KR102354103B1

KR102354103B1 - Plp-의존성 효소 및 이의 보조인자를 캡슐화하는 적혈구를 포함하는 약학적 조성물

Info

Publication number: KR102354103B1
Application number: KR1020167022067A
Authority: KR
Inventors: 얀 고드프린; 바네사 부르주옥스; 파비앙 게이; 토마스 코르테스
Original assignee: 에리테끄 파르마
Priority date: 2014-02-12
Filing date: 2015-02-12
Publication date: 2022-01-24
Also published as: AU2015217045B2; US10780126B2; RU2019123935A3; ES2808849T3; US10046009B2; WO2015121348A2; CN111358941B; WO2015121348A3; MX2016010235A; IL246941B; JO3522B1; JP2017506260A; US20210008114A1; EP3104875B1; RU2019123935A; RU2744659C2; US20180344771A1; BR112016017337A2; SG10201907367QA; CN106255506B

Abstract

본 발명은 PLP-의존성 효소(PLP-dependent enzyme), 및 선택적으로 이의 보조인자(cofactor), 피리독살 포스페이트(PLP), 및/또는 PLP의 포스페이트 또는 비-포스페이트 전구체(precursor)를 함유하는 약학적 조성물, 약물로서 이의 용도, 이의 제조 방법 및 이에 관한 치료학적 치료 방법에 관한 것이다. 약학적 조성물은 PLP-의존성 효소를 캡슐화하는 적혈구 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함한다. PLP-의존성 효소는 메티오닌아제, 티로신 페놀-리아제, 티로신 아미노트랜스퍼라제 또는 시스타티오닌 베타-신타아제일 수 있다.

Description

PLP-의존성 효소 및 이의 보조인자를 캡슐화하는 적혈구를 포함하는 약학적 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING ERYTHROCYTES ENCAPSULATING A PLP-DEPENDENT ENZYME AND ITS COFACTOR}

본 발명은 PLP-의존성 효소(PLP-dependent enzyme), 예를 들면, 메티오닌아제(methioninase), 및 선택적으로 이의 보조인자(cofactor), 피리독살 포스페이트(pyridoxal phosphate) (PLP 또는 P5P), 및/또는 PLP의 포스페이트 또는 비-포스페이트 전구체(phosphate or non-phosphate precursor of PLP)를 함유하는 약학적 조성물, 약물로서 이의 용도, 이의 제조 방법 및 이에 관한 치료학적 치료 방법(therapeutic treatment method)에 관한 것이다.

비타민 B6의 유도체인 피리독살 포스페이트(pyridoxal phosphate: PLP)는 다양한 많은 효소에 대해 사용되는 보조인자(cofactor)이다. PLP-의존성 효소에 대하여 본원에 "PLP 효소"로 언급되는 효소들은 이들 중 대부분이 아미노산 변형을 위한 대사 경로와 관련된 약 145가지의 별개의 효소의 그룹을 형성한다. 이들 효소에 의해 촉매화된 반응은 탈카르복실화(decarboxylation), 트랜스아민화(transamination)를 포함하고, 추가로 제거 반응(removal reaction)을 포함한다 (문헌 참조: Percudani and Perrachi, EMBO reports Vol. 4 no. 9, 2003).

PLP 효소 및 후자의 효소에 의해 촉매화된 반응의 그룹에 속해있는 많은 수의 효소들로 인하여, 인간의 치료제에서 이를 잠재적으로 사용하는 것이 조사되어 왔다. PLP 효소와 관련된 치료학적 개입에 대한 서로 다른 기회들로부터, 암 및 심혈관 병변(cardiovascular pathology)의 치료에 있어서 이들 효소의 용도는 다수의 연구의 주제가 되어 왔다(문헌 참조: 엘-사이드(El-Sayed) 및 신디아(Shindia) "유전자 치료에서의 타겟(Targets in gene therapy)" Prof. Yongping You ed., 2011). 보다 상세하게는, 메티오닌아제(methioninase)는 혈장 메티오닌(plasma methionine)을 소모(deplete)시키고 이러한 아미노산에 대한 영양요구성 종양 세포(auxotrophic tumoral cell)의 세포사멸(apoptosis)를 유도하는 데에 유리하다. 많은 인간 종양 세포는, 정상 세포가 배지에서 증식하는 능력을 가지는 반면에 메티오닌이 메티오닌 전구체 호모시스테인(homocysteine)으로 대체되는 경우, 증식 능력을 가질 수 없다고 알려져 있다. 메티오닌에 대한 의존성(dependency)은 유방암, 폐암, 결장암, 신장암, 방광암, 흑색종(melanoma) 및 아교모세포종(glioblastoma)으로부터 유래된 세포주(cell lines)에 대해서 현저하게 관찰되었다 (문헌 참조: 두란도(Durando) 등, Bull Cancer 2008; 95 (1): 69-76).

PLP 효소의 치료학적 장점에도 불구하고, 이들 효소의 전신 경로를 통한 투여를 기초로 하여 치료를 개발하는 것은 상당한 제한점에 직면해 있다:

- PLP 효소는 주로 원핵 유기체(prokaryotic organisms)로부터 수득되고, 이에 따라서 인간에게 투여되는 경우 강한 면역원성(immunogenic)을 나타낸다.

- 혈장 내 반감기가 짧으며, 충분한 활성을 수득할 수 있도록 빈번한 투여 또는 고용량을 요구한다.

- 혈장 내 PLP 보조인자의 낮은 생체이용률은 투여 후 급격한 활성 저하를 야기한다.

이러한 제한은 메티오닌아제의 경우에 광범위하게 기재되어 있다. 선(Sun) 등은 슈도모나스 푸티다 박테리아(Pseudomonas putida bacterium)로부터 추출된 효소를 코딩하는 유전자로부터 대장균 박테리아(Escherichia coli bacterium)에서 재조합 메티오닌아제를 생산하였다. 이로써 수득된 효소는 rMETase로 불리며, 이를 면역 결핍 쥐(immunodeficient mouse)에게 정맥 주사하였다. 주사 24시간 후, PLP를 추가하지 않고 생체외(시험관)(in vitro)에서 측정된 효소의 혈장 활성은 측정불가하였으며, 이는 짧은 활성 기간임을 나타내었다 [문헌 참조: 선(Sun) 등, Cancer Research 63, 8377-8383, 2003].

1년 후, 동일한 연구팀이 마카크(macaque: 짧은 고리 원숭이)에서 rMETase의 투여 결과를 발표하였다(문헌 참조: 양 (Yang) 등, Clinical Cancer Research Vol. 10, 2131-2138, 2004). 본 연구에서, 1,000, 2,000 및 4,000 units/kg의 rMETase 용량이 6마리의 원숭이에게 정맥으로 투여되었다. 두번째 주사는 첫번째 주사 후 28일째에 수행하였으며, 2마리 원숭이 중에서 한 마리는 아나필락시스 쇼크(anaphylactic shock)에 기인하여 사멸하였다. 또한, rMETase의 면역원성은 치료된 동물 대다수(6마리 중 4마리)에 대하여 IgG 유형(다수) 및 IgM 유형의 항-rMETase 항체의 발전을 야기하였다. 이들 항체의 중화 특성(neutralizing nature)은 생체외에서 입증되었다.

이들의 메티오닌아제의 짧은 반감기 및 면역원성 제한을 극복하기 위해서, 같은 연구팀은 이의 효소의 페길화(pegylation)에 의존하는 방법을 제안하였다. PEG 그룹의 이식은 치료학적 단백질의 반감기를 증가시키고 면역원성을 감소시키기 위한 공지된 기술이다. PEG-rMETase를 수득하기 위해서 rMETase의 존재하에 활성화된 PEG 유도체를 넣었다. 이러한 효소의 수정은 자유 효소(free enzyme)에 대해서 2시간이던 반감기를 PEG-rMETase에 대해 38 시간 동안으로 쥐 내 반감기를 증가시켰다. 반감기의 이러한 확실한 증가는 면역원성의 감소를 동반한다(문헌 참조: 선(Sun) 등, Cancer Research 63, 8377-8383, 2003).

페길화가 반감기 및 면역원성의 문제를 부분적으로 충족시키는 경우, PLP 효소의 주요 문제가 남아있다: 혈장 내 보조인자의 낮은 생체 이용률(bioavailability). PLP 효소는 보조인자, PLP의 존재하에 촉매적으로 활성화되며, 이후 전효소(holoenzyme)라고 불린다. 주입 후, 전효소는 PLP 보조인자의 손실로 인하여 비활성 상태의 아포 효소(apoenzyme)로 빠르게 변환된다.

외래 방식(exogenous way)으로 가져온 PLP는 효소에 대해 빠르게 이용 가능하지 않은데, 자유 PLP의 혈장 반감기는 단지 약 15분이다. 이러한 현상은 PLP 효소의 경우에, 티로신 페놀-리아제(tyrosine phenol-lyase, TPL)을 정제시키고 정상 쥐에게 주입시켜 입증하였다(문헌 참조: 엘머(Elmer) 등, Cancer Research 38 ; 3663-3667, 1978). 주입 5시간 후, TPL의 활성을 분석하기 위하여 혈액 시료를 수득하였다. 본 활성 분석은 2가지 조건에 따라 수행하였다: 시료의 일부를 PLP를 가하지 않고 분석하고, 시료의 다른 일부를 본 검정의 반응 혼합물에 적정량의 PLP를 첨가하여 분석하였다(이들 2가지 조건은, PLP 보조인자에 대해 엑세스(access)한 경우 혈장 내 실제로 측정된 활성 및 효소의 잠재적 활성을 반영한다). 수득한 결과를 비교한 결과, TPL의 잠재적 활성의 7% 만이 혈장에서 실제로 측정되는 것으로 나타났다. 동일한 시험을 쥐 그룹에 수행하되, 여기서, TPL의 주입에 부수적으로, 다량의 PLP를 투여한 다음, 매시간 마다 PLP를 재투입하였다. 이러한 경우, 분석 결과를 비교한 결과, 37%의 잠재적 활성이 혈장에서 실제로 측정되는 것으로 나타났다. 따라서, PLP의 병용-투여(co-administration)는 혈장내 TPL의 활성을 제한된 방식으로 향상시키는 가능성을 제공하였다. 그러나, 외래 방식(exogenous way)으로 제공된 PLP는 TPL에 대해 빠르게 이용 가능하지 않은데, 자유 PLP의 혈장 반감기는 단지 약 15분이다. 따라서, 솔루션 내 PLP의 반복된 주입에 의한 혈장 수준의 PLP의 증가는 실현가능하지 않다. 엘머(Elmer) 등은 엉덩이에 근육 경로를 통해 주입된 경랍(spermaceti) 및 땅콩 기름으로 구성된 임플란트(implant)를 통해 시간이 경과함에 따라 연장된 방식의 PLP의 제공을 제안하였다. 그럼에도 불구하고, 이 솔루션은 확실한 것으로 밝혀지지 않았으며, 혈장에서 실제로 측정된 활성을 잠재적 활성(potential activity)의 25% 이상으로 재-설정(re-establish)하도록 처리하지 않으며, 흑색종 B-16 종양으로 이식된 쥐에서 TPL의 항-종양 효과를 통계학적으로 유의한 방식으로 향상시키지는 않는다. 메티오닌아제를 이용한 시험에서도 유사한 결과가 관찰되었다. 선(Sun) 등은 체외에서는 전효소 PLP-rMETase가 상대적으로 안정하지만, 생체 내에서는 이 복합체가 빠르게 해리되어 rMETase의 활성의 손실을 유도하는 것을 확인하였다(문헌 참조: Cancer Research 63, 8377-8383, 2003). 선(Sun) 등은 rMETase 뿐만 아니라 PEG-rMETase로 수득된 메티오닌 소모 기간(methionine depletion duration)이 PLP 펌프(PLP를 연속적으로 투여하는 펌프)의 주입을 통해 PLP 보충으로 향상될 수 있음을 추가로 보여준다. 그럼에도 불구하고, 이러한 연속 투여 장치는 변함없이 혈장 내 PLP의 낮은 생체 이용률의 문제에 직면할 것이다.

따라서, PLP 효소의 치료학적 잠재성은 많은 연구 작업의 주제였으며, 특히, 메티오닌아제를 파일럿 임상 시험을 수행하도록 유도하였으나, 이들 효소의 임상적 효율성을 입증할 수는 없었다.

이에 따라, PLP 효소의 치료학적 잠재성을 활용하기 위한 목적으로, 이들 효소를 최적의 이용가능한 양의 PLP의 존재하에 유지시키기 위한 솔루션을 갖는 것이 유리할 것이다.

적혈구 내 활성 성분의 혼합을 허용하는 다양한 방법이 기술되어 왔다. 이들 방법 중에서, 소위 용해-재실링(lysis-resealing) 기술은 가장 광범위하다. 이 기술은 3가지 대안인, 저장성 투석, 저장성 <<프리스웰링(preswelling)>> 및 저장성 희석을 포함하며, 이들 모두는 적혈구 내부 및 외부 사이의 삼투압 차에 기초한다. 이들 대안들은 일반적으로 다음 5가지 단계를 갖는다: 패킹(packing)된 적혈구 세포들을 생리학적 완충액으로 1회 이상 세척하고 원심분리 한 다음, 적혈구는, 적혈구 멤브레인 내 기공의 개구(opening)를 생성하는 저장성 액체 배지와 접촉시켜, 활성 성분은 적혈구로 들어가고, 기공은 고장성 완충액(hypertonic buffer)을 사용하여 폐쇄(<<재실링(resealed)>>)되며, 활성 성분을 적혈구 안으로 둘러싸고, 이후 마지막은 보존 용액에 현탁된다. 저장성 투석 기술은 가장 흥미로운 기술이며, 산업 발달의 대상이 되어 왔다. 유럽 특허 제1 773 452에 기재된 기술은 현 시점에서 가장 많이 수행되는 기술로 재현성(reproducible)을 가지며, 활성 성분의 캡슐화 비율(encapsulation rate)을 향상시키는 장점을 갖는다.

효소의 면역원성과 관련된 위험을 제한한다는 관점에서, 반감기를 연장시키는 적혈구 내 효소의 캡슐화는 과학 출판물의 대상이었던 연구 작업에서 이미 제안되었던 것이다. 효소, L-아스파라기나아제(L-asparaginase)의 캡슐화는 유럽 특허 제1 773 452에 기재되어 있으며, 아르기닌 디이미나아제(arginine deiminase)의 캡슐화도 유럽 특허 제1 874 341에 기재되어 있다.

이전 연구들은 보조인자를 요구하는 효소와 관련되지 않으며, PLP 효소 및 이의 PLP 보조 인자의 동역학(kinetic)과 관련된 복잡성을 해결하지 않는다.

