CN110804580B - 一种体外形成早期微毛囊的培养方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种体外形成早期微毛囊的培养方法及其应用。所述培养方法包括：将真皮祖细胞与表皮干细胞混合，使用培养基悬浮培养，形成真皮‑表皮聚集物，收集培养后的毛囊样结构即为培养的毛囊样微器官。该方法仅通过使用头皮真皮祖细胞和包皮表皮干细胞的简单悬浮方法，即可在24小时内形成大量的毛囊微器官结构(聚集体)。同时通过体内移植实验进一步证实该体外培养的毛囊微器官移植到体内能形成成熟的毛囊。本发明为研究毛囊上皮‑间质相互作用、评估诱导的毛干细胞和筛选支持毛囊再生的以及将来应用于临床治疗脱发等奠定了良好的基础。

Description

一种体外形成早期微毛囊的培养方法及其应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种体外形成早期微毛囊的培养方法及其应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
干细胞具有自我组织和组装成复杂的功能性组织和器官的能力，在损伤的组织或器官修复中起着至关重要的作用。利用这种能力，科学家们最近优化各种培养条件下在体外能成功培养出各种类器官样组织(Organoid)，该微器官为研究人类发育、疾病和组织再生提供了新的机会。类器官样体(Organoid)是由干细胞形成的三维结构，具有与实际器官相似的特征，可广泛应用于不同医学领域的基础及临床转化等研究。近年来乳腺、唾液腺、结肠和肝管等多种上皮组织类器官已经培养成功，但在体外培养牙齿、毛囊等微器官仍面临挑战。毛囊是具有多种功能，包括感觉活动、调节皮肤湿度及温度和美观。最近，韦伯等人用液滴法成功地从新鲜胎儿头皮真皮祖细胞与培养的新生儿包皮结合再生出毛囊样结构，这是首次报道培养成人毛囊类器官，然而该培养方法采用的真皮细胞是新鲜分离的，未经培养扩增的，而且采用的液滴法也不适用于大规模培养毛囊类器官用于促进毛发生长药物的筛选等研究。
用体外培养扩增的细胞重建人毛囊一直是挑战，直到最近才取得了进展，但人毛囊的再生效率仍然较低，尤其是来自成人组织的细胞。因此，开发新的技术和方法来提高体外和体内培养细胞的再生能力是非常重要的。
发明内容
鉴于现有技术方法的不足，本发明提供一种体外形成早期微毛囊的培养方法及其应用。本发明利用头皮来源的真皮祖细胞与任何部位皮肤来源的表皮干细胞按比例混合，使用培养基悬浮培养，培养2天以上即能形成毛囊样微器官，组织切片显示早期毛囊结构，免疫染色证实其表达毛囊标志物。并用分子染料标记法分析了类器官中真皮和表皮细胞的组织结构。并通过体内移植实验进一步证实该体外培养的毛囊微器官移植到体内能形成成熟的毛囊。本发明为研究毛囊上皮-间质相互作用、评估诱导的毛干细胞和筛选支持毛囊再生的以及将来应用于临床治疗脱发等奠定了良好的基础。
为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明的第一个方面，提供一种体外形成早期微毛囊的培养方法，所述培养方法包括：
将真皮祖细胞与表皮干细胞混合，使用培养基悬浮培养，形成真皮-表皮聚集物，收集培养后的毛囊样结构即为培养的毛囊样微器官。本发明经研究证实，真皮祖细胞与表皮干细胞预聚集可引发真皮祖细胞和表皮干细胞之间的关键性串扰(相互作用)，特别是增强WNT信号通路，WNT激活真皮表皮聚集在体外促进早期毛囊的形成，将早期毛囊移植至体内后引发体内新毛囊的再生。
