4 ’C-on 2,7 illetve 30 napig;

ii) fagyasztás (-70 ’C) és felolvasztás egyszer illetve háromszor;

iii) fagyasztás - 70 ’C-ra, fagyasztva szárítás és 50 tárolás 25 ’C-on 7 napig.

A fenti kísérletek során a stabilizátor nélküli TNF oldat volt a kontroll. A fagyasztva szárított készítményből (iii) a TNF aktivitás meghatározásához steril desztillált vizes oldatot készítettünk. 55 A maradék aktivitás meghatározása a korábban ismertetett in vitro illetve ín vivő módszerekkel történt. Az in vitro módszerrel a maradék aktivitást (%) a mérési adatokból az alábbi képlet szerint kaptuk:

⁶⁰ Maradék aktivitás (%) = ^x 100

B ahol A a TNF minta aktivitása a kezelés után,

B pedig a TNF minta aktivitása a kezelés előtt.

Az in vivő meghatározáshoz a mintákat a kezde65 tihez képest 20-szorosra töményítettük Mini-5189 251

Modulé NM-3 készülékkel (a gyártó Asahi Chemical Industiy Co. Ltd.. Japán, cég védjegye az ultraszűrő készülékre). Az így töményített oldat 0,5 miét injektáltuk 5-5 tumoros egér farokvénájába.

A TNF aktivitást 24 óra elteltével a korábbiakban ismertetett kritérium alapján határoztuk meg. A kapott eredményeket az 1. táblázat tartalmazza.

I. táblásai

HSA. BSA, PHO-I, HOO 6» SPS tabiliiiló lmja

Körülmények	Kontroll (tárolás vagy fizikai kezelés előtt)	4*C-on tárolva (oldat)	Fafyuztf·- olvtutit	25 *C-on tárolva lioftlizált kéadtmény
Az aktivitás vizsgálati módszere	ín vitro	in vivő	in vitro	in vivő	in vitro	in vitro	in vivő
Stabilizáló	Koncentrá·					napok		napok		Ismétlői	napok	napok
anyag	ció mg/ml				2	7	30	7		1	3	7	7
Kontroll (stabilizáló		100	+ + + 4.	+ + I	52	26	4	+ 3.	-2	30	8	40	+ 4.	-1
anyag nélkül)
HSA	0.1	100	+ + +4.	+ + I	102	95	90	+ + +3.	+ +2	90	82	95	+ + +3.	+ +2
1.0	100	4 + +4.	+ + 1	100	98	92	+ + 4-4.	+ 1	100	94	102	+ + +4,	+ +1
BSA	1.0	100	+ + +4,	+ +1	99	98	93	+ + +4.	+ 1	102	96	96	+ + +Χ	+ +2
PHG-I	0.1	100	+ + +4.	+ +1	96	94	88	+ + + 3.	+ +2	95	85	97	+ + +4.	+ +1
1.0	100	+ + + 4.	+ + 1	103	97	91	+ + +4.	+ +1	101	93	100	+ + +5
HGG	0.1	100	+ + +4.	+ + !	94	90	87	+ + +3.	+ 2	88	•80	93	*t- + +3,	+ +2
1.0	100	+ + +4.	+ +1	102	97	90	+ + +3.	+ +2	100	90	98	+ + +3,	+ +2
SPS	0.1	100	+ + +4.	+ + 1	95	90	87	+ + +3.	+ +2	93	80	90	+ + +3,	+ +2
1.0	100	+ + +4.	+ + I	101	96	90	+ + +4.	+ 1	100	92	97	♦ + +4,	+ +1

Az ..in vitrú** jelű oszlopokban szereplő számok az előbbiekben definiált maradék aktivitást jelentik. Az ..in \i\o” jelű oszlopokban szereplő értékek az egerek számát jelölik.

A szimbólumok 4-, + +, stb.) jelentését korábban megadtuk.

HSA: Sigma Chemical Co.. USA terméke

BSA: Armour Pharmacentical Co.. USA terméke

PHG-1: Nippi Co.. Ltd.. Japán terméke (Nagy polimerizáciős fokú zselatin)

HGG: Nutritional Biochemicals Corp.. USA terméke

SPS: Sigma Chemical Co., USA terméke.

