HU189251B - Process for stabilizing tumor necrosis factor - Google Patents
Process for stabilizing tumor necrosis factor Download PDFInfo
- Publication number
- HU189251B HU189251B HU83981A HU98183A HU189251B HU 189251 B HU189251 B HU 189251B HU 83981 A HU83981 A HU 83981A HU 98183 A HU98183 A HU 98183A HU 189251 B HU189251 B HU 189251B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- tnf
- activity
- stabilizer
- solution
- priority
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/08—Solutions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/191—Tumor necrosis factors [TNF], e.g. lymphotoxin [LT], i.e. TNF-beta
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
- A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
A találmány tárgya eljárás tumor nekrózis faktor stabilizálására. A találmány közelebbről eljárás tumor nekrózis faktor (a továbbiakban TNF) stabil vizes oldat vagy stabil por formában történő előál-. lítására.
Carswell és munkatársai fedezték fel a TNF-et. Beszámoltak róla, hogy a TNF immunpotenciátorokkal - pl. Calmette^uérin bacillus (BCG), Corynebacteriumok vagy Zymosan - előkezelt egerek, patkányok vagy nyulak szérumában jelenik meg endotoxin kezelés hatására. Beszámoltak továbbá arról is, hogy a TNF egy sor transzplantált egértumor nekrózisát idézi elő anélkül, hogy ártalmas volna a gazdaszervezetre [Proc. Nat. Acad. Sci. USA 72 (9), 3666-70 (1975)].
Később számos közlemény látott napvilágot az egér és nyúl TNF fizikai és biokémiai tulajdonságairól [pl.: Proc. Nat. Acad. Sci. USA 73 (2) 381-5 (1976); Expl. Cell. Bioi. 47 53-60 (1979); Br. J. Cancer 38 302-9 (1978), valamint uo. 42 416-22 (1980)].
Megjegyzendő, hogy egy citotoxikus faktor, amely feltételezhetően azonos a TNF-el, szintén több közleményben szerepel [Pl.: Infect. Immun. 28 (1) 204-11 (1980)].
A TNF in vitro előállítását is ismertették már. Például Matthews meghatározta és leírta a normál, illetve BCG-vel kezelt nyulak különböző szöveteiből származó egymagvú fagocitákkal való TNF előállítás optimális körülményeit [Br. J. Cancer 44 418-24 (1981)]. A cikk szerint optimális mennyiségű TNF endotoxin jelenlétében állítható elő az egymagvú fagocitákkal, és úgy találták, hogy a leghatásosabb TNF termelők az alveoláris és peritoneális makrofágok.
A cikkből azt is megtudhatjuk, hogy a BCG-vel kezelt nyulak makrofágjai szignifikánsan több TNF-et állítanak elő, mint a kezeletlen állatokból származók. Időközben Mánnel és munkatársai közölték, hogy a BCG-vel fertőzött egerek makrofágban dúsított, hashártya váladékból származó sejtjei in vitro lipopoliszacharid (endotoxin) hatására citotoxikus faktort választanak ki [Infect. Immun. 30 (2) 523-30 (1980) és uo. 33 (1) 156-64 (1981)]. Ami a TNF jellemző tulajdonságait illeti ismertes, hogy a TNF sokféle tumorra gyakorolt nekrotizáló hatását az élőlények fajától függetlenül fejti ki. Például a nyúl TNF nekrózist idéz elő egér tumoroknál. Továbbá ismeretes az is, hogy a TNF in vitro semmilyen toxikus hatással sem rendelkezik a normális sejtekre, viszont citotoxikus hatású bizonyos fajta neoplasztikus sejtvonalakra (pl.: L-M és Meth-A sejtek).
A fentieket összefoglalva, a TNF antitúmor hatású, hatását fajtól függetlenül fejti ki, és a legkevésbé sem ártalmas a normális sejtekre. Ezért a TNF tumorellénes gyógyszerként való klinikai alkalmazásához szakmai körökben igen nagy reményeket fűznek.
Az is ismeretes, hogy emlősökben vagy szövettenyészeteiben csak igen kevés TNF keletkezik. Ennek megfelelően ahhoz, hogy a TNF tumorellenes gyógyszerként széleskörűen és biztonságosan klinikailag alkalmazható legyen, okvetlenül szükséges az emlősökben és szövettenyészetekben keletkező ·>
nyers TNF izolálása és nagymérvű tisztítása. Továbbá midőn a tumorellenes gyógyszerként alkalmazásra kerülő TNF nagyüzemi előállítása megvalósul, általában szükségessé válik a nagytisztaságú TNF hosszabb időn át való tárolása oldat vagy fagyasztott formában, illetőleg a TNF oldat fagyasztva szárítása. A találmány feltalálói azonban úgy találták, hogy a nagytisztaságú TNF aktivitása a tárolás, fagyasztás, olvasztás és fagyasztva szárítás során jelentősen csökken. A feltalálók tudomása szerint eddig még nem jelent meg a nagy tisztaságú TNF stabilitásával foglalkozó közlemény. Ilyen körülmények között a nagytisztaságú TNF-ből megfelelő és állandó ellátás - különösen kereskedelmi méretekben - nem biztosítható, annak ellenére, hogy tudjuk, hogy a TNF hatásos tumorellenes gyógyszer.
A fentiekben vázolt, a TNF instabilitására vonatkozó nehézségek leküzdésére a feltalálók kiterjedt és mélyreható kutatásokat folytattak. Meglepő módon azt tapasztalták, hogy egy bizonyos fehérje megfelelő mennyiségben stabilizáló szerként a TNF tartalmú vizes oldathoz adva lehetővé teszi a TN F aktivitásvesztés nélküli hosszabb ideig történő tárolását és stabilizálja a TNF-et a fagyasztás, olvasztás, fagyasztva szárítás és a hasonló műveletek során is.
A találmány tárgya eljárás TNF stabilizálására.
A találmányt a következő részletes leírással és a mellékelt ábrákkal szemléltetjük:
1. ábra Az emberi szérumalbumin koncentrációjának a +4 ’C-on 7 napig tárolt TNF maradék aktivitására gyakorolt hatását bemutató grafikon.
2. ábra A részlegesen hidrolizált zselatin koncentrációjának a +4 ’C-on 7 napig tárolt TNF maradék aktivitására gyakorolt hatását bemutató grafikon.
3. ábra Az emberi gamma-globulin koncentrációjának a +4 ’C-on 7 napig tárolt TNF maradék aktivitására gyakorolt hatását bemutató grafikon.
4. ábra A lazac protamin szulfát koncentrációjának a +4 ’C-on 7 napig tárolt TNF maradék aktivitására gyakorolt hatását bemutató grafikon.
Az ábrák rovábbi részletes magyarázatára később a 2. példa kapcsán kerül sor.
