KR860000842B1 - 종양 괴사 인자의 안정화 방법 - Google Patents

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Description

종양 괴사 인자의 안정화 방법

제1도 : 인체 혈청 알부민의 농도가 4℃에서 7일간 저장후의 TNF의 잔류 활성에 미치는 효과를 나타낸 그래프.

제2도 : 부분가수 분해된 젤라틴의 농도가 4℃에서 7일간 저장후의 TNF의 잔류 활성에 미치는 효과를 나타낸 그래프.

제3도 : 인체 감마 글로블린의 농도가 4℃에서 7일간 저장후의 TNF의 잔류 활성에 미치는 효과를 나타낸 그래프.

제4도 : 연어 프로타민 설페이트의 농도가 4℃에서 7일간 저장후의 TNF의 잔류 활성에 미치는 효과를 나타낸 도면.

본 발명은 종양 괴사 인자를 안정화시키는 방법, 특히 특수 단백질을 종양 괴사 인자 함유 수성용액 또는 분말에 첨가한, 종양 괴사 인자를 안정화시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 종양 괴사 인자 및 특수 단백질 유효량을 함유하는 안정한 수성용액 또는 분말에 관한 것이다.

카스웰 등은 종양 괴사 인자(이하, "TNF"라 칭함)를 찾아 내었다. 이들은 TNF가 바실루스 칼메테-구에랑(Bacillus Calmette Guerin)(BCG), 코리네 박테리아(Coryne bacteria) 또는 지모산(Zymosan)과 같은 면의 상승제로 감각시킨 엔도톡신-처리 새앙쥐, 쥐 또는 토끼의 혈청내에 존재하는 물질이며 또한 TNF는 종양이 있는 수용체에 투여시 독성이 없는 각종으로 이식된 새앙쥐의 종양 괴사를 유발한다는 것을 발표하였다.

[참조 : Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 72(9), 3666-3670(1975)].

이후, 새앙쥐 TNF 및 토끼 TNF의 생화학적 및 생리학적 특성에 대해 수많은 논문이 발표되었다.

[참조 : Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 73(2), 381-385(1976); Expl. Cell Biol, 47, 53-60(1979); Br. J. Cancer, 38, 302-309(1978); and ibicl. , 42, 416-422(1980)]. TNF와 동일한 것으로 제시된 물질인 세포독성 인자가 몇몇 연구자에 의해 발표된 바 있다. [참조 : Infect. Immun. , 28(1), 204-211(1980)].

TNF의 시험관내 생산도 이미 발표되어 있다. 예를들면, 마테우는 정상적인 토끼 및 BCG접종 토끼의 각종 조직으로부터 채취한 단일핵 식세포에 의해 시험관내에서 TNF가 생산되는 최적조건을 측정하고 발표하였다. [참조 : Br. J. Cancer, 44, 418-427(1981)].

그의 발표에 따르면, TNF의 최적량은 엔도톡신 존재하에 단일핵 식세포에 의해 생산되며 폐포 및 복강 대식세포는 TNF의 가장 큰 효능을 가진 생산체라는 것이다. 더욱이, 그는 BCG-접종토끼에서 채취한 대식세포는 정상 동물에서 채취된 것보다 유의적으로 더 많은 TNF를 생산한다는 것을 발포하였다.

또한 맨넬등은 BCG-접종 새앙쥐에서 채취한 대식세포-함유 복강 분비 세포를 리포 폴리사카라이드(엔도톡신)로 시험관내 자극을 할 경우, 세포독성 인자가 방출된다는 것을 발표하였다. [참조 : Infect. Immun. , 30(2), 523 530(1980) and ibid. 38(1), 156-164(1981)].

TNF의 특성에 있어서, TNF는 각종 종양의 괴사를 유발하는 작용이외도, 동물종에 국한되지 않고 활성을 나타낸다. 예를들면 토끼 TNF가 새앙쥐 종양에 괴사를 유발할 수 있다는 것은 공지되어 있다. 더욱이, TNF는 시험관내에서, 정상 세포상에는 아무런 세포독성 영향을 끼치지 않으나 어떤 종류의 종양 세포 라인(예 : L-M 및 메트-A세포)에는 세포독성 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 상술한바와같이, TNF는 항종양 작용을 지니며, 동물종에 국한되지 않고 활성을 나타낼뿐만 아니라, 정상세포에는 아루런 해를 끼치지 않는다. 따라서, 항종양 약품으로서의 TNF의 임상 적용에 대한 기대가 이 기술분야에서 증가 되었다.

매우 소량의 TNF가 포유동물 또는 조직배양물내에서 유발된다는 것도 알려져 있다. 따라서, 항종양 약품으로서 TNF가 광범위하고도 안전하게 임상 적용이 가능하도록 하기 위해서는, 포유동물 또는 조직 배양물내에서 유발된 불순한 TNF를 분리하여 고도로 정제하는 것이 절대적으로 필요하다. 더욱이, 항종양 약품으로서 사용될 TNF를 대량 생산할 경우, 통상적으로는, 고도로 정제된 TNF를 장기간에 걸쳐 용액 또는 동결의 형태로 저장하거나, TNF용액을 동결건조시킬 필요가 있다. 그러나, 본 발명자들은 고도로 정제된 의 활성이 저장시, 동결시, 해동시 및 동결건조시에 현저하게 감소된다는 것을 알게 되었다.

