CN104094117A - 用于评估能够保持上皮干细胞的功能的活性剂的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于体外评估至少一种活性剂的方法，所述活性剂能够保持上皮干细胞的功能，特别是维持或刺激角蛋白物质的生长及/或密度及/或更新，所述方法在于，测定所述活性剂模拟所述角蛋白物质中的低氧状态的能力，与未用所述活性剂处理的角蛋白物质相比，在用所述活性剂处理的所述角蛋白物质中，所述活性剂能够增加作为低氧的生物标记的至少碳酸酐酶IX的表达。本发明还涉及所述方法的用途。

Description

用于评估能够保持上皮干细胞的功能的活性剂的方法
 
本发明涉及一种用于体外评估至少一种活性剂的方法，所述活性剂能够保持上皮干细胞的功能，特别是维持或刺激角蛋白物质、特别是头发或皮肤的生长及/或密度及/或更新。具体地，此类评估方法对于选择用以维持或增加头发密度及/或对抗皮肤衰老的候选者有用。
角蛋白物质，特别是头发及皮肤包含上皮干细胞，通常，所述上皮干细胞除了其多能性能力以外，还能够分化成构成机体组织的多种细胞及自我更新。这些功能对于组织再生是必需的，但可随时间经历某些改变或功能不良。
具体地，人的头发代表大约15万根头发的集合。其中的每一根头发由皮肤的专门的二级组件，一个真正的自主性器官毛囊生成。头发的生长及其更新不是一个连续的过程，它由毛囊的活性及其基质环境决定。此类毛囊的活性是周期性的，并且基本上包括四个时期。实际上，毛囊相继经历以下时期：从产生毛干的生长期(毛发生长初期(anagen phase))，到快速退化期(毛发生长中期(catagen phase))，然后到脱发的静止期(毛发生长终期(telogen phase))，之后为再生(再生(neogen))期，从而再次达到毛发生长初期。毛发生长初期是活动期或生长期，期间头发变长，其持续数年。非常短的毛发生长中期持续几周。终期或静止期持续几个月。在这个静止期结束时，头发脱落，并且另一个周期重新开始。因此，头发一直经历不断的更新，并且，在构成头发的大约15万根头发中，大约10%的头发处于静止期，并且会在未来几个月内被替换。
对于正常的生理状态，天然的脱发估计可在平均每天几百根头发。这个恒定的物理更新过程在衰老期间经历自然变化，头发变得较细并且其周期变得较短。
然而，各种原因可以导致大量的暂时性或永久性脱发。脱发，尤其秃发基本上是由头发更新的破坏而引起。这些破坏最初导致毛发生长初期缩短及头发逐渐变细，然后导致其量降低。毛球（bulb）的逐渐小型化与通过外部结缔鞘的胶原基质的逐渐增厚造成的其隔离结合发生。因此，对于各周期，毛囊周围的血管再形成更加困难。头发退化并且小型化，直到它们仅仅为无色素的短绒毛，并且这种现象导致头发逐渐掉光。
在男性中，优先受到影响的部位特别是颞叶或额叶，并且在女性中，观察到头顶弥漫性秃发。
术语秃发也涵盖最终导致部分或总体永久性脱发的整个毛囊族的损坏。更具体地，它是雄激素性秃发。在相当多的情况下，过早脱发发生在遗传倾向的个体中，那么它是男性型(androchronogenetic)秃发；这种形式的秃发尤其涉及男性。
此外，已知某些因素，例如荷尔蒙失调、生理应激或营养不良会加重这种现象。另外，脱发或改变可以联系到季节性现象。
通常，影响这些过程的任何因素，即周期频率的加速、毛球的逐渐小型化、毛囊周围的胶原基质的逐渐增厚、外部结缔鞘的增厚及血管形成的减少都会对毛囊的生长具有影响。