A találmány eljárást nyújt TNF stabilizálására oly módon, hogy a TNF tartalmú vizes oldathoz legalább egy - albumin, zselatin, globulin, protamin és protaminsó közül választott - stabilizálószer megfelelő mennyiségét adjuk. 1
Az itt használt TNF megnevezés fiziológiailag aktív anyagot jelent, amely egyrészt oly módon állítható elő, hogy a legalább egy reticulo-endothel ·« rendszert (RÉS) stimulálni képes anyaggal előkezelt emlősökbe Gram-negativ baktériumból származó endotoxint injektálunk, másrészt pedig úgy juthatunk hozzá, hogy emlősökből származó aktivált makrofágokat tartalmazó szövetkultúrákhoz Gram-negativ baktériumból származó endotoxint adunk. A TNF olyan anyag, amely tumoros emlősökbe passzívan bejuttatva némely tumor nekrózisát idézi elő, vagyolyan tetszőleges módon előállított anyag, amely a fentiekben ismertetett fiziológiailag aktív anyaghoz hasonló tulajdonságokkal rehdelkezik.
189 251
A találmány szerinti eljárásban alkalmazásra kerülő TNF előállítására több módszer is ismeretes, így például Matthews és munkatársainak eljárása [Br. J. Cancer 42 416-22 (1980)], valamint a Green és munkatársai által kidolgozott eljárás [J. Natl. Cancer Insti 59 (5) 1519-22 (1977)].
A találmány szerinti eljárásban TNF előállítására a következő jellegzetes eljárásokat alkalmaztuk.
Először is legalább egy, a reticulo-endothel rendszer (RÉS) stimulálására képes anyagot injektáltunk intravénásán vagy intraperitoneálisan emlősbe (pl. egér, nyúl, tengeri malac stb.). A RES-t stimuláló anyagként általában Gram-pozitív baktériumok, protozoonok vagy élesztők alkalmasak, amelyek egyaránt lehetnek élő vagy elölt (pl. hő-, illetve formalinos kezeléssel) mikroorganizmusok, vagy mikrobasejt kivonatok. Gram-pozitív baktériumként például Propionibacteriumok így Propionibacterium acnes (Corynebacterium parvum) és Propionibacterium granulosum (Corynebacterium granulosum), Mycobacteriumok, így a CalmetteGuérin (BCG) bacillus és Mycobacterium smegmatis, valamint Nocardiák, így Nocardia erythropolis és Nocardia gardneri alkalmasak. Megfelelő protozoonok például a Plamodium és Toxoplasma fajok, az élesztőkre pedig egyebek között jó példa a Saccharomyces cerevisiaeből extrahált Zymosan. Erre a célra egyébként szintetikus makromolekulák (igy például pirán-kopolimer) is alkalmazhatók.
Másodszor, 7-15 nappal az említett RES-t stimuláló anyaggal történt kezelést követően Gramnegatív baktériumból származó endotoxint (pl. Escherichia coliból, Pseudomonas aeruginosából vagy Salmonella typhosából származó lipopoliszacharidot) injektáltunk intravénásán az emlősbe.
Harmadszor, 1,5-2 órával az injektálás után kinyerjük az emlős testnedveit (pl. hasvíz, nyirok stb.) és/vagy szérumját vagy plazmáját; vagy pedig homogenizáltuk és fiziológiás sóoldattal extraháltuk a belső szerveket (pl. máj, lép stb.). Ezek a testnedvek, szérum, plazma és/vagy belső szerv kivonatok szolgáltak nyers TNF oldatként. Közülük mégis általában a szérum vagy a plazma használatos.
A találmány szerinti eljárásban alkalmazott TN F előállítási módszere azonban - mint már említettük - nem korlátozódik a fenti eljárásra. A génmanipuláción vagy a szövettenyésztésen alapuló, TNF termelő sejteket hasznosító eljárások szintén s eredményesen alkalmazhatók. Megjegyzendő, hogy ezek a módszerek humán TNF előállítására is alkalmasak.
t A nyers TNF, amint a fenti módszerek bármelyikével állítottak elő, a következő szokványos biokémiai műveletekkel külön-külön, vagy azok kombinálásával tisztítható és ennek eredményeként tisztított TNF oldatot, ezt fagyasztva szárítva pedig tisztított TNF port kapunk.
A TNF tisztítására alkalmas biokémiai műveletekként a következők említhetők: ammónium-szulfátos kisózás, ioncserés kromatográfia anioncserélő gyantán, gélszűrés és elektroforézis. Ezeknek a módszereknek az alkalmazása során a TNF tisztasága növekszik, de fokozatos stabilitáscsökkenés észlelhető. Például egy 500 ezer egység/mg fehétje fajlagos aktivitásig tisztított (a TNF aktivitás egység fogalmát később definiáljuk) TNF minta már meglehetősen instabil, amint ezt a példákban közölt adatokból látszik. Még az ennél alacsonyabb 5 fajlagos aktivitású minták is némileg veszítenek aktivitásukból, ha tárolják, fagyasztják, olvasztják, fagyasztva szárítják őket, vagy egyéb műveleteket végeznek velük.
Ennek megfelelően a találmány célja a nagy tisz10 taságú és igy instabillá vált TNF stabilizálása. Előnyös, ha a stabilizálandó TNF készítmény oldat.
A találmány értelmében előnyös, ha a stabilizálandó TNF oldat pH-ja állandóan 5- és 10 közötti érték, továbbá, ha az oldószer valamilyen alkalmas 15 puffer. Ilyen alkalmas pufferként említhető például a foszfátpuffer, valamint a trisz(hidroximetil)amino-metán (HCl puffer). Kívánt esetben sót, például nátrium- vagy kálium-kloridot adunk a TNFoldathoz. Sót adunk például a TNF oldathoz, ha 20 injekció készítéséhez izotóniás oldatot kívánunk előállítani, de nem csupán e célból történhet sóadagolás. A TNF oldat sókoncentrációját a sóadagolás céljának megfelelően választjuk meg. Ha például a TNF oldatból injekció készül, akkor 0,15 mó25 los izotóniás nátrium-klorid oldatot készítünk belőle.
A találmány értelmében eljárva legalább egy albumin, zselatin, globulin, protamin és protaminsó közül választott - stabilizálószer megfelelő 30 mennyiségét adjuk a TNF-et tartalmazó vizes oldathoz.
Alkalmas albuminként különböző állatokról (pl. marha, ló, birka, kecske, csirke) és emberből származó albuminokat említhetjük. A megfelelő albu3θ min konkrét példái a következők: marha szérumalbumin, humán szérumalbumin, csirke tojásalbumin, marha laktalbumin és humán laktalbumin. Az említett albuminok között nem észleltek számottevő különbséget a TNF stabilizáló képesség tekinte40 tében. Injekció készítésére azonban a legelőnyösebb stabilizálószer a humán szérumalbumin.
Alkalmas zselatinként a szokásos módon előállított közönséges zselatint, valamint a részlegesen hidrolizált zselatint említhetjük. A zselatin moleku45 lasúlya nem lényeges. Injekció készítéséhez azonban a részlegesen hidrolizált, vízoldható zselatin a legelőnyösebb stabilizálószer. A részlegesen hidrolizált zselatin proteolitikus enzimekkel (pl. papain) végzett enzimatikus hidrolízissel, vagy savas vagy lúgos hidrolízissel állítható elő.
