BR112014019378B1 - Processo in vitro de avaliação de pelo menos um agente ativo e uso de um processo de avaliação - Google Patents

Abstract

processo in vitro de avaliação de pelo menos um agente ativo e uso de um processo de avaliação. a presente invenção trata de um processo para avaliar in vitro pelo menos um agente ativo capaz de preservar a funcionalidade das células- tronco epiteliais, em particular de manter ou estimular o crescimento e/ou a densidade e/ou a renovação de uma matéria queratínica, que consiste em determinar a aptidão do ou dos agentes ativos de imitar um estado hipóxico na matéria queratínica, sendo que o(s) agente(s) ativo (s) é(são) capaz(es) de aumentar a expressão de pelo menos a anidrase carbônica ix como marcador biológico de hipóxia, na matéria queratínica tratada com o(s) agente(s) ativo(s) em comparação à matéria queratínica não tratada o(s) agente(s) ativo(s). ela trata também do uso de tal processo.

Description

[001] A presente invenção trata de um processo para avaliar in vitro pelo menos um agente ativo capaz de preservar a funcionalidade das células-tronco epiteliais, em particular de manter ou estimular o crescimento e/ou a densidade e/ou a renovação de uma matéria queratínica, em particular do cabelo ou da pele. Em particular, tal processo de avaliação é usado para selecionar candidatos que atuem para manter ou aumentar a densidade e/ou para combater o envelhecimento da pele.

[002] As matérias queratínicas, e em particular a cabeleira e a pele, compreendem células-tronco epiteliais que, geralmente, além de sua capacidade pluripotente, são capazes de se diferenciarem em várias células que produzem tecidos do corpo e de autorrenovação. Essas funcionalidades são necessárias para regenerar os tecidos, mas podem sofrer certas modificações ou disfunções ao longo do tempo.

[003] Em particular, a cabeleira humana representa um conjunto de aproximadamente 150.000 cabelos. Cada um deles é gerado por um componente secundário especializado da pele, um órgão verdadeiramente autônomo, o folículo piloso. O crescimento do cabelo e sua renovação não é um processo contínuo, sendo determinado pela atividade dos folículos pilosos e seu ambiente matricial. A atividade desses folículos é cíclica e compreende essencialmente quatro fases. Na verdade, o folículo passa sucessivamente de uma fase de crescimento com produção da haste do cabelo (fase anagênica), para uma fase de involução rápida (fase catagênica), e depois a uma fase de repouso com perda de cabelo (fase telogênica), que antecede uma fase de regeneração (neogênica) de modo a chegar novamente à fase anagênica. A fase anagênica, uma fase ativa ou de crescimento durante a qual o cabelo se torna mais comprido, dura vários anos. A fase catagênica muito curta dura poucas semanas. A fase telogênica ou fase de repouso dura poucos meses. No fim desse período de repouso, os cabelos caem e outro ciclo recomeça. A cabeleira sofre, portanto uma renovação constante e, dentre os aproximadamente 150 000 fios que compõem uma cabeleira, cerca de 10% estão em repouso e serão substituídos ao longo dos próximos meses.

[004] A perda natural de cabelo pode ser estimada, em média, em algumas centenas de cabelos por dia para um estado fisiológico normal. Esse processo de renovação física constante sofre uma alteração natural durante o envelhecimento, os cabelos ficam mais finos e seus ciclos se tornam mais curtos

[005] Várias causas podem, entretanto, levar a uma perda de cabelo considerável temporária ou definitiva. A perda de cabelo, em particular a alopecia, é causada essencialmente por perturbações da renovação do cabelo. Essas perturbações levam, inicialmente, ao encurtamento da fase anagênica e um afinamento gradual do cabelo, e então a uma diminuição de sua quantidade. Ocorre uma miniaturização gradual dos bulbos, conjuntamente com seu isolamento através do espessamento gradual da matriz de colágeno da bainha conjuntiva externa. A revascularização em torno do folículo piloso se torna, portanto, mais difícil com cada ciclo. Os cabelos regridem e miniaturizam até se tornarem apenas uma penugem não pigmentada, e esse fenômeno conduz a uma gradual depleção da cabeleira.

[006] Algumas áreas são preferencialmente afetadas, em particular os lobos temporal ou frontal nos homens, e nas mulheres, a alopecia difusa do topo da cabeça é observada.