毛囊在结构上由两个不同的隔室构成：上皮隔室及真皮(间充质)隔室，并且这两个隔室之间的相互作用对于头发的形态发生及再生长以及对于维持毛囊的周期是必不可少的。上皮隔室的功能的维持依赖于各种干细胞储库的存在及活性。上皮干细胞的第一个储库被确定在啮齿类动物中的称为“隆起(bulge)”的区域中(Cotsarelis G, Sun TT, Lavker RM. (1990) Cell 61: 1329-1337)。由于这个第一次发现，已经确定角质形成细胞干细胞的其它储库，始终在啮齿类动物中。这些干细胞在毛囊的形态发生中起重要作用，但它们在损伤事件中也参与表皮修复。对人毛囊的研究更加少见，但揭示存在至少两个特征在于角蛋白19的表达的上皮干细胞储库，它们嵌在毛囊的外根鞘(ORS)(上三分之一及下三分之一)中(Commo S, Gaillard O, Bernard BA. (2000) Differentiation 66:157-164)。
尽管这些干细胞储库公认对于维持及再生毛囊绝对必要，但在目前，对这些细胞群随年龄及/或随秃发(所有类型的秃发都包括在内)的开始及进展的变化知之甚少。最近已经证实，患有秃发的男性的脱发伴随着不是干细胞而是祖细胞(更活跃，增殖细胞)的某些群体的消失。这些结果表明，秃发可能与毛囊干细胞的活化或祖细胞的完全再生潜力的表达的问题有关(LA Garza等人. (2011) J Clin Invest. 121: 613-622)。
因此，为了在个体的整个生命期间保持头发的质量、密度及形态，允许更好地保持毛囊上皮干细胞的功能/活性的技术方案的确定将是非常重要的。
考虑到微环境(生态位)在各种不同组织中的干细胞的活性及功能的调节中的重要性，本发明人进行了研究，以便确定可调节上皮干细胞的活性的环境因素。
为此，除了对毛囊上皮干细胞进行研究以外，本发明人还同时将其研究拓宽到了皮肤上皮细胞。
令人惊奇及出乎意料的是，本发明人由此发现，毛囊或皮肤上皮干细胞的某些储库浸在低氧环境中。这个观察是通过碳酸酐酶IX所揭示，碳酸酐酶IX是在低氧条件下表达增加的蛋白质(S Kaluz等人.  (2010) Biochim Biophys Acta 1795:162-172)。
通过借助双重免疫荧光检测试验证实碳酸酐酶IX的子集表达CD34，并且将此与指出具有CD34的干细胞在秃发个体中耗尽的出版物LA Garza等人.(2011) J Clin Invest.121: 613-622结合，本发明人因此制定了如下假设：低氧状态的信号的感应能够维持上皮干细胞的功能。
因此，本发明的主题是用于体外评估至少一种活性剂的方法，所述活性剂能够保持上皮干细胞的功能，特别是维持或刺激角蛋白物质的生长及/或密度及/或更新，所述方法在于，测定活性剂优选在正常氧条件下模拟角蛋白物质中的低氧状态的能力，与未用活性剂处理的角蛋白物质相比，在用活性剂处理的角蛋白物质中，活性剂优选在正常氧条件下能够增加作为低氧的生物标记的至少碳酸酐酶IX的表达。
优选地，这种方法在于，在用活性剂处理正常氧状态下的角蛋白物质后，测定活性剂模拟角蛋白物质中的低氧状态的能力。
术语“模拟”是指，活性剂能够增加低氧的生物标记(在这种情况下，至少碳酸酐酶IX)的表达(即表达或过表达)，所述生物标记在正常氧状态下通常很少表达或者根本不表达。
术语“正常氧状态”是指分子氧的水平对应于周围地球大气的水平，即21%。
术语“低氧状态”是指分子氧的水平严格小于周围地球大气的水平，例如小于5%，例如等于3%。
因此，活性剂具有以下能力：从在正常氧状态下的角蛋白物质开始，使所述角蛋白物质处于低氧型状态，由此能够实现与上皮干细胞的低氧微环境相当的效果。
作为低氧的生物标记的至少碳酸酐酶IX的表达可以通过标记呈其蛋白质形式的碳酸酐酶IX，优选通过所述蛋白质的免疫荧光标记或蛋白质印迹法，及/或通过碳酸酐酶IX的转录组学分析来证实。
如上文所定义的方法的依赖性或非依赖性目标作为变型或另外可以在于，观察毛囊外鞘的近端区域的基底层中一个(或更多个)低氧生物标记，例如碳酸酐酶IX的表达。