Alkalmas globulinként különböző emlősökből (pl. marha, ló, birka, kecske) származó, valamint emberi eredetű globulinok és származékaik említhetők. A felsorolt globulinok között a TNF stabili55 záló képesség vonatkozásában számottevő különbség nem észlelhető. Előnyösen közülük mégis gamma-globulint, illetve ennek enzimes kezeléssel vagy kémiai módosítással előállított származékát használhatjuk, injekció készítéséhez pedig stabilizátor60 ként legelőnyösebbek a humán gamma-globulin, valamint származékai, mint például a plazminnal vagy pepszinnel kezelt humán gamma-globulin vagy a szulfonált humán gamma-globulin. Alkalmas protaminként megfelelő halfajok (pl. lazac. 65 hering, makréla) protaminjai említhetők. Alkalmas
189 251 protamin sóként pedig a protaminok sósavas, kénsavas és foszforsavas sói jöhetnek szóba. A felsorolt protaminok és protamimók között nem észlelhető számottevő különbség a TNF stabilizáló képesség tekintetében. A találmány szerinti stabilizá- 5 ló szerek külön-külön vagy keverékként is alkalmazhatók.
A találmány értelmében a hozzáadott stabilizátor mennyisége 10 pg és 5 mg között van a TNF oldatban milliliterenként, amelynek TNF aktivitá- 10 sa 102 és 10’ egység/ml közötti (az aktivitás egységét később definiáljuk).
A stabilizálószer alkalmazható maximális menynyiségét a stabilizálószer oldhatósága, a keletkező oldat viszkozitása, valamint gazdasági megfontolá- 15 sok szabják meg.
A stabilizálószer hozzáadásának módja nem lényeges. Poralakú stabilizátor például közvetlenül hozzáadható a TNF oldathoz. Úgy is eljárhatunk, · hogy a stabilizálószer porát előbb feloldjuk vízben 20 vagy valamilyen alkalmas puflferben és így adjuk a TNF oldathoz. A stabilizátor a tisztítási eljárás bármely lépésekor vagy a gyógyszerkészités során is hozzáadható. Ha két vagy több különböző stabilizátort alkalmazunk, akkor együttes mennyiségük- 25 nek kell a fentiekben ismertetett koncentráció határok közé esni.
Kívánatos, hogy a stabilizálószert tartalmazó TNF oldat tárolása, tisztítása és a belőle való gyógyszerkészítés 0 és 30 ’C, előnyösen 0 és 10 ’C 30 közötti hőmérsékleten történjen. Ha a TNF oldatot fagyasztva tároljuk, akkor a tárolási hőmérséklet előnyösen 0 ’C alatti, még előnyösebben pedig - 20 °C alatti legyen.
A TNF oldat, amely a találmány értelmében 35 legalább egy stabilizálószert tartalmaz, megtartja aktivitását a tárolás, tisztítás és gyógyszerkészités során, akár oldat formájában van, akár pedig fagyasztott állapotban.
A találmány értelmében a TNF stabilizálására 40 szolgáló eljárás alkalmazható a fagyasztva szárítás során is. Példaként említettük, hogy a fagyasztva szárítás során a TNF oldat (különösen hogyha nagy tisztaságú TNF-ről van szó) aktivitása általában jelentősen csökken. Azok a TNF oldatok 45 azonban, amelyek a találmány értelmében legalább, egy stabilizálószer fent említett mennyiségét tartalmazzák, aktivitásveszteség nélkül fagyasztva száríthatok TNF porrá. Stabil TNF oldat készíthető az olyan TNF por vizes oldásával, amelynek 50 TNF és stabilizátor koncentrációja a fent meghatározott tartományba esik. A találmány szerint a stabilizálószert a fagyasztva szárított készítmények is tartalmazhatják. Ha a TNF poralakban kerül tárolásra, akkor a tárolási hőmérséklet előnyösen 55 25 ’C vagy alacsonyabb legyen. ·
A TNF aktivitásának meghatározására általában két módszer használatos; az in vivő módszer, amelynek során a tumor nekrotizáló hatást in vivő mérik; valamint az in vitro eljárás, amelynél a neo- 60 plasztikus sejtekre gyakorolt citotoxikus hatást in vitro mérik.
In vivő módszerként említhetjük például a Carswell és munkatársai által alkalmazott eljárást [Proc. Nat. Acad. Sci. USA 72 (9) 3666-70 (1975)]. 65
E módszer szerint BALB/C Szarkóma Meth A sejteket (2x10* sejt) intradermálisan átültetnek (BALB/C x C57BL(6)F, egerek hónaljába, majd 7 nap elteltével a 7-8 mm átmérőjű, jó vérellátású, spontán központi nekrózistól mentes tumorral rendelkező egereket választják ki az értékeléshez. Fiziológiás sóoldattal hígított TNF mintát (0,5 ml) injektálnak mindegyik egér farokvénájába. A TNF minta aktivitását 24 óra elteltével az alábbi kritériumok szerint értékelik:
(-): nincs változás (+): enyhe haemorrhagiás nekrózis (+ +): mérsékelt haemorrhagiás nekrózis (a tumor felületének kb. 50%-ára kiterjedő központi nekrózis) (+ + +): jelentős haemorrhagiás nekrózis (erőteljes nekrózis, amely csak a tumor peremén hagy keskeny életképes szegélyt).
TNF aktivitás mérésinek in vitro módszerei közül például a RufT és munkatársai'[Lymphokines, Vol. Z. Ed. by E. Pick, Academic Press, New York, 245-8 (1980)], valamint a Kuli és munkatársai [J. Immunoi. 126 (4) 1279-83 (1981)] által alkalmazott eljárásokat említhetjük.
A feltalálók által használt, a TNF aktivitását in vitro mérő módszert a fent említett hagyományos módszerek tökéletesítésével fejlesztették ki. Ez az in vitro eljárás, amely az L-M sejtekre (ATCC CCL
1. 2) gyakorolt citotoxikus TNF aktivitást méri a következőképpen végzendő el. Tenyészrésre szolgáló edényként 96 lyuku mikroliter tálcákban (Floww Laboratories Inc. USA), 10% hőinaktivált magzati borjúszérumot tartalmazó Eagle minimál táptalajon [Science 130 432-7 (1959)] szaporítjuk el az L-M sejteket. A TNF mintákból (0,1 ml) sorozathigitásokat készítünk a táptalajjal és L-M sejtszuszpenzióval (0,1 ml, 1 x 10* sejt)elegyítjük őket a tálcák lyukjaiban, majd a tálcákat 37 ’C-on, 5% széndioxid tartalmú légtérben 48 órán át inkubáljuk. A tenyésztési periódus befejeztével 20 μΐ 20%os vizes glutáraldehid oldatot adagolunk a lyukakba a sejtek rögzítésére. A rögzítés után a tálcákat desztillált vízzel mossuk, azután száradni hagyjuk őket, majd 0,05%-os metilénkék oldat (0,1 ml) hozzáadásával megfestjük az élő sejteket. A színezék feleslegét alapos, desztillált vizes mosással eltávolítjuk, majd a tálcákat száradni hagyjuk. A megfestett sejtekből ezután extraháljuk a színezéket a lyukakba 3%-os sósavoldatot (0,2 ml) juttatva. A minták adszorpcióját 665 nm-en megmérve (Titertek Multiscan, gyártja Flow Laboratories Inc.) az élő sejtek számával arányos jelet kapunk.