본 발명의 목적은 PLP 효소를 함유하는 약학적 조성물을 제공하는 것으로, 효소의 면역원성과 관련된 위험을 제한하고, 효소의 반감기를 연장시키면서, 최적의 이용가능한 양의 PLP 보조인자의 존재하에 효소를 둔다.

따라서, 본 발명의 목적은 약학적으로 허용되는 부형제(pharmaceutically acceptable vehicle) 내 적혈구의 현탁액 및 PLP 효소를 캡슐화(encapsulate)하는 적혈구 및 약학적으로 허용되는 부형제을 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다. 이하, 이들은 현탁액 또는 약학적 조성물을 동등하게 나타내기 위하여 조성물로서 지칭될 것이다. <<캡슐화(encapsulating)>>는 활성 성분(효소 및 선택적으로 보조 인자 및/또는 기타 분자)이 기본적으로 또는 전체적으로 내부에 존재하는 것을 의미한다. <<기본적으로(Essentially)>>는 소수 비율의 활성 성분이 결국 멤브레인 내에 포획되어 발견될 수 있음을 의미한다.

조성물은 특히 적혈구 세포 ml 당 0.01 내지 30 mg, 바람직하게는 0.05 내지 10 mg의 PLP 효소를 함유한다.

제1 실시 예에 따르면, PLP 효소는 메티오닌아제로, 추가로는 그 중에서도 소위 L-메티오닌아제(L-methioninase), 메티오닌 감마 리아제 MGL(Methionine Gamma Lyase MGL), 번호 EC 4.4.1.11, CAS 번호 42616-25-1로 불리우는 것들이다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 메티오닌아제 공급원을 인식하기 위해서는 특히 문헌(참조: 엘 세이드 에이(El Sayed A), Applied Microbiol. Biotechnol. (2010) 86: 445-467)에 기재된 내용을 참고할 수 있다.

제2 실시 예에 따르면, PLP 효소는 티로신 페놀-리아제 또는 TPL, EC 4.1.99.2, CAS 9059-31-8이다. 문헌(참조: 에이취. 쿠마가이(H. Kumagai) 등, J. Biol. Chem. 245, 7: 1767-72 및 245, 7: 1773-7)을 참조할 수 있다.

제3 실시 예에 따르면, PLP 효소는 티로신 아미노트랜스퍼라제(tyrosine aminotransferase: hTATase), EC 2.6.1.5, CAS 9014-55-5이다. 문헌(참조: 알. 레튼마이어(R. Rettenmeier) 등, Nucleic Acids Res. 1990, 18, 13: 3583-61)을 참조할 수 있다.

제4 실시 예에 따르면, PLP 효소는 시스타티오닌 베타-합성효소(cystathionine beta-synthethase) 또는 신타아제(synthase), EC 4.2.1.22, CAS 9023-99-8이다. 문헌(참조: 제이 크라스 (J. Kraus) 등, J. Biol. Chem. 1978, 253, 18: 6523-8)을 참조할 수 있다.

본 조성물은 추가로 효소, 즉, PLP의 보조 인자 및/또는 이의 전구체를 추가로 포함할 수 있으며, 여기서, 전구체는 비타민 B6의 비-포스페이트 형태와 같은 비-포스페이트 전구체, 및/또는 피리독신 포스페이트(pyridoxine phosphate, PNP)와 같은 포스페이트 전구체일 수 있다.

비타민 B6은 포스페이트 또는 비-포스페이트 중의 하나로 다양한 형태로 존재한다. 피리독신 포스페이트(PNP), 피리독살 포스페이트(pyridoxal phosphate, PLP) 및 피리독사민 포스페이트(pyridoxamine phosphate, PMP)는 이의 포스페이트 형태들이다. 상응하는 비-포스페이트 형태는 피리독신(PN), 피리독살(PL), 및 피리독사민(PM)이다. 비타민 B6의 비-포스페이트 형태는 적혈구 멤브레인을 통과할 수 있으며, 포스페이트 형태만이 통과하는데 어려움을 가질 수 있다. 주된 경로(문헌 참조: 앤더슨(Anderson) 등 J. Clin. Invest. 1971, Vol. 50, 1901-1909)에 따르면, 피리독신(PN)은 PN-키나제의 영향으로 적혈구 내에서 PNP로 변환되고, PNP는 이후 PNP-옥시다제(oxidase)의 영향으로 PLP로 변환된다. 이후, PLP는 PLP-포스파타제(phosphatase)의 영향으로 피리독살(PL)로 변환될 수 있으며, PL은 적혈구에 남을 수 있다. 제공된 전구체는 조성물의 제조 방법 중에 또는 조성물의 저장 동안에 적혈구에서 변환을 수행할 수 있는 것으로 쉽게 이해된다.

비타민 B6의 비-포스페이트 형태는 본원에서는 비타민 B6의 3개 비타머(vitamer) 중의 하나, 또는 2개 또는 3개 비타머의 혼합물: PL, PN 및 PM을 의미할 것이다. PN 형태가 바람직하다. 이들은 또한 염의 형태일 수 있다.

조성물은 적혈구 내에서 캡슐화된 PLP를 포함한다. PLP는 캡슐화 과정 동안에 제공될 수 있거나, 또는 이의 전구체로부터 적혈구에 전체적으로 또는 부분적으로 수득될 수 있다. 존재하거나 형성된 PLP는 효소와 관련될 수 있다. 이에 따라, 조성물은 상응하는 전효소(holoenzyme), 예를 들면, 메티오닌아제-PLP를 포함할 수 있다. 이러한 조건 하에서, 예를 들면, 이의 기질의 혈장 소모 동안 관찰되는 바와 같이, 활성 효소의 반감기가 상당히 증가된다. 본 발명에 따른 조성물은 특히, 투여 후 24시간 이상, 특히, 1일, 5일, 10일 또는 15일 째에 또는 이 기간 후에도 효소 활성을 보존할 가능성을 제공한다. 효소 활성은 특히, 혈장 내 기질이 20, 30, 40 또는 50%를 초과하여 소모하는 것을 의미한다.

이에 따라, 하나의 실시 예에서, 조성물은 피리독살 포스페이트(PLP) 및/또는 비타민 B6의 비-포스페이트 형태 및/또는 포스페이트 전구체, 피리독신 포스페이트(PNP) 및/또는 피리독사민 포스페이트(PMP)를 포함한다.

하나의 특징에 따르면, PNP 및/또는 PMP는 조성물 내에 적혈구 내부로 캡슐화된다. 이 전구체는 효소와 공동-캡슐화될 수 있거나, 또는 자신의 전구체로부터 적혈구에 전체적으로 또는 부분적으로 수득될 수 있다.

조성물은 특히, 적혈구 세포의 리터(L) 당 캡슐화된 약 0.05 내지 약 600, 특히 약 0.5 내지 약 100, 바람직하게는 약 5 내지 약 50 μmole의 PLP 및/또는 PNP 및/또는 PMP를 포함한다.

하나의 특징에 따르면, 조성물은 PLP 효소 및 PLP를 캡슐화하는 적혈구를 포함하고, 추가로, 적혈구 내 캡슐화되고, 적혈구 내에 존재하거나 또는 적혈구 내부 및 외부에 존재하는 비-포스페이트 PLP 전구체를 포함한다. 이러한 비-포스페이트 전구체는 PN, PL 또는 PM, 바람직하게는 PN, 또는 이들 2개 또는 3개 화합물의 혼합물일 수 있다. 비-포스페이트 전구체는 적혈구 내부 및/또는 외부에 존재할 수 있다. 이러한 비-포스페이트 전구체의 존재는 비-포스페이트 전구체의 부재 하에서보다 현저히 높은 내부-적혈구 PLP 레벨에 도달할 가능성을 제공한다.

하나의 실시 예에서, 조성물은 PLP 효소, 및 이에 추가하여 PLP, 및 이의 포스페이트 전구체, PNP, PLP 및/또는 PMP 중의 하나를 캡슐화하는 적혈구를 포함한다. 상기 동일한 조성물은 유리하게는 기재된 바와 같이, 비-포스페이트 전구체, 특히, PN을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 바람직하게는 35%, 40% 또는 45%를 초과하거나 또는 동등한 헤마토크릿(hematocrit)을 갖는다.

하나의 실시 예에 따르면, 조성물은 동시 투여(simultaneous administration), 별도 투여(separate administration) 또는 순차적 투여(sequential administration)로, 한편으로는(on the one hand) PLP 효소, 예를 들면, 메티오닌아제, 및 다른 한편으로는(on the other hand) 비-포스페이트 형태의 비타민 B6, 바람직하게는 PN을 캡슐화하는 적혈구 및, 약학적으로 허용되는 부형제(vehicle)을 포함한다. 조성물은 특히 적혈구(현탁액) 및 비-포스페이트 형태, 바람직하게는 PN(용액)의 비타민 B6를 별개로 포함하는, 키트(kit)의 형태로 존재할 수 있다. 하나의 실시 예에서, 약학적으로 허용되는 부형제은 적혈구에 대한 <<보존 용액(preservation solution) >>으로, 즉, 활성 성분을 캡슐화하는 적혈구가 주입을 기다리는 동안 저장되는데 적합한 형태로 현탁되는 용액을 의미한다. 보존 용액은 바람직하게는 글루코스(glucose), 덱스트로스(dextrose), 아데닌(adenine) 및 만니톨(mannitol)로부터 특히 선택되는 적혈구의 보존을 촉진하는 하나 이상의 제제를 포함한다. 유리하게는, 보존 용액은 내부-적혈구 PLP-포스파타제 효소(intra-erythrocyte PLP-phosphatase enzyme)의 억제를 허용하는 무기 포스페이트(inorganic phosphate)를 함유한다.

보존 용액은 NaCl, 아데닌, 및 글루코스, 덱스트로스과 만니톨로부터의 하나 이상의 화합물을 포함하는 수용액일 수 있다. 하나의 특징에 따르면, 무기 포스페이트를 추가로 포함한다.

보존 용액은 NaCl, 아데닌 및 덱스트로스, 바람직하게는 AS3 배지(medium)를 포함할 수 있다. 하나의 특징에 따르면, 무기 포스페이트를 추가로 포함한다.

보존 용액은 NaCl, 아데닌, 글루코스 및 만니톨, 바람직하게는 SAG-만니톨 또는 ADsol 배지를 포함할 수 있다. 하나의 특징에 따르면, 무기 포스페이트를 추가로 포함한다.

특히, 보존 용액 내 조성물 또는 현탁액은 0.5 g/dl 이하, 특히, 0.3 g/dl 이하, 특히 0.2 g/dl 이하, 바람직하게는 0.15 g/dl 이하, 심지어 더 바람직하게는 0.1 g/dl의 수준에서 72시간으로 유지되고 2℃ 내지 8℃의 온도에서 보존되는 세포외 헤모글로빈(extracellular hemoglobin) 수준으로 특징지어진다.

특히, 보존 용액 내 조성물 또는 현탁액은 0.5 g/dl 이하, 특히, 0.3 g/dl 이하, 특히 0.2 g/dl 이하, 바람직하게는 0.15 g/dl 이하, 심지어 더 바람직하게는 0.1 g/dl의 수준에서 24시간 내지 20일 동안, 특히, 24 시간 내지 72 시간 유지되고 2℃ 내지 8℃의 온도에서 보존되는 세포외 헤모글로빈 수준으로 특징지어진다.

세포외 헤모글로빈 수준은 문헌(참조: G. B. Blakney and A. J. Dinwoodie, Clin. Biochem. 8, 96-102, 1975)에 기재된 매뉴얼 참조 방법으로 측정하는 것이 유리하다. 또한, 자동 장치(automatic devices)가 특이적인 감도로 측정될 수 있도록 존재한다.

특히, 조성물 또는 현탁액은 보존 용액에서, 2% 이하, 특히, 1.5% 이하, 바람직하게는 1% 이하로 72시간에서 유지되고, 2℃ 내지 8℃의 온도에서 보존된 용혈 비율(hemolysis rate)로 특징지어진다.

특히, 조성물 또는 현탁액은 2% 이하, 특히, 1.5% 이하, 바람직하게는 1% 이하의 수준에서 24시간 내지 20일 동안, 특히, 24시간 내지 72 시간 동안 유지되고 특히, 2℃ 내지 8℃의 온도에서 보존되는 용혈 비율로 특징지어진다.

특히, 현탁액의 헤마토크릿(hematocrit)은 35%, 40%, 45% 이상이다.

특정 방법에 따르면, 적혈구 내 비타민 B6의 대사작용은 PN-키나제(PN-kinase) 및 PNP-옥시다제(PNP-oxidase)의 내부-적혈구 수준을 증가시키고/증가시키거나 PLP-포스파타제(PLP-phosphatase)의 내부-적혈구 수준을 감소시킴으로써 내부-적혈구 PLP 농도를 증가시키도록 조정된다.

하나의 특징에 따르면, 조성물은, PLP 효소, 예를 들면, 메티오닌아제, 및 PLP 또는 이의 전구체에 추가로, PN-키나제 및/또는 PNP-옥시다제 및/또는 PLP-포스파타제를 억제하는 제제를 포함한다. 이들 효소 또는 제제는 적혈구에 캡슐화되어 발견될 수 있거나 또는 적혈구 외부 및 내부에서 발견될 수 있다.

이들 효소 또는 제제는 또한, 적혈구의 현탁액으로부터 분리하는 경우, 비-포스페이트 비타민 B6의 제형과 특히 혼합함으로써 별개로 투여될 수 있다.

이에 따라, 본 발명의 목적은 약물(drug)로서 사용하기 위한 이러한 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 특히, 이를 필요로 하는 환자에서 양호한 생체이용률(bioavailability) 조건 하에 PLP 효소 및 이의 보조인자를 제공하는 가능성이 있는 약물을 제공하는 것으로, 이는 효소 및 이의 보조인자가 서로 이용가능하며, 효소가 활성이고 치료학적 적용에서 효과적인 유효한 양임을 의미한다. 상기 약물은 특히, 효소의 기질의 혈장 또는 순환 농도 및/또는 기관에서의 농도를 소모 또는 감소시키는데 목표를 두고 있다.

제1 서브-목적에 따르면, 약물은 메티오닌아제를 포함하고, 이를 필요로 하는 환자에서 혈장 또는 순환 메티오닌의 소모 또는 감소를 허용한다. 약물은 항암 약물(anti-cancer drug)이며, 암, 특히, 메티오닌에 영양요구성인 종양 세포를 포함하는 암, 특히, 유방암, 폐암, 결장암, 신장암, 방광암, 흑색종(melanoma) 및 아교모세포종(glioblastoma)의 치료를 허용한다.