[007] O termo alopecia também engloba uma família inteira de danos dos folículos capilares que resultam no final em uma perda de cabelo definitiva geral ou parcial. Essa é mais particularmente a alopecia androgênica. Em um número considerável de casos, a perda de cabelo prematura ocorre em indivíduos geneticamente predispostos, trata-se então da alopecia androcronogenética; essa forma de alopecia afeta, em particular, os homens.

[008] É, ainda, conhecido que certos fatores, tais como um desequilíbrio hormonal, um estresse fisiológico ou a malnutrição, podem acentuar o fenômeno. Além disso, a perda ou a modificação do cabelo podem estar ligadas a fenômenos sazonais.

[009] Geralmente, qualquer fator que influencie esses processos, ou seja, a aceleração da frequência do ciclo, a miniaturização gradual do bulbo, o espessamento gradual da matriz de colágeno perifolicular, o espessamento da bainha conjuntiva externa, e uma diminuição da vascularização, terão um efeito sobre o crescimento do folículo piloso.

[0010] O folículo piloso é estruturalmente composto por dois compartimentos distintos: um compartimento epitelial e um compartimento dérmico (mesenquimal), e a interação desses dois compartimentos é essencial para a morfogênese e o renascimento do cabelo e também para manter o ciclo folicular. A manutenção da funcionalidade do compartimento epitelial depende da presença e da atividade de vários reservatórios de células-tronco. Um primeiro reservatório de células-tronco epiteliais foi identificado em uma região denominada "tubérculo" nos roedores (Cotsarelis G, Sun TT, Lavker RM. (1990) Cell 61: 1329-1337). A partir dessas primeiras descobertas, outros reservatórios de células-tronco de queratinócitos foram identificados, sempre em roedores. Essas células-tronco desempenham um papel essencial na morfogênese dos folículos, mas estão também envolvidas no reparo da epiderme no caso de uma lesão. Estudos sobre os folículos humanos são muito mais raros, mas revelam pelo menos dois reservatórios de células-tronco epiteliais caracterizados pela expressão de queratina 19, que estão alojados na bainha radicular externa do (ORS) do folículo (terço superior e terço inferior) (Commo S, Gaillard O, Bernard BA. (2000) Differentiation 66:157-164).

[0011] Embora esses reservatórios de células-tronco sejam conhecidos por serem absolutamente essenciais para manter e regenerar o folículo piloso, existe atualmente muito pouco conhecimento em relação à modificação dessas populações celulares com a idade e/ou com o início e a progressão da alopecia (todos os tipo de alopecia incluídos). Foi demonstrado recentemente que a perda de cabelo em homens com alopecia é acompanhada por um desaparecimento não das células-tronco, mas de certas populações de células progenitoras (mais ativas, células proliferativas). Esses resultados sugerem que a alopecia podia estar ligada a um problema de ativação das células tronco do folículo ou ainda da expressão do potencial regenerativo completo das células progenitoras (LA Garza et al. (2011) J Clin Invest. 121: 613622).

[0012] A identificação de soluções técnicas que permitam melhor preservação da funcionalidade/atividade de células-tronco epiteliais foliculares seria, portanto, muito importante a fim de preservar a qualidade, a densidade e a forma do cabelo ao longo da vida do indivíduo.

[0013] Dada a importância do microambiente (nicho) na regulação da atividade e da funcionalidade de células-tronco em diversos e variados tecidos, os inventores realizaram estudos a fim de identificar os fatores ambientais que podem regular a atividade das células-tronco epiteliais.

[0014] Para isso, além das investigações sobre as células-tronco epiteliais foliculares, os inventores ampliaram ao mesmo tempo sua investigação sobre as células epiteliais cutâneas.

[0015] De modo surpreendente e inesperado, os inventores descobriram assim que certos reservatórios de células-tronco epiteliais foliculares ou cutâneas estão imersas em um ambiente hipóxico. Essa observação foi revelada através da anidrase carbônica IX, uma proteína cuja expressão aumenta em condições hipóxicas (S Kaluz et al. (2010) Biochim Biophys Acta 1795:162-172).