A TNF aktivitást [egység (E)/ml] az 50%-os citotoxicitást eredményező hígítás reciprokaként definiáljuk és oly módon kapjuk meg grafikusan a mérési eredményekből, hogy a hígítást az adszorpció függvényében ábrázoljuk. Valamennyi, a későbbiekben közölt, in vitro módszerrel meghatározott TNF aktivitás az így definiált egységben értendő.
A találmány szerinti módszerrel a klinikailag alkalmazható hatásos antitumor gyógyszernek tartott nagytisztaságú TNF-ből megfelelő és állandó kereskedelmi ellátás biztosítható, mivel ennek alapján lehetővé válik a TNF aktivitásának megőrzése a tárolás (oldat, fagyasztott vagy fagysztva szárított készítményként), tisztítás és gyógyszerkészítés során. Ezen kívül úgy találtuk, hogy a TNF oldat vagy por, amely legalább egy - humán szérumalbumin, zselatin, humán gamma globulin vagy ennek származéka, protamin vagy protaminsó közül választott - stabilizáló szert tartalmaz, biztonsággal bejuttatható az emberi szervezetbe, és ennek következtében a találmány szerinti új összetételű készítmény különösen előnyös midőn a TNF-et antitumor gyógyszerként klinikailag kívánják alkalmazni. A találmányt a következő példákban részletesen ismertetjük, anélkül azonban, hogy a találmány tárgykörét ezzel korlátoznánk.
A példákban használt rövidítések:
A következő példákban a stabilizálószerek rövidítései:
HSA: humán szérumalbumin
BSA: marha szérumalbumin
PHG-1: részlegesen hidrolizált zselatin, amelyet a zselatin lúgos hidrolízisével kaptunk (átlagmólsúly: kb. 7000)
HGG: humán gamma-globulin *”
SPS: lazac protamin-szulfát
HPS: hering protamin-szulfát
BGG: marha gamma-globulin
CEA: csirke tojásalbumin
BLA: marha a-laktalbumin
PHG-2: részlegesen hidrolizált zselatin, amelyet a zselatin savas hidrolízisével kaptunk (átlagmólsúly kb. 7000)
PHG-3: alacsony polimerizációs fokú részlegesen hidrolizált zselatin
PG: tisztított zselatin
SPF: lazac protamin (szabad bázis)
SPP: lazac protamin-foszfát EDTA: etilén-diamin-tetraecetsav
Referencia példa
2-3 kg súlyú nőstény nyulakba 75-75 mg formaiinnal elölt Propionibacterium acnes (Corynebacterium parvum; Wellcome Research Laboratories, England) sejttömeget injektáltunk intravénásán. Nyolc nap elteltével a nyulakba intravénásán 100-100 pg endotoxint (Escherichia coli 026 : B6 lipopoliszacharidot, a Dífco Laboratories, USA terméke) injektáltunk. Két órával ezután a nyulaktól szívből vért vettünk, kévés heparint kevertünk hozzá, majd 3000/perc fordulaton 15 percen át centrifugáltuk. így 2500 E/ml TNF aktivitású plazmát kaptunk. Ezt a TNF tartalmú plazmát (10 liter) 5 liter mól/l-es foszfátpufferrel (pH 7,8) hígítottuk és 0,13 mól/1 NaCl tartalmú 0,03 mól/l-es foszfátpufferrel (pH 7,8) egyensúlyba hozott DEAE - Sepharose CL-6B (Pharmacia Fine Chemicals AB , Svédország terméke) oszlopra (10 * 42 cm) vittük. Az oszlopot 2,5 liter 0,03 mól/l-es foszfátpufferrel (ph 7,8) mostuk, majd a megkötött TNF elucióját lineáris NaCl gradienssel végeztük a következő két oldattal: 5,0 liter 0,15 mól/I NaCl tartalmú 0,03 mól/l-es foszfátpuffer (pH 7,8), illetve 5,0 liter 0,3 mól/1 NaCl tartalmú 0,03 mól/l-es foszfátpuffer (pH 7,8). Az átfolyási sebesség 230 ml/óra volt és 45 ml-es frakciókat szedtünk. A TNF aktivitás a 0,20 és 0,24 mól/1 NaCl koncentrációtartományban lejövő frankciókban volt. Ezeket egyesítettük és éjszakán át 0,13 mól/1 NÁCI tartalmú 5 0,03 mól/1 Tris/HCl pufferrel (pH 7,2) szemben dializáltuk.
A dializált TNF oldatot újra kromatografáltuk 0,15 mól/1 NaCl tartalmú 0,03 mól/l-es Tris/HCI pufferrel (pH 7,2) ekvilibrált DEAE-Sepharose CL-6B oszlopon (3,0x30 cm). Az adszorbeált TNF-et lineáris NaCl gradienssel eluáltuk, a határoldatok: 500 ml ekvilibráló puffer, illetve 0,3 mól/l NaCl tartalmú 0,03 mól/l-es Tris/HCl puffer (pH 7,8). Az átfolyási sebesség 40 ml/óra volt és 10 15 ml-es frakciókat gyűjtöttünk. A TNF aktivitással rendelkező frakciókat egyesítettük és töményítettük. Ezt a koncentrátumot 0,15 mól/1 NaCl tartalmú 5 mól/l-es foszfátpufferrel (pH 7,0) ekvilibrált Sephacryl S-200 (Pharmacia termék) oszlopon 20 (5 x 100 cm) gélszűrtük. Az eluciót a kiegyenlítő pufferrel végeztük. Az átfolyási sebesség 80 ml/óra volt és 13 ml-es frakciókat szedtünk. A TNF aktivitást tartalmazó frakciókat egyesítettük és ultraszűréssel töményítettük.
25 Az így kapott TNF oldat 5,0 x 10s E/mg fehérje fajlagos aktivitású és a plazmához viszonyítva tízezerszeres tisztaságú.
Ezt a TNF oldatot ugyanazon az oszlopon (Sephacryl S-200) ugyanazzal a pufferrel újra kro30 matografálva 1 x 10* E/mg fehérje fajlagos aktivitású TNF oldatot kaptunk.