본 발명자들이 알고 있는 바로는, 고도로 정제된 TNF의 안정성에 대한 연구 논문이 아직까지 발표되지 않았다. 이러한 상황 때문에 TNF가 유효한 항종양 약품으로서 알려지고 있음에도 불구하고, 특히 시판 규용으로서의 고도로 정제된 TNF를 충분하고도 안정성있게 공급하는 것은 불가능하다.

TNF의 안정성에 관련된 상술한 바와같은 단정을 해소하기 위해, 본 발명들은 광범위하고도 철저한 연구를 하였다. 이 결과, 놀라웁게도, 안정제로서 특수 단백질의 유효량을 TNF함유 수성용액 또는 분말에 첨가함으로써 활성이 상실됨이 없이 TNF의 장기간동안의 저장이 가능하며 동결시, 해동시, 동결건조등 에서도 TNF에 안정성이 부여된다는 것을 발견하게 되었다. 이러한 새로운 발견을 근거로하여, 본 발명자들은 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 TNF를 안정화시키는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 장기간 동안 그의 활성을 유지하며 동결, 해동, 동결건조시에 안정성을 갖는 안정한 TNF용액 또는 분말을 제공하는데 있다.

본 발명의 상기에 열거한 목적 및 기타 목적과 특징 및 잇점에 대해서는 하기의 상세한 설명관 특허청구범위와 함께 첨부된 도면으로부터 이 기술분야에서 통상의 지식음 가진 사람은 잘 이해할 수 있을 것이다.

본 발명의 한 태양에서, 알부민, 젤라틴, 글로불린, 프로타민 및 프로타민의 염 중에서 선택된 하나 이상의 안정제 유효량을 TNF함유의 수성용액 또는 분말에 첨가함을 특징으로 하는, TNF를 안정화시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 태양에서는, TNF 및 알부민, 젤라틴, 글로불린, 프로타민 및 프로타민의 염 중에서 선택된 하나 이상의 안정제 유효량을 함유하는 안정한 수성 용액 또는 분말을 제공한다.

본원 명세서에서 사용된 "TNF"란 말은 포유동물에 세망내피계 자극능을 가진 적어도 하나의 물질을 투여한후 그람-음성 박테리아에서 채취한 엔도톡신을 포유동물에 주사하거나 또는 그람-음성박테리아에서 채취한 엔도톡신을 포유동물에서 채취한 활성화된 대식세포를 함유한 조직 배양계에 함유한 조직 배양계에 첨가함으로써 유받되는 생리학적으로 활성을 갖는 물질을 나타낸 것이며, 이물질은 종양을 가진 포유동물에 수동적으로 이식될 경우 종양의 괴사를 유도하거나 또는 상기 생리학적으로 활성을 가진 물질이 특성과 유사한 성질을 가진 물질로서 어느 방법으로든지 생산할 수 있는 물질이다.

본 발명에서 사용되는 TNF는 마테우등의 방법[참조 : Br. J. Cancer, 42, 416 422(1980)] 및 그린등의 방법 [참조 : J. Natl Cancer Inst. , 59(5), 1519-1522(1977)]을 포함하며, 이기술분야에서 공지된 여러 방법으로 생산된다.

본 발명에서 사용하는 TNF를 제조하는 전형적인 방법은 다음과 같다.

첫번째로, 망상 내피계 자극능을 가진 적어도 하나의 물질을 포유동물(예 : 새앙쥐, 토끼, 기니아 피그등)에 정맥내 또는 복강내 주사한다. 세망내피계 자극능을 가진 물질로서, 일반적으로는 그람-음성 박테리아, 원생동물 또는 이스트가 사용되며, 생미생물, 죽은 미생물(예 : 열처리 또는 포르마린 처리후) 및 미생물 세포 추출물 상태에서 포유동물에 투여한다. 그람-음성 박테리아의 예를들면 프로피오니박테리아애크네 (Propionibacterium)(코리네 박테리아 파범(Corynebacterium parvum) 및 프로피오니 박테리아 그래눌로섬(Propionibacterium granulosum)(코리네 박테리아 그래눌로섬 Corynebacterium granulosum)과 같은 프로피오니 박테리(Propionibacteria)바실루스 칼메테 구애랑(BCG) 및 마이코 박테리아 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis)와 같은 마이코박테리아(Mycobacteria) 및 노카르디아에리트로폴리스(Nocardia erythropolis) 및 노카르디아 가드네리(Nocardia gardneri)와 같은 노카르디아스 (Nocardias)이다. 적합한 원생동물로서 예를들면 플라스모디움(Plasmodium) 또는 톡소플라스마(Toxoplasma)를 사용할 수 있다. 적합한 이스트로서는 일반적으로 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharcmyce)등에서 추출한 지모산(Zymosan)이 사용된다. 또한 피란 코폴리머와 같은 합성고분자 화합물을 사용할 수도 있다.