其中，所述培养基的配方包括以下组分：DMEM/F12(3:1)培养基、0.05～0.2％青霉素/链霉素、1～10ng/ml成纤维细胞生长因子2(FGF2)、1～10ng/ml EGF(表皮生长因子)、0.1～2％B27、0.5～5mg/ml牛垂体提取物(BPE)和1～5％胎牛血清(FBS)。
本发明的第二个方面，提供一种培养基在体外培养早期微毛囊中的应用。
所述培养基的配方包括以下组分：DMEM/F12(3:1)培养基、0.05～0.2％青霉素/链霉素、1～10ng/ml成纤维细胞生长因子2(FGF2)、1～10ng/ml表皮生长因子(EGF)、0.1～2％B27、0.5～5mg/ml牛垂体提取物(BPE)和1～5％胎牛血清(FBS)。
本发明的第三个方面，提供上述培养方法获得的早期微毛囊。
本发明的第四个方面，提供上述早期微毛囊具有如下a)-d)中任意一种或多种应用：
a)毛囊上皮-间质相互作用研究；
b)对毛发干细胞的毛发生成潜能的评估；
c)脱发转化研究；
d)促毛发再生的化合物筛选。
本发明的有益技术效果：
本发明提供一种体外形成早期微毛囊的培养方法，该方法仅通过使用头皮真皮祖细胞和包皮表皮干细胞的简单悬浮方法，在特制培养基作用下，即可在24小时内形成大量的毛囊微器官结构(聚集体)。同时通过体内移植实验进一步证实该体外培养的毛囊微器官移植到体内能形成成熟的毛囊。本发明为研究毛囊上皮-间质相互作用、评估诱导的毛干细胞和筛选支持毛囊再生的以及将来应用于临床治疗脱发等奠定了良好的基础。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明事先聚集培养的真皮和表皮细胞形成表皮真皮细胞聚集物能促进毛囊再生能力相关图。其中，A移植移植以下3组细胞到裸鼠背上：游离的胎儿头皮真皮细胞与包皮表皮细胞(第1组)或24小时悬浮培养胎儿头皮真皮细胞形成真皮聚集物，然后加上游离的包皮表皮细胞(第2组)或24小时悬浮培养形成胎儿头皮真皮和表皮细胞聚集物(第3组)，3个月后移植出再生毛发的照片。B.对A组小鼠的再生毛囊数进行计数分析。C.皮下注射法移植以下3组细胞：游离的成年头皮真皮细胞和新分离的新生小鼠表皮细胞(第1组)或24小时悬浮培养的成体头皮真皮细胞聚集物加上游离离的新生小鼠表皮细胞聚集(第2组)或24小时悬浮培养形成成人头皮真皮细胞和小鼠表皮细胞聚集物(第3组)，1个月后，收集注射处皮肤，并对其形成的毛囊的平均数量进行计数分析。比较图中标记的两组时，*显示P值：*p<0.05，**p<0.01；**p<0.005。
图2为本发明真皮和表皮细胞聚集增强WNT途径相关图。其中，A-L:分离细胞(2x106)真皮(Der)、表皮(Epi)或混合真皮-表皮(Epi Der)以1:1的比例收集，用于总mRNA提取(Dis-0h)或放置在非贴壁培养皿中；在24小时(Agg-24h)收集聚集物用于总mRNA提取用RT-PCR方法检测各条件下的总mRNAs基因的表达，并将各基因的相对表达水平与家政基因36B4进行标准化实验重复3次(n＝3)通过p值确定各组间的显著性，如：*p<0.05，**p<0.01；**p<0.005，**p<0.001。