제2 서브-목적에 따르면, 약물은 메티오닌아제를 포함하고, 이를 필요로 하는 환자에서 혈장 또는 순환 또는 간 호모시스테인(plasmatic or circulating or hepatic homocysteine)의 소모 또는 감소를 허용한다. 약물은 안구 시스템(ocular system) 및/또는 골격의 중추 신경계의, 호모시스테인뇨증(homocysteinuria) 및/또는 고호모시스테인혈증(hyperhomocysteinemia) 및/또는 심혈관 질환(cardiovascular disease)과 같은 관련된 병변의 치료를 허용한다(문헌 참조: 엘-세이드 및 신디아(El-Sayed and Shindia) Targets in gene therapy Prof. Yongping You ed., 2011).

본 발명의 제3 서브-목적에 따르면, 약물은 TPL을 함유하고, 이를 필요로 하는 환자에서 혈장 또는 순환 티로신의 소모 또는 감소를 허용한다. 약물은 항암 약물이고, 암, 특히, 티로신, 특히 흑색종에 대해 영양요구성인 종양 세포를 포함하는 암의 치료를 허용한다.

본 발명의 제4 서브-목적에 따르면, 약물은 hTATase를 함유하고, 이를 필요로 하는 환자에서 혈장 또는 순환 및/또는 간 티로신의 소모 또는 감소를 허용한다. 약물은 PLP 효소의 결핍, 특히, 리치너-한하트 증후군(Richner-Hanhart syndrome, 티로신혈증 제2 유형(tyrosinemia type II))과 관련된 희귀질환의 치료를 허용한다.

본 발명의 제5 서브-목적에 따르면, 약물은 시스타티오닌 베타-합성효소(cystathionine beta-synthethase)를 함유하고, 이를 필요로 하는 환자에서 혈장 또는 순환 및/또는 간 호모시스테인의 소모 또는 감소를 허용한다. 약물은 호모시스테인뇨증(homocysteinuria) 및/또는 고호모시스테인혈증(hyperhomocysteinemia) 및/또는 관련된 병변, 예를 들면, 심혈관 질환, 중추 신경계 질환, 안구 시스템 질환 및/또는 골격 질환의 치료를 허용한다.

본 발명은 또한, PLP 효소, 예를 들면, 메티오닌아제, 약학적으로 허용되는 부형제(pharmaceutically acceptable vehicle), 및 피리독살 포스페이트(PLP), 및 선택적으로 포스페이트 또는 비-포스페이트 PLP 전구체를 캡슐화하는 적혈구를 포함하는 약학적 조성물의 제조 방법에 관한 것으로, 상기 제조 방법은 선택적으로, 및 바람직하게는, 적혈구 세포의 펠릿(pellet)을 생리학적 완충액으로 1회 이상 세척하고 원심분리(centrifuged)하는 단계; 적혈구의 현탁액(suspension of erythrocytes)을 적혈구 멤브레인(membrane) 내 기공의 개구(opening)를 생성하는 저장성 액체 배지(hypotonic liquid medium)와 접촉시키는 단계; 적혈구의 현탁액을, 기공 개구 전 또는 후에 PLP 효소, 예를 들면, 메티오닌아제와 접촉시키는 단계; PLP 효소, 예를 들면, 메티오닌아제가 적혈구로 들어가는 단계; 기공은 등장성(isotonic) 또는 고장성(hypertonic), 바람직하게는 고장성 완충액을 사용하여 닫히고 PLP 효소, 예를 들면, 메티오닌아제를 함유하는 재실링된 적혈구의 현탁액을 모으는(collect) 단계; 선택적으로, 가장 취약한 적혈구를 제거하기 위해 적혈구 현탁액을 배양하는 단계; 적혈구의 현탁액을 세척하고 보존 용액으로 조절하는 단계를 포함하며, 여기서,

- PLP 및/또는, PLP 포스페이트 전구체가 존재하는 경우(if present) PLP 포스페이트 전구체는, PLP 효소, 예를 들면, 메티오닌아제와 공동-캡슐화(co-encapsulate)되고,

- 비-포스페이트 PLP 전구체가 존재하는 경우 비-포스페이트 PLP 전구체는, 기공 개구 전 및/또는 후에 적혈구의 현탁액에 추가되고/추가되거나,

- 비-포스페이트 PLP 전구체가 존재하는 경우 비-포스페이트 PLP 전구체는, 배양하는 동안 또는 보존 용액(preservation solution)에 추가되는, 약학적 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.

바람직하게는, 일부 PLP는 PLP 효소와 공동-캡슐화되고, 하나 이상의 비-포스페이트 전구체, 예를 들면, PN, PL 및/또는 PM은 기공 개구 전 및/또는 후에 적혈구 현탁액에 추가되고/추가되거나, 배양하는 동안 및/또는 보존 용액에 추가된다. 바람직하게는, 비-포스페이트 전구체는 PN이다.

적혈구 현탁액은 적혈구 멤브레인 내 기공의 개구(opening)를 생성하는 저장성 액체 배지와 접촉시킨다. 용해-재실링(lysis-resealing) 기술에서의 3가지 대안인, 저장성 투석, 저장성 프리스웰링 및 저장성 희석이 존재하며, 이들 모두는 적혈구 내부 및 외부 사이의 삼투압 차를 기초로 하는 것으로 보여진다. 저장성 투석이 바람직하다.

PLP 효소, 예를 들면, 메티오닌, 및 선택적으로 PLP 및/또는 PLP 전구체를 캡슐화하는 적혈구의 현탁액은 특히 다음 방법으로 수득될 수 있다:

1 - 65% 이상의 헤마토크릿 수준으로 등장성 용액 내 적혈구 펠릿을 현탁시키고, +1℃ 내지 +8℃에서 냉각시키는 단계,

2 - +1℃ 내지 +8℃에서 유지되는 온도에서, 65% 이상의 헤마토크릿 수준의 적혈구 및 +1℃ 내지 +8℃에서 냉각된 저장성 용해 용액의 현탁액을 투석 장치, 예를 들면, 코일 또는 투석 카트리지(cartridge)(카트리지가 바람직하다)로 통과시키는 단계를 포함하는 용해 단계(lysis procedure),

3 - (특히, 미리 구성된 용액 중에) 캡슐화되는 활성 성분(들)을 +1℃ 내지 +8℃로 유지되는 온도에서 용해 전에 또는 용해 중에 현탁액에 바람직하게 점차적으로 가하는 캡슐화 단계, 및

4 - 더 높은 온도, 특히, +30 내지 +42℃를 포함하는 온도에서 등장성 또는 고장성 용액, 유리하게는 고장성 용액의 존재하에 수행되는 재실링 단계(resealing procedure).

바람직한 대체 예에서, WO-A-2006/016247(유럽 특허 제1 773 452)에 기재된 방법으로부터 영감을 얻을 수 있다:

2 - 동일한 펠릿으로부터 적혈구 시료로부터 삼투압 취약성(osmotic fragility)을 측정하는 단계,

3 - +1℃ 내지 +8℃에서 유지되는 온도에서, 65% 이상의 헤마토크릿 수준의 적혈구 및 +1℃ 내지 +8℃에서 냉각된 저장성 용해 용액의 현탁액을 투석 장치, 예를 들면, 코일 또는 투석 카트리지(cartridge) (카트리지가 바람직하다)로 통과시키는 단계를 포함하는 용해 단계(lysis procedure); 여기서, 용해 파라미터(lysis parameter)는 앞서 측정된 삼투압 취약성에 따라 조절되고; 특히 측정된 삼투압 취약성에 따라, 투석 장치에 통과하는 적혈구 현탁액의 유동이 조절되거나 또는 용해 용액의 삼투압이 조절되며;

4 - (특히, 미리 구성된 용액 중에) 캡슐화되는 활성 성분(들)을 +1℃ 내지 +8℃로 유지되는 온도에서 용해 전에 또는 용해 중에 현탁액에 바람직하게는 점차적으로 가하는 캡슐화 단계, 및

5 - 더 높은 온도, 특히, +30 내지 +42℃를 포함하는 온도에서 등장성 또는 고장성 용액, 유리하게는 고장성 용액의 존재하에 수행되는 재실링 단계(resealing procedure).

특히, 투석을 위해, 적혈구의 펠릿은 65% 이상, 바람직하게는 70% 이상의 높은 헤마토크릿 수준으로 등장성 용액에 현탁되고, 이러한 현탁액은 +1 내지 +8℃, 바람직하게는 +2 내지 +6℃, 일반적으로는 약 +4℃로 냉각된다. 특정 방법에 따르면, 헤마토크릿 수준은 65% 내지 80%, 바람직하게는 70% 내지 80%로 포함된다.

측정되는 경우, 삼투압 취약성은 유리하게는 캡슐화되는 활성 성분(들)의 존재 또는 부재, 바람직하게는 존재 하에, 용해 단계 직전에 적혈구에 측정된다. 적혈구 또는 이들을 함유하는 현탁액은 용해에 선택된 온도와 근접하거나 또는 동등한 온도에서 유리하다. 본 발명의 다른 유리한 특징에 따르면, 삼투압 취약성의 측정은 빠르게 활용되는데, 즉, 시료를 수득한 후 짧은 시간에 용해 과정이 수행된다. 바람직하게는, 샘플링(sampling)과 용해의 시작 사이의 시간의 경과는 30분 이하로, 25분 이하 심지어 20분 이하가 여전히 바람직하다.

삼투압 취약성을 고려하여 용해-재실링 과정을 수행하는 방법에 관하여, 당해 분야의 숙련가는 WO-A-2006/016247에 기술된 상세한 기재를 참조할 수 있다. 본 문서는 본원에 참조로 인용된다.

캡슐화 기술의 증강은 당해 분야의 숙련가가 참조할 수 있고 본원에 참조로 인용된 2013년 5월 7일자로 출원된 프랑스 특허 FR 제1 354 204에 기술되어 있다. 따라서, 하나의 실시 예에 따르면, 활성 성분, 즉, PLP 효소, 예를 들면, 메티오닌아제, 및 선택적으로 PLP 및/또는 PLP 전구체와 같은 하나 이상의 기타 활성 성분을 캡슐화하는 적혈구는, 용해-재실링에 의해 적혈구 내로 활성 성분을 캡슐화하는 단계, 활성 성분을 포함하는 적혈구 및 280 mOsmol/kg 이상, 특히, 약 280 내지 약 380 mOsmol/kg, 바람직하게는 약 290 내지 약 330 mOsmol/kg의 삼투압 농도(osmolality)를 갖는 용액을 포함하는 현탁액 또는 펠릿을 수득하는 단계, 이러한 펠릿 또는 현탁액을 배양하거나 또는 280 mOsmol/kg 이상, 특히, 약 280 내지 약 380 mOsmol/kg, 바람직하게는 약 290 내지 약 330 mOsmol/kg의 삼투압 농도에서 배양 용액을 가하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득된다. 특히, 30분 이상, 특히, 1시간 이상의 기간 동안 배양을 수행한다. 이후, 배양된 용액의 액체 배지를 제거하고, 수득된 적혈구는, 환자에게 현탁액을 주입시키는 것이 허용되는 용액으로 현탁시키고, 바람직하게는, 환자에게 현탁액을 주입시키는 것이 허용되는 보존 용액으로 현탁시킨다. 지시된 삼투압 농도는, 적혈구가 관련된 순간에 현탁되어 있거나 또는 펠릿인 용액의 삼투압 농도를 의미한다.

특정 방법에 따르면, 비-포스페이트 PLP 전구체, 특히, 비타민 B6의 비-포스페이트 형태는 생산 또는 저장 방법 동안 또는 최종 제형에 제공된다. 이 화합물은, 예를 들면, 배양 용액 또는 보존 용액으로 포함될 수 있거나, 또는 추가로, 예비-주입 희석(pre-injection dilution)이 수행되는 경우 주입 전에 제형에 포함될 수 있다.

하나의 특징에 따르면, 특히 0.1 내지 250 mM, 바람직하게는 1 내지 50 mM의 PN 및/또는 PL 및/또는 PM은 생산 방법 또는 저장 방법 동안에 또는 최종 제형 내에 제공된다. 위에 기재된 바와 같이, 비타민 B6의 이들 비-포스페이트 유도체의 부분(fraction)은 적혈구 세포 내 PLP로 전환될 것이다.

<<안정화된 적혈구 현탁액(stabilized erythrocyte suspension)>>은 특히 인간에게 사용할 때까지 0.2 g/dl 단위 이하를 유지하는 세포외 헤모글로빈 함량을 갖는 현탁액을 의미하는 것으로, 특히 활성 성분을 포함하는 적혈구 배치(erythrocyte batch)를 생산한 후 1 내지 72 시간에 존재할 수 있다.

<<즉시 사용가능한 안정화된 적혈구 현탁액 (ready-to-use stabilized erythrocyte suspension) >>은 환자에게 주입가능한 용액, 특히, 보존 용액 내 안정화된 현탁액을 의미한다. 적혈구 현탁액의 헤마토크릿은 일반적으로 35%, 40% 또는 45% 이상이다.

<<적혈구 펠릿(erythrocyte pellet)>>은 이전에 현탁되었던 액체 배지의 적혈구를 분리한 후 수거된 적혈구의 농축액 또는 농도를 의미한다. 분리는 여과 또는 원심분리에 의해 확보될 수 있다. 원심분리는 분리에 일반적으로 사용되는 수단이다. 펠릿은 특정 비율의 액체 매질을 포함한다. 일반적으로, 펠릿은 70% 내지 85%의 헤마토크릿을 갖는다.

<<배양 용액(incubation solution)>>은 활성 성분을 캡슐화하는 적혈구가 배양 단계 동안에 존재하는 용액을 의미한다. 넓은 범위의 헤마토크릿, 특히, 10% 내지 85%의 헤마토크릿을 넘어 배양은 달성될 수 있다.

<<취약한 적혈구(fragile erythrocyte)>>는 일단 보존 용액에 현탁되고 현탁액이 2℃ 내지 8℃에서, 특히 1 내지 72 시간 후 보존시 용해될 수 있는 포함 과정(incorporation procedure)으로부터 유래한 적혈구를 의미한다.

<<초기 헤마토크릿(initial hematocrit)>>은 배양하는 동안 취약한 적혈구의 용해로 인한 세포 손실 전 헤마토크릿을 의미한다.