두번째로 망상내피계 자극성을 가진 상술한 물질을 투여한지 7내지 14일후에, 그람-음성 박테리아 예를 들면 에스케리키아 콜리(Escheichia coli); 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)에서 유도된 리포 폴리사카라이드에서 채취한 엔도톡신 또는 살모넬라 티포사(Salmonella typhosa)를 상기 동물에 정맥내 주사한다. 셌째로, 주사한지 1.5내지 2시간후, 상기 포유동물의 체액(예 : 복수, 림프등) 및/또는 혈청 또는 플라스마를 채취하거나 또는 간, 지라등과 같은 내부기관을 균질화시키고 생기 염수를 추출한다. 이들 체액, 혈청, 플라스마 및/또는 내부 기관의 추출물을 TNF의 불순한 용액으로서 사용할 수 있다.

상기에서 언급한 바와같이, 본 발명에서 사용되는 TNF를 제조하는 방법은 상기 방법으로 제한하는 것은 아니다. TNF-생산능을 가진 세포를 사용하는 유전 공학 및 조직 배양 방법을 기초로 하는 방법을 효율적으로 사용할 수도 있다. 이들 방법은 인체 TNF의 생산에도 잘 적용할 수 있는 것으로 주지되어 있다.

상기에 기술한 어느 방법으로나 제조된 불순한 TNF는 하기에 인용한 종래의 생화학적 방법 단독으로 또는 혼합 방법으로 정제하여 수성의 정제된 TNF용액을 얻을 수 있는데, 이 정제된 TNF용액을 동결건조하여 정제된 TNF분말로 얻을 수 있다. TNF를 정제하는 적합한 생화학적 방법은, 예를들면 황산 암모늄을 사용하는 염석법, 음이온 교환수지를 사용하는 이온 교환 크로마토그래피, 겔여과법 및 전기영동법을 들 수 있다.

TNF의 순도는 상기의 정제 방법을 사용함으로써 증가하기 때문에, TNF가 점차로 불안정하게 되는 것으로 알려져 있다. 예를들면, 특수 활성도가 200, 000단위/mg(특수 활성은 단백질 mg당 TNF활성 단위로서 표시하였으며, TNF활성단위는 하기에서 정의하였다)인 정제된 TNF시료는 실시예에 주어진 데이타에서 알 수 있는 바와같이, 매우 불안정하다. 500, 000단위/mg이하의 특수 활성도를 갖는 TNF시료의 경우에도 이들을 저장시, 또는 동결, 해동, 동결건조 및 다른 조작을 할 경우, 각 활성이 어느정도 감소한다.

따라서, 본 발명은 고도로 정제하여 불안정하게 된 TNF를 안정화시키는 것에 관한 것이다. 본 발명에 따라 안정화시킬 TNF는 용액 또는 분말 어느 형태나 가능하다. 그러나, 안정화시킬 TNF는 용액 형태가 바람직하다.

본 발명에 따라 안정화시킬 TNF용액은 항상 pH 5내지 10을 갖는데, 안정화시킬 TNF용액에 사용하는 용매로는 적합한 완충액이 바람직하다. 적합한 완충액으로서, 예를들면, 인산염 완충액 및 트리스(하이드록시메틸)아미노 메틸-염산 완충액을 들 수 있다. 필요에 따라, 염화 나트륨 및 염화 칼륨과 같은 염을 TNF용액에 가한다. 예를들면, TNF용액을 주사용으로 사용할 경우, 등장성 용액이 제조되도록 TNF용액에 염을 가한다. 염의 첨가 목적은 상기에 언급한 것에 한정되는 것은 아니다. TNF용액내의 상기와 같은 염의 농도는 염의 첨가 목적에 따라 결정할 수 있다. 예를들면 극한 TNF용액을 주사용으로 사용할경우, 등장성 용액은 0.5M의 농도가 될때까지 염화나트륨을 첨가함으로써 TNF용액으로부터 제조된다.

본 발명의 방법에 따라, 알부민, 젤라틴, 글로불린, 프로타민 및 프로타민의 염 중에서 선택된 하나 이상의 안정제 유효량을 TNF함유 수성용액 또는 분말에 가한다.

적합한 알부민으로서 예를들면, 소, 말, 양, 염소, 닭 및 인간과 같은 각종동물에서 채취한 알부민을 언급할 수 있다. 적합한 알부민의 구체적인 예로서 소혈청 알부민, 인체 혈청 알부민, 계란알부민, 소 락트알부민 및 인체 락트알부민을 들 수 있다. TNF를 안정화시키는 능력에 있어서는 상술한 알부민 사이에 유의적인 차이가 없는 것으로 나타났다. 그러나, 주사용 제제에 사용되는 안정제로서는 인체 혈청 알부민이 가장 바람직하다.

적합한 젤라틴으로서, 예를들면 통상적 방법으로 제조된 정상 젤라틴 및 부분 가수 분해된 젤라틴을 들 수 있다. 젤라틴의 분자량은 문제가 되지 않는다. 그러나, 주사용 제제에 사용되는 안정제로서는 수용성부분 가수 분해된 젤라틴이 더욱 바람직하다. 부분 가수분해된 젤라틴은 파파인과 같은 단백분해 효소를 사용하여 젤라틴을 효소적 가수 분해시키거나 또는 젤라틴을 산-또는 알카리-촉매화 가수분해시켜 얻는다.

적합한 글로불린으로서는, 소, 말, 양, 염소 및 인체와 같은 각종 포유동물에서 채취한 혈청 글로불린 및 이의 유도체를 예로 들수 있다.