, /. példa
5,0 x 105 E/mg fajlagos aktivitású, a referencia példa szerinti módon előállított nyúl TNF-ből 0,15 mól/1 NaCl tartalmú 0,1 mól/l-es foszfátpufferrel (pH 7,0) 1200 E/ml aktivitású TNF oldatot készí40 tünk. Az így kapott oldat alikvotjáihoz különkülön stabilizálőszereket (HSA, BSA, PHG-1, HGG és SPS) adtunk kétféle koncentrációban (0,1, illetve 1,0 mg/ml).
Az oldatok maradék aktivitását a következő ke45 zelések után meghatároztuk;
í) tárolás 4 ’C-on 2,7 illetve 30 napig;
ii) fagyasztás (-70 ’C) és felolvasztás egyszer illetve háromszor;
iii) fagyasztás - 70 ’C-ra, fagyasztva szárítás és 50 tárolás 25 ’C-on 7 napig.
A fenti kísérletek során a stabilizátor nélküli TNF oldat volt a kontroll. A fagyasztva szárított készítményből (iii) a TNF aktivitás meghatározásához steril desztillált vizes oldatot készítettünk. 55 A maradék aktivitás meghatározása a korábban ismertetett in vitro illetve ín vivő módszerekkel történt. Az in vitro módszerrel a maradék aktivitást (%) a mérési adatokból az alábbi képlet szerint kaptuk:
60 Maradék aktivitás (%) = ^x 100
B ahol A a TNF minta aktivitása a kezelés után,
B pedig a TNF minta aktivitása a kezelés előtt.
Az in vivő meghatározáshoz a mintákat a kezde65 tihez képest 20-szorosra töményítettük Mini-5189 251
Modulé NM-3 készülékkel (a gyártó Asahi Chemical Industiy Co. Ltd.. Japán, cég védjegye az ultraszűrő készülékre). Az így töményített oldat 0,5 miét injektáltuk 5-5 tumoros egér farokvénájába.
A TNF aktivitást 24 óra elteltével a korábbiakban ismertetett kritérium alapján határoztuk meg. A kapott eredményeket az 1. táblázat tartalmazza.
I. táblásai
HSA. BSA, PHO-I, HOO 6» SPS tabiliiiló lmja
Körülmények | Kontroll (tárolás vagy fizikai kezelés előtt) | 4*C-on tárolva (oldat) | Fafyuztf·- olvtutit | 25 *C-on tárolva lioftlizált kéadtmény | ||||||||||
Az aktivitás vizsgálati módszere | ín vitro | in vivő | in vitro | in vivő | in vitro | in vitro | in vivő | |||||||
Stabilizáló | Koncentrá· | napok | napok | Ismétlői | napok | napok | ||||||||
anyag | ció mg/ml | 2 | 7 | 30 | 7 | 1 | 3 | 7 | 7 | |||||
Kontroll (stabilizáló | 100 | + + + 4. | + + I | 52 | 26 | 4 | + 3. | -2 | 30 | 8 | 40 | + 4. | -1 | |
anyag nélkül) | ||||||||||||||
HSA | 0.1 | 100 | + + +4. | + + I | 102 | 95 | 90 | + + +3. | + +2 | 90 | 82 | 95 | + + +3. | + +2 |
1.0 | 100 | 4 + +4. | + + 1 | 100 | 98 | 92 | + + 4-4. | + 1 | 100 | 94 | 102 | + + +4, | + +1 | |
BSA | 1.0 | 100 | + + +4, | + +1 | 99 | 98 | 93 | + + +4. | + 1 | 102 | 96 | 96 | + + +Χ | + +2 |
PHG-I | 0.1 | 100 | + + +4. | + +1 | 96 | 94 | 88 | + + + 3. | + +2 | 95 | 85 | 97 | + + +4. | + +1 |
1.0 | 100 | + + + 4. | + + 1 | 103 | 97 | 91 | + + +4. | + +1 | 101 | 93 | 100 | + + +5 | ||
HGG | 0.1 | 100 | + + +4. | + + ! | 94 | 90 | 87 | + + +3. | + 2 | 88 | •80 | 93 | *t- + +3, | + +2 |
1.0 | 100 | + + +4. | + +1 | 102 | 97 | 90 | + + +3. | + +2 | 100 | 90 | 98 | + + +3, | + +2 | |
SPS | 0.1 | 100 | + + +4. | + + 1 | 95 | 90 | 87 | + + +3. | + +2 | 93 | 80 | 90 | + + +3, | + +2 |
1.0 | 100 | + + +4. | + + I | 101 | 96 | 90 | + + +4. | + 1 | 100 | 92 | 97 | ♦ + +4, | + +1 |
Az ..in vitrú** jelű oszlopokban szereplő számok az előbbiekben definiált maradék aktivitást jelentik. Az ..in \i\o” jelű oszlopokban szereplő értékek az egerek számát jelölik.
A szimbólumok 4-, + +, stb.) jelentését korábban megadtuk.
HSA: Sigma Chemical Co.. USA terméke
BSA: Armour Pharmacentical Co.. USA terméke
PHG-1: Nippi Co.. Ltd.. Japán terméke (Nagy polimerizáciős fokú zselatin)
HGG: Nutritional Biochemicals Corp.. USA terméke
SPS: Sigma Chemical Co., USA terméke.
2. példa
Az 1. példában szereplővel megegyező aktivitású TNF oldat alikvotjaihoz külön-külön, különböző koncentrációban stabilizálószerekct adtunk (HSA, PHG-1, HGG, illetve SPS - azonosak az 1. példában szereplő fehérjekészitményekkel). Az így kapott oldatokat 7 napig4 'C-on tároltuk, majd TNF aktivitásukat az in vitro módszerrel meghatároztuk. A maradék aktivitás számítását az 1. példa szerinti módon végeztük.
A kapott eredmények az 1-4. ábrákon láthatók.
3. példa
1,0 x 10® E/mg fajlagos aktivitású, a referencia példa szerinti módon előállított TNF-ből 0,15 mól/1 NaCl tartalmú 0,1 mól/l-es foszfátpufferrel (pH 7,0) 1000 E/ml aktivitású TNF oldatot készítettünk. Az igy kapott oldat alikvotjaihoz két különböző fajta - a különböző albuminok, globulinok, protaminok és zselatinok közül választott stabilizálószert együttesen adtunk hozzá különböző koncentrációkban, a 2. táblázatban szereplő módon. Valamennyi így kapott oldatot 4 *C-on 7 napig tároltuk, majd in vitro TNF meghatározásnak vetettük alá őket. A maradék TNF aktivitást (%) az 1. példa szerinti módon számítottuk.
A kapott eredményeket a 2. táblázat tartalmazza.
2. táblázat
A különböző stabilizáló anyagok hatása
Stabilizáló anyag (koncentráció, mg/ml) | Maradék aktivitás (<) 4 C-on. 7 napig tárolva |
Nincs (kontroll) | 5 |
BSA (0,5)+HSA (0,05) | 96 |
HSA (0,01)+PHG-1 (0,05) | 90 |
HPS (0,1) +PHG-1 (0,05) | 95 |
BGG (1,0)+CEA (1,0) | 93 |
HGG (0.1) +SPS (0.1) | 94 |
Megjegyzés:
BSA, HSA, PHG-1, HGG és SPS megegyeznek az 45 1. példában használt anyagokkal.