[0016] Demonstrando, por meio de testes de detecção de imunofluorescência dupla, que um subconjunto de anidrase carbônica IX expressa CD34, e tomando isso em combinação com a publicação LA Garza et al. (2011) J Clin Invest. 121: 613-622 que mostra que as células-tronco que portam CD34 estão depletadas em indivíduos com alopecia, os inventores formularam, por conseguinte, a hipótese de que a indução de um sinal de um estado hipóxico é capaz de manter a funcionalidade das células-tronco epiteliais.

[0017] Um objeto da presente invenção é, portanto, um processo para avaliar in vitro pelo menos um agente ativo capaz de preservar a funcionalidade das células-tronco epiteliais, em particular de manter ou estimular o crescimento e/ou a densidade e/ou a renovação de uma matéria queratínica, que consiste em determinar a aptidão do ou dos agentes ativos de imitar um estado hipóxico na matéria queratínica, de preferência em condições normóxicas, e o(s) agente(s) ativo(s) é(são) capaz(es) de aumentar a expressão de pelo menos a anidrase carbônica IX como marcador biológico de hipóxia, na matéria queratínica tratada com o(s) agente(s) ativo(s) em comparação à matéria queratínica não tratada com o(s) agente(s) ativo(s), de preferência em condições normóxicas.

[0018] De preferência, esse processo em determinar a aptidão do o dos agentes ativos de imitar um estado hipóxico na matéria queratínica, após tratamento da matéria queratínica em um estado normóxico com o(s) agente(s) ativo(s).

[0019] O termo “imitar” designa que o(s) agente(s) ativo(s) é(são) capaz(es) de aumentar a expressão de (isto é, expressando ou superexpressando) um marcador biológico de hipóxia, nesse caso pelo menos a anidrase carbônica IX, que está normalmente pouco ou nem um pouco expressa no estado normóxico.

[0020] O termo “estado normóxico” designa um nível de dioxigênio que corresponde ao da atmosfera terrestre ambiente, isto é, 21%.

[0021] O termo “estado hipóxico” designa um nível de dioxigênio que é estritamente inferior ao da atmosfera terrestre ambiente, por exemplo, inferior a 5%, por exemplo, igual a 3%.

[0022] Assim, o(s) agente(s) ativo(s) possui(possuem) a aptidão, a partir de uma matéria queratínica no estado normóxico, de mover a referida matéria queratínica para um estado de tipo hipóxico, sendo assim capaz de causar efeitos comparáveis com os de um microambiente hipóxico para as células-tronco epiteliais.

[0023] A expressão de pelo menos a anidrase carbônica IX como marcador biológico de hipóxia pode ser demonstrada pela marcação de anidrase carbônica IX em sua forma de proteína, de preferência por marcação imunofluorescente ou Western blotting da referida proteína e/ou por análise transcriptômica de anidrase carbônica IX.

[0024] Um objetivo dependente ou independente do processo tal como definido acima pode consistir, como uma variante ou adicionalmente, em observar a expressão um (ou mais) marcador(es) biológico(s) de hipóxia, tais como a anidrase carbônica IX, na camada basal da região proximal da bainha externa de um folículo piloso.

[0025] Ao conhecimento dos inventores, nenhum documento da arte anterior ensina ou sugere o uso de tal processo para avaliar o(s) agente(s) ativo(s) em relação à sua aptidão de imitar a hipoxia, em particular analisando a expressão de pelo menos a anidrase carbônica IX como marcador biológico dessa hipoxia, em particular com o fim de estudar sua propriedade de preservar a funcionalidade das células-tronco epiteliais, sendo que os estudos anteriores mostraram até o momento essencialmente que as condições hipóxicas possuem um impacto considerável sobre a biologia das células-tronco embriônicas (U Silvan et al. (2009) Differentiation 78:159-168) e também sobre a biologia de células-tronco derivadas de tecidos adultos, tais como as células-tronco neurais ou as células-tronco hematopoiéticas (P Eliasson et JI Jonsson (2010) J Cell Physiol 222:17-22; DM Panchision (2009) J Cell Physiol 220:562-568).