TNF를 안정화 시키는 능력에 있어서는 상기에 언급한 글로불린들 사이에 유의적 차이가 없는 것으로 나타났다. 그러나, 이들중, 출발 글로불린의 효소처리 또는 화학적 변형에 의해 수득된 감마 글로불린 및 이의 유도체가 더욱 바람직하다. 주사용 제제에 사용되는 안정제로서 인체 감마 글로불린 및 이의 유도체 예를들면 플라스민-또는 펩신-처리 인체 감마글로불린 및 설폰화 인체 감마 글로불린이 더욱 바람직하다.

적합한 프로타민으로서는, 연어, 청어 및 고등어와 같은 적합한 생선에서 채취한 프로타민을 예로 언급할 수 있다. 적합한 프로타민의 염으로는 프로타민의 염산염, 황산염 및 인산염을 예로들수 있다. TNF를 안정화시키는 능력에 있어서는, 상기 언급한 프로타민 및 이의 염들사이에 유의적인 차이는 없는 것으로 나타났다.

본 발명에서 사용되는 안정제는 단독으로 또는 혼합물로 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 안정제는 10²내지 10⁹단위/ml의 TNF활성(활성단위는 이후에 정의 하였다)을 갖는 TNF용액 ml당, 약 1㎍ 또는 2이상, 바람직하기는 10㎍ 또는 그이상, 특히 바람직 하기는 100㎍ 또는 그 이상의 양을 첨가한다. 안정제의 상한량은 통상적으로 안정제의 용해도 및 생성된 용액의 정도를 고려하여, 또한 경제적 견지에서 결정된다. 안정제의 상한량은 일반적으로, TNF용액 ml당 50mg, 바람직하기는 10mg이다. 안정화시킬 TNF가 분말형태일 경우, 안정제는 수용액을 유도할 수 있을 정도의 양, 즉 상술한 농도의 안정제를 가하는데, 이 수용액은 활성도가 10²내지 10⁹단위/ml이 되도록 분말상의 TNF를 용해함으로써 수득된다.

안정제의 첨가 방식은 별문제가 되지 않는다. 예를들면, 분말 형태의 안정제를 TNF 용액에 직접가 할 수 있다. 이와 달리, 분말의 안정제를 물 또는 적합한 완충액에 용해한다음 TNF 용액에 가할 수 있다.

또다른 방식에서는, 분말의 안정제를 TNF 분말과 혼합할 수 있다. 안정제의 첨가는 약학적 제제의 제조단계 또는 정제 단계 어느때나 수행할 수 있다. 2종 이상의 안정제를 사용할 경우, 이의 총량의 상술한 범위내의 양이 될수있는 양을 첨가한다.

저장 및 TNF 용액으로 부터 약학적 제제의 제조 및 정제에 있어서 본 발명에 따라 사용되는 안정제를 혼입하고, 용액 형태일 경우, 0내지 30℃ 더욱 바람직하기는 0내지 10℃의 온도에서 수행하는 것이 바람직하다. TNF용액을 동결 형태로 저장할 경우는, 저장 온도를 0℃이하, 더욱 바람직하기는 -20℃이하로 유지 시키는 것이 바람직하다.

본 발명에 따라, 하나 이상의 안정제 유효량이 혼입된 TNF용액은 용액 형태 또는 동결 형태 어느형태로든지 저장동안, 또는 약학적 제제의 정제단계 및 제조단계 동안 이의 TNF활성을 유지한다.

더욱이, 본 발명에 따라, TNF를 안정화 시키는 방법은 동결건조에 적용할 수 있다. 상세히 말하자면, TNF 용액(특히, 고도로 정제된 TNF의 경우)을 동결건조시킬 경우 이의 활성은 일반적으로 현저하게 떨어진다. 그러나, 본 발명에 따라, 하나 이상의 안정제 유효량을 함유하는 TNF 용액은 이의 활성을 상실함이 없이 동결건조시켜 TNF분말을 얻을 수 있다. TNF 분말은 용해하여 안정한 수성 TNF 용액을 얻을 수 있는데, 여기에서 안정제 및 TNF의 농도는 상술한 범위내에서 포함되는 농도이다. 본 발명에서 정의된 바와 같은 안정제는, 이와달리, 동결건조된 TNF제제내에 혼입시킬 수 있다. TNF를 분말 형태로 저장할 경우, 저장 온도는 25℃ 또는 그 이하에서 유지시키는 것이 바람직하다.

TNF의 활성을 분석하는데는, 통상적으로 두가지 방법, 예를들면 종양 괴사 효과를 생체내에서 측정하는 생체내 방법 및 종양세포에 미치는 세포독소 효과를 시험관내에서 측정하는 시험관내 방법을 사용한다.

생체내 방법으로는, 예를들면 카스웰등의 방법 [참조 : Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 72(9), 3666-3670(1975)]을 들 수 있다. 이방법에 따라 BALB/C 육종 Meth A 세포(2×10⁵세포)를 각(BABL/C×C 57 BL/6) F 새앙쥐의 겨드랑이 피내 이식한 다음 7일후, 직경 7내지 8mm의 종양을 가진 새앙쥐에 이식하고 우수한 맥관 및 자생이 아닌 중심부 괴사를 평가용으로 선택한다. 생리 염수로 희석한 TNF시료(0.5ml)를 각 새앙쥐의 꼬리 정맥을 통해 주사한다. TNF시료의 활성도를 24시간후 다음과 같은 평가 기준에 따라 측정한다.