HPS: Sigma Chemical Co. terméke
BGG: Sigma Chemical Co. terméke
CEA: Nutritional Biochemicals Corp. terméke.
4. példa
A 3. példában szereplővel megegyező TNF aktivitású oldat alikvotjaihoz stabilizálószerként kü55 lönbözö albuminokat adtunk 1,0 mg/ml koncentrációban. Az így kapott oldatokat 4 °C-on 7 napig tároltuk, majd in vitro TNF aktivitás meghatározásnak vetettük alá őket. A maradék aktivitást (%) az 1. példa szerinti módon számítottuk.
A kapott eredményeket a 3. táblázat tartalmazza.
189 251
J. táblázat
Λ különböző albuminok stabilizáló hatása
Stabilizáló anyag | Maradék TNF aktivitás (%) 4 ’C-on 7 napig tárolva |
nincs (kontroll) | 5 |
HSA | 98 |
USA frakció | 97 |
BSA | 98 |
BSA frakció | 98 |
CEA | 90 |
BLA | 91 |
Megjegyzés:
HSA, BSA és CEA az 1. és 3. példában szereplő anyagokkal megegyeznek.
HSA frakció: emberi szérum albumin frakció (Chon frakció V.) Sigma Chemical Co. terméke
BSA frakció: ökör szérum albumin frakció (Chon frakció V.), Sigma Chemical Co. terméke
BLA: Sigma Chemical Co. terméke.
5. példa
A 3. példában szereplővel megegyező TNF aktivitású oldat alikvotjaihoz stabilizálószerként különféle zselatinokat adtunk, a 4. táblázatban közöltek szerint. 1,0 mg/ml koncentrációban. Az így kapott oldatokat 4 °C-on 7 napig tároltuk, majd in vitro módszerrel végzett TNF aktivitás meghatározásnak vetettük alá őket. A maradék TNF aktivitást („) az 1. példában ismertetett módon számítottuk. A kapott eredményeket a 4. táblázat tartalmazza.
4. táblázat
Különböző zselatinok stabilizáló hatása
Stabilizáló anyag | Maradék TNF aktivitás (%) 4 ’C-on 7 napig tárolva |
Nincs (kontroll) | 4 |
PHG-1 | 97 |
PHG-2 | 99 |
PHG-3 | 99 |
PG | 96 |
Megjegyzés:
PHG-I az 1. példában szereplő anyaggal azonos.
PHG-2: Nippi Co., Ltd, terméke
PHG-3: Sigma Chemical Co. terméke (Gelatin Type IV.: Approx. 60 Bloom)
PG: Nakarai Chemicals Co., Ltd., Japán terméke.
6. példa
A 3. példában szereplővel megegyező TNF aktivitású oldat alikvotjaihoz stabilizálószerként különféle globulinokat adtunk az 5. táblázatban közöltek szerint 1,0 mg/ml koncentrációban. Az így kapott oldatokat 4 ’C-on 7 napig tároltuk, majd in vitro módszerrel végzett TNF aktivitás meghatározásnak vetettük alá őket. A maradék TNF aktivitást (%) az 1. példában ismertetett módon számítottuk. A kapott eredményeket az 5. táblázat tartalmazza.
5. táblázat
Különböző globulinok stabilizáló hatása
Stabilizáló anyag | Maradék TNF aktivitás („) 4 ’C-on 7 napig tárolva |
Nincs (kontroll) | 4 |
HGG | 97 |
BGG | 95 |
Plazmin-kezelt HGG | 93 |
Pepszin-kezelt HGG | 94 |
Szulfonált HGG | 91 |
HGG frakció | 99 |
Megjegyzés:
HGG és BGG az 1. és 3. példában szereplő anyagokkal azonosak.
Plazmin-kezelt HGG: Venoglobulin (márkanév), The Green Cross Corporation, Japán terméke
Pepszin-kezelt HGG: Gamma-Venin (márkanév) HOECHST Japán Ltd terméke
Szulfonált HGG: Venilon (márkanév), ChemoSero-Therapeutic Research Institute, Japán terméke
HGG. frakció: emberi gamma globulin frakció (Cohn frakció II.), Sigma Chemical Co. terméke.
7. példa
A 3. példában szereplővel megegyező TNF aktivitású oldat alikvotjaihoz stabilizálószerként különféle protaminokat adtunk, a 6. táblázatban közöltek szerint, 1,0 mg/ml koncentrációban. Az így kapott oldatokat 4 *C-on 7 napig tároltuk, majd in vitro módszerrel végzett TNF aktivitás meghatározásnak vetettük alá őket. A maradék TNF aktivitást (%) az 1. példában ismertetett módon számítottuk. A kapott eredményeket a 6. táblázat tartalmazza.
6. táblázat
Különböző protaminok stabilizáló hatása
Stabilizáló anyag | Maradék TNF aktivitás (%) 4 ’C-on 7 napig tárolva |
Nincs (kontroll) | 6 |
SPS | 96 |
SPF | 93 |
SPP | 95 |
HPS | 93 |
Megjegyzés:
SPS és HPS az 1. és 3. példában szereplő anyaggal megegyezik.
SPF: Sigma Chemical Co. terméke SPP: Sigma Chemical Co. terméke.
-7189 251
8. példa
1,0 x 10® E/mg fajlagos aktivitású, a referencia példa szerinti módon előállított nyúl TNF-ből 0,15 mól/1 NaCl tartalmú 0,1 mól/l-es foszfátpufferrel (pH 7,0) 100,1000,10 000 és 100 000 E/ml aktivitású oldatokat készítettünk. Az oldatok alikvotjaihoz stabilizálószerként HSA-t adtunk 1,0 mg/ml koncentrációban. Az így kapott oldatokat 4 ’C-on 7 napig tároltuk, majd in vitro módszerrel végzett TNF aktivitás meghatározásnak vetettük alá őket. A maradék TNF aktivitást (%) az 1. példában ismertetett módon számítottuk. Kontrollként HSA nélküli TNF oldattal is elvégeztük a meghatározást. A kapott eredményeket a 7. táblázat tartalmazza.
7. táblásat
HSA stabilizáló hatása
TN F koncentrációja E ml | HSA koncentrációja, mg/ml | |
0 (kontroll) | 1,0 | |
100 | 3 | 85 |
1000 | 5 | 98 |
10000 | 45 | 101 |
100000 | 48 | 99 |
(A számok a TNF maradék aktivitását fejezik ki %-ban.) összehasonlító példa
Az 1. példában szereplővel megegyező TNF aktivitású oldat alikvotjaihoz különféle aminosavakat, fémsókat és kelátképző szereket - amelyek közismert stabilizátorai a közönséges fiziológiailag aktív anyagok oldatainak - adtunk különböző koncentrációban, a 8. táblázatban közöltek szerint. Az igy kapott oldatokat 4 ’C-on 7 napig tároltuk, majd in vitro módszerrel végzett TNF aktivitás meghatározásnak vetettük alá őket. A maradék TNF aktivitást (%) az 1. példában ismertetett módon számítottuk. A kapott eredményeket a 8. táblázat tartalmazza.