图3为本发明胎儿头皮真皮细胞和包皮表皮细胞聚集成极梨状结构(I型聚集体)相关图。其中，A.胎儿头皮真皮细胞与新生包皮表皮细胞以1:1的比例悬浮培养3天形成的聚集物的典型图像白色箭头表示II型团聚体呈球形，黑色箭头表示I型团聚体呈梨状，右面显示了I型和II型骨料的高倍图像。标尺＝200μm。B.胎儿头皮真皮和膜染料标记的包皮表皮细胞混合形成的3天聚集物的代表性图像上板为标记的表皮细胞聚集体，下板为标记的表皮细胞聚集体用DAPI条染色的细胞核。标尺＝50μm。C.悬浮培养后12h、24h和48h，胎儿头皮真皮细胞与标记的包皮表皮细胞混合形成的聚集物的代表性图像细胞核用DAPI染色Bars＝50μm。D.成人头皮真皮细胞(成人，左边)或胎儿头皮真皮细胞(胎儿，右边)混合相同的包皮表皮细胞。黑色箭头表示I型聚集体。Bar＝500μm。E.显示I型聚集体形成百分比，与胎儿组和成人组相比，****p<0.001。
图4为本发明I型聚集体呈现早期毛囊结构图。从图3A中提取3天的I型真皮-表皮细胞聚集体，并进行H&E染色(A)和IF染色(B-I)分析所示的毛囊相关基因表达DAPI染色的细胞核；黑色箭头表示上皮化结构；箭头表示相应基因的阳性染色所在位置。标尺＝50μm。
图5为本发明WNT途径的激活促进I型聚集体的形成相关图。其中，A.将胎儿头皮真皮细胞与包皮表皮细胞按1:1的比例混合培养，在不同时间点采集，进行LEF1、WNT10b和K17表达的RT-PCR分析,与0小时组比较，*p<0.05，**p<0.01，**p<0.005。B.DMSO(对照)或WNT3a或IWP-2处理下，胎儿头皮真皮细胞与包皮表皮细胞以1:1的比例混合在悬浮培养中形成48小时聚集形成的代表性聚集体，标尺＝500μm。黑色箭头表示I型聚集体，C.显示图B中I型聚集体形成百分比。与对照组相比：**p<0.01，**p<0.005。
图6为本发明第3代培养扩增的表皮细胞能克隆样生长图。将500个分离的第3代包皮表皮细胞接种到100mm培养皿中，在接种后3天(左面板)和14天(右面板)分别观察到具有代表性的克隆图像。标尺＝100μm
图7为本发明真皮细胞在悬浮液中形成球形聚集体图。30万第3代胎儿头皮真皮祖细胞铺在一个无粘性的6孔板上，培养3天后形成球体的代表性图像。标尺＝200μm。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。
如前所述，用体外培养扩增的细胞重建人毛囊一直是挑战，直到最近才取得了进展，但人毛囊的再生效率仍然较低，尤其是来自成人组织的细胞。因此，开发新的技术和方法来提高体外和体内培养细胞的再生能力非常重要。
有鉴于此，本发明的一个具体实施方式中，提供一种体外形成早期微毛囊的培养方法，所述培养方法包括：
将真皮祖细胞与表皮干细胞混合，使用培养基悬浮培养，形成真皮-表皮聚集物，收集培养后的毛囊样结构即为培养的毛囊样微器官。本发明经研究证实，真皮祖细胞与表皮干细胞预聚集可引发真皮祖细胞和表皮干细胞之间的关键性串扰(相互作用)，特别是增强WNT信号通路，WNT激活真皮表皮聚集在体外促进早期毛囊的形成，将早期毛囊移植至体内后引发体内新毛囊的再生。
其中，所述培养基的配方包括以下组分：DMEM/F12(3:1)培养基、0.05～0.2％青霉素/链霉素、1～10ng/ml成纤维细胞生长因子2(FGF2)、1～10ng/ml EGF(表皮生长因子)、0.1～2％B27、0.5～5mg/ml牛垂体提取物(BPE)和1～5％胎牛血清(FBS)。
本发明又一具体实施方式中，所述培养基的配方包括以下组分：DMEM/F12(3:1)培养基、0.1％青霉素/链霉素、5ng/ml成纤维细胞生长因子2(FGF2)、5ng/ml表皮生长因子(EGF)、1％B27、1mg/ml牛垂体提取物(BPE)和2％胎牛血清(FBS)。通过采用上述特制培养基进行培养，有利于真皮祖细胞与表皮干细胞形成真皮-表皮聚集体，分化形成毛囊样微器官(早期毛囊)，将其移植至体内，可有效促进体内毛囊形成，提高毛发在体内的再生潜力。