据本发明人所知，没有现有技术文献教导或建议使用此类用于就活性剂模拟低氧的能力对其进行评估的方法，具体地，通过分析作为这种低氧的生物标记的至少碳酸酐酶IX的表达，具体地，以研究其保持上皮干细胞的功能的性能为目的，先前的研究目前基本上指出，低氧条件对胚胎干细胞的生物学(U Silvan等人(2009) Differentiation 78:159-168)以及衍生自成体组织的干细胞(例如，神经元干细胞或造血干细胞)的生物学(P Eliasson及JI Jonsson (2010) J Cell Physiol 222:17-22；DM Panchision (2009) J Cell Physiol 220:562-568)具有相当大的影响。
在细胞水平上，低氧条件尤其对细胞周期的控制、代谢及氧化应激应答能力具有影响。细胞对低氧条件的应答在HIF (低氧诱导性因子)、特别是HIF-1的控制下，HIF-1是由两个亚基，即HIF1-α (阿尔法)及HIF1-β (贝它)构成的转录因子，并且调节超过100个参与细胞周期、存活、分化、自噬等的基因的转录。HIF1的激活根据细胞的氧合状态精细调节。在高氧合(“正常氧”)的条件下，HIF1-α亚基由脯氨酰4-羟化酶羟化，从而能够实现其泛素化及其蛋白酶体降解。相反，当分子氧压力降低(低氧)时，这个亚基不再降解，因此可积聚及迁移到细胞核，以便结合HIF1-β亚基，并由此形成转录因子HIF1。
因此，在这种评估方法的上下文中，优选的解决方案可在于，测定对应于本发明的评估方法的待测试的活性剂是否具有作为脯氨酰羟化酶的抑制剂的能力，作为脯氨酰羟化酶的抑制剂的目的在于，阻止其使这个转录因子、具体地HIF-1蛋白的α (阿尔法)亚基降解，由此维持上皮干细胞的低氧状态。当然，这种作用途径不应视为限制性的，活性剂可以出于产生这种低氧效应的目的参与一种以上其它附加的或不同的作用途径。
本发明的主题也是如上文所定义的评估方法的用途，其用于测定一种以上能够维持或增加头发密度及/或能够对抗皮肤衰老的活性剂。
本发明的其它特征、性能及优点将在阅读下面的说明及实施例后更加清楚地显现。
 
角蛋白物质
本发明的评估方法使用角蛋白物质。
术语“角蛋白物质”是指角蛋白纤维及皮肤。具体地，角蛋白纤维涉及头发、眉毛、睫毛及体毛。优选地，角蛋白纤维是指头发。
此类角蛋白物质在体外进行测试，在某种意义上说，它是在与它所属的有机体分离的情况下进行测试。
为此，它可以例如源自外科手术废弃物、活组织检查、毛囊或皮肤的角质形成细胞的培养物或上皮干细胞的培养物，例如毛囊或皮肤的上皮干细胞的培养物。
活性剂
本发明的评估方法使用至少一种活性剂，使其与如上文所定义的分离的角蛋白物质同在。
优选地，打算在角蛋白物质上进行测试的活性剂能够在正常氧条件下在被测试的角蛋白物质上模拟低氧。
本发明的活性剂可以关于其增加所述分离的角蛋白物质内的作为低氧的生物标记的至少碳酸酐酶9的表达(即，表达或过表达)的能力进行测试。
此类活性剂还可以关于其表达或过表达低氧的一种以上其它生物标记的能力进行测试。
例如，根据一个特定的实施方案，这种活性剂可以关于其增加作为低氧的生物标记的葡萄糖转运蛋白1 (GLUT-1)的表达(即表达或过表达)的能力进行测试。
根据一个特定的实施方案，这种活性剂间接地作用于HIF-1蛋白。具体地，这种活性剂作用于HIF-1降解酶。更具体地，这种活性剂优选作为脯氨酰羟化酶抑制剂。
优选地，活性剂能够独立于细胞氧合水平而作用于HIF-1蛋白的表达水平的稳定。
还优选地，这种活性剂不会导致HIF-1的转录组学变化，特别是不会导致HIF-1基因表达的变化。
因此，所述活性剂优选仅间接作用于HIF-1蛋白。