[0026] No nível celular, as condições hipóxicas possuem um impacto, em particular sobre o controle do ciclo celular, o metabolismo e a aptidão para responder ao estresse oxidativo. A resposta celular às condições hipóxicas está sob o controle dos HIFs (fatores induzidos por hipóxia), e em particular HIF-1 que é um fator de transcrição composto de 2 subunidades, HIF1- α (alpha) e HIF1-β (beta), e que regula a transcrição de mais de 100 genes envolvidos no ciclo celular, viabilidade, diferenciação, autofagia, etc. A ativação do HIF1 é finamente regulada de acordo com o estado de oxigenação das células. Nas condições de oxigenação alta (“normóxia”), a subunidade HIF1-alfa é hidroxilada por prolil 4-hidroxilase, que permite sua ubiquitinação e sua degradação pelo proteossoma. Inversamente, quando a pressão de dioxigênio diminui (hipoxia), essa subunidade não fica mais degradada e pode então acumular e migrar para o núcleo de modo a se ligar à subunidade HIF1-beta e formar assim o fator de transcrição HIF1.

[0027] Uma solução preferencial no contexto desse processo de avaliação pode consistir, assim, em determinar se o(s) agente(s) ativo(s) a ser(em) testado(s), que corresponde ao processo de avaliação de acordo com a presente invenção, possuem a aptidão para atuar como inibidores da prolil hidroxilase a fim de evitar sua degradação desse fator de transcrição, e em particular a subunidade α (alfa) da proteína HIF-1, e mantendo assim um estado hipóxico das células-tronco epiteliais. Evidentemente, essa via de ação não deve ser considerada limitativa, sendo possível que o(s) agente(s) ativo(s) esteja(m) envolvido(s) em outra(s) via(s) de ação adicional(is) ou a fim de produzir esse efeito hipóxico.

[0028] Um objeto da presente invenção é também o uso de um processo de avaliação tal como definido acima a fim de determinar um (ou mais) agente(s) ativo(s) capaz(es) de manter ou aumentar a densidade e/ou capaz(es) de combater o envelhecimento da pele.

[0029] Outras características, propriedades e vantagens da presente invenção aparecerão mais claramente com a leitura da descrição e dos exemplos a seguir.

MATÉRIAS QUERATÍNICAS

[0030] O processo de avaliação de acordo com a presente invenção usa matérias queratínicas.

[0031] O termo “matérias queratínicas” designa as fibras queratínicas e a pele. As fibras queratínicas referem-se, em particular, ao cabelo, às sobrancelhas, aos cílios e aos pelos do corpo. De preferência, as fibras queratínicas referem-se ao cabelo.

[0032] Tal matéria queratínica é testada in vitro no sentido de que é testada isoladamente do organismo ao qual pertence.

[0033] Para isso, ela, por exemplo, ser derivada de resíduos cirúrgicos, de uma biópsia, de uma cultura de queratinócitos foliculares ou cutâneos ou de uma cultura de células-tronco epiteliais, por exemplo, uma cultura de células-tronco epiteliais foliculares ou cutâneas.

AGENTES ATIVOS

[0034] O processo de avaliação de acordo com a presente invenção utiliza pelo menos um agente ativo a ser colocado na presença da matéria queratínica isolada tal como definido acima.

[0035] De preferência, o(s) agente(s) ativo(s) a ser testado(s) sobre a matéria queratínica é(são) capaz(es) de imitar a hipóxia em uma matéria queratínica testada em condições normóxicas.

[0036] Um agente ativo de acordo com a presente invenção é testado em relação à sua aptidão de aumentar a expressão de (isto é, de expressar ou superexpressar) pelo menos a anidrase carbônica IX, como marcador biológico de hipóxia, na referida matéria queratínica isolada.

[0037] Tal agente ativo pode também ser testado em relação à sua aptidão de expressar ou superexpressar outro ou outros marcadores biológicos de hipóxia.

[0038] Por exemplo, de acordo com um modo de realização particular, esse agente ativo pode ser testado em relação à sua aptidão de aumentar a expressão de (isto é, expressar ou superexpressar) transportador de glicose 1 (GLUT-1), como marcador biológico(s) de hipóxia.

[0039] De acordo com um modo de realização particular, esse agente ativo atua indiretamente sobre a proteína HIF-1. Em particular, esse agente ativo atua sobre uma enzima de degradação HIF-1. Mais especificamente, esse agente ativo de preferência atua como um inibidor da prolil hidroxilase.

[0040] De preferência, o(s) agente(s) ativo(s) é(são) capaz(es) de atuar, independentemente do nível de oxigenação celular, sobre a estabilização do nível de expressão da proteína HIF-1.