( - ) : 변화무

( + ) : 약간 출혈성 괴사

( ++ ) : 중정도의 출혈성 괴사(종양 표면의 약 50%에 걸쳐 확장된 중심부 괴사)

( +++ ) : 현저한 출혈성 괴사(종양 말초를 따라 나타난 조그만 테를 가진 괴상 괴사) TNF활성을 분석하기 위해 사용되는 시험관내 방법으로는 루프 등의 방법 [참조 : Lymphokines, vol. 2, edited by E, Pick, Academic Press, N. Y. , 245-248(1980)] 및 쿨등의 방법 [참조 : J. Immunol. , 126(4), 1279-1283(1981)]을 예로 들 수 있다.

본 발명자들이 TNF활성 분석에 사용한 시험관내 시험 방법은 상술한 종래 방법을 개발한 것이다. 본 발명자들의 시험관내 시험에서, L-M세포(American Type Culture Collection CCL 1.2)에 대한 TNF의 세포독성 작용의 측정은 다음과 같이 수행하였다. 배양 용기로서는 시판용(Flow Laboratories, Inc. U.S.A.에서 제조) 96-웰 마이크로타이터 판을 사용하고, L-M세포는 가열-불활성화된 송아지 태아혈청 10v/v%를 함유시킨 이글의 최소 필수 배지 [참조 : Science, 130, 432-437(1959)]에 배양시킨다. 배지로 연속적으로 희석한 TNF시료 0.1ml 및 L-M세포 현탁액(0.1ml, 1×10⁴세포)을 판의 각 웰에서 혼합하고 판을 5%이산화탄소 함유 공기중에서 48시간동안 37℃에서 배양시킨다. 배양기간 말기에, 글루타르알데히드의 20% 수용액(20μl)을 가하여 세포를 고정시킨다. 고정화후, 판을 증류수로 세척하고 방치하여 건조시킨다음, 0.05% 메틸렌 청(0.1ml)을 가하여 생세포를 염색시킨다. 판을 증류수로 철저히 세척하여 과잉의 염료를 제거한 다음 방치하여 건조시킨다. 3% 염산(0.2ml)을 각 웰에 가하여 염색된 세포로부터 염료를 추출한다. 665nm에서의 각 웰의 흡광도를 측정한다 [Flow Laboratories. Inc. 제품의 Titertek Multiskan 사용] 흡광도는 생 세포 수에 비례한다. TNF 활성도, 단위(u)/ml, 는 50%세포독성을 유발하는 TNF의 상반 희석으로서 정의하며 그래프사의 흡광도 대 희석을 플롯팅하여 수득할 수 있다.

본원에서 사용한, 시험관내 시험방법에 따라 분석된 모든 TNF의 활성도는 상기의 정의된 단위로써 나타내었다.

본 발명의 방법에 따라, 임상적 적용이 가능한 효과적인 항종양 약품이 될 고도로 정제된 TNF의 공업적 규모의 충분하고도 안정된 공급이 가능한데, 그 이유는 본 발명의 방법에서 TNF의 활성이 용액, 등결괴 형태 또는 동결건조된 제제 여하간에, 저장기간 동안 및 약학적 제제의 정제 및 제조단계 동안 유지되기 때문이다. 인체 혈청 알부민, 젤라틴, 인체 감마 글로불린, 인체감마 글로부린의 유도체, 프로타민 및 프로타민의 염중에서 선택된 하나 이사의 안정제를 혼입시킨 TNF용액 또는 분말을 인체에 안전하게 투여할 수 있기 때문에 본 발명의 신규 조성물은 TNF를 항종양 약품으로서 임상적으로 적용할 경우에 특히 유효하다는 것을 알게 되었다.

본 발명은 다음 참고 실시예, 실시예 및 대조 실시예로 더욱 상세히 설명하였으며 본 발명의 범위를 이로써 제한하지는 않는다.

실시예에서 사용된 약어

다음 실시예에서, 안정제의 명칭을 다음과 같이 약칭하였다.

HSA : 인체 혈청 알부민

BSA : 소 혈청 알부민

PHG-1 : 젤라틴의 알카리-촉매화 가수분해에 의해 수득된 부분 가수분해된 젤라틴(평균 분자량 : 약 7, 000)

HGG : 인체 감마 글로불린

SPS : 연어 프로타민 황산염

HPS : 청어 프로타민 황산염

BCG : 소 감마글로불린

CEA : 계란 알부민

BLA : 소 α-락트알부민

PHG-2 : 젤라틴의 산-촉매화 가수분해에 의해 수득된 부분가수분해된 젤라틴(평균 분자량 : 약 7, 000)

PHG-3 : 저 겔 강도를 갖는 부분 가수분해된 젤라틴

PG : 정제된 젤라틴

SPG : 연어 프로타민(유리 염기)

SPP : 연어 프로타민 인산염

EDTA : 에틸렌디아민 테트라아세트산

[참고 실시예]

2내지 3kg중량의 암토끼를 프로피오니박테리아아크네(코리네박테리아파범 ; Welcome Research Labories, England)의 포르말린으로 사멸시킨 세포 75mg으로 각기 정맥주사한다. 8일후에 100 의 엔도톡신(스케리키아 콜리 026 : B6에서 채취한 리포폴리사카라이드, 미합중국 Difco Laboratories사 제품)으로 토끼에 각기 정맥내 주사한다. 엔도톡신주사한지 2시간후에 심장천공에 의해 각 토끼로 부터 혈액을 채취하고 얻어진 혈액을 소량의 헤파린과 혼합한다. 혈액을 3, 000rpm에서 15분간 원심분리시킨다. 2, 500u/ml의 TNF활성도를 갖는 플라스마를 수득한다.