本发明又一具体实施方式中，所述真皮祖细胞来源于头皮；
本发明又一具体实施方式中，所述表皮干细胞可选自来源于任何部位的皮肤，在本发明中，优选选自包皮。
本发明又一具体实施方式中，所述真皮祖细胞与表皮干细胞混合比例为0.5～5:1(细胞个数比，例如0.5:1、1:1、2:1、3:1、4:1和5:1)。通过优化二者混合比例，有利于获得更多的早期微毛囊。
本发明又一具体实施方式中，所述培养条件具体为：在37℃、含5％CO2的组织培养箱中进行培养，每两天更换一次培养基，培养时间为4～72小时(例如4小时，8小时，12小时，24小时，48小时和72小时)，进一步优选为24～48小时。
本发明又一具体实施方式中，提供一种培养基在体外培养早期微毛囊中的应用。
本发明又一具体实施方式中，所述培养基的配方包括以下组分：DMEM/F12(3:1)培养基、0.05～0.2％青霉素/链霉素、1～10ng/ml成纤维细胞生长因子2(FGF2)、1～10ng/mlEGF(表皮生长因子)、0.1～2％B27、0.5～5mg/ml牛垂体提取物(BPE)和1～5％胎牛血清(FBS)。
本发明又一具体实施方式中，所述培养基的配方包括以下组分：DMEM/F12(3:1)培养基、0.1％青霉素/链霉素、5ng/ml成纤维细胞生长因子2(FGF2)、5ng/ml EGF(表皮生长因子)、1％B27、1mg/ml牛垂体提取物(BPE)和2％胎牛血清(FBS)。
本发明又一具体实施方式中，提供上述培养方法获得的早期微毛囊。
本发明又一具体实施方式中，提供上述早期微毛囊具有如下a)-d)中任意一种或多种应用：
a)毛囊上皮-间质相互作用研究；
b)对毛发干细胞的毛发生成潜能的评估；
c)脱发转化研究；
d)促毛发再生的化合物筛选。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例
1.材料与方法
1.1细胞制备
真皮细胞从医院废弃的胎儿或成人头皮组织分离获得，并且已被证明具有多重分化潜能。表皮干细胞是从儿童包皮组织中分离出来的，细胞的制备见文献(Liu Z,Wen J,Leng X et al.A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary HumanKeratinocytes from Adult Skin Tissue.J Vis Exp.2018(138)；Wen J,Zu T,Zhou Q etal.Y-27632simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cellsby selectively blocking focal adhesion of dermal cells.J Tissue Eng RegenMed.2018；12(2):e1251-e5)。培养扩增的第3代表皮细胞成克隆形式生长，这是表皮干细胞的一个重要特征(图6)。表皮干细胞在K-SFM(Thermo Fisher Scientific，分类号17005-042)中培养真皮祖细胞在含0.1％青霉素/链霉素、40μg/ml真菌唑酮、40ng/ml FGF2、20ng/ml表皮生长因子、2％B27和5％FBS的DMEM/F12(3:1)中培养。
1.2毛囊类器官培养(聚集或悬浮培养)