评估方法
本发明的评估方法的目的在于，研究一种以上活性剂对上皮干细胞的功能的保持的影响，所述研究通过观察一种以上活性剂在分离的角蛋白物质上模拟低氧状态的能力，通过观察与未处理的对照角蛋白物质相比，作为低氧的生物标记的至少碳酸酐酶IX的表达来进行。
第一种评估方法可以在于，通过例如免疫荧光或蛋白质印迹法对作为低氧的生物标记的至少碳酸酐酶IX蛋白进行标记，优选免疫标记。更具体地，用对作为低氧的生物标记的碳酸酐酶IX具有特异性的抗体对角蛋白物质(例如，源自人头皮的组织、具体地毛囊，或毛囊或皮肤的角质形成细胞的培养物)进行分析，可使用所述分析观察在存在或不存在活性剂下，分别在低氧条件下及在正常氧条件下表达的变化，以便研究活性剂是否能够模拟低氧状态。
第二种评估方法可以在于，使用RT-qPCR技术，在角蛋白物质上，例如在角质形成细胞或毛球的体外培养物上，所述角质形成细胞或毛球通过显微切割分离并放置于离体培养物中，在存在或不存在所述待测试活性剂下，在低氧条件下及在正常氧条件下，对碳酸酐酶IX进行转录组学分析，其中，低氧信号改变对应基因的表达，以便研究活性剂是否能够模拟低氧状态。
可以任选地向这两种评估方法添加方法，以便确立能够模拟低氧的活性剂对上皮干细胞的质量的影响。为此，可对角质形成细胞(包括上皮干细胞)进行CFE (集落形成效率)测试，在于，分别在低氧条件下及在正常氧条件下，在存在或不存在活性剂下，观察活性剂的存在对给定群体内能够产生细胞克隆的细胞的出现率以及对所获得克隆形态的影响，以便由此确立它们参与用活性剂处理的上皮干细胞的功能的保持。
根据一个例示性的非限制性实施方案，可以执行这些评估方法中的至少一种方法或全部这些评估方法，以便确立一种以上活性剂对作为低氧的生物标记的至少碳酸酐酶的表达的影响。
附图简述
图1：通过蛋白质印迹法分析HIF1-α蛋白的表达/稳定水平。
实施例
下文给出本发明的评估方法的若干个实施例，以作为对本发明的例示说明。这些实施例并不限制本发明的范围，本领域的技术人员能够使用本身已知的其它方法证实作为低氧的生物标记的碳酸酐酶IX对角蛋白物质的刺激。
I- 方案及结果
作为对对应于本发明的评估方法的活性剂的例示说明，可以提及吡啶二羧酸及某些衍生物，特别是酯及酰胺。作为实例，使用已知适合用于抑制脯氨酰羟化酶的化合物，在这种情况下，选自通式(I)的吡啶二羧酸的衍生物或一种其盐的化合物：
        (I)
在式(I)中：
- R1及R2彼此独立地表示OH、OR’、-NH2、-NHR’或-NR’R”，其中R’及R”彼此独立地表示饱和或不饱和的直链或支链的C1-C18烷基或芳基，这个芳基或烷基任选地被至少一个OH、烷氧基、酰氧基、氨基或烷基氨基取代，或者R’与R”一起表示杂环，如申请EP1352629中所提及，并且具体地，使用吡啶-2,4-二甲酸二乙酯。
1/第一种评估方法的实施例
这个第一种方法在于，在不存在及存在吡啶-2,4-二甲酸二乙酯下，在使用对作为低氧的生物标记的碳酸酐酶IX具有特异性的抗体进行免疫荧光标记后，用光学荧光显微镜观察毛囊。
借助于这种方法，可以观察碳酸酐酶IX蛋白的表达，更甚者，所述蛋白位于含有毛囊上皮干细胞的毛囊外鞘的近端区域的基底层中。
2/第二种评估方法的实施例
这个第二种方法在于，使用RT-qPCR技术，在毛球上，对编码碳酸酐酶IX的基因进行转录组学分析，低氧信号改变所述基因的表达，所述毛球在人头皮下皮的水平上通过显微解剖分离并在低氧条件(3%分子氧)下或在21%分子氧下，在不存在(对照)或存在吡啶-2,4-二甲酸二乙酯下，在培养物中离体放置4小时。
所有毛球在低氧条件下或在正常氧条件下，在存在吡啶-2,4-二甲酸二乙酯下培育4小时后，观察到碳酸酐酶9的标准表达，表明用吡啶-2,4-二甲酸二乙酯处理诱导的分子谱与由低氧诱导的分子谱类似。