수득된 TNF를 함유하는 플라스마(10ℓ)를 5ℓ 의 0.03M 인산염 완충액(pH 7.8)로 희석하고 희석된플라스마를 0.13M NaCl이 함유되어 있는 0.03M 인산염 완충액(pH 7.8)으로 평형화시킨 DEAE-세팔로스 CL-6B (스웨덴 소재의 Pharmacia Fine Chemical AB사 시판품)컬럼에 통과시킨다. 컬럼을 0.13M NaCl이 함유되어 있는 2.5ℓ의 0.03M 인산염 완충액(pH 7.8)로 세척하고 흡착된 TNF를 0.15M NaCl이 함유되어 있는 0.03M 인산염 완충액(pH 7.8)과 0.03M NaCl이 함유되어 있는 5.0ℓ 의 0.03M 인산염 완충액(pH 7.8)으로 이루어진 NaCl 선형구배로 용출시킨다. 유출속도는 230ml/시간으로 하고 획분들을 45ml씩 수집한다. TNF활성은 0.20내지 0.24M NaCl로 용출시킨 획분에서 발견되었다. TNF 활성을 지닌 획분들을 모으고 0.13M NaCl이 함유되어 있는 0.03M 트리스-HCl 완충액(pH 7.2)에 대해 철야투척시킨다.

투석된 TNF 용액을, 0.03M NaCl로 평형화시킨 DEAE-세팔로스 CL-68컬럼(3.0 30cm)상에서 다시 크로마토그라피한다. 흡착된 TNF를 500ml의 평형완충액과 0.3M NaCl이 함유되어 있는 500ml의 0.03M 트리스-HCl 완충액(pH 7.8)으로 이루어진 NaCl선형구배로 용출시킨다. 유출속도는 40ml/시간으로 하고 획분을 10ml씩 수집한다. TNF활성을 지닌 획분들을 모아 농축시킨다.

농축물을, 0.15M NaCl이 함유되어 있는 5mM 인산염 완충액(pH 7.0)으로 평형화시킨 세파크릴 S-200컬럼(Pharmacia 사시판품)을 통해 겔-여과시키고 평형 완충액으로 용출시킨다. 유출속도는 80ml/시간으로 하고 획분을 13ml씩 수직한다. TNF활성을 지닌 획분들을 모아 한외 여과시킨다.

수득된 TNF용액으 특수 활성도가 5.0×10⁵u/mg-프로테인이며 순도가 플라스마순도의 10, 000배 임이 밝혀졌다.

수득된 TNF용액을, 동일 완충액을 사용한 동일컬럼(세파크릴 S-200) 상에서 다시 크로마토그라피하여 특수 활성도가 1.0×10⁶u/mg-단백질인 TNF용액을 수득한다.

[실시예 1]

참고실시예에 기술된 바와 같은 방법으로 수득된, 특수 활성도가 5.0×10⁵um/g인 토끼 TNF를 0.15M염화나트륨이 함유되어 있는 0.1M 인산염 완충용액(pH 7.0)으로 희석시켜 TNF활성도가 1,200 u/ml인 TNF 용액을 얻는다. 수득된 TNF 용액의 분취액에 HSA(인체 혈청 알부민), BSA(소혈청 알부민), PHG-1(부분적으로 가수분해된 젤라틴), HGG(인체 감마 글로부린) 및 SPS(연어단백질 황산염)을 안정제로서 각각 첨가하여 농도 0.1mg/ml와 농도 1.0mg/ml의 각각 서로 다른 두가지 용액을 형성시킨다.

생성된 용액 각각에 대해, 잔류활성을 다음 3가지 시료에 대해 측정한다 ; i) 각각 4℃에서 2일, 7일및 30일간 저장한 시료 , ii) 각각 동결(-70℃) 및 해동을 1회 및 3회 실시한 시료 및 iii) -70℃에서 동결시키고 동결건조시킨후 -25℃에서 7일간 저장한 시료. 상기 시험을 수행함에 있어서, 안정제가 첨가되지 않은 TNF용액을 대조용으로 사용한다. 동결건조된 제제 [상기 iii) 참조]는 멸균수에 녹이고 TNF활성을 분석한다.

잔류활성을 측정하기 위하여, 각 시료의 활성을 상술한 방법에 따라 시험관내 또는 생체내시 험으로 분석한다. 시험관내 시험방법에서, 잔류활성(%)은 다음과 같은 반응식에 따른 분석치로 부터 계산한다.