상기 방법은 다음 단계를 특히 포함할 수 있다:

(a) 적혈구를 저장성 배지와 접촉시키는 단계(적혈구의 멤브레인 내 기공의 개구를 허용시키는 단계), 활성 성분과 접촉시키는 단계(활성 성분을 적혈구에 도입시키기 위함), 특히, 등장성 배지 또는 고장성 배지, 유리하게는 고장성 배지를 사용하여 적혈구를 재실링하는 단계를 포함하여, 캡슐화되는 활성 성분(들) (PLP 효소, 예를 들면, 메티오닌아제, 및 선택적으로 PLP 및/또는 PLP 전구체)을 적혈구에 캡슐화하는 단계,

(b) 활성 성분을 포함하는 적혈구 및 280 mOsmol/kg 이상, 특히, 약 280 내지 약 380 mOsmol/kg, 바람직하게는 약 290 내지 약 330 mOsmol/kg의 삼투압 농도를 갖는 용액을 포함하는 현탁액 또는 펠릿을 수득 또는 제조하는 단계,

(c) 이러한 단계 (b)의 펠릿 또는 현탁액을 배양하거나 또는 280 mOsmol/kg 이상, 특히, 약 280 내지 약 380 mOsmol/kg, 바람직하게는 약 290 내지 약 330 mOsmol/kg의 삼투압 농도에서 30분 이상, 특히, 1시간 이상의 기간 동안 배양 용액을 가하는 단계,

(d) 단계 (c)의 배양된 현탁액의 액체 배지를 제거하는 단계,

(e) 단계 (d)에 수득된 적혈구를 환자에게 현탁액을 주입시키는 것이 허용되는 용액으로 현탁시키고, 바람직하게는, 환자에게 현탁액을 주입시키는 것이 허용되는 보존 용액으로 현탁시키는 단계.

비-포스페이트 형태의 비타민 B6은, 단계 (a)의 캡슐화 단계 동안, 또는 단계 (c)의 배양 단계 동안, 또는 보존 용액에 더 추가될 수 있다.

제1 방법에 따르면, 용해-재실링에 의한 캡슐화 이후 단계, 특히 단계 (b)는, 용해-재실링 단계 또는 단계 (a)에서 수득된 현탁액 또는 펠릿을, 280 mOsmol/kg 이상의 삼투압 농도, 특히, 약 280 내지 약 380 mOsmol/kg, 바람직하게는 약 290 내지 약 330 mOsmol/kg의 삼투압 농도에서 용액에서 희석시킴으로써 1회 이상의 세척 주기, 바람직하게는 2 또는 3회 세척 주기를 포함하여 적혈구의 펠릿 또는 현탁액을 수득하는 단계를 포함한다. 이러한 펠릿 또는 이러한 현탁액은 활성 성분을 포함하는 적혈구 및 280 mOsmol/kg 이상, 특히, 약 280 내지 약 380 mOsmol/kg, 바람직하게는 약 290 내지 약 330 mOsmol/kg의 삼투압 농도를 갖는 용액을 포함한다. 이후, 다음 단계, 예를 들면, (c), (d) 및 (e) 단계가 적용된다.

제2 방법에 따르면, 용해-재실링 단계 또는 단계 (a)에서, 등장성 배지 또는 고장성 배지를 사용하여 적혈구를 재실링하여 적혈구의 현탁액을 생산하고, 이후 배양하는 단계, 예를 들면, 단계 (b)의 현탁액을 280 mOsmol/kg 이상, 특히, 약 280 내지 약 380 mOsmol/kg, 바람직하게는 약 290 내지 약 330 mOsmol/kg의 삼투압 농도를 갖는 용액에 배양하는 단계를 수행할 수 있다. 다시 말하면, 용해-재실링 단계 또는 단계 (a)는 적혈구를 재실링하는 단계를 포함하는 것으로, 활성 성분을 캡슐화하는 현탁된 적혈구를 등장성 또는 고장성 재실링 용액, 유리하게는 고장성 재실링 용액과 혼합시켜, 280 mOsmol/kg 이상, 특히, 약 280 내지 약 380 mOsmol/kg, 바람직하게는 약 290 내지 약 330 mOsmol/kg의 삼투압 농도를 갖는 적혈구의 현탁액을 생산한다. 이러한 방법에서, 배양 단계 또는 단계 (c)는 재실링으로부터 유래한 현탁액의 배양을 포함한다. 특히, 30분 이상, 특히, 1시간 이상의 기간 동안 배양을 수행한다. 이후, 다음 단계, 예를 들면, (d) 및 (e) 단계가 적용된다.

용해-재실링 이후 단계, 예를 들면, (b) 내지 (e) 단계는 취약한 적혈구, 또는 이들 대다수, 특히, 50, 60, 70, 80 또는 90%를 초과하는, 또는 그 이상의 용해를 생성하는 조건에서 수행된다. 이를 위해서, 배양 기간, 배양 온도 및 적혈구가 현탁되는 용액의 삼투압 농도에 작용하는 것이 가능하다. 삼투압 농도가 높을수록 배양 시간이 길어질 수 있다. 따라서, 삼투압 농도를 낮출수록 동일한 효과를 수득하기 위해서는 배양 기간을 짧게 할 수 있다. 또한, 온도가 높을수록, 배양 시간을 짧게 할 수 있고, 그 반대도 가능하다. 이후, 1회 이상의 세척 주기를 수행하여 세포 파편 및 세포외 헤모글로빈, 뿐만 아니라 세포외 활성 성분을 제거할 수 있다.

본 발명에 따르면, 세척 주기는 적혈구의 현탁액 또는 펠릿을 희석하는 단계, 이후 적혈구와 세척 용액 사이의 분리 단계를 포함한다. 바람직하게는, 세척 단계를 2 또는 3 희석-분리 사이클을 바람직하게 포함한다. 분리 단계는 여과 및 원심분리와 같은 임의의 적합한 수단에 의해 달성될 수 있다. 원심분리가 바람직하다.

배양은 현탁액의 헤마토크릿에 의해 제한되지 않는다. 이러한 방식에서, 일반적으로 10% 내지 85%, 특히, 40% 내지 80%의 초기 헤마토크릿을 갖는 현탁액이 배양될 수 있다. 이는 오히려 70%의 펠릿 및 70% 미만의 현탁액을 의미할 수 있다.

제거 단계 또는 단계 (d)는 특히 세포 파편, 및 세포외 헤모글로빈, 뿐만 아니라 결과적으로 세포외 활성 성분을 제거하기 위해서, 현탁액 또는 배양된 펠릿의 액체 부분을 제거하는 것을 목표로 한다.

제거 단계 또는 단계 (d)를 위한 제1 방법에 따르면, 분리, 특히 원심분리가 수행되는데, 이는 특히 현탁액에 적용 가능하다. 1회 이상, 예를 들면, 2 또는 3회 세척 사이클과 같은 분리 단계는, 등장성 용액 내 희석 단계 이후 특히 원심분리에 의해 수행될 수 있다.

제거 단계 또는 단계 (d)를 위한 제2 방법에 따르면, 분리, 특히 원심분리가 수행되기 전 희석이 수행되는데, 이는 현탁액 또는 펠릿에 적용 가능하다. 특히 등장성 세척 용액 또는 보존 용액을 사용하여 희석을 수행할 수 있다.

최종 단계 또는 단계 (e)는 임의의 기타 처리를 하지 않고 환자에게 투여될 수 있도록 최종 현탁액을 제조하는 단계로 구성된다.

이러한 단계에 대한 제1 방법에 따르면, 제거 단계 또는 단계 (d)로부터의 적혈구 펠릿의 희석은 주입 용액, 특히 보존 용액으로 수행된다.

이러한 단계에 대한 제2 방법에 따르면, 제거 단계 또는 단계 (d)로부터 유래한 적혈구 펠릿을 세척하기 위한 1회 이상의 사이클은, 주입 용액, 특히, 보존 용액을 이용하여 희석 후 분리에 의해 수행된다. 세척 후, 적혈구는 주입 용액, 특히, 보존 용액에서 재-현탁된다.

본 발명의 방법은 다음 특징을 하나, 여러 개, 또는 전체적으로 추가로 포함할 수 있다:

- 약 2℃ 내지 약 39℃의 온도에서 취약한 적혈구의 용해를 확보하는데 충분한 시간에 걸쳐 배양 단계 또는 단계 (c)가 수행되고;

- 저온, 특히, 약 2℃ 내지 약 10℃, 특히, 약 2℃ 내지 약 8℃의 온도에서 배양 단계 또는 단계 (c)를 수행하여 약 1 시간 내지 약 72 시간 동안, 특히, 약 6 시간 내지 약 48 시간, 바람직하게는 약 19 시간 내지 약 30 시간 동안 지속하고;

- 더 높은 온도, 약 20℃ 내지 약 39℃, 특히, 실온 (25 ℃ ± 5 ℃)에서 배양 단계 또는 단계 (c)를 수행하여 약 30 분 내지 약 10 시간 동안, 특히, 약 1 시간 내지 약 6 시간 동안, 바람직하게는, 약 2 시간 내지 약 4 시간 동안 지속하며; 이는 실온보다 심지어 더 높은 온도에서 작동하는 것이 가능하지만, 세포 수율(cell yield), P 50 및/또는 2,3-DPG 함량에 부정적 영향을 미칠 수 있고;

- 배양 단계 또는 단계 (c)에서, 현탁액은 초기 헤마토크릿이 10% 내지 85% 특히, 40% 내지 80%이고; 예를 들면, 70% 내지 약 85%의 분리된 펠릿, 또는 약 40% 내지 70%의 헤마토크릿을 갖는 희석된 펠릿이 배양될 수 있으며;

- 배양 단계는 현탁액의 교반을 포함하며;

- 배양 단계는 임의의 교반을 포함하지 않으며;

- 세척 및/또는 배양을 위한 용액으로서, 바람직한 삼투압 농도를 수득하기 위해 계량 NaCl 수용액을 사용하고; 이에 따라, 하나의 예로서, 용액은 0.9%의 NaCl을 포함할 수 있고; 이러한 용액은 또한, NaCl에 추가로, 글루코스, 특히, 글루코스 모노하이드레이트(glucose monohydrate), 모노소듐 포스페이트 디하이드레이트(monosodium phosphate dehydrate), 디소듐 포스페이트 도데카하이드레이트(disodium phosphate dodecahydrate)를 포함할 수 있고; 하나의 예로서, 조성물은 0.9%의 NaCl, 0.2%의 글루코스 모노하이드레이트, 0.034%의 모노소듐 포스페이트 디하이드레이트, 0.2%의 디소듐 포스페이트 도데카하이드레이트를 포함하며;

- 최종 단계 또는 단계 (e)에서 세척은 보존 용액으로 수행되고;

- 즉시 사용 가능한 현탁액 또는 환자에게 주입될 수 있는 용액(액체 부분)의 삼투압 농도는 약 280 내지 약 380 mOsmol/kg, 바람직하게는 약 290 내지 약 330 mOsmol/kg에 포함되고;

- 즉시 사용 가능한 현탁액 또는 환자에게 주입될 수 있는 현탁액의 헤마토크릿은 35%, 40% 또는 45% 이상이고;

- 세척, 배양을 위한 모든 단계는 보존 용액으로 수행되며;

- 단계 (b)의 세척 용액 및/또는 단계 (e)의 세척 용액 및 보존 용액은 동일한 조성이고, 적혈구의 보존을 강화하는 화합물(들)을 포함하며;

- 보존 용액 (및 세척 용액(들) 또는 필요한 경우 배양 용액)은 NaCl, 아데닌 및 글루코스, 덱스트로스(dextrose) 및 만니톨로부터 하나 이상의 화합물을 포함하는 수용액이고;

- 보존 용액 (및 세척 용액 또는 필요한 경우 배양 용액(들))은 NaCl, 아데닌 및 덱스트로스, 바람직하게는 AS3 배지를 포함하고;

- 보존 용액 (및 세척 용액 또는 필요한 경우 배양 용액(들))은 NaCl, 아데닌 및 글루코스 및 만니톨, 바람직하게는 SAG-만니톨 또는 ADsol 배지를 포함한다.

본 발명에 따른 방법은 다음 단계를 특히 포함한다:

(a) 적혈구의 멤브레인 내 기공의 개구(opening)를 생성하는 저장성 배지와 접촉시키는 단계; 적혈구 내로 유입시키기 위해 활성 성분과 접촉시키는 단계, 등장성 또는 고장성 배지를 사용하여 적혈구를 재실링하는 단계를 포함하여 활성 성분을 적혈구 내로 캡슐화하는 단계. 활성 성분은, 후자의 용해 전에 적혈구의 현탁액에 존재할 수 있거나, 또는 용해 동안 또는 용해 후에 추가로 가해질 수 있으나, 항상 재실링 전에 가해져야 함을 명심해야 한다. 단계 (a)의 하나의 실시 예에서, 방법은 다음 하위 단계를 포함한다:

(a1) 60% 또는 65% 이상의 헤마토크릿에서 적혈구의 현탁액을 갖는 단계,

(a2) 이러한 현탁액에서 적혈구의 삼투압 취약성을 측정하는 단계,

(a3) (a2)에 측정된 삼투압 취약성에 따라 적혈구 현탁액의 유동을 조절하거나 또는 용해 용액의 유동 속도를 조절하거나 또는 용해 용액의 삼투압 농도를 조절하여 용해 용액에 역행하는 투석 장치, 특히, 투석 카트리지에 적혈구 현탁액을 통과시키는 단계를 포함하여 활성 성분(들)을 용해 및 내재화(internalization)를 위한 단계,

(a4) 적혈구를 재실링 하는 단계.

본 발명의 다른 목적은 이를 필요로 하는 환자에게 양호한 생체이용률 조건 하에 PLP 효소 및 이의 보조인자를 제공하기 위한 치료학적 치료 방법을 제공하는 것으로, 이는 효소 및 이의 보조인자가 서로 이용가능하며, 효소가 활성이고 치료학적 적용에서 효과적인 유효한 양임을 의미한다. 이러한 방법은 특히, 효소의 기질의 혈장 농도 또는 순환 농도 및/또는 기관에서의 농도를 소모 또는 감소시키는데 목표를 두고 있다. 이러한 방법은 본 발명에 따른 조성물의 유효량의 투여 또는 본 발명에 따른 키트의 용도를 포함한다.

제1 서브-목적에 따르면, 본 발명은 이를 필요로 하는 환자에서 혈장 또는 순환 메티오닌의 소모 또는 감소를 허용하는 치료학적 치료 방법이다. 이러한 방법은 본 발명에 따른 조성물의 유효량의 투여 또는 메티오닌아제 및 이의 보조인자를 포함하는 본 발명에 따른 키트의 용도를 포함한다. 상기 방법은 암, 특히, 메티오닌에 영양요구성인 종양 세포를 포함하는 암, 특히, 유방암, 폐암, 결장암, 신장암, 방광암, 흑색종(melanoma) 및 아교모세포종(glioblastoma)을 치료하기 위한 방법이다.