[0041] Também preferencialmente, esse agente ativo não resulta em uma variação transcriptômica de HIF-1, em particular não resulta em uma variação do gene de expressão HIF-1.

[0042] Consequentemente, o referido agente ativo atua de preferência, apenas, e indiretamente, sobre a proteína HIF-1.

PROCESSO DE AVALIAÇÃO

[0043] O processo de avaliação de acordo com a presente invenção visa estudar os efeitos de um ou mais agente ativos sobre a preservação das funcionalidades das células-tronco epiteliais observando sua aptidão a imitar um estado hipóxico em uma matéria queratínica isolada, observando a expressão de pelo menos a anidrase carbônica IX como marcador biológico de hipóxia, em comparação a uma matéria queratínica de controle não tratada.

[0044] Um primeiro processo de avaliação pode consistir em realizar uma marcação, de preferência imunomarcação, por exemplo, por imunofluorescência ou Western blotting, de pelo menos a proteína anidrase carbônica IX como marcador biológico de hipóxia. Mais particularmente, análises de matérias queratínicas, tais como de tecidos derivados do couro cabeludo humano, em particular folículos pilosos, ou de culturas de queratinócitos foliculares ou cutâneos, com anticorpos específicos para a anidrase carbônica IX, um marcador biológico de hipóxia, podem ser usadas a fim de observar variações em expressão, respectivamente em condições hipóxicas e em condições normóxicas na presença ou ausência de agentes ativos a fim de estudar se o(s) agente(s) ativo(s) é(são) capaz(es) de imitar um estado hipóxico.

[0045] Um segundo processo de avaliação pode consistir em realizar uma análise transcriptômica da anidrase carbônica IX, cuja expressão do gene correspondente é modificada por um sinal hipóxico, usando a técnica RT-qPCR, nas matérias queratínicas, por exemplo, ou culturas in vitro de queratinócitos ou bulbos capilares isolados por microdissecção e postos em cultura ex vivo, em condições hipóxicas, e em condições normóxicas na presença ou ausência do ou dos referidos agentes ativos a ser testados, a fim de estudar se o(s) agente(s) ativo(s) é(são) capaz(es) de imitar um estado hipóxico.

[0046] É possível adicionar opcionalmente a esses dois processos de avaliação um processo destinado a estabelecer o impacto do o ou dos agentes ativos capazes de imitar a hipoxia sobre a qualidade das células-tronco epiteliais. Para isso, um teste CFE (Eficiência de Formação de Colônias) pode ser realizado para queratinócitos (incluindo células-tronco epiteliais), que consiste em observar, respectivamente, em condições hipóxicas e em condições normóxicas na presença ou ausência de agente ativo(s), o impacto da presença do(s) o(s) agente(s) ativo(s) sobre a frequência das células capazes de gerar um clone de células dentro de uma dada população, e também sobre a morfologia clonal obtida, de modo a estabelecer, assim, sua participação da preservação da funcionalidade das células-tronco epiteliais tratadas com o(s) agente(s) ativo(s).

[0047] De acordo com uma realização ilustrativa e não limitativa, pelo menos um desses processos de avaliação ou a totalidade desses processos de avaliação podem ser implementados a fim de estabelecer o efeito de um ou mais agentes ativos sobre a expressão de pelo menos a anidrase carbônica como marcador biológico de hipóxia.

EXPLICAÇÃO DAS FIGURAS

[0048] Figura 1: Análise do nível de expressão/estabilização da proteína HIF1-alfa por Western blotting.

EXEMPLOS

[0049] Diversos exemplos de processos de avaliação de acordo com a presente invenção foram dados a seguir a título de ilustração da presente invenção. Tais exemplos não limitam o âmbito da presente invenção, e o técnico no assunto é capaz de usar outros processos conhecidos em si a fim de demonstrar a estimulação da anidrase carbônica IX como marcador biológico de hipóxia nas matérias queratínicas.