2. példa

Az 1. példában szereplővel megegyező aktivitású TNF oldat alikvotjaihoz külön-külön, különböző koncentrációban stabilizálószerekct adtunk (HSA, PHG-1, HGG, illetve SPS - azonosak az 1. példában szereplő fehérjekészitményekkel). Az így kapott oldatokat 7 napig4 'C-on tároltuk, majd TNF aktivitásukat az in vitro módszerrel meghatároztuk. A maradék aktivitás számítását az 1. példa szerinti módon végeztük.

A kapott eredmények az 1-4. ábrákon láthatók.

3. példa

1,0 x 10® E/mg fajlagos aktivitású, a referencia példa szerinti módon előállított TNF-ből 0,15 mól/1 NaCl tartalmú 0,1 mól/l-es foszfátpufferrel (pH 7,0) 1000 E/ml aktivitású TNF oldatot készítettünk. Az igy kapott oldat alikvotjaihoz két különböző fajta - a különböző albuminok, globulinok, protaminok és zselatinok közül választott stabilizálószert együttesen adtunk hozzá különböző koncentrációkban, a 2. táblázatban szereplő módon. Valamennyi így kapott oldatot 4 *C-on 7 napig tároltuk, majd in vitro TNF meghatározásnak vetettük alá őket. A maradék TNF aktivitást (%) az 1. példa szerinti módon számítottuk.

A kapott eredményeket a 2. táblázat tartalmazza.

2. táblázat

A különböző stabilizáló anyagok hatása

Stabilizáló anyag (koncentráció, mg/ml)	Maradék aktivitás (<) 4 C-on. 7 napig tárolva
Nincs (kontroll)	5
BSA (0,5)+HSA (0,05)	96
HSA (0,01)+PHG-1 (0,05)	90
HPS (0,1) +PHG-1 (0,05)	95
BGG (1,0)+CEA (1,0)	93
HGG (0.1) +SPS (0.1)	94

Megjegyzés:

BSA, HSA, PHG-1, HGG és SPS megegyeznek az ⁴⁵ 1. példában használt anyagokkal.

HPS: Sigma Chemical Co. terméke

BGG: Sigma Chemical Co. terméke

CEA: Nutritional Biochemicals Corp. terméke.

4. példa

A 3. példában szereplővel megegyező TNF aktivitású oldat alikvotjaihoz stabilizálószerként kü55 lönbözö albuminokat adtunk 1,0 mg/ml koncentrációban. Az így kapott oldatokat 4 °C-on 7 napig tároltuk, majd in vitro TNF aktivitás meghatározásnak vetettük alá őket. A maradék aktivitást (%) az 1. példa szerinti módon számítottuk.

A kapott eredményeket a 3. táblázat tartalmazza.

189 251

J. táblázat

Λ különböző albuminok stabilizáló hatása

Stabilizáló anyag	Maradék TNF aktivitás (%) 4 ’C-on 7 napig tárolva
nincs (kontroll)	5
HSA	98
USA frakció	97
BSA	98
BSA frakció	98
CEA	90
BLA	91

Megjegyzés:

HSA, BSA és CEA az 1. és 3. példában szereplő anyagokkal megegyeznek.

HSA frakció: emberi szérum albumin frakció (Chon frakció V.) Sigma Chemical Co. terméke

BSA frakció: ökör szérum albumin frakció (Chon frakció V.), Sigma Chemical Co. terméke

BLA: Sigma Chemical Co. terméke.

5. példa

A 3. példában szereplővel megegyező TNF aktivitású oldat alikvotjaihoz stabilizálószerként különféle zselatinokat adtunk, a 4. táblázatban közöltek szerint. 1,0 mg/ml koncentrációban. Az így kapott oldatokat 4 °C-on 7 napig tároltuk, majd in vitro módszerrel végzett TNF aktivitás meghatározásnak vetettük alá őket. A maradék TNF aktivitást („) az 1. példában ismertetett módon számítottuk. A kapott eredményeket a 4. táblázat tartalmazza.