제2 서브-목적에 따르면, 본 발명은 이를 필요로 하는 환자에서 혈장 또는 순환 또는 간 호모시스테인의 소모 또는 감소를 허용하는 치료학적 치료 방법이다. 이러한 방법은 본 발명에 따른 조성물의 유효량의 투여 또는 메티오닌아제 및 이의 보조인자를 포함하는 본 발명에 따른 키트의 용도를 포함한다. 상기 방법은 호모시스테인뇨증(homocysteinuria) 및/또는 고호모시스테인혈증(hyperhomocysteinemia) 및/또는 고호모시스테인혈증과 관련된 병변, 예를 들면, 심혈관 질환, 중추 신경계 질환, 안구 시스템 질환 및/또는 골격 질환을 치료하기 위한 방법이다.

본 발명의 제3 서브-목적에 따르면, 본 발명은 이를 필요로 하는 환자에서 혈장 또는 순환 티로신의 소모 또는 감소를 허용하는 치료학적 치료 방법이다. 이러한 방법은 본 발명에 따른 조성물의 유효량의 투여 또는 TPL 및 이의 보조인자를 포함하는 본 발명에 따른 키트의 용도를 포함한다. 상기 방법은 암, 특히, 티로신에 영양요구성인 종양 세포를 포함하는 암, 특히, 흑색종을 치료하기 위한 방법이다.

본 발명의 제4 서브-목적에 따르면, 본 발명은 이를 필요로 하는 환자에서 혈장 또는 순환 및/또는 간 티로신의 소모 또는 감소를 허용하는 치료학적 치료 방법이다. 이러한 방법은 본 발명에 따른 조성물의 유효량의 투여 또는 hTATase 및 이의 보조인자를 포함하는 본 발명에 따른 키트의 용도를 포함한다. 상기 방법은 PLP 효소의 결핍, 특히, 리치너-한하트 증후군 (Richner-Hanhart syndrome, 티로신혈증 제2 유형(tyrosinemia type II))과 관련된 희귀질환을 치료하기 위한 방법이다.

본 발명의 제5 서브-목적에 따르면, 본 발명은 이를 필요로 하는 환자에서 혈장 또는 순환 및/또는 간 호모시스테인의 소모 또는 감소를 허용하는 치료학적 치료 방법이다. 이러한 방법은 본 발명에 따른 조성물의 유효량의 투여 또는 시스타티오닌 베타-신타아제(cystathionine beta-synthase) 및 이의 보조인자를 포함하는 본 발명에 따른 키트의 용도를 포함한다. 상기 방법은 호모시스테인뇨증(homocysteinuria) 및/또는 고호모시스테인혈증(hyperhomocysteinemia) 및/또는 고호모시스테인혈증과 관련된 병변, 예를 들면, 심혈관 질환, 중추 신경계 질환, 안구 시스템 질환 및/또는 골격 질환을 치료하기 위한 방법이다.

이러한 치료학적 적용에 사용된 조성물은 PLP 효소의 보조인자, 즉, PLP, 및/또는 비타민 B6의 비-포스페이트 형태와 같은 비-포스페이트 전구체, 및/또는 피리독신 포스페이트(PNP)와 같은 포스페이트 전구체일 수 있는 이의 전구체를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 조성물은 PN-키나제, PNP-옥시다제, PLP-포스파타제를 억제하는 제제를 포함할 수 있다. 보다 일반적으로, 치료 방법은 상기한 바와 같은 조성물의 투여 또는 키트를 포함할 수 있다.

치료하는 기간 동안 매월 환자에게 투여하는 1회 복용, 1회 이상의 용량, 특히, 1회 또는 2회는 1회 이상의 주입으로 35%, 40% 또는 45% 이상의 헤마토크릿을 갖는 50 내지 300 ml의 현탁액 또는 조성물을 나타낸다. 특히, 상기 용량은 정맥 내 주입 또는 동맥 내 주입, 특히, 관류(perfusion)로 투여된다.

대안적으로는, PLP 효소, 예를 들면, 메티오닌아제를 캡슐화하는 적혈구를 포함하는 조성물의 유효량, 및 비타민 B6의 비-포스페이트 형태, 바람직하게는 PN을 함유하는 용액의 유효량은 동일한 환자에게 별개로 투여된다. 비타민 B6의 비-포스페이트 형태는 적혈구의 현탁액과 동시에 또는 별개로 주입되어 투여될 수 있거나 또는 임의의 기타 경로, 특히, 경구 경로를 통해 투여될 수 있다.

제1 실시 예에서, 주입 전에 1시간 내지 72 시간 내에 특히, 10 시간 내지 72시간 사이에 준비된 활성 성분(들)을 캡슐화하는 적혈구의 현탁액이 환자에게 주입된다. 이러한 현탁액은 35%, 40% 또는 45% 이상의 헤마토크릿을 갖는다. 보존 용액에서 발견된다. 세포외 헤모글로빈 수준은 0.5 g/dl 이하, 특히, 0.3 g/dl 이하, 특히, 0.2 g/dl 이하, 바람직하게는 0.15 g/dl 이하, 여전히 바람직하게는 0.1 g/dl 이하이고/이거나, 용혈 수준(hemolysis level)은 2% 이하, 특히, 1.5% 이하, 바람직하게는 1% 이하이다. 현탁액은 주입 전에 세척하지 않거나 유사한 작업을 수행한다.

본 발명의 다른 목적은 정제된 형태 하에 고 수율로 메티오닌아제를 생산하는 방법으로, 다음 단계를 포함한다:

(a) 메티오닌아제(methioninase)를 생산하도록 형질전환된(transformed) 박테리아를 배양시키고, 배양물(culture)을 원심분리(centrifugation)한 다음, 펠릿을 회수(recover)하는 단계,

(b) 펠릿을 용해 완충액(lysis buffer)에 현탁시키고, 박테리아 세포를 용해시키고, 원심분리시켜, 상층액(supernatant)을 회수하는 단계,

(c) 상층액을 침전제(precipitating agent)로 처리하여 침전시키고, 펠릿을 회수하는 단계,

(d) 약 25 ℃ 내지 40 ℃의 온도에서 PEG를 사용하여 펠릿에 2회의 결정 또는 침전을 적용시켜 펠릿을 회수하는 단계,

(e) 펠릿을 가용화 완충액(solubilization buffer) (예를 들면, [25mM Tris ; 0.5mM P5P ; 0.5mg/mL 베타 머캅토 에탄올 ; pH 7.5])에 현탁시키고, 2회의 음이온 교환 크로마토그래피(anion exchange chromatography)를 수행하여 메티오닌아제의 용액을 회수하는 단계, 및

(f) 메티오닌아제의 용액에 크로마토그래피에 의한 연마 단계(polishing step)를 수행하여 정제된 메티오닌아제 용액을 회수하는 단계.

바람직한 실시 예에서, 슈도모나스 푸티다의 메티오닌아제 코딩 서열(methioninase coding sequence)로 사용된다. 이러한 서열은 생산 균주에 대한 서열에 적응하기 위해서 최적화될 수 있다. 생산 균주는 바람직하게는 대장균, 예를 들면, HMS174 균주이다. 메티오닌아제 서열, 바람직하게는 최적화된 서열을 함유하는 발현 벡터(expression vector)를 사용하여 생산 균주를 형질전환시키고, 생산 클론(producing clone)을 선택할 수 있다. 이후, 통상적인 조건 하에 발효기에서 클론을 사용하는 메티오닌아제의 생산을 수행한다.

바람직하게는, 단계 (a)의 펠릿은 용해 완충액(예를 들면, [100mM 소듐 포스페이트 ; 4.4mM EDTA ; 3.3mM P5P ; 1mM DTT ; pH 7.6]) (습윤 중량의 그램(gram of wet weight) 당 7mL)에 재현탁된다. 바람직하게는, 용해는 고압 균질화(high pressure homogenization), 유리하게는 여러 단계, 바람직하게는 3단계의 고압 균질화로 수행된다. 전형적인 온도는 각 단계의 균질화 전 약 10℃ (9 내지 12℃)로 유지된다. 바람직하게는, 용해 후 및 원심분리 전, 세포 용해물(cell lysate)은 양이온 응집제(cationic coagulant), 바람직하게는 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine, PEI)을 사용하여 정화(clarify)된다. 전형적인 PEI 농도는 약 0.05 내지 약 0.5% (V/V), 특히 약 0.1 내지 약 0.3%, 바람직하게는 약 0.2%일 수 있다.

단계 (c)에서 침전은 암모늄 설페이트(ammonium sulfate), 전형적으로 약 60% 포화된 암모늄 설페이트로 수행될 수 있다. 바람직하게는, 침전 전에, 상층액은 약 0.2 μm 멤브레인에 여과된다.

단계 (d)에서, PEG는 바람직하게는 PEG-6000이다. 최종 농도는 약 5 내지 약 25% (W/V), 특히 약 5 내지 약 15% 일 수 있다. 제1회 침전은 암모늄 설페이트의 존재하에 바람직하게 수행될 수 있다. 전형적으로는, 암모늄 설페이트는 약 10% 포화(9 내지 11%)일 수 있다. 전형적으로는, PEG는 약 10%의 최종 농도를 가질 수 있다. 제2회 침전은 무기염(inorganic salt), 전형적으로는 소듐 클로라이드 또는 포타슘 클로라이드, 바람직하게는 소듐 클로라이드와 같은 알칼리성 금속염의 존재하에 바람직하게 수행될 수 있다. 상기 염은 약 0.20 M(0.19 내지 0.21)의 최종 농도를 가질 수 있다. 전형적으로는, PEG는 약 12%의 최종 농도를 가질 수 있다. 온도는 약 25 ℃ 내지 약 35 ℃, 특히, 약 28℃ 내지 약 32 ℃, 전형적으로는 약 30℃를 포함할 수 있다.

단계 (e)에서, 크로마토그래피는 DEAE 세파로스(sepharose)에서 수행될 수 있다. 바람직하게는, 크로마토그래피 전에, 재현탁된 펠릿 또는 침전물은 약 0.45 μm 필터를 통해 통과될 수 있다.

단계 (f)에서, 연마가 수행되어 내독소(endotoxin), HCP 및 DNA와 같은 남아있는 잔여 오염물을 제거한다. 연마는 Q 멤브레인 크로마토그래피(Q membrane chromatography)를 사용하여 수행될 수 있다.

이후, 정제된 메티오닌아제는 농축되고 투석여과(diafilter)될 수 있다. 약 -80℃에서 동결 건조 및 저장을 통해 보존될 수 있다. 이제, 본 발명은 비-제한적인 실시 예 및 도면을 참고하여 수행된 구체적인 예에 의해 더욱 상세히 기술될 것이다.

도 1은 유럽 특허 제0 978 560에 기술된 방법을 따르고, 본 출원에 기술된 향상된 방법을 따라 MGL을 정제하는 방법의 기술을 도시한 도면으로, 유럽 특허 제0 978 560 B1에 기술된 방법의 변형은 암모늄 설페이트(ammonium sulfate)를 이용한 침전 단계 이후의 단계들과 관련이 있다.
도 2 및 도 3은 RC-MGL-PLP 현탁액을 다양한 농도의 피리독신(PN)으로 배양한 후 PLP의 내부-적혈구 농도(도 2) 및 세포외 농도(도 3)의 비교를 도시한 도면으로, 피리독신의 부재(0 mM) 하에 실온에서 3시간 및 24 시간 동안 배양된 RC-MGL-PLP 현탁액은 약 3.9 μM의 기저 PLP 수준을 가지며, 2 mM 및 4 mM 피리독신으로 현탁액을 배양함으로써 3시간의 배양 후 (연한 회색 막대) 내부-적혈구 PLP 농도를 8 μM으로 증가시키는 가능성을 제공하였으며, 24 시간의 배양 후(진한 회색 막대)에는 상당히 높은 수준(11 μM 및 14 μM, 각각)을 수득하는 가능성을 제공하였다.
도 4는 복합체 MGL-PLP로 로딩(loading)된 적혈구(RC)의 약물 동력학을 도시한 도면으로, RC-MGL-PLP2 산물은 3 mg/ml의 MGL 및 약 30 μM의 PLP를 함유하는 현탁액의 용해-재실링(lysis-resealing)으로 수득되고, RC-MGL-PLP3 산물은 3 mg/ml의 MGL 및 약 125 μM의 PLP를 함유하는 현탁액의 용해-재실링으로 수득되고, RC-MGL-PLP4 산물은 5 mg/ml의 MGL 및 33 μM의 PLP를 함유하는 현탁액의 용해-재실링으로 수득되며, RC-MGL-PLP5 산물은 6 mg/ml의 MGL 및 100 μM의 PLP를 함유하는 현탁액의 용해-재실링으로 수득되고, 산물(CFSE)의 형광 표지(fluorescent labeling)는 생체 내 적혈구를 추적할 수 있으며, 쥐 CD1에게 정맥 주입된 산물(산물 RC-MGL-PLP2, RC-MGL-PLP3 및 RC-MGL-PLP5에 대해 8 ml/kg 및 산물 RC-MGL-PLP4에 대해 10 ml/kg)은 투여 후 주입된 적혈구의 120시간, 즉 5일에 75% 이상의 생존율을 가지며 우수한 안정성을 나타내고, RC-MGL-PLP4 산물에 대해서는 생존율이 약 10일 후 75% 미만으로 감소한다.
도 5는 자유 MGL 효소의 약물 동력학을 도시한 도면으로, MGL 효소는 2개의 주입가능한 산물 (MGL-L1 및 MGL-L2)을 수득하기 위해서, 10 μM의 P5P로 보충된 포타슘 포스페이트 용액(potassium phosphate solution)을 사용하여 희석하였으며, 이들 산물은 1) 산물 RC-MGL-PLP2로서의 동일한 효소 농도, 즉, 0.45 mg/ml의 MGL, 및 2) 산물 RC-MGL-PLP2보다 2배 이상의 농도, 즉, 0.90 mg/ml의 MGL을 수득하기 위해서 제조하였으며, 주입 후 6시간에 피리독신을 정맥 내(intravenously, IV) 보충하면서 CD1 쥐(8 ml/kg)에게 2가지 산물은 정맥 내(IV) 투여되었다. 혈장 L-메티오닌 수준은 HPLC-MS-MS로 측정하고, 비-처리된 CD1에서 L-Met 수준은 68 μM으로 평가되었으며, 이들 산물 MGL-L1 및 MGL-L2 둘 다는 투여 후 길지 않은 시간인 15 분 내에 L-Met 수준을 신속히 소모시킨다.
도 6은 짧은 시간 동안의 RC-MGL-PLP의 약물 동력학을 도시한 도면으로, 산물 RC-MGL-PLP2은 3 mg/ml의 MGL 및 약 30 μM의 PLP를 함유하는 현탁액의 용해-재실링으로 수득되고, 산물 RC-MGL-PLP3은 3 mg/ml의 MGL 및 약 125 μM의 PLP를 함유하는 현탁액의 용해-재실링으로 수득되며, RC-MGL-PLP2를 주입한 쥐에게 투여한 후 6시간에 피리독신을 정맥 내(IV) 보충하면서 CD1 쥐 (8 ml/kg)에게 2가지 산물을 정맥 내(IV) 투여하였다. 혈장 L-메티오닌 수준은 HPLC-MS-MS로 측정하고, 비-처리된 CD1에서 L-Met 수준은 82 μM으로 평가되었으며, 이들 산물 RC-MGL-PLP2 및 RC-MGL-PLP3 둘 다는 투여 후 15 분에 L-Met 수준을 15.0 ± 3.6 μM 및 22.7 ± 1.5 μM으로 각각 신속히 소모시킨 후 35 μM으로 보다 완만한 소모를 유지하지만, 48시간 내지 120 시간에 안정된다.
도 7은 오랜 기간 동안 RC-MGL-PLP의 약물 동력학을 도시한 도면으로, 산물 RC-MGL-PLP4 (0.5 mg/ml)은 5 mg/ml의 MGL 및 33 μM의 PLP를 함유하는 현탁액의 용해-재실링으로 수득되고, RC-MGL-PLP4를 주입한 쥐에게 투여한 후 6시간에 피리독신을 정맥 내(IV) 보충하면서 CD1 쥐 (10 ml/kg)에게 산물을 정맥 내(IV) 투여하였다. 혈장 L-메티오닌 수준은 HPLC-MS-MS로 측정하고, 비-처리된(untreated) CD1에서 L-Met 수준은 68 μM으로 평가되었으며, 산물 RC-MGL-PLP4는 투여 후 15 분에 빠른 소모를 유도하여 L-Met 수준을 약 10 μM으로 감소시킨 후 약 25 μM으로 보다 완만한 소모를 유지하지만, 24 시간 내지 48시간에 안정되고, 이후 주입 후 12일째에는 대조값으로 점차적으로 돌아간다.
도 8은 순환 PLP 효소의 잔여 활성을 도시한 도면으로, 효소 MGL은 주입 가능한 산물 MGL-L2를 수득하기 위하여 10 μM의 P5P로 보충된 포타슘 포스페이트 용액을 사용하여 희석하였으며, 산물 RC-MGL-PLP2는 3 mg/ml의 MGL 및 약 30 μM의 PLP를 함유하는 현탁액의 용해-재실링으로 수득되고, 산물 RC-MGL-PLP3는 3 mg/ml의 MGL 및 약 125 μM의 PLP를 함유하는 현탁액의 용해-재실링으로 수득되고, 산물 RC-MGL-PLP4는 5 mg/ml의 MGL 및 33 μM의 PLP를 함유하는 현탁액의 용해-재실링으로 수득되며, 산물 RC-MGL-PLP5는 6 mg/ml의 MGL 및 100 μM의 PLP를 함유하는 현탁액의 용해-재실링으로 수득된다. 산물은 CD1 쥐에게 정맥 내(IV) 주입(산물 MGL-L2, RC-MGL-PLP2, RC-MGL-PLP3 및 RC-MGL-PLP5에 대해서 8 ml/kg 주입, 및 산물 RC-MGL-PLP4에 대해서 10 ml/kg 주입)된다. 주입된 MGL 효소(총 적혈구)의 잔여 활성은 실시 예 4에 기재된 방법에 따라 MGL에 의해 생산된 NH₃를 측정하여 결정된다.