PROTOCOLO E RESULTADOS

[0050] A título de ilustração de agentes ativos que correspondem ao processo de avaliação de acordo com a presente invenção, podem ser citados os ácidos piridinacarboxílicos e certos derivados, em particular ésteres e amidas. A título de exemplo, um composto conhecido por ser apropriado para inibir a prolil hidroxilase foi usado, nesse caso um composto escolhido entre os derivados do ácido piridinadicarboxílicos de fórmula geral (I) ou um de seus sais:

fórmula (I) na qual: - R1 e R2 representam, independentemente um do outro, OH, OU’, -NH2, -NHR’ ou -NR’R’’, com R’ e R’’ representando, independentemente um do outro, um radical alquila com C1-C18 saturado ou insaturado, linear ou ramificado, ou um radical arila, e esse radical arila ou alquila é opcionalmente substituído por pelo menos um grupo OH, alcoxi, aciloxi, amino ou alquilamino, ou R’ e R’’ representam juntamente um heterociclo, tal como citado no pedido EP1352629, e em particular foi usado dietil piridina-2,4-dicarboxilato.

1/ PRIMEIRO EXEMPLO DE PROCESSO DE AVALIAÇÃO

[0051] Esse primeiro processo consistiu em observar, com um microscópio de fluorescência ótica, um folículo piloso após marcação imunofluorescente usando anticorpos específicos para anidrase carbônica IX, um marcador biológico de hipóxia, na ausência e presença de dietil piridina-2,4- dicarboxilato.

[0052] Em virtude desse processo, é possível observar a expressão da proteína anidrase carbônica IX que, além disso, está localizada na camada basal da região proximal da bainha externa do folículo piloso que contém as células-tronco epiteliais foliculares.

2/ SEGUNDO EXEMPLO DE PROCESSO DE AVALIAÇÃO

[0053] Esse segundo processo consiste em realizar uma análise transcriptômica do gene que codifica a anidrase carbônica IX, cuja expressão é modificada por um sinal hipóxico, usando a técnica RT-qPCR em bulbos capilares isolados por microdissecção no nível da hipoderme do couro cabeludo humano e colocado em cultura ex vivo durante 4 horas em condições hipóxicas (3% de dioxigênio) ou a 21% de dioxigênio, na ausência (controle) ou na presença de dietil piridina-2,4-dicarboxilato.

[0054] Após 4 horas de incubação dos bulbos inteiros em condições hipóxicas ou em condições normóxicas na presença de dietil piridina-2,4- dicarboxilato, a expressão padrão de anidrase carbônica IX é observada, indicando que o tratamento com dietil piridina-2,4-dicarboxilato induz um perfil molecular similar ao que é induzido por hipoxia.

3/ TERCEIRO EXEMPLO DE PROCESSO DE AVALIAÇÃO

[0055] Esse terceiro exemplo consiste em realizar uma análise do nível de expressão/estabilização da proteína HIF-1 alfa usando a técnica Western blotting como base. Para resumir, em condições normóxicas, a proteína HIF-1 alfa é hidroxilada com um resto de prolina (reação catalisada por uma prolil hidroxilase), ubiquitinilada e depois degradada pelo proteassoma. Em condições hipóxicas, a proteína HIF-1 alfa não é hidroxilada e seu nível de expressão é mantido. Para caracterizar o efeito da dietil piridina-2,4-dicarboxilato sobre o nível de expressão/estabilização de HIF-1 alfa, um extrato de proteína foi preparado em culturas de queratinócitos derivados da bainha externa de folículos pilosos humanos mantidos e postos em cultura em condições hipóxicas ou em condições normóxicas, na ausência ou presença de dietil piridina-2,4-dicarboxilato. A imunodetecção da proteína HIF-1 alfa revela que o nível de expressão dessa proteína aumenta quando as células são cultivas em cultura em condições hipóxicas (3% de oxigênio) em comparação condições normóxicas (21% de oxigênio). Da mesma forma, cultivar em condições normóxicas na presença de dietil piridina-2,4-dicarboxilato induz um aumento da quantidade de proteína detectada. A esse respeito, pode ser afirmado que o efeito de dietil piridina-2,4-dicarboxilato em condições normóxicas imita o efeito de condições hipóxicas sobre a expressão/estabilização da proteína HIF-1 alfa.

II - AVALIAÇÃO DA PRESERVAÇÃO DA FUNCIONALIDADE DAS CÉLULAS-TRONCO EPITELIAIS

[0056] Essa avaliação da qualidade das células-tronco epiteliais tratadas ou não tratadas o(s) agente(s) ativo(s) pode, por exemplo, ser estabelecida por meio de um teste CFE (Eficiência de Formação de Colônias) para queratinócitos (incluindo as células-tronco epiteliais), que consiste em observar, respectivamente, em condições hipóxicas e na ausência ou presença de dietil piridina-2,4-dicarboxilato, o impacto desse agente ativo sobre a frequência de células capazes de gerar um clone celular dentro de uma população dada e também sobre a morfologia clonal obtida.