为使真皮或真皮表皮细胞聚集，将20万头皮真皮细胞或10万头皮真皮细胞混合10万表皮细胞混合，悬浮于含有0.1％青霉素/链霉素、5ng/ml FGF2、5ng/ml EGF、1％B27的DMEM/F12(3:1)3ml培养基中1mg/ml BPE(牛垂体提取物)，添加2％胎牛血清，镀于非粘附性6孔板上，在含5％CO2的组织培养箱中培养(37℃)生长培养基每两天更换一次。为追踪聚集物中表皮细胞的定位，使用QtrackerTM525(绿色，TermoFisher Scientific cat.Q25041MP)或QtrackerTM625(红色，ThermFisherA101098号)细胞标记试剂盒标记表皮干细胞，随后，混合头皮真皮祖细胞。分别24，48小时采集样本进行分析。
1.3体内毛发再生试验
(1)移植试验法
为了测试人真皮表皮聚集物的毛发再生能力，我们进行了移植实验。移植以下三组细胞：1)2百万培养扩增的胎儿头皮真皮祖细胞与2百万包皮表皮干细胞混合(没有悬浮培养)；2)2百万人胎儿头皮真皮祖细胞悬浮(24小时)形成的真皮聚集体，然后混合2百万的包皮表皮干细胞；3)2百万人胎头皮真皮祖细胞与2百万包皮表皮干细胞混和后，悬培养24小时形成真皮-表皮聚集体。3组细胞分别重新悬浮于在100微升的F12中，并转移到纤维膜上，在组织培养箱中37℃孵育1.5h，然后移植到裸鼠背部皮肤上，移植后3个月取移植物检测毛囊形成情况。
(2)人鼠细胞杂交斑贴试验法(皮下注射法)
为了测试成人头皮真皮祖细胞的再生能力，进行人-鼠杂交斑贴试验，将分离的2百万人成人头皮真皮细胞与2百万新生小鼠分离的表皮细胞(MNE)混合或将2百万人成人头皮真皮细胞(悬浮24小时)聚集体与2百万MNE混合，或将2百万人成人头皮真皮混合2百万MNE悬浮培养24小时形成人-小鼠真皮聚集体，悬浮在75μl F12培养基中，皮下注射到裸鼠背部皮肤，每只小鼠接受4个点皮下细胞注射，注射4周后取注射部位，在显微镜下检测测毛囊数。
1.4组织学分析及免疫荧光染色
组织学和免疫荧光(IF)分析遵循标准方案。将聚集体转移到15ml锥形管中，用PBS含0.5％BSA洗涤，然后在室温下用4％PFA(多聚甲醛)固定30分钟固定集料在0.5％BSA/PBS中洗涤，然后在7.5％蔗糖/PBS中室温浸泡3h，然后在4℃下转移到15％蔗糖/PBS中过夜在OCT中植入聚集体，冷冻(-80C)并切片(6μm)进行组织学分析。
免疫荧光分析采用以下主要和次要抗体：大鼠抗FITC结合(CD49)α6-整合素(Stemcells，Cat 10111)、小鼠抗人角蛋白14/15/16/19(泛细胞角蛋白)(BD，Cat.550951)；单克隆小鼠抗人波形蛋白(5G3F10)(cell signaling，Cat.3390)；兔抗细胞角蛋白14单克隆抗体(K14，Abcam，CatAb119695)；小鼠对细胞角蛋白15(K15)的单克隆抗体(Abcam，Catab80522)；对细胞角蛋白17(K17，Abcam，Cat.ab51056)；兔抗细胞角蛋白6单克隆抗体(K6，Abcam，Cat.ab93279)K6；兔多克隆抗花叶病药(Santa Cruz，Cat.Sc-47769)，兔多克隆到Ki67(Abcam，cat.ab15580)；以下二抗体信息：(lexa fluor-488驴抗鼠IgG(Cat。A21202)；Alexa fluor-594驴抗鼠IgG(Cat。A21203)；Alexa fluor-488驴抗兔IgG(CatA21206)；Alexa fluor-594驴抗兔IgG(Cat.A21207).