실시 예 1. 메티오닌 감마 리아제( Methionine Gamma Lyase , MGL )를 수득하고 특성화하는 방법

균주(strain)의 생산 및 과대-생산 클론(hyper-producing clone)의 분리: 희귀 코돈(rare codon)을 변형하여 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida(유전자 은행(GenBank) D88554.1)의 MGL의 자연 서열(natural sequence)을 최적화하였다(P. 푸티다로부터 유래된 서열(sequence)을 생산 균주인 대장균(Escherichia coli)에 적응시키기 위함). 번역 개시(translation initiation)의 컨텍스트(context)를 향상시키기 위해 기타 변형이 이루어졌다. 최종적으로, 잠재 돌연변이(silent mutation)를 수행하여 코딩 서열 내 추정 세균 프로모터의 일부인 세가지 요소(박스 -35, 박스 -10, 및 위치 56에서 전사 인자의 결합 부위)를 제거하였다. 생산 균주 대장균 HMS174 (DE3)는 최적화된 서열을 함유하는 발현 벡터(expression vector) pGTPc502_MGL (프로모터 T7)로 형질전환되고, 생산 클론을 선별하였다. 생산 클론은 GY 배지 + 0.5% 글루코스 + 카나마이신(kanamycin)에서 6 시간 내지 8 시간 (전배양(pre-culture) 1) 및 16 시간 (전배양 2) 동안 37℃에서 전배양되었다.

발효(Fermentation): 이후, 0.02의 광학 밀도에서 전배양 2로부터 제어된 압력 및 pH 하에 GY 배지를 함유하는 발효기(fermenter)에서 교반하면서 생산을 달성하였다. 성장 단계(growth phase)는 배양 배지에 1mM의 IPTG를 첨가하여 광학 밀도가 10으로 수득되고, 발현 유도(expression induction)가 28 ℃에 도달할 때까지(37 ℃에서) 일어나고, 세포 침전물(cell sediment)은 2 단계로 유도 후 20 시간에 수확된다: 세포 배양액(cell broth)을 500 kDa의 중공 섬유(hollow fiber)를 통과시킨 후 5-10배 농축시킨 다음, 세포 펠릿을 15900 x g에서 원심분리로 회수한 다음 -20℃에서 저장한다.

정제(Purification): 세포 펠릿은 해동된 다음, 용해 완충액(7v / w)에 현탁된다. 용해(lysis)는 고압 균질화에 의해 3단계로 10℃에서 (1 단계는 1000 bar에서, 이후 2, 3 단계는 600 bar에서)수행된다. 이후, 0.2% PEI를 가하고 15900 x g에서 원심분리함으로써, 세포 파쇄물(cell lysate)에 10℃에서 정화작용이 수행된다. 암모늄 설페이트(60% 포화)로 20 시간 동안 6 ℃에서 침전하기 전에 가용성 부분(soluble fraction)은 0.2μm로 멸균된다. 가용성 완충액을 사용하여 재-용해된 퇴적물에 2회의 결정화 단계를 수행하고, 제1 결정화 단계는 10 %(최종 농도)의 PEG-6000 및 10% 포화 암모늄 설페이트를 가하여 실현되며, 제2 결정화 단계는 30 ℃에서 12 %의 최종 농도의 PEG-6000 및 0.2M NaCl (최종 농도)를 가하여 수행된다. 15900 x g에서 원심분리 한 후 MGL 단백질을 함유하는 펠릿을 각 단계에서 수확한다. MGL 단백질을 함유하는 펠릿을 가용화 완충액에 재-현탁시키고 2회의 음이온 교환 크로마토그래피(DEAE 세파로스 FF)를 수행하기 전에 0.45 μm 필터를 통과시킨다. 정제된 단백질은 그 후 연마 단계(polishing step)를 거치고, 상이한 오염물(내독소, HCP 숙주 세포 단백질, 잔여 DNA)을 제거하기 위한 Q 멤브레인 크로마토그래피 캡슐(Q membrane chromatography capsule)을 통과시킨다. 최종적으로는, 정제된 MGL 단백질은 40 mg/ml로 농축되고, 10 kDa 컷-오프 접선유동 여과 카세트(cut-off tangential flow filtration cassette)를 사용하여 제형 완충액(formulation buffer)으로 투석여과된다(diafiltered). 이후, 물질은 바이알(vial) 당 약 50 mg의 단백질로 나뉘고(aliquoted), 제어된 압력 및 온도 하에서 최종적으로 동결-건조(freeze-dry)된 다음, -80 ℃에서 보관된다.

특성화 (characterization): 실시 예 4에 기재된 바와 같이 생산된 NH₃를 측정함으로써 효소의 특이적 활성(specific activity)을 결정한다. SDS-PAGE로 순도를 결정한다. 물에 용해된 후의 PLP 수준을, 실시 예 5에 기재된 방법에 따라 평가하였다. 삼투압농도(osmolarity)를 삼투압계(osmometer)(Micro-Osmometer Loser Type 15)로 측정한다.

하나의 생산된 배치의 MGL의 주요 특성이 다음 표에 요약되어 있다:

생산 방법의 설명. 실시 예 1에 기재된 MGL을 정제하는 방법은 유럽 특허 제0 978 560 B1 및 관련 문헌(참조: 타카쿠라(Takakura) 등, Appl Microbiol Biotechnol 2006)에 기재된 방법을 기초로 하여 설정한다. 이를 선택한 이유는 저자에 따르면 대규모 생산에 특히 실용적이고 용이하게 적용할 수 있다고 기술되는 결정화 단계의 간단함과 견고성(robustness)으로 설명된다. 이 단계는, 용해/정화 후 수득된 MGL 용액을 가열한 후, PEG 6000 및 암모늄 설페이트를 사용하는 것을 기초로 하고, PEG 6000/암모늄 설페이트 단계를 추가함으로써 불순물을 제거한다. 이 단계의 다른 주목할만한 점은 MGL 용액을 PEG 6000으로 처리한 후 원심분리를 수행함으로써 불순물을 제거하는 단계 동안에 높은 순도 수준을 빠르게 수득할 수 있는 가능성에 있다. 불순물은 원심분리 펠릿에서 다시 발견되며, MGL의 대다수가 상층액 내 용액에서 발견된다. 이러한 순도로 인하여, 단일 크로마토그래피 단계에서 MGL 용액이 음이온 교환기 칼럼(anion exchanger column, DEAE)를 통과하는 것은, 세파크릴 S200 HR 칼럼(sephacryl S200 HR column) 상에 겔 여과에 의한 정제 단계와 관련하여, 정제된 단백질을 수득할 수 있는 가능성을 제공한다.

작은 규모 시험을 위한 특허 방법을 설정시에는, 수득한 결과를 재현할 수 없는 것으로 나타났다. 유럽 특허 제0 978 560 B1에 따르면, 불순물을 제거하는 단계의 마지막(PEG6000/암모늄 설페이트로 처리 및 원심분리)에서, MGL 효소의 대다수가 가용성 부분에서 발견되며, 원심분리는 펠릿 내 불순물을 제거한다. 유럽 특허 제0 978 560 B1에 기재된 방법에 따라 수행된 소규모 시험을 수행하는 동안, MGL 단백질의 대다수는 원심분리 펠릿에서 다시 발견(약 80%)된다. 아래 표는 가용성 부분 내 SDS-PAGE 겔에서 농도계에 의해 평가된 MGL 퍼센트를 나타낸다.

이에 따라 예기치 않은 결과는, 1) MGL을 함유하는 원심분리 펠릿으로부터 작업하고, 2) DEAE 칼럼에 로딩(loading)한 후 불순물의 제거를 향상시키기 위한 두 번의 연속적인 결정화 단계를 수행하고, 3) DEAE 칼럼에 크로마토그래피를 최적화하여 특허된 방법의 최적화로 이어진다:

이러한 마지막 단계에서, DEAE 세파로스 FF 수지(DEAE sepharose FF resin)는 최종적으로, 시험된 완충액 및 pH 조건에서 충분히 강한 교환체(sufficiently strong exchanger)가 아님이 밝혀진다. 다른 추가의 최적화 시험을 수행한 후, 최종적으로 선택은 1) 방법의 견고성을 향상시키기 위해 초기 방법에 사용된 포스페이트 완충액을 트리스(Tris) 완충액 pH 7.6으로 대체하고, 2) MGL의 임의의 손실 (문헌: 타카무라(Takakura) 등, 2006에 따른 0.8 EU/mg 대 수정된 방법에 대한 0.57 EU/mg)없이, 내독소 수준 및 단백질 순도를 실질적으로 향상시키기 위해서 DEAE에 대한 제2 통로를 수행하는 것에 관한 것이다.

최종적으로, 대규모 GMP 생산을 위한 요건에 호환가능한 방법을 수득하기 위해서, 멤브레인 Q에 대한 연마 단계를 가하여 잔여 내독소 및 HCP 수준을 감소시켰다. 이러한 연마의 마지막 단계는 산업적 규모(비용 및 크로마토그래피 기간)에서 생산 공정에 사용되는 어려운 단계인 S200 겔 여과 크로마토그래피의 실행을 방지한다.

유럽 특허 제0 978 560 B1의 방법 및 본 발명의 방법의 상이한 정제 단계는 도 1에 도시되어 있다.

다음 표에서, 상기 제공된 적응(adaptation)이 초기 방법에 기재된 정제 방법과 적어도 동일한 수율을 가진 정제 방법을 수득하도록 유도하였음을 확인하는 가능성이 제공된다.

^$ 세파크릴 S-200 HR (유럽 특허 제978 560) 후 또는 멤브레인 Q (본 발명의 방법) 후.

실시 예 2. 뮤린 ( murine ) 적혈구 내 MGL 및 PLP의 공동-캡슐화

CD1 쥐 (찰스 리버(Charles River))의 전혈(whole blood)을 1000 x g에서 10분 동안 4℃에서 원심분리하여 혈장 및 연막(buffy coat)을 제거하였다. 적혈구를 0.9% NaCl (v:v)로 3회 세척하였다. 동결-건조된 MGL을 78.7 mg/ml의 농도로 물에 재-현탁시키고, 적혈구 현탁액에 가하여 상이한 농도의 MGL 및 PLP를 함유한 70% 헤마토크릿(hematocrit)을 갖는 최종 현탁액을 수득하였다. 이후, 현탁액을 120 ml/h의 유동 속도로 혈액투석기(hemodialyzer)에 로딩시킨 다음, 역류로서 15 ml/분의 유동 속도로 저장성 용액(hypotonic solution)으로 투석시켰다. 현탁액을 이후 고장성 용액(hypertonic solution)으로 재실링 한(resealed) 후 37 ℃에서 30 분 동안 배양하였다. 0.9% NaCl, 0.2 % 글루코스로 3회 세척한 후, 현탁액을 6 % BSA가 보충된 보존 용액 SAG-만니톨(SAG-Mannitol)에 용해시켰다. 수득된 산물은 D0 (제조 후 2 시간 이내) 및 D1 (즉, 2℃ 내지 8℃에서 18 시간 내지 24 시간 보존 후)으로 특징지어진다. 수의학 자동 장치(veterinary automaton)(Sysmex, PocH-100iV)를 이용하여 혈액학적 특성을 수득하였다.