잔류활성(%)=

상기식에서

A는 저장 또는 물리적처리후 시료의 TNF 활성이고 B는 저장 또는 물리적 처리전 시료의 TNF활성이다. 생체내 시험에서는, 각 시료용액을, Mini-Module NM-3(일본국소재의 Asahi Chemical Industry Co. LTD 사의 시판품인 환외여과기의 상품명)를 사용하여 여과시켜 초기농도 20배의 농도로 만든다. 이어서 각각의, 농축된 TNF용액 0.5ml를 꼬리정맥을 통해 5마리의 종양을 앓고 있는 마우스 각 그룹에 주사한다. 24시간후 상술한 기준에 따라 TNF활성을 측정한다. 결과는 다음 표 1과 같다.

[표 1]

HSA, BSA, PHG-1, HGG 및 SPS의 안정화 효과

주 : " 시험관내"로 표시한 난의 숫자는 상기에서 정의된 바와 같은 잔류활성을 나타낸 것이다. "생체내"로 표시한 난의 숫자는 쥐의 수효를 나타낸 것이다. 기호(-,+, ++등)의 의미는 상기에서 주어진 바와 같다.

HSA : 시판품(Sigma Chem ical Co., U.S.A)

BSA : 시판품(Armour Pharmaceutical Co., U.S.A)

PHG-1 : 시판품(Nippi Co., Ltd., Japan(High grade gelatin)

HGG : 시판품(Nutritional Biochemicals Corp, U.S.A)

SPS : 시판품(Sigma Chemical Co., U.S.A)

[실시예 2]

실시예1에서 사용한 바와 같은 동일한 TNF활성을 갖는 TNF 용액의 분취액에 HSA, PHG-1, HGG 및 SPS(이들 단백질은 실시예 1에서 사용된 단백질과 동일하다)를 농도를 달리하며 안정제로서 각기 첨가한다. 생성된 각 용액은 4℃에서 7일간 저장한 다음 시험관내 시험방법에 따라 TNF활성에 대한 분석을 한다. 잔류 TNF 활성율(%)은 실시예 1에서와 동일한 방법으로 계산한다. 얻어진 결과를 도면 1내지 4에 나타내었다.

[실시예 3]

참고 실시예에 기술된 방법에 따라 수득된 특수 활성도가 1.0×10⁶μ/mg인 토끼 TNF를 0.15M 염화나트륨 함유 0.1M 인산염 완충액(pH 7.0)으로 희석하여 TNF활성도가 1,000μ/ml인 TNF수용액을 수득한다. 얻어진 TNF용액의 분취액에 알부민, 글로불린, 프로타민 및 젤라틴중에서 선택한 2종의 다른 안정제를 표2에 기술된 바와 같은 여러농도로 하여 가한다. 생성된 각 용성을 4℃에서 7일간 저장하고 시험관내 시험방액에 따라 TNF활성에 대한 분석을 한다. 잔류 TNF 활법(%)은 실시예 1에서와 같은 방법으로 계산한다. 결과는 표 2와 같다.

[표 2]

여러 안정제의 안정화 효과

주 : BSA, HSA, PHG-1, HGG 및 SPS로서, 실시예 1에서 사용된 것과 동일한 물질을 사용한다.

HPS : 시판품(Sigma Chemical Co., 제품)

BGG : 시판품(Sigm a Chemical Co., 제품)

CEA : 시판품(Nutritional Biochemicals Corp, 제품)

[실시예 4]

실시에 3에서 사용된 것과 같은 동일한 활성을 갖는 TNF 용액의 분취액에 표3에 기술된 각종 알부민을 안정제로서 생성된 용액의 농도가 1.0mg/ml로 될수 있는 양을 각기 첨가한다. 생성된 각 용액을 4℃에서 7일간 저장하고 시험관내 시험방법에 따라 TNF활성에 대한 분석을 한다. 잔류활성(%)은 실시예 1에서와 동일한 방법으로 계산한다. 결과는 표 3과 같다.

[표 3]

각종 알부민의 안정화 효과

주 : HSA, BSA, 및 CEA로서, 실시예 1 및 3에서 사용된 것과 동일한 물질을 사용한다. HSA획분 : 인체 혈청 알부민 획분(Cohn fraction v, Sigma Chemical Co. 제품)

BSA획분 : 소혈청 알부민 획분(Cohn fraction v, Sigma Chemical Co. 제품).

BLA : 시그마 케미칼 캄파니 제품.

[실시예 5]

실시에 3에서 사용된 것과 동일한 TNF활성을 갖는 TNF용액의 분취액에 표 4에서 기술된 바와 같은 각종 젤라틴을 생성된 용액의 농도가 1.0mg/ml로 될수 있는 양을 안정제로서 각기 첨가한다. 생성된 각 용액을 4℃에서 7일간 저장한 다음 시험관내 시험방법에 따라 TNF활성에 대한 분석을 한다. 잔류 TNF활성(%)은 실시예 1에서와 동일한 방법으로 계산한다. 결과는 표 4와 같다.

[표 4]

각종 젤라틴의 안정화 효과

주 : PHG-1로서 실시예 1에서 사용된 것과 동일한 물질을 사용하였다.

PHG-2 : 시판품(Nippi Co., Ltd 제품)

PHG-3 : 시판품(Gelatin Type IV : Approx. 60 Bloom; Sigma Chemical Co., 제품)

PG : 시판품(Japan, Nakari Chemicals Co., Ltd, 제품).