1.5实时qPCR分析
实时定量PCR分析遵循标准方法。总RNA是根据制造商的说明，用QIAGEN RNeasyPlus微型试剂盒(德国希尔登QIAGEN)从细胞或细胞聚集物中提取，使用TakaraPrimeScriptTM RT试剂盒(Takara Bio Inc.)反向转录总RNA(1μg)用Takara SYBRRPremix Ex TaqTM II(Takara Bio Inc.)和LightCyclerR 480II(Roche DiagnosticsLtd.)进行PCR反应，用cDNA(100ng)和250nm特异性基因引物共20ul qRT PCR反应进行扩增PCR反应在95℃下进行30s，然后在95℃下重复40次循环5s，55℃下重复30s，并在72℃下延长15s。数据通过LightCycler 480系统采集和分析PCR引物列于表1；36B4，一个家养基因被用作内部对照。
表1 RT-PCR引物序列表
Figure BDA0002288839770000121
Figure BDA0002288839770000131
1.6统计分析
所有实验用三个不同供体的头皮真皮细胞重复3次(n＝3)，数据用平均值±标准差(平均值±标准差)表示，统计分析的p值如图所示采用学生t检验分析两个实验组的差异。
2结果
2.1真皮和表皮细胞的体外预聚集能促进体内毛囊的形成
由于毛囊的形成需要间充质细胞和上皮细胞之间的相互作用，我们假设在体外预先聚集间充质细胞和上皮细胞可以促进体内毛囊的形成。为了验证这一假设，将三组相同数量的细胞移植到裸鼠背部：第1组(Dis)Der+Epi细胞)由分离培养的扩张胎头皮真皮祖细胞和分离培养的扩张表皮干细胞以1:1的比例混合而成，然后移植；第2组(Der-Aggs+Dis)Epi)由胎儿真皮细胞悬浮培养24小时形成真皮球，再与分离的表皮细胞混合；第3组(derepi-Aggs)由胎儿头皮真皮细胞与表皮细胞按1:1的比例混合，悬浮培养24小时形成表皮真皮聚集体，然后将这些聚集体移植。移植后3个月，这三组小鼠的代表性图像如图1A所示。在所有三组中观察到毛发的形成，在第2组和第3组中形成更多的毛发，特别是第3组，毛发数量最多(图2A-B)；这一结果表明，真皮和表皮细胞在体外的预聚集可以增强了体内毛发再生为了证实这一结果。我们在相同的条件下对来自成人头皮组织的真皮细胞进行了测试；在这种情况下，由于毛发形成的效率太低，无法检测出各组之间的任何差异，因此，我们用小鼠新生表皮细胞(MNE)代替人成体表皮细胞移植后1个月，用斑贴法对三组进行评价结果反映了我们在图1B中观察到的情况：成年人真皮细胞与MNE的预聚集产生了最多数量的毛发(图1C)。总之，研究结果表明，真皮和表皮细胞的悬浮培养会引发间充质细胞和表皮细胞之间的相互作用，从而提高毛发在体内的再生潜力。
2.2真皮表皮聚集激活WNT分子通路
为了了解真皮和表皮细胞聚集后毛发再生增强的分子机理，我们通过实时qRT-PCR检测真皮、表皮和真皮表皮聚集物(悬浮培养24小时)的基因表达如图2所示，与真皮或表皮-表皮聚集物相比，真皮-表皮聚集物中Notch、Sonic hedgehog和WNT分子通路的基因表达显著增加，尤其值得注意的是WNT3a、WNT10b和LEF1的水平；这些WNT基因在真皮-表皮细胞聚集中显著增加，表明真皮表皮细胞相互作用主要激活WNT分子通路。
2.3真皮表皮细胞在体外相互作用形成两种类型的聚集体
在三维悬浮培养(图7)中，我们观察到单独真皮细胞悬浮培养形成一种球形聚集体，然而用表皮细胞和真皮细胞的混合培养时，可形成两种形态的聚集体：I型聚集体呈梨形(白色箭头，图3A)，II型聚集体呈球形(黑色箭头，图3A)。为了了解细胞如何在聚集过程中是如何排列的，我们用红色或绿色的膜染料标记表皮细胞(红色或绿色的膜染料)与未标记的真皮细胞混合；悬浮培养3天，我们发现I型聚集体的突出部分由红色或绿色标记细胞组成(箭头，图3B)，表明茎结构是由表皮细胞形成的。II型聚集体进一步分为两个亚型：II-A型，红色或绿色标记的表皮细胞存在于内层，和II-B型，标记的表皮细胞随机分布于内层(图3B)。