4. táblázat

Különböző zselatinok stabilizáló hatása

Stabilizáló anyag	Maradék TNF aktivitás (%) 4 ’C-on 7 napig tárolva
Nincs (kontroll)	4
PHG-1	97
PHG-2	99
PHG-3	99
PG	96

Megjegyzés:

PHG-I az 1. példában szereplő anyaggal azonos.

PHG-2: Nippi Co., Ltd, terméke

PHG-3: Sigma Chemical Co. terméke (Gelatin Type IV.: Approx. 60 Bloom)

PG: Nakarai Chemicals Co., Ltd., Japán terméke.

6. példa

A 3. példában szereplővel megegyező TNF aktivitású oldat alikvotjaihoz stabilizálószerként különféle globulinokat adtunk az 5. táblázatban közöltek szerint 1,0 mg/ml koncentrációban. Az így kapott oldatokat 4 ’C-on 7 napig tároltuk, majd in vitro módszerrel végzett TNF aktivitás meghatározásnak vetettük alá őket. A maradék TNF aktivitást (%) az 1. példában ismertetett módon számítottuk. A kapott eredményeket az 5. táblázat tartalmazza.

5. táblázat

Különböző globulinok stabilizáló hatása

Stabilizáló anyag	Maradék TNF aktivitás („) 4 ’C-on 7 napig tárolva
Nincs (kontroll)	4
HGG	97
BGG	95
Plazmin-kezelt HGG	93
Pepszin-kezelt HGG	94
Szulfonált HGG	91
HGG frakció	99

Megjegyzés:

HGG és BGG az 1. és 3. példában szereplő anyagokkal azonosak.

Plazmin-kezelt HGG: Venoglobulin (márkanév), The Green Cross Corporation, Japán terméke

Pepszin-kezelt HGG: Gamma-Venin (márkanév) HOECHST Japán Ltd terméke

Szulfonált HGG: Venilon (márkanév), ChemoSero-Therapeutic Research Institute, Japán terméke

HGG. frakció: emberi gamma globulin frakció (Cohn frakció II.), Sigma Chemical Co. terméke.

7. példa

A 3. példában szereplővel megegyező TNF aktivitású oldat alikvotjaihoz stabilizálószerként különféle protaminokat adtunk, a 6. táblázatban közöltek szerint, 1,0 mg/ml koncentrációban. Az így kapott oldatokat 4 *C-on 7 napig tároltuk, majd in vitro módszerrel végzett TNF aktivitás meghatározásnak vetettük alá őket. A maradék TNF aktivitást (%) az 1. példában ismertetett módon számítottuk. A kapott eredményeket a 6. táblázat tartalmazza.

6. táblázat

Különböző protaminok stabilizáló hatása

Stabilizáló anyag	Maradék TNF aktivitás (%) 4 ’C-on 7 napig tárolva
Nincs (kontroll)	6
SPS	96
SPF	93
SPP	95
HPS	93

Megjegyzés:

SPS és HPS az 1. és 3. példában szereplő anyaggal megegyezik.

SPF: Sigma Chemical Co. terméke SPP: Sigma Chemical Co. terméke.

-7189 251

8. példa

1,0 x 10® E/mg fajlagos aktivitású, a referencia példa szerinti módon előállított nyúl TNF-ből 0,15 mól/1 NaCl tartalmú 0,1 mól/l-es foszfátpufferrel (pH 7,0) 100,1000,10 000 és 100 000 E/ml aktivitású oldatokat készítettünk. Az oldatok alikvotjaihoz stabilizálószerként HSA-t adtunk 1,0 mg/ml koncentrációban. Az így kapott oldatokat 4 ’C-on 7 napig tároltuk, majd in vitro módszerrel végzett TNF aktivitás meghatározásnak vetettük alá őket. A maradék TNF aktivitást (%) az 1. példában ismertetett módon számítottuk. Kontrollként HSA nélküli TNF oldattal is elvégeztük a meghatározást. A kapott eredményeket a 7. táblázat tartalmazza.