결과:

이후 언급된 다양한 연구에서는, 수용액 내 외부 검정 범위(external calibration range)의 MGL에 대하여 실시 예 4에 기재된 방법으로, 완성된 산물 내 MGL 활성을 분석하였다. 이들 결과는, 설명이 있는 연구와 결합하여, 최종 산물 내 MGL 활성이 방법에 도입된 효소의 양과 증가하고, 양호한 안정성을 유지하면서 최종 산물의 ml 당 32 IU 이하의 MGL을 용이하게 캡슐화할 수 있음을 보여준다.

다른 연구에서, 3개의 뮤린 완성 산물인 RC-MGL-PLP1, RC-MGL-PLP2 및 RC-MGL-PLP3을 다음 방법에 따라 제조하였다:

- RC - MGL - PLP1: 3 mg/ml의 MGL 및 약 30 μM의 PLP를 함유하는 현탁액으로부터 MGL 및 PLP의 공동-캡슐화. 최종 산물(final product)은 최종 10 μM PLP가 보충된 SAG-만니톨, 6% BSA에 용해시켰다.

- RC - MGL - PLP2: 3 mg/ml의 MGL 및 약 30 μM의 PLP를 함유하는 현탁액으로부터 MGL 및 PLP의 공동-캡슐화. 완성된 산물(finished product)은 SAG-만니톨, 6% BSA에 용해시켰다.

- RC - MGL - PLP3: 3 mg/ml의 MGL 및 약 124 μM의 PLP를 함유하는 현탁액으로부터의 MGL 및 PLP의 공동-캡슐화로부터 유래한 산물. 최종 산물은 SAG-만니톨, 6% BSA에 용해시켰다.

제3 연구에서, 뮤린 최종 산물 RC-MGL-PLP4을 다음 방법에 따라 MGL의 새 배치로부터 제조하였다:

- RC-MGL-PLP4: 5 mg/ml의 MGL 및 약 35 μM의 PLP를 함유하는 현탁액으로부터 MGL 및 PLP의 공동-캡슐화. 완성된 산물은 SAG-만니톨, 6% BSA에 용해시켰다.

최종적으로, 제4 연구에서, 뮤린 산물 RC-MGL-PLP5를 다음 방법에 따라 MGL의 제3 배치로부터 제조하였다:

- RC-MGL-PLP5: 6 mg/ml의 MGL 및 ~ 100 μM의 PLP를 함유하는 현탁액으로부터 MGL 및 PLP의 공동-캡슐화. 완성된 산물은 SAG-만니톨 6% BSA에 용해시켰다.

D0 (이의 제조 후)에서 3개의 완성된 산물의 혈액학적 특성 및 생화학적 특성은 아래 표에 상세히 기재되어 있다. 캡슐화 수율은 만족스러웠으며 18.6% 내지 30.5%으로 다양하였다.

* 각 배치의 특이적 활성으로부터 계산

실시 예 3. 산업적 방법에 따라 메티오닌 감마 리아제 및 PLP를 캡슐화하는 인간 RC의 생산

문헌 (참조: "Etablissement Francais du Sang")에 의해 제공된 백혈구-소모된 인간 RC 파우치에 0.9% NaCl (세척기 Cobe 2991)로 3회 세척 주기를 수행하였다. 동결-건조된 MGL은 0.7% NaCl에 재-현탁하고, 적혈구 현탁액에 가하여 3 mg/ml의 MGL 및 약 30 μM의 PLP를 함유(MGL의 제형으로부터 유래함)하는 70% 헤마토크릿(hematocrit)을 갖는 최종 현탁액을 수득하였다. 현탁액을 균질화시키고, 유럽 특허 제 1 773 452에 기재된 방법에 따라 캡슐화를 진행하였다. 재실링으로부터 수득한 현탁액을 이후, 실온에서 3시간 동안 배양하여 대부분의 취약한 적혈구를 제거하였다. 현탁액을 0.9% NaCl, 0.2% 글루코스 용액(세척기 Cobe 2991)로 3회 세척한 후, 80 ml의 보존 용액(AS-3)으로 재-현탁시켰다. 캡슐화된 MGL 수준은 실시 예 4에서와 같이 분석하였다.

실시 예 4. 적혈구 내 캡슐화된 MGL의 분석

세포 현탁액 (총 RC) 내 및 상층액 내 MGL 활성의 분석은 MGL에 의해 생산된 NH₃의 측정을 기초로 한다. 로슈 진단학 (Roche Diagnostics) (11877984)에서 시판된 키트에 따른 글루타메이트 디하이드로게나제(glutamate dehydrogenase, GLDH)의 효소 활성에 의해, NH₃ 이온을 간접적으로 분석하였다.

표준물질의 제조: 다양한 농도의 MGL 표준물질(standards)을 매트릭스 (총 또는 상층액 RC)내 또는 수용액에 제조하였다.

- 수용액 내 표준물질에 대하여, pH 7.2에서 포스페이트 완충액 100 mM 중에 20 μM PLP의 존재 하에 0 내지 12 μg/ml로 다양한 농도로 MGL을 제조한다.

- 총 적혈구 매트릭스 표준물질에 대하여, 약 10 μl의 RC-LR을, 260 μM의 PLP 및 0 내지 100 μg/ml의 다양한 농도의 MGL을 함유하는 90 μl의 용액으로 용해시킨다. 이후, "총 RC" 표준물질은 포스페이트 완충액 100 mM, pH 7.2로 20회 희석시켰다.

- 상층액 매트릭스 표준물질에 대하여, 10 μl의 RC-LR의 상층액을 6.4 μM의 PLP 및 0 내지 20 μg/ml의 다양한 농도의 MGL을 함유하는 50 μl의 용액으로 용해시킨다.

시료의 전-처리(pre-treatment): 분석하고자 하는 시료 (10 μl)를 표준물질과 동일한 방식으로 전-처리하였다(PLP 및 동일한 희석물을 추가하였으나, MGL을 추가하지는 않음).

MGL의 분석: 표준물질(STD) 및 시료의 7.5 μl를 UV 플레이트의 웰(well)에 도입하였다. 완충 용액 내 α-케토글루타레이트(α-ketoglutarate), NADPH 및 GLDH를 함유하는 94 μl의 시약 R1 (로슈 키트(Roche kit)) 및 56 μl의 시약 R2 (로슈 키트)를 추가하여 시료의 내생(endogenous) NH₃ 이온을 제거하였다. 10분 배양한 후, 78.3 mM에서 75 μl의 L-메티오닌을 도입하고 반응 혼합물을 30분 동안 배양하였다. NADP⁺로의 NADPH의 저하(degradation)는 340 nm의 광학 밀도를 측정함으로써 연속적으로 추적된다. 표준물질 및 시료에 대하여, ΔOD/분의 값을, 340 nm에서 수득된 광학 밀도(O.D) 곡선의 선형 도메인으로 계산한다. 이후, 검정 곡선 ΔOD/분 = f (표준물질 내 MGL 농도 또는 활성)이 만들어진다. 회귀 파라미터(regression parameters)는 시료 내 MGL 농도의 결정을 허용한다. 이러한 결과는 단위: mg/ml 또는 IU/ml (특이적 MGL 활성이 각 배치에 대해 평가된다)으로 표현될 수 있다. 내부-적혈구(intra-erythrocyte) MGL 수준은 다음 식을 가진 계산식에 의해 수득된다: [MGL]_{내부-적혈구} = ([MGL]_총 - ([MGL]_상층액 x (1- 헤마토크릿/100)) / (헤마토크릿/100).

실시 예 5. HPLC 방법에 의한 혈액 시료 내 PLP의 분석

세포 현탁액 (총 RC) 및 상층액 내 PLP 분석은 문헌(참조: 반드 캄프(Van de Kamp) 등, Nutrition Research 15, 415-422, 1995)에 기재된 방법의 적응(adaptation)이다. RP-HPLC (Shimadzu UFLC)를 이용하여 형광측정(RF-10AXL 기구, 여기(excitation): 300 nm, 방출(emission): 400 nm)에 의한 검출을 통해 분석을 수행하였다. 시료에 함유된 PLP는 최종 6%로 트리클로로-아세트산(trichloro-acetic acid, TCA)으로 추출하였다. 원심분리(15,000 x g, 10 분) 후, 상층액을 수거하고 이동상 (mobile phase) A에서 희석하였다. 50 μl 시료 용량을 5 μC-18 제미니 칼럼(Gemini column), 250 x 4.6 mm (Phenomenex)에 주입하였다. 이동상 A는 33 mM의 일염기 포타슘 포스페이트(monobasic potassium phosphate) 및 PLP 신호를 강화시키기 위한 나트륨 비설파이트(sodium bisulfite, 0.5 g/l)가 보충된 8 mM의 나트륨 1-옥탄설포네이트(1-octanesulfonate)로 구성되며, 이동상 B는 33 mM의 일염기 포타슘 포스페이트 및 17% (v:v)의 2-프로판올(2-propanol)로 구성된다. 사용된 구배(gradient)는, 8 분에 걸쳐 0% 에서 8%로 증가하는 증가된 비율의 이동상 B를 갖는 이동상 A(100%)이다. 칼럼을 통한 유동은 1 ml/분으로 유지된다. 시료 내 PLP 농도는 시료와 동일한 TCA 처리가 수행된 PLP의 외부 표준 범위로 결정된다. PLP의 보유 시간은 약 3.4 분이다. 내부-적혈구 PLP 수준은 다음 식을 가진 계산식에 의해 수득된다: [PLP]_{내부-적혈구} = ([PLP]_총 - ([PLP]_상층액 x (1- 헤마토크릿/100)) / (헤마토크릿/100).

실시 예 6. MGL을 이용한 PLP의 공동-캡슐화에 의한 적혈구 내 PLP 수준의 증가 .

뮤린 RC의 현탁액에, 실시 예 2에 기재된 MGL 및 PLP를 캡슐화하는 방법을 수행한다. 실시 예 5에 기재된 방법에 따라 세포내 PLP 분석을 수행한다.

인간 RC의 현탁액에, 실시 예 3에 기재된 MGL 및 PLP를 캡슐화하는 방법을 수행한다. 실온에서 배양 단계 전에, 인간 RC-MGL-PLP의 일부를 샘플링하여 실시 예 5에 기재된 방법에 따라 세포내 PLP의 분석을 수행한다.

다음 표는, 인간 또는 뮤린 적혈구의 PLP의 생리학적 수준을, MGL을 이용하여 PLP를 공동-캡슐화하여 수득한 수준과 비교한 결과를 나타낸다.

* 계산의 세부사항: 7.5 nmol/g Hb ~2.4 μM (32 g/dl의 CCMH를 가정함).

실시 예 7. 피리독신을 이용한 생체외 배양에 의한 RC - MGL 내 PLP 농도 증가의 입증.

인간 RC의 현탁액에, 실시 예 3에 기재된 MGL을 캡슐화하는 방법을 수행한다. 배양 3시간 전에, RC의 일부를 샘플링하고, 다양한 농도 (0 mM, 2 mM, 및 4 mM)의 피리독신으로 용적-대량 배양을 위해 세 부분으로 분리하였다. 균질화한 후, 이 현탁액을 실온(room temperature, RT)에서 배양하였다. 3시간 및 24 시간 배양한 후, 세포 현탁액 및 상층액의 시료(1000 x g, 4℃에서 10 분 동안 상층액을 원심분리 후 수득)를 제조한 다음, 실시 예 5에 기재된 바와 같이 HPLC에 의한 PLP 농도를 측정하기 위해 냉동시켰다.

수득된 결과는 도 2 및 도 3에 도시된다.

피리독신의 부재(absence)에서, 내부-적혈구 PLP 수준은 3.9 μM (MGL 및 PLP의 공동-캡슐화로부터 유래된 PLP)이었다. 이러한 PLP 농도는 3시간 및 24시간 배양 후 일정하게 유지된다. 24시간째에 PLP 농도가 약간 감소하는 것이 관찰되며, 배양 마지막에는 용혈(hemolysis)로 설명될 수 있는 세포외 PLP(extracellular PLP)의 발생이 수반된다.

피리독신의 존재(2 mM 또는 4 mM)에서는, 용량 효과의 발생과 함께 배양 3시간 후 요소 2(약 8 μM의 PLP) 및 배양 24 시간 후 대부분 요소(factor) 3에 의해 증가된 내부-적혈구 농도와 함께 RC-MGL가 PLP 내에서 강화된다(2 mM 및 4 mM의 각각의 피리독신 농도에 대해 11 μM 및 14 μM). 이러한 결과는 PLP에 의존하는 PLP 효소를 피리독신(pyridoxine, PN)과 캡슐화하는 RC 현탁액을 배양하여 세포내 PLP 수준(intracellular PLP level)을 장기간 지속적인 방식으로 증가시킬 수 있음을 보여준다.

실시 예 8. 쥐(mice) 내 MGL - PLP를 캡슐화하는 RC의 약물 동력학 (pharmacokinetics).

뮤린 산물(murine products) RC-MGL-PLP2, RC-MGL-PLP3, RC-MGL-PLP4 및 RC-MGL-PLP5은 CFSE (형광(fluorescent))으로 표지된 다음, 정맥 주사로(intravenously) CD1 쥐 내에 주입되었다. 다양한 시간 (3개 산물에 대해 0일 + 15분, 1일, 2일, 5일, 추가로 RC-MGL-PLP4 산물에 대해 14일 및 28일, 및 RC-MGL-PLP5 산물에 대해 14일) 후, 쥐는 희생되고, 약물 동력학을 결정하기 위해 빛으로부터 멀리하여 +4℃에서 유지한 리튬 헤파린염 튜브(lithium heparinate tube)에 피를 수거하였다. 전혈 내 CFSE로 표지된 적혈구 세포의 비율은, 유동 세포 계측법(flow cytometry method)에 의해 결정된다. 전혈 5 마이크로리터를 1ml의 PBS 0.5% BSA로 희석시키고, 각 시료를 3회 통과시켰다(FL-1 중 10,000 세포의 계수; 사이토미터(cytometer) FC500, 베크만 쿨터(Beckman Coulter)). MGL로 로딩된 적혈구 세포의 생존을 평가하는 것은, 다양한 시간으로 CFSE로 표지된 적혈구의 비율을, T0 + 15 분 (100% 대조군)에 CFSE로 표지된 적혈구의 비율에 추가함으로써 수행된다. 각 시간 별로 수득한 다양한 비율은, 시간에 대한 순환 내 MGL로 로딩된 적혈구의 비율을 도시하는 그래프 (도 4)에 표시된다.