3/第三种评估方法的实施例
这第三个实施例在于，使用蛋白质印迹技术作为基础，对HIF1-α蛋白的表达/稳定水平进行分析。概括地说，在正常氧条件下，HIF1-α蛋白在脯氨酸残基上被羟化(由脯氨酰羟化酶催化的反应)，泛素化，随后由蛋白酶体降解。在低氧条件下，HIF1-α蛋白不被羟化，并且其表达水平得以维持。为表征吡啶-2,4-二甲酸二乙酯对HIF1-α的表达/稳定水平的影响，在源自人毛囊外鞘的角质形成细胞的培养物上制备蛋白质提取物，所述角质形成细胞在低氧条件下或在正常氧条件下，在不存在或存在吡啶-2,4-二甲酸二乙酯下维持并放置于培养物中。HIF1-α蛋白的免疫检测显示，当细胞在低氧条件(3%氧)下在培养物中生长时，与正常氧条件(21%氧)相比，这种蛋白质的表达水平增加。同样，在吡啶-2,4-二甲酸二乙酯存在下在正常氧条件下的培养引起所检测蛋白质的量增加。在这方面，可以说，吡啶-2,4-二甲酸二乙酯在正常氧条件下的影响模拟低氧条件对HIF1-α蛋白的表达/稳定的影响。
II-     上皮干细胞的功能的保持的评估
对用或未用活性剂处理的上皮干细胞的质量的这种评估可以例如借助角质形成细胞(包括上皮干细胞)的CFE (集落形成效率)测试确立，在于，分别在低氧条件下及在不存在或存在吡啶-2,4-二甲酸二乙酯下，观察这种活性剂对给定群体内能够产生细胞克隆的细胞的出现率以及对所获得克隆形态的影响。
为此，将通过整容手术从头皮分离的所有毛囊切成1 cm2的片，然后用稀释在William E培养基中的2.4 U/ml处理，并在4℃下培育过夜。翌日，将样品用PBS冲洗，使用镊子除去表皮，取出每个毛囊，并放置在位于冰上的PBS中。除去PBS后，将毛囊在37℃下在0.5 ml 1X胰蛋白酶-EDTA中放置5分钟，以便仅使来自毛囊外鞘的下部区域的角质形成细胞分离。酶促过程通过加入1 ml含10%血清的培养基来停止，然后使用细胞筛(70 μm)过滤含有分离的细胞的上清液。然后，将回收的细胞在1000转/分钟下在4℃下离心15分钟，并将细胞沉淀物再悬浮于DMEM (Cambrex) - Hams F12培养基(3:1混合物)中，所述培养基含有2 mM L-谷氨酰胺及1 mM丙酮酸钠，补充有胎牛血清10 (HyClone)、非必需氨基酸、5 μg/ml胰岛素、0.18 mM腺嘌呤、0.4 μg/ml氢化可的松、2 nM三碘甲状腺原氨酸、10 ng/ml表皮生长因子、1 μM异丙肾上腺素(isoprotenerol)、5 μg/ml转铁蛋白、4 mM谷氨酰胺及50 U/ml青霉素/链霉素。
接着，将由此从毛囊提取并切割的外上皮鞘的细胞随后以1000个细胞/培养皿的比例，在CFE条件下接种在受辐照的3T3成纤维细胞的层上。然后，将细胞在3%分子氧(低氧条件)下或在21%分子氧下，在吡啶-2,4-二甲酸二乙酯(浓度在50 μM到500 μM范围内)存在下进行培养。未处理并且在21%分子氧下培养的对照作为参考。在第3天及第8天更换培养基，并在第10天停止培养。在克隆源性培养结束时，并且在固定(经由70%乙醇)及染色(与曙红一起培育，冲洗，然后与BlueRAL 555一起培育)所获得的细胞克隆后，对克隆及构成这些克隆的细胞的形态进行分析。
这些细胞在低氧条件(3%分子氧)下的培养非常明显地对克隆形态具有影响。所获得的克隆与在21%分子氧下在常规培养条件下获得的克隆相比，显示出更为紧凑且较不弥漫的形态(克隆边缘明确界定)。克隆由小的高度连接且更均匀的细胞构成，这让人想起了Y.Barrandon及H.Green (Proc.Natl.Acad.Sci. 1987, 84:2302-2306)描述的完全克隆(holoclone)。这些结果以高度可再现的方式观察到，并且表明细胞的未成熟性在培养物中的更好维持。