8. táblázat
Különböző stabilizáló anyagok stabilizáló hatásuk alapján történő összehasonlítása
Maradék TNF
Stabilizáló anyag Koncentráció (/°\ tárolva
Nincs (kontroll) | 26 | |
HSA | 1.0 (mg/ml) | 98 |
PHG-1 | 1.0 (mg/ml) | 97 |
HGG | 1,0 (mg/ml) | 97 |
SPS | 1,0 (mg/ml) | 90 |
Glicin | 0,1 (mól/1) | 30 |
L-Lyzin | 0,1 (mól/1) | 28 |
L-Arginin | 0,1 (mól/1) | 24 |
L-Glutamin sav | 0,1 (mól/1) | 23 |
CaCl2 | 1 (nmól/1) | 32 |
MgCl2 | 1 (nmól/1) | 32 |
EDTA | 1 (nmól/1) | 26 |
Szabadalmi igénypontok
Claims (10)
- Szabadalmi igénypontok1. Eljárás tumor nekrózis faktor stabil vizes oldat vagy stabil por formában történő előállítására, azzal jellemezve, hogy tumor nekrózis faktorból 102—10’ TNF-aktivitás-egység/ml-es 5-10 pH-ra pufferolt vizes oldatot készítünk, az oldathoz annak 1 ml-ére számítva 10 gg és 5 mg közötti menynyiségű albumínt vagy zselatint adunk, majd kívánt esetben az igy kapott oldatot liofilizáljuk. (Elsőbbsége: 1982. 04. .07.)
- 2. Eljárás tumor nekrózis faktor stabil vizes oldat vagy stabil por formában történő előállítására, azzal jellemezve, hogy tumor nekrózis faktorból 102-109 TNF-aktivitás-egység/ml-es 5-10 pH-ra pufferolt vizes oldatot készítünk, az oldathoz annak 1 ml-ére számítva 10 gg és 5 mg közötti menynyiségű globulint, protamint vagy protaminsót adunk, majd kívánt esetben az így kapott oldatot liofilizáljuk. (Elsőbbsége: 1982. 07. 27.)
- 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy stabilizálószerként albumint használunk. (Elsőbbsége: 1982. 04. 07.)
- 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy albuminként humán szérum albumint használunk. (Elsőbbsége: 1982. 04. 07.)
- 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy stabilizálószerként zselatint használunk. (Elsőbbsége: 1982. 04. 07.)
- 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy zselatinként részben hidrolizált, vízben oldódó zselatint használunk. (Elsőbbsége: 1982.04. 07.)
- 7. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy stabilizálószerként globulint használunk. (Elsőbbsége: 1982. 07. 27.)
- 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy globulinként humán gamma globulint vagy annak valamilyen származékát használjuk. (Elsőbbsége: 1982. 07. 27.)
- 9. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy stabilizálószerként protamint vagy valamilyen protaminsót használunk. (Elsőbbsége: 1982. 07. 27.)
- 10. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a stabilizálószert 100 gg és 5 mg közötti mennyiségben adjuk a tumor nekrózis faktor 102-10Q egység/ml aktivitású vizes oldatához, annak egy milliliterére számítva. (Elsőbbsége: 1982. 04. 07.)
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP57056690A JPS58174330A (ja) | 1982-04-07 | 1982-04-07 | ガン壊死因子の安定化法 |
JP57129560A JPS5920225A (ja) | 1982-07-27 | 1982-07-27 | ガン壊死因子の安定化方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
HU189251B true HU189251B (en) | 1986-06-30 |
Family
ID=26397663
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
HU83981A HU189251B (en) | 1982-04-07 | 1983-03-23 | Process for stabilizing tumor necrosis factor |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4447355A (hu) |
EP (1) | EP0091258B2 (hu) |
KR (1) | KR860000842B1 (hu) |
CA (1) | CA1187412A (hu) |
CH (1) | CH656534A5 (hu) |
DE (1) | DE3373628D1 (hu) |
ES (1) | ES8505546A1 (hu) |
FR (1) | FR2530472B1 (hu) |
HU (1) | HU189251B (hu) |
IT (1) | IT1162845B (hu) |
Families Citing this family (28)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6019719A (ja) * | 1983-07-15 | 1985-01-31 | Asahi Chem Ind Co Ltd | 抗腫瘍活性を有する蛋白質 |
US4524026A (en) * | 1983-08-29 | 1985-06-18 | Yoshio Sakagami | Novel proteinous cancer-cell proliferation inhibitory factors |
US4879226A (en) * | 1984-04-06 | 1989-11-07 | Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha | Novel human physiologically active polypeptide |
DE3583880D1 (de) * | 1984-04-09 | 1991-10-02 | Takeda Chemical Industries Ltd | Stabile interleukin-2-zusammensetzung. |
JPS60260522A (ja) | 1984-06-07 | 1985-12-23 | Asahi Chem Ind Co Ltd | 遺伝子組換体が生産する生理活性物質の安定化法 |
US5672347A (en) * | 1984-07-05 | 1997-09-30 | Genentech, Inc. | Tumor necrosis factor antagonists and their use |
US6686455B1 (en) | 1984-07-05 | 2004-02-03 | Genentech, Inc. | Tumor necrosis factor |
US5840522A (en) * | 1984-09-20 | 1998-11-24 | Chiron Corporation | Recombinant lectins |
US4677063A (en) * | 1985-05-02 | 1987-06-30 | Cetus Corporation | Human tumor necrosis factor |
US4677064A (en) * | 1984-11-09 | 1987-06-30 | Cetus Corporation | Human tumor necrosis factor |
US4900724A (en) * | 1985-03-04 | 1990-02-13 | Sawai Pharmaceutical Co., Ltd | Tumor necrosis factor inducing substance derived from acid-fast bacteria |
US6084073A (en) * | 1985-03-25 | 2000-07-04 | Chiron Corporation | Recombinant ricin toxin |
US4870163A (en) * | 1985-08-29 | 1989-09-26 | New York Blood Center, Inc. | Preparation of pure human tumor necrosis factor and hybridomas producing monoclonal antibodies to human tumor necrosis factor |
US4770995A (en) * | 1985-08-29 | 1988-09-13 | New York Blood Center, Inc | Detection of the sensitivity of cells to the effects of tumor necrosis factor and lymphotoxin |
US5425940A (en) * | 1986-04-09 | 1995-06-20 | Cetus Oncology Corporation | Combination therapy using interleukin-2 and tumor necrosis factor |
DE3631413A1 (de) * | 1986-09-16 | 1988-03-24 | Knoll Ag | Therapeutisches system zur lokalen applikation von pharmawirkstoffen |
US5215743A (en) * | 1988-04-13 | 1993-06-01 | Maninder Singh | Tumor necrosis factor formulations |