[실시예 6]

실시예 3에서 사용된 것과 같은 TNF활성을 가진 TNF용액의 분취액에 표 5에 표시된 여러가지글로불린을 생성된 용액이 1.0mg/ml의 농도를 가질 수 있는 양만큼 안정제로서 각각 가한다. 각각의 생성된 용액은 4℃에서 7일동안 저장하고 시험관내 분석방법에 따라 TNF 활성을 분석한다. 잔류 TNF활성(%)은 실시예 1에서와 같은 방법으로 계산한다. 얻어진 결과는 표 5와 같다.

[표 5]

여러가지 글로불린의 안정화 효과

주 : HGG와 BGG로서, 실시예 1과 3에서 사용된 것과 같은 동일물질을 사용하였다. 플라즈민-처리 HGG : 베노글로불린(상품명) (일본의 The Green Cross Corporation 제품)

펩신-처리 HGG : 감마-베닌(상품명)(Hoechst Japan Ltd제품)

설폰화된 HGG : 베닐론(상품명)

(일본의 Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute 제품)

HGG획분 : 인체 감마글로불린 획분(Cohn fration Ⅱ, Sigma Chemical Co. 제품).

[실시예 7]

실시예 3에서 사용된 것과 같은 TNF활성을 가진 TNF 용액의 분취액에 표 6에 표시된 각종프로타민을 생성된 용액이 1.0mg/ml 4℃의 농도를 가질 수 있는 양만큼 안정제로서 각각 가한다. 각각의 생성된 용액은 4℃에서 7일동안 저장하고, 시험관내분석방법에 따라 TNF활성을 분석한다. 잔류 TNF 활성(%)은 실시예 1에서와 같은 방법으로계산한다. 얻어진 결과는 표 6과 같다.

[표 6]

각종 프로타민의 안정화 효과

주 : SPS 및 HPS로서, 실시예 1 및 3에서 사용된 것과 같은 동일물질을 사용하였다.

SPF : 시판품(Sigma Chemical Co.의 제품)

SPP : 시판품(Sigma Chemical Co.의 제품)

[실시예 8]

참고예에 기술된 방법에 따라 수득한, 특수 활성도 1.0×10⁶u/mg인 토끼의 TNF를 0.15M 염화나트륨을 함유 0.1N 인산완충액(pH 7.0)으로 희석시켜 각기 100U/ml, 1,000U/ml, 10,000U/ml, 및 100,000U/ml의 TNF활성을 갖는 TNF 용액을 제조한다. 제조된 TNF 용액의 각 분취액에, HSA를 생성된 용액이 1.0mg/ml의 농도를 가질 수 있는 양만큼 가한다. 각각의 생성된 TNF 용액을 4℃에서 7일동안 저장하고, 시험관내분석방법에 따라 TNF 활성을 분석한다. 잔류 TNF 활성(%)은 실시예 1에서와 같은 방법으로 계산한다. 대조로서 HSA를 혼입하지 않은 각 TNF 용액의 다른 분취액도 TNF 활성을 분석한다.

얻어진 결과는 표 7과 각다.

[표 7]

HSA의 안정화 효과

[숫자는 잔류 TNF 활성(%)을 나타낸 것이다]

[비교 실시예]

실시예 1에서 사용된 것과 같은 TNF 활성을 가진 TNF 용액의 분취액에, 표8에 표시된 각종 아미노산, 금속염 및 켈레이트화제(이들 시약은 통상생리학적으로 활성을 가진 물질의 용액에 사용되는 안정화제로 공지되어 있다)를 농도를 달리하여 각각 가한다. 각각의 생성된 용액은 4℃에서 7일동안 저장하고, 시험관내 분석방법에 따라 TNF 활성을 분석한다. 잔류 TNF 활성(%)은 실시예 1에서와 같은 방법으로 계산한다.

얻어진 결과는 표 8과 같다.

[표 8]

각종 안정화제의 안정화 효과에 대한 비교

주 : HSA, PHG-1, HGG 및 SPS로서, 실시예 1에서 사용된 것과 같은 동일물질을 사용하였다.

Claims (10)

1. 종양 괴사 인자 함유 수용액 또는 분말에 알부민, 제라틴, 글로불린, 프로타민 및 프로타민의 염중에서 선택된 하나 이상의 안정제 유효량을 첨가함을 특징으로 하는, 종양 괴사 인자 안정화 방법.
2. 제1항에 있어서, 안정제가 알부민인 방법.
3. 제2항에 있어서, 알부민이 인체 혈청알부민인 방법.
4. 제1항에 있어서, 안정제가 젤라틴인 방법.
5. 제4항에 있어서, 젤라틴이 수용성 부분 가수분해된 젤라틴 방법.
6. 제1항에 있어서, 안정제가 글로불린인 방법.
7. 제6항에 있어서, 글로불린이 인체 감마글로불린 또는 이의 유도체인 방법.
8. 제1항에 있어서, 안정제가 프로타민 또는 프로타민의 염인방법.
9. 제1항에 있어서, 안정제를 TNF활성도가 10²내지 10⁹단위/ml인 종양괴사 인자함유 수용액 ml당 약 10㎍내지 50mg의 양으로 첨가하는 방법.
10. 제1항에 있어서, 안정제를 TNF활성도가 10²내지 10⁹단위/ml인 종양 괴사 인자함유 수용액 ml당 약 100㎍내지 10mg의 양으로 첨가하는 방법.

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