与在21%分子氧存在下培育的对照相比，用吡啶-2,4-二甲酸二乙酯处理后获得的克隆也较不弥漫且较不密集。通常，所获得的克隆由质量非常好的细胞构成。与21%分子氧对照条件相比，克隆的数量没有显著降低。
综上所述，在正常氧条件下用吡啶-2,4-二甲酸二乙酯处理产生的克隆与在低氧条件下获得的克隆类似。
III-    说明
本发明人能够观察到上皮干细胞与碳酸酐酶IX的共定位，即浸在低氧环境中的干细胞。具体地，低氧的生物标记的表达可以在毛囊外鞘的近端区域的基底层，也称为毛囊外鞘的下部储库中观察到。
本发明人指出，令人惊奇及出乎意料的是，活性剂、更具体地脯氨酰羟化酶抑制剂部分模拟低氧效应，所述活性剂独立于细胞氧合水平而作用于HIF-1α蛋白的表达水平的稳定。实际上，在正常氧条件下用此类抑制脯氨酰羟化酶的活性剂处理存活条件下的毛囊产生的转录组学谱与由低氧条件产生的转录组学谱类似。此外，用此类脯氨酰羟化酶抑制剂处理或在低氧条件下培养，对刚刚从人毛囊的外鞘分离的细胞群的集落形成的影响类似。因此，这些研究证实，这些活性剂能够再现毛囊干细胞的下部储库的生态位的一种生理特征(即低氧)的效应。
当然，借助本发明的评估方法评估的活性剂可经由一种以上附加的或不同的生物路径起作用，以便模拟所观察到的低氧效应。
不用说，本领域的技术人员会小心地引入任选的修改或添加，以使设想的添加不会或基本上不会不利地影响本发明的评估方法的有利性质。
在整篇申请中，除非另有说明，否则词语“包含一个”或“包括一个”是指“包含至少一个”或“包括至少一个”。

Claims (9)

1.一种用于评估至少一种活性剂的体外方法，所述活性剂能够保持上皮干细胞的功能，特别是维持或刺激角蛋白物质的生长及/或密度及/或更新，所述方法在于，测定所述活性剂模拟角蛋白物质中的低氧状态的能力，与未用所述活性剂处理的角蛋白物质相比，在用所述活性剂处理的所述角蛋白物质中，所述活性剂能够增加作为低氧的生物标记的至少碳酸酐酶IX的表达。
2.根据权利要求1所述的评估方法，所述方法在于，在用所述活性剂处理正常氧状态下的所述角蛋白物质后，测定所述活性剂模拟角蛋白物质中的低氧状态的能力。
3.根据权利要求1或2所述的评估方法，其中，所述活性剂能够独立于细胞氧合水平而作用于HIF-1蛋白的表达水平的稳定。
4.根据权利要求1、2或3所述的评估方法，其中，所述活性剂能够间接作用于所述HIF-1蛋白，具体地，抑制脯氨酰羟化酶，以便阻止所述HIF-1蛋白的α (阿尔法)亚基降解。
5.根据前述权利要求中任一项所述的评估方法，其中，所述活性剂不能够产生HIF-1的转录组学变型。
6.根据前述权利要求中任一项所述的评估方法，其中，与未用所述活性剂处理的角蛋白物质相比，在用所述活性剂处理的角蛋白物质中，除碳酸酐酶IX的所述表达以外，所述活性剂还能够增加作为低氧的生物标记的葡萄糖转运蛋白1 (GLUT-1)的表达。
7.根据前述权利要求中任一项所述的评估方法，其中，作为低氧的生物标记的至少碳酸酐酶IX的所述表达可以通过标记呈其蛋白质形式的碳酸酐酶IX，优选通过所述蛋白质的免疫荧光标记或蛋白质印迹法，及/或通过碳酸酐酶IX的转录组学分析来证实。
8.根据前述权利要求中任一项所述的评估方法，所述方法在于，观察毛囊外鞘的近端区域的基底层中低氧的生物标记的表达。
9.一种根据前述权利要求中任一项所述的评估方法的用途，其用于测定一种(或更多种)能够维持或增加头发密度及/或能够对抗皮肤衰老的活性剂。
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