接下来，我们通过荧光共聚焦显微镜在12h、24h和48h观察到I型和II型聚集体形成的时间过程，我们发现这两种类型的聚集体最早在培养后24h形成(图3C)。为了测试不同聚集的形态是否显示头皮真皮细胞再生潜力，我们对胎儿或成人头皮真皮祖细胞混合相同表皮细胞进行了检测如图3D所示，胎儿细胞形成更多得I型聚集体(图3D)，表明I型聚集的形成与毛囊再生潜能的相关。
2.4 I型聚集体表达毛囊标志物
由于I型聚集体的形成反映了头皮真皮细胞的再生潜能，我们怀疑I型聚集体是否就是一个早期结构的毛囊。为了更详细地研究其结构，对3天的Ⅰ型聚集体进行常规组织学(H&E染色)和免疫荧光(IF)检测，I型聚集体的H&E染色显示出突起结构部分是角化的细胞(黑色箭头，图4A)，并表达角质蛋白(Pan-CK)和角蛋白14(K14)；表皮基底层和表皮突起下部的表达毛囊突起干细胞标记物角蛋白15(K15)。Ⅰ型聚集物同时表达毛囊标志物角蛋白17(K17)和角蛋白6(K6)；表皮和真皮中间的基底膜表达a6整合素(白色箭头，图4C)，Versican，一种间充质细胞标记物，在毛乳头中表达，位于聚集体突起的正下方(箭头所示)，表明I型聚集体可能含有毛乳头样结构。最后，我们发现增殖标记Ki67的染色出现在3天聚集的真皮细胞中，表明聚集的细胞在培养过程中有增值。这些结果表明，I型聚集体类似于毛囊早期结构。
2.5 WNT途径的激活对真皮-表皮聚集过程中的毛栓样形成至关重要
如图2所示，在真皮和表皮聚集过程中，WNT通路显著上调，我们想知道在细胞聚集过程中WNT通路是何时被激活的。我们在悬浮培养中形成表皮-真皮聚集体，并在不同时间点进行基因表达分析。图5A所示为WNT10b、LEF1和毛囊标记K17的RT-PCR分析,可见WNT通路在培养4-6小时后开始激活，在24小时达到最高峰(LEF1)，K17的表达在悬浮液后48小时达到最大值。为了进一步验证WNT途径对I型聚集体形成的重要性，我们在培养基中加入了WNT3a重组蛋白我们发现WNT3a的加入增加了I型聚集形成的百分比相反，加入WNT抑制剂IWP-2可阻止I型团聚体的形成。这些结果表明WNT信号通路在体外形成毛囊样结构的起着重要作用。
由于毛囊由表皮(上皮)和真皮(间充质)两部分组成，表皮-间充质细胞的相互作用在毛囊的形态发生和生长中起着至关重要的作用由于这两个腔室细胞之间的有效串扰被认为是成功再生毛囊的关键，我们假设头皮真皮和表皮细胞在体外的预聚集可能会增强毛囊在体内的再生。本发明中我们发现与游离真皮和表皮细胞或与游离表皮细胞混合的真皮和表皮细胞移植相比，事先在体外悬浮培养形成的真皮-表皮聚集物，移植后再生的毛囊数量明显增多(图1)，表明预聚集引发了真皮细胞和表皮细胞之间的关键性串扰(相互作用)，从而引发体内新毛囊的再生。
WNT信号通路在毛囊发育和再生中起着重要作用，我们发现聚集的表皮和真皮细胞激活NOTCH、Sonic Hedgehog(SHH)和WNT信号通路，特别是WNT信号通路升高明显，包括WNT配体WNT3a、WNT10b和WNT下游靶点LEF1的表达增加(图2)值得注意的是，与游离细胞相比，LEF1在表皮真皮聚集体中增加了近5倍。
WNT信号通路在皮肤及皮肤附属物形成中起主导作用。在胎儿皮肤形态发生过程中，Wnt首先在真皮中表达，然后在表皮中表达Wnt/β-catenin对第一个真皮信号的反应是出现在表皮中，促进长春新碱的形成接着，长条细胞向下面的间充质细胞发出信号，形成真皮凝结物(最终是真皮乳头)，再向上皮细胞发出信号，使其增殖并向下生长到真皮中，形成早期毛囊。我们的结果显示WNT激活真皮表皮聚集在体外促进早期毛囊的形成。