[0057] Para isso, os folículos pilosos inteiros isolados do couro cabeludo por cirurgia cosmética foram cortados em pedaços de 1 cm2 e depois tratados com 2,4 U/ml diluído em um meio William E e incubados por uma noite a 4°C. No dia seguinte, as amostras são enxaguadas com PBS, a epiderme é removida com pinças, e cada folículo piloso é extraído e colocado em PBS, sobre gelo. Depois de ter removido o PBS, os folículos são colocados em 0,5 ml de 1X tripsina-EDTA durante 5 minutos a 37°C a fim de dissociar apenas os queratinócitos da região inferior da bainha externa do cabelo folículo. O processo enzimático é interrompido pela adição de 1 ml de meio contendo 10% de soro, e o sobrenadante contendo as células dissociadas é então filtrado com um tela celular (70 μm). As células recuperadas são então centrifugadas a 1000 revoluções/minuto durante 15 minutos a 4°C e o precipitado celular é resuspenso em um DMEM (Cambrex) - meio de Hams F12 (mistura 3 : 1) contendo 2 mM de L-glutamina e 1 mM de piruvato de sódio, suplementado com soro de bezerro fetal 10 (HyClone), aminoácidos não essenciais, 5 μg/ml de insulina, 0,18 mM de adenina, 0,4 μg/ml de hidrocortisona, 2 nM de triiodotironina, 10 ng/ml de fator de crescimento epidérmico, 1 μM de isoprotenerol, 5 μg/ml de transferrina, 4mM de glutamina e 50 U/ml de penicilina/estreptomicina.

[0058] Em seguida, as células da bainha epitelial externa extraídas assim do folículo pilosos e dissecada são subsequentemente inoculadas em uma proporção de 1000 células/prato de cultura em condições CFE, sobre uma camada de fibroblastos irradiados 3T3. As células são então cultivadas a 3% dioxigênio (condições hipóxicas) ou a 21% de dioxigênio na presença de dietil piridina-2,4-dicarboxilato (em concentrações que variam de 50 a 500 μM). Um controle que não é tratado e cultivado a 21% de dioxigênio serve de referência. O meio é trocado no 3° dia e no 8° dia e a cultura é interrompida no 10° dia. No fim da cultura clonogênica e após fixação (com 70% de etanol) e manchamento (incubação com eosina, enxágue e, depois, incubação com BlueRAL 555) das clones celulares obtidos, a morfologia dos clones e das células que constituem esses clones é analisada.

[0059] A cultura dessas células em condições hipóxicas (3% dioxigênio) possui muito claramente um efeito sobre a morfologia clonal. Os clones obtidos apresentam uma morfologia mais compacta e menos difusa (bordas dos clones bem delimitadas) do que os obtidos em condições convencionais de cultura a 21% de dioxigênio. Os clones são compostos de células pequenas, altamente conectadas e mais homogêneas que são uma reminiscência dos holoclones descritos por Y. Barrandon e H. Green (Proc. Natl. Acad. Sci. 1987, 84:2302-2306). Esses resultados foram observados de um modo altamente reprodutível e sugerem melhor manutenção da imaturidade das células em cultura.

[0060] Os clones obtidos após o tratamento com dietil piridina-2,4- dicarboxilato são também menos difusos e menos densos que os controles incubados na presença de 21% de dioxigênio. Em general, os clones obtidos são compostos de células muito boa qualidade. O número de clones não diminui significativamente em comparação às condições do controle 21% de dioxigênio.

[0061] Em resumo o tratamento com dietil piridina-2,4-dicarboxilato em condições normóxicas gera clones similares aos obtidos em condições hipóxicas.

III - INTERPRETAÇÃO

[0062] Os inventores foram capazes de observar a co-localização das células-tronco epiteliais e da anidrase carbônica IX, estando as células- tronco imersas em um ambiente hipóxico. Em particular, a expressão do marcador biológico de hipóxia pode ser observada na camada basal da região proximal da bainha externa de um folículo piloso, também chamado reservatório inferior da bainha externa do cabelo folículo.