DE3839639A1 (de) * | 1988-11-24 | 1990-05-31 | Basf Ag | Verwendung von tnf bei der behandlung von hautkrankheiten |
US5223395A (en) * | 1988-12-01 | 1993-06-29 | Centocor, Inc. | Immunometric assays for tumor necrosis factor-alpha and methods for preventing the loss of biological activity of tumor necrosis factor-alpha in biological samples |
US5653974A (en) * | 1990-10-18 | 1997-08-05 | Board Of Regents,The University Of Texas System | Preparation and characterization of liposomal formulations of tumor necrosis factor |
EP0495187B1 (en) * | 1991-01-15 | 1997-01-22 | Hemosphere, Inc. | Protein nanomatrixes and method of production |
US5344644A (en) * | 1991-08-01 | 1994-09-06 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Water-soluble composition for sustained-release |
DE4239877C1 (de) * | 1992-11-27 | 1994-03-17 | Boehringer Ingelheim Int | Stabilisierte Superoxid-Dismutase (SOD)-Zusammensetzung |
JPH0776527A (ja) * | 1993-06-28 | 1995-03-20 | Hayashibara Biochem Lab Inc | 半固形製剤とその製造方法 |
US5556771A (en) * | 1995-02-10 | 1996-09-17 | Gen-Probe Incorporated | Stabilized compositions of reverse transcriptase and RNA polymerase for nucleic acid amplification |
ES2180416B1 (es) | 2001-03-12 | 2004-06-01 | BIOTOOLS BIOTECHNOLOGICAL & MEDICAL LABORATORIES, S.A. | Procedimiento para la preparacion de mezclas de reaccion estabilizadas, total o parcialmente desecadas, que comprenden, al menos, una enzima, mezclas de reaccion y kits que las contienen. |
EP1578799B8 (en) * | 2002-12-02 | 2011-03-23 | Amgen Fremont Inc. | Antibodies directed to tumor necrosis factor and uses thereof |
JP2010143860A (ja) * | 2008-12-19 | 2010-07-01 | Chisso Corp | タンパク質の安定化剤 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3637640A (en) * | 1970-05-04 | 1972-01-25 | Diagnostic Data Inc | Orgotein stabilized with saccharide process and products |
JPS5668607A (en) * | 1979-11-07 | 1981-06-09 | Teikoku Hormone Mfg Co Ltd | Medical preparation with storage stability |
-
1983
- 1983-03-23 HU HU83981A patent/HU189251B/hu unknown
- 1983-03-23 US US06/477,866 patent/US4447355A/en not_active Expired - Lifetime
- 1983-03-28 DE DE8383301740T patent/DE3373628D1/de not_active Expired
- 1983-03-28 EP EP83301740A patent/EP0091258B2/en not_active Expired
- 1983-03-29 CA CA000424749A patent/CA1187412A/en not_active Expired
- 1983-04-05 IT IT67372/83A patent/IT1162845B/it active
- 1983-04-05 FR FR8305540A patent/FR2530472B1/fr not_active Expired
- 1983-04-06 ES ES521266A patent/ES8505546A1/es not_active Expired
- 1983-04-06 KR KR1019830001415A patent/KR860000842B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1983-04-07 CH CH1885/83A patent/CH656534A5/fr not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0091258A3 (en) | 1984-09-19 |
IT1162845B (it) | 1987-04-01 |
EP0091258B2 (en) | 1992-12-16 |
EP0091258B1 (en) | 1987-09-16 |
ES521266A0 (es) | 1985-06-01 |
FR2530472B1 (fr) | 1986-04-25 |
KR860000842B1 (ko) | 1986-07-09 |
FR2530472A1 (fr) | 1984-01-27 |
IT8367372A0 (it) | 1983-04-05 |
DE3373628D1 (en) | 1987-10-22 |
CA1187412A (en) | 1985-05-21 |
ES8505546A1 (es) | 1985-06-01 |
CH656534A5 (fr) | 1986-07-15 |
US4447355A (en) | 1984-05-08 |
EP0091258A2 (en) | 1983-10-12 |
KR840004365A (ko) | 1984-10-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
HU189251B (en) | Process for stabilizing tumor necrosis factor | |
Howard et al. | Specificity of the autolysin of Streptococcus (Diplococcus) pneumoniae | |
ES2202425T3 (es) | Composicion deshidratada de factor sanguineo que comprende trehalosa. | |
US4675183A (en) | Method for solubilization of interferon | |
US5372942A (en) | Protease K resistant arginine deiminase, its method of preparation and its use as an anti-neoplastic agent | |
Foged et al. | Characterization and biological effects of the Pasteurella multocida toxin | |
Buecher Jr et al. | Ficoll activation of a protein essential for maturation of the free-living nematode Caenorhabditis briggsae. | |
SE454403B (sv) | Anvendning av ett cellyteprotein med fibronektin-, fibrinogen-, kollagen-, och/eller lamininbindande egenskaper vid framstellning av sarbehandlingsmedel | |
JPH03505334A (ja) | 凍結乾燥されたペプチド製剤 | |
CN103874502B (zh) | 用于控制病原体的氨基酸序列 | |
Forst et al. | The role of phospholipase A2 lysines in phospholipolysis of Escherichia coli killed by a membrane-active neutrophil protein. | |
Cox et al. | Serum albumin regeneration as effected by intravenously and orally administered protein hydrolysates | |
JPH0222233A (ja) | スーパーオキシドディスムターゼ組成物 | |
Lopez-Merino et al. | Immunization by an insoluble fraction extracted from Brucella melitensis: immunological and chemical characterization of the active substances | |
KR101480716B1 (ko) | 가다랑어 간 유래의 새로운 항미생물성 펩타이드 및 이의 용도 | |
JPS5959625A (ja) | ガン壊死因子を安定化する方法 | |
JP2001526537A (ja) | 敗血症の治療法 | |
BE896383A (fr) | Procede pour stabiliser un facteur de necrose tumorale et solution aqueuse ou poudre stables contenant ce facteur | |
CA2186121A1 (en) | Pasteurellaceae antigens and related vaccines | |
JP2722143B2 (ja) | トリプシンインヒビター含有凍結乾燥製剤 | |
Shiomi et al. | Purification and properties of a proteinaceous toxin newly found in the roe of lamprey Lampetra japonica | |
JPS60260523A (ja) | インタ−フエロンの凍結乾燥医薬組成物 | |
JPH04198195A (ja) | Cpb―iの安定化方法及び製剤組成物 | |
RU2294372C1 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ИНТЕРФЕРОНА АЛЬФА-2b И ИНТЕРФЕРОНСОДЕРЖАЩИЙ ПРЕПАРАТ (ВАРИАНТЫ) | |
SU1605914A3 (ru) | Способ стабилизации высокоочищенного фактора некроза опухоли из плазмы или сыворотки кролика, индуцированного липополисахаридами |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
HU90 | Patent valid on 900628 |