我们观察到表皮真皮细胞悬浮液导致两种形态的聚集体的形成：I型聚集体和II型聚集体(图3)：I型聚集体呈梨形，类似于早期毛囊结构，是毛囊形态发生的早期阶段。从细胞追踪研究中，我们发现聚集体是细胞有序组织的，表皮细胞和真皮细胞有机组合在一起，其中表皮细胞形成I型聚集体的茎结构部分(图3B-C)。对I型聚集体的进一步研究，发现了其具有毛囊的组织学特征和毛囊特殊基因的表达(图4)。另外，在生长培养基中添加WNT3a蛋白可促进I型聚集体的形成，而抑制Wnt合成过程和分泌的IWP2则阻止了它们的形成(图5B-C)因此，我们认为头皮真皮细胞和表皮细胞在悬浮液中的混合物可以激活WNT通路，并通过该途径导致毛囊微器官的形成。
最近的研究表明，LEF1的过度表达显著促进了三维打印模具中人毛囊的形成。在本研究的表皮真皮聚集体中观察到显著的LEF1表达增高，并与I型聚集体形成时间一致(图3)(图5)。可见LEF1可以作为毛发再生的生物标志物，并且在表皮真皮聚集体中诱导的LEF1表达可能有助于形成毛囊类器官。
我们的系统能够在24小时内形成大量的毛囊微器官结构(聚集体)，使用头皮真皮祖细胞和包皮表皮干细胞的简单悬浮方法，我们的研究为研究毛囊再生及临床应用提供了一个平台，例如测试毛发干细胞的毛发生成潜能，或进行大规模的促进毛发再生化合物筛选，以及研究间充质和上皮相互作用。
应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东大学
<120> 一种体外形成早期微毛囊的培养方法及其应用
<130>
<160> 24
<170> PatentIn version 3.3
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ccactgtaga aatggatggt 20

Claims (9)

1.一种体外形成早期微毛囊的培养方法，其特征在于，所述培养方法包括：
将真皮祖细胞与表皮干细胞混合，使用培养基悬浮培养，形成真皮-表皮聚集物，收集培养后的毛囊样结构即为培养的毛囊样微器官；
其中，所述培养基的配方包括以下组分：DMEM/F12（3:1）培养基、0.05~0.2%青霉素/链霉素、1~10 ng/ml FGF2、1~10 ng/ml EGF、0.1~2%B27、0.5~5mg/ml BPE和1~5% FBS；
所述培养条件具体为：在37℃、含5%CO2的组织培养箱中进行培养，每两天更换一次培养基，培养时间为4~72小时。
2.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述培养基的配方包括以下组分：DMEM/F12（3:1）培养基、0.1%青霉素/链霉素、5 ng/ml FGF2、5 ng/ml EGF、1%B27、1mg/ml BPE和2% FBS。
3.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述真皮祖细胞来源于头皮。
4.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述表皮干细胞选自来源于任何部位的皮肤。
5.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述表皮干细胞选自包皮。
6.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述真皮祖细胞与表皮干细胞混合比例为0.5~5:1。
7.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述培养时间为24~48小时。
8.权利要求1-7任一项所述培养方法获得的早期微毛囊。
9.权利要求8所述早期微毛囊的应用，其特征在于，所述应用为如下a）-c）中的任意一种或多种：
a）毛囊上皮-间质相互作用研究；
b）对毛发干细胞的毛发生成潜能的评估；
c）促毛发再生的化合物筛选。
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