[0063] Os inventores mostram, de modo surpreendente e inesperado, que um agente ativo, e mais especificamente um inibidor da prolil hidroxilase, que atua, independentemente do nível de oxigenação celular, sobre a estabilização do nível de expressão da proteína HIF-1 alfa, imita parcialmente um efeito hipóxico. De fato, o tratamento em condições normóxicas do cabelo folículos, em condições de sobrevivência, com tal prolil hidroxilase inibindo um agente ativo induz um perfil transcriptômico similar ao que é induzido por condições hipóxicas. Além disso, a clonogenicidade das populações celulares recentemente isoladas da bainha externa de folículos pilosos humanos é similarmente impactada seja por tratamento com tais inibidores de prolil hidroxilase ou por cultura em condições hipóxicas. Esses estudos demonstram assim que esses agentes ativos possuem a aptidão de reproduzir os efeitos de uma das características fisiológicas (ou seja, hipóxia) do nicho do reservatório inferior das células-tronco foliculares.

[0064] Evidentemente, o(s) agente(s) ativo(s) avaliado(s) pelo processo de avaliação de acordo com a presente invenção pode(m) atuar por meio de uma ou mais vias biológicas adicionais ou diferentes de modo a imitar o efeito hipóxico observado.

[0065] Evidentemente, o técnico no assunto tomará cuidado ao introduzir as modificações ou adições opcionais que modo que as propriedades vantajosas do processo de avaliação de acordo com a presente invenção não sejam, substancialmente, afetadas adversamente pela adição considerada.

[0066] Ao longo do pedido, as palavras “que compreende um” ou “que inclui um” designa “que compreende pelo menos um” ou “que inclui pelo menos um”, salvo especificação contrária.

Claims (9)

1. PROCESSO IN VITRO DE AVALIAÇÃO DE PELO MENOS UM AGENTE ATIVO capaz de preservar a funcionalidade de células-tronco epiteliais, em particular de manter ou estimular o crescimento e/ou a densidade e/ou a renovação de uma matéria queratínica, caracterizado por consistir em determinar a aptidão do(s) agente(s) ativo(s) para imitar um estado hipóxico na matéria queratínica, sendo que o(s) agente(s) ativo(s) é(são) capaz(es) de aumentar a expressão de pelo menos anidrase carbônica IX como marcador biológico de hipóxia na matéria queratínica tratada com o(s) agente(s) ativo(s) em comparação à matéria queratínica não tratada com o(s) agente(s) ativo(s).

2. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por consistir em determinar a aptidão do(s) agente(s) ativo(s) para imitar um estado hipóxico na matéria queratínica, após tratamento da matéria queratínica em um estado normóxico com o(s) agente(s) ativo(s).

3. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo(s) agente(s) ativo(s) ser(em) capaz(es) de atuar, independentemente do nível de oxigenação celular, sobre a estabilização do nível de expressão da proteína HIF-1.

4. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo(s) agente(s) ativo(s) ser(em) capaz(es) de atuar indiretamente sobre a proteína HIF-1 e em particular de inibir prolil hidroxilase a fim de evitar a degradação da subunidade α (alfa) da proteína HIF- 1.

5. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo(s) agente(s) ativo(s) ser(em) incapaz(es) de gerar uma variação transcriptômica de HIF-1.

6. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por, além da expressão de anidrase carbônica IX, o(s) agente(s) ativo(s) ser(em) capaz(es) de aumentar a expressão de transportador de glicose 1 (GLUT-1) como marcador biológico de hipóxia na matéria queratínica tratada com o(s) agente(s) ativo(s) em comparação à matéria queratínica não tratada com o(s) agente(s) ativo(s).

7. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pela expressão de pelo menos anidrase carbônica IX como marcador biológico de hipóxia ser demonstrada pela marcação de anidrase carbônica IX em sua forma de proteína, de preferência por marcação imunofluorescente ou Western blotting da referida proteína e/ou por análise transcriptômica de anidrase carbônica IX.

8. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por consistir em observar a expressão do(s) marcador(es) biológico(s) de hipóxia na camada basal da região proximal da bainha externa de um folículo piloso.

9. USO DE UM PROCESSO DE AVALIAÇÃO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por ser para determinar um (ou mais) agente(s) ativo(s) capaz(es) de manter ou aumentar a densidade capilar e/ou capaz(es) de combater o envelhecimento da pele.

Images