7. táblásat

HSA stabilizáló hatása

TN F koncentrációja E ml	HSA koncentrációja, mg/ml
0 (kontroll)	1,0
100	3	85
1000	5	98
10000	45	101
100000	48	99

(A számok a TNF maradék aktivitását fejezik ki %-ban.) összehasonlító példa

Az 1. példában szereplővel megegyező TNF aktivitású oldat alikvotjaihoz különféle aminosavakat, fémsókat és kelátképző szereket - amelyek közismert stabilizátorai a közönséges fiziológiailag aktív anyagok oldatainak - adtunk különböző koncentrációban, a 8. táblázatban közöltek szerint. Az igy kapott oldatokat 4 ’C-on 7 napig tároltuk, majd in vitro módszerrel végzett TNF aktivitás meghatározásnak vetettük alá őket. A maradék TNF aktivitást (%) az 1. példában ismertetett módon számítottuk. A kapott eredményeket a 8. táblázat tartalmazza.

8. táblázat

Különböző stabilizáló anyagok stabilizáló hatásuk alapján történő összehasonlítása

Maradék TNF

Stabilizáló anyag Koncentráció (/°\ tárolva

Nincs (kontroll)		26
HSA	1.0 (mg/ml)	98
PHG-1	1.0 (mg/ml)	97
HGG	1,0 (mg/ml)	97
SPS	1,0 (mg/ml)	90
Glicin	0,1 (mól/1)	30
L-Lyzin	0,1 (mól/1)	28
L-Arginin	0,1 (mól/1)	24
L-Glutamin sav	0,1 (mól/1)	23
CaCl2	1 (nmól/1)	32
MgCl2	1 (nmól/1)	32
EDTA	1 (nmól/1)	26

Szabadalmi igénypontok

Claims (10)

1. Szabadalmi igénypontok

   1. Eljárás tumor nekrózis faktor stabil vizes oldat vagy stabil por formában történő előállítására, azzal jellemezve, hogy tumor nekrózis faktorból 10²—10’ TNF-aktivitás-egység/ml-es 5-10 pH-ra pufferolt vizes oldatot készítünk, az oldathoz annak 1 ml-ére számítva 10 gg és 5 mg közötti menynyiségű albumínt vagy zselatint adunk, majd kívánt esetben az igy kapott oldatot liofilizáljuk. (Elsőbbsége: 1982. 04. .07.)
2. 2. Eljárás tumor nekrózis faktor stabil vizes oldat vagy stabil por formában történő előállítására, azzal jellemezve, hogy tumor nekrózis faktorból 10²-10⁹ TNF-aktivitás-egység/ml-es 5-10 pH-ra pufferolt vizes oldatot készítünk, az oldathoz annak 1 ml-ére számítva 10 gg és 5 mg közötti menynyiségű globulint, protamint vagy protaminsót adunk, majd kívánt esetben az így kapott oldatot liofilizáljuk. (Elsőbbsége: 1982. 07. 27.)
3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy stabilizálószerként albumint használunk. (Elsőbbsége: 1982. 04. 07.)
4. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy albuminként humán szérum albumint használunk. (Elsőbbsége: 1982. 04. 07.)
5. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy stabilizálószerként zselatint használunk. (Elsőbbsége: 1982. 04. 07.)
6. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy zselatinként részben hidrolizált, vízben oldódó zselatint használunk. (Elsőbbsége: 1982.04. 07.)
7. 7. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy stabilizálószerként globulint használunk. (Elsőbbsége: 1982. 07. 27.)
8. 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy globulinként humán gamma globulint vagy annak valamilyen származékát használjuk. (Elsőbbsége: 1982. 07. 27.)
9. 9. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy stabilizálószerként protamint vagy valamilyen protaminsót használunk. (Elsőbbsége: 1982. 07. 27.)
10. 10. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a stabilizálószert 100 gg és 5 mg közötti mennyiségben adjuk a tumor nekrózis faktor 10²-10^Q egység/ml aktivitású vizes oldatához, annak egy milliliterére számítva. (Elsőbbsége: 1982. 04. 07.)