상이한 시간에 순환되는 피(circulating blood)에서 CFSE로 표시된 RC의 비율을 결정함으로써, 주입 후 120 시간까지 쥐의 생체 내(in vivo) 4가지 산물의 우수한 안정성을 보여준다 (각각, 83.5 ± 0.6 %, 94.7 ± 0.6 %, 87.3 ± 5.6 % 및 76.8 ± 1.3 % 생존율). 산물 RC-MGL-PLP4에 대하여, 29일에 걸친 약물 동력학 연구는 MGL을 캡슐화하는 적혈구 세포의 반감기가 약 12.6 일임을 나타내었다.

실시 예 9. 24시간에서의 L-메티오닌 소모

실시 예 2에 따라 제조되고 특성화된 뮤린 산물 RC-MGL-PLP1, RC-MGL-PLP2 및 RC-MGL-PLP3은, 8 ml/kg의 용량으로 정맥 주사로 CD1 쥐 내에 주입되었다. 6시간 후, 약 0.09 mg의 피리독신(즉, 150 μL의 2.9 mM 피리독신 하이드로클로라이드 용액(pyridoxine hydrochloride solution))을, RC-MGL-PLP2을 수득한 쥐에게 주입하였다. HPLC-MS-MS로 L-Met 혈장 수준을 24시간에 평가하였다 (문헌 참조: 피라우드 엠(Piraud M) 등, Rapid Commun. Mass Spectrum. 19, 3287-97, 2005).다음 표는 주입된 쥐의 다양한 그룹에서 수득된 소모를 나타낸다.

대조군 쥐에서 L-Met 혈장 수준은 82.7 ± 22.5 μM로 평가되었다. 저농도의 PLP로 캡슐화된 MGL을 함유하는 산물 RC-MGL-PLP1은 산물을 투여한 후 24시간에 L-Met가 44% 소모하였다. 1) 대다수가 보존 용액에 존재하는 BSA와 결합되어 있으며, 2) RC의 멤브레인을 통과할 수 없기 때문에 산물의 보존 용액에 가해진 PLP가 효소 MGL에 대해 이용가능하지 않다는 가설을 세웠다.

이러한 결과는, 피리독신 (RC-MGL-PLP2)의 정맥 내(IV) 주입에 의하거나, 또는 더 강한 농도에서의 PLP의 캡슐화에 의한 적혈구(red corpuscle) 내 PLP의 보다 결과론적인 제공이 L-Met 소모를 약 1.5 배 더 크게 증가시킬 가능성(각각, 73% 및 64% 소모)을 제공한다는 것을 보여준다.

실시 예 10. RC - MGL의 약물 동력학

자유 형태(free form)의 MGL 효소는 8 ml/kg 용량으로 정맥 주사로 CD1 쥐 내에 주입되었다. 두 시리즈의 주입이 수행되었는데, 제1 주입은 0.45 mg/ml (산물 MGL-L1)의 효소 농도로 수행되며, 제2 주입은 2배 높은 농도인 0.90 mg/ml (산물 MGL-L2)로 수행된다. 주입 6시간 후, 약 0.09 mg의 피리독신(즉, 150 μL의 2.9 mM 피리독신 하이드로클로라이드 용액)을, MGL-L1 및 MGL-L2을 수득한 쥐에게 주입하였다. L-Met 혈장 수준을 MGL-L1의 주입 후 15 분, 24 시간, 48 시간, 및 120 시간 및 MGL-L2의 주입 후 15 분, 24 시간, 48 시간, 120 시간 및 144 시간에 HPLC-MS-MS 로 평가하였다. 도 5는 주입된 쥐의 다양한 그룹에서 수득된 소모(depletions)를 나타낸다.

실험 그룹 둘 다에서, 매우 강한 L-메티오닌 소모(대략 4 μM) 및 시간 경과에 따른 신속한 소모(주입 후 15 분)를 결과로 보여준다. 그러나, 이러한 소모는 일시적인 것으로 시간이 흐르면서 유지되지 않고, L-메티오닌 수준은 주입 후 24시간에 대조군의 값으로 돌아가며, P5P(희석 완충액 뿐만 아니라 물에 용해된 효소의 제형에도 존재함)의 초기 제공 및 비타민 B6를 보충함에도 불구하고, RC-MGL-PLP2 산물에 대해 수행된 것과 동일하다. 이에 따라, 아마도 순환 효소의 신속한 제거로 인하여, 주입 후 15분 내지 24시간에 자유 MGL의 활성은 소실된다.

제2 단계에서는, 실시 예 2에서 제조되고 특성화된 뮤린 산물 RC-MGL-PLP2 및 RC-MGL-PLP3는, 8 ml/kg의 용량으로 정맥 주사로 CD1 쥐 내에 주입되었다. 6시간 후, 약 0.09 mg의 피리독신(즉, 150 μL의 2.9 mM 피리독신 하이드로클로라이드 용액)은, RC-MGL-PLP2을 수득한 쥐에게 주입되었다. L-Met 혈장 수준을 주입 후 15 분, 24 시간, 48 시간, 및 120 시간에 HPLC-MS-MS 로 평가하였다. 도 6 및 다음 표는 주입된 쥐의 다양한 그룹에서 수득된 소모를 나타낸다.

실험 그룹 둘 다에서, L-메티오닌 소모가 약 35 μM에서 안정화되고, 시간이 흐르면서(주입 후 48시간 내지 120 시간) 유지됨을 결과로 보여준다. 이러한 결과는 PLP 또는 이의 전구체 (비타민 B6)를 보충하여 쥐 내 주입 후 적어도 120 시간 동안 적혈구(RC)에 캡슐화된 MGL의 활성을 유지하는 가능성을 제공하는 것임을 의미한다. 이를 시사하는 것으로서, 다양한 산물(자유 형태의 MGL 또는 적혈구 세포 내 PLP와 공동-캡슐화된 MGL)에 대해 주입 후 혈장 24 시간 및 120 시간의 L-메티오닌 농도가 다음 표에 제공된다.

120 시간을 초과하는 약물 동력학을 평가하기 위해서, 완성된 산물 내 0.5 mg/ml의 효소의 캡슐화된 MGL의 농도를 갖는 뮤린 산물 RC-MGL-PLP4은, 10 ml/kg의 용량으로 정맥 주사로 CD1 쥐 내에 주입되었다. 6시간 후, 약 0.09 mg의 피리독신(즉, 150 μL의 2.9 mM 피리독신 하이드로클로라이드 용액)은, RC-MGL-PLP4을 수득한 쥐에게 주입되었다. L-Met 혈장 수준을 HPLC-MS-MS로 평가하였다. 도 7은 주입 후 15 분, 1일, 2일, 5일, 14일 및 28일에 수득된 소모를 나타낸다.

L-메티오닌의 상당한 소모(대략 10 μM, 대조군은 대략 68 μM) 및 시간 경과에 따른 신속한 소모(주입 후 15 분)를 결과로 보여준다. 그러나, 이러한 소모는 24 시간 내지 48 시간에 약 25 μM으로 약간 안정화되고, 5일 후 약 40 μM 까지 증가하여 RC-MGL-PLP4 주입 후 약 12일째에는 대조군의 값을 마침내 수득하였다.

마지막으로, 주입된 MGL 효소의 잔여 활성(residual activity)을, PLP의 존재하에 실시 예 4에 기재된 분석 방법에 따라 결정하였다. 이하, 도 8은 자유 효소(free enzyme) MGL-L2, 다양한 산물의 RC-MGL-PLP 및 TPL 효소(문헌으로부터 수득한 데이터)에 대하여, 시간 대비 잔여 활성을 도시하고 있다.

뮤린 적혈구 세포 내 MGL을 캡슐화함으로써, 24시간에 강한 효소학적 활성을 유지(약 60% 내지 100%의 잔여 활성)하는 것이 가능하다는 것을 결과로 나타낸다. 잔여 활성은 48 시간에 약간 감소(약 35% 내지 100%)하다가, 약 20% 내지 약 65%의 값에서, 주입 후 120 시간 까지, 즉 5일 까지 유지된다. 자유 형태의 MGL의 잔여 활성은 주입 후 1분에 급격하게 감소하다가 24 시간에 거의 제로(잔여 활성 <10%)가 된다. 비교하자면, 자유 형태로 주입된 TPL의 잔여 활성이 그래프로 도시되며, 주입 후 5시간에 겨우 37% 이었다(참조 문헌: 엘머(Elmer) 등, 1978). 잔여 활성의 측정은 효소학적 활성을 유지하기 위한 적혈구 내 PLP 효소의 캡슐화의 장점을 확실하게 나타낸다.

Claims

환자에게 투여하기 위한 약학적 조성물(pharmaceutical composition)에 있어서,
적혈구(erythrocyte) 및 약학적으로 허용되는 부형제(pharmaceutically acceptable vehicle)를 포함하고, 상기 적혈구는 PLP-의존성 효소(PLP-dependent enzyme) 및 피리독살 포스페이트(pyridoxal phosphate, PLP)를 캡슐화(encapsulating)하며,
상기 PLP-의존성 효소는,
메티오닌아제(methioninase), 티로신 페놀-리아제(tyrosine phenol-lyase), 티로신 아미노트랜스퍼라제(tyrosine aminotransferase) 및 시스타티오닌 베타-신타아제(cystathionine beta-synthase) 중에서 선택되며,
상기 약학적 조성물은 별도(separate), 동시(simultaneous), 또는 순차적(sequential) 투여를 위한, 비-포스페이트 PLP 전구체(non-phosphate PLP precursor)를 더 포함하며,
상기 비-포스페이트 PLP 전구체는,
피리독살(pyridoxal), 피리독신(pyridoxine) 및 피리독사민(pyridoxamine) 중 적어도 하나에서 선택되며,
상기 적혈구는 상기 비-포스페이트 PLP 전구체를 PLP로 전환시키기 위해 피리독신 키나제(pyridoxine kinase, PN-kinase) 및 피리독신 포스페이트 옥시다제(pyridoxine phosphate oxidase, PNP-oxidase)를 더 포함하여, 투여 후 24시간 이상 PLP-의존성 효소 활성을 제공하는,
약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 비-포스페이트 PLP 전구체는,
상기 적혈구 내에 캡슐화되어 있거나 상기 적혈구 외부에 존재하는, 약학적 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 적혈구 내에 캡슐화된 포스페이트 PLP 전구체를 더 포함하며,
상기 PLP 포스페이트 전구체는
PNP(피리독신 포스페이트(pyridoxine phosphate)) 및 PMP(피리독사민 포스페이트(pyridoxamine phosphate)) 중 적어도 하나에서 선택되는, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
적혈구 세포 ml 당 0.01 내지 30 mg의 상기 PLP-의존성 효소를 포함하는, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
적혈구 세포의 리터(liter, L) 당 0.05 내지 600 μmol의 캡슐화된, PLP, PNP 및 PMP 중 적어도 하나를 포함하는, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
무기 포스페이트(inorganic phosphate)를 더 포함하는, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
약물(drug)로서 사용하기 위한, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
동시(simultaneous), 별도(separate) 또는 순차적(sequential) 투여(administration)를 위해, 한편으로는(on the one hand) 상기 PLP-의존성 효소, 및 다른 한편으로는(on the other hand) 비타민 B6의 비-포스페이트 형태를 캡슐화하는 상기 적혈구 및, 약학적으로 허용되는 부형제(vehicle)를 포함하는, 약학적 조성물.
제1항에 따른 상기 약학적 조성물의 제조 방법에 있어서,
상기 제조 방법은,
A) 적혈구의 현탁액(suspension of erythrocytes)을 적혈구 멤브레인 내 기공의 개구(opening)를 생성하는 저장성 액체 배지(hypotonic liquid medium)와 접촉시키는 단계;
B) 상기 적혈구의 현탁액을, 기공 개구 전 또는 후에 PLP-의존성 효소와 접촉시키는 단계;
C) 상기 효소가 상기 적혈구로 들어가는 단계;
D) 기공은 고장성 완충액(hypertonic buffer)을 사용하여 닫히고, 상기 효소를 함유하는 재실링된(resealed) 적혈구의 현탁액을 모으는(collect) 단계; 및
E) 적혈구의 현탁액을 세척하고 보존 용액(preservation solution)으로 조절하는 단계;를 포함하는,
약학적 조성물의 제조 방법.
제9항에 있어서,
상기 약학적 조성물은 포스페이트 PLP 전구체를 더 포함하고,
상기 포스페이트 PLP 전구체는,
PNP(피리독신 포스페이트(pyridoxine phosphate)) 및 PMP(피리독사민 포스페이트(pyridoxamine phosphate)) 중 적어도 하나에서 선택되며,
상기 제조 방법에서,
상기 PLP 및 상기 PLP 포스페이트 전구체가, 상기 PLP-의존성 효소와 공동-캡슐화(co-encapsulate)되는, 약학적 조성물의 제조 방법.
제9항에 있어서,
상기 제조 방법에서,
상기 비-포스페이트 PLP 전구체는,
기공 개구 전 또는 후에 상기 적혈구의 현탁액에 추가되고/추가되거나, 배양하는 동안 또는 보존 용액에 추가되는, 약학적 조성물의 제조 방법.
제9항에 있어서,
상기 A) 단계 전에,
적혈구의 펠릿(pellet)을 생리학적 완충액으로 1회 이상 세척하고 원심분리(centrifuged)하는 단계;를 더 포함하는, 약학적 조성물의 제조 방법.
제9항에 있어서,
상기 D) 단계와 상기 E) 단계 사이에,
가장 취약한 적혈구를 제거하기 위해 적혈구의 현탁액을 배양하는 단계;를 더 포함하는, 약학적 조성물의 제조 방법.
제9항에 있어서,
PLP는 상기 PLP-의존성 효소와 공동-캡슐화되고, 하나 이상의 상기 비-포스페이트 PLP 전구체는, 기공 개구 전 상기 적혈구의 현탁액, 기공 개구 후 상기 적혈구의 현탁액, 배양 동안의 상기 적혈구의 현탁액 및 보존 용액 중 적어도 하나에 추가되는, 약학적 조성물의 제조 방법.
제14항에 있어서,
상기 비-포스페이트 PLP 전구체는, 피리독신인, 약학적 조성물의 제조 방법.
제1항에 있어서,
환자에서 혈장 또는 순환 메티오닌(plasma or circulating methionine)을 소모(deplete) 또는 감소시키는, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
적혈구 세포 ml 당 0.05 내지 10mg의 상기 PLP-의존성 효소를 포함하는, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
적혈구 세포의 리터 당 0.5 내지 100 μmol 의 캡슐화된, PLP, PNP 및 PMP 중 적어도 하나를 포함하는, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
적혈구 세포의 리터 당 5 내지 50 μmol 의 캡슐화된, PLP, PNP 및 PMP 중 적어도 하나를 포함하는, 약학적 조성물.
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