TW202317752A

TW202317752A - 由非毛囊幹細胞至非聽覺誘導毛囊幹細胞的轉分化

Info

Publication number: TW202317752A
Application number: TW111133090A
Authority: TW
Inventors: 埃內斯托盧揚
Original assignee: 美商德諾沃股份有限公司
Priority date: 2021-09-01
Filing date: 2022-09-01
Publication date: 2023-05-01
Also published as: WO2023034910A1; AR126960A1

Abstract

本發明提供一系統組合物及其使用方法，以將非毛囊幹(hair follicle stem；HFS)細胞轉分化成非聽覺誘導毛囊幹細胞(induced hair follicle stem cell；iHFSC)且隨後使用此等細胞來治療脫髮。

Description

由非毛囊幹細胞至非聽覺誘導毛囊幹細胞的轉分化

本發明大體上係關於用於將非毛囊幹(HFS)細胞轉分化成非聽覺誘導毛囊幹細胞(iHFSC)以用於治療脫髮的組合物。

用於治療脫髮(另外稱為禿髮)之有效療法已廣泛研究數十年，但當前可用之療法不足以長期逆轉該病狀。醫藥療法可用於治療驅動脫髮之潛在病狀，諸如遺傳性禿病使用敏樂定(Minoxidil)(落健(Rogaine))或非那雄安(Finasteride)(柔沛(Propecia))。然而，許多患者很少(若存在)受益於此等療法，且受益於藥物介入之彼等患者必須無限期地服藥以維持治療效果。

毛髮移植手術為藥物介入之替代方案。藉由此程序，自供體部位獲取患者毛囊且重新移植至頭皮之另一部分，作為自體移植。令人遺憾地，由於執行該程序需要足夠量之患者供體部位，因此此程序僅在呈現早期脫髮之患者中為可能的。隨著遺傳性脫髮進展，此等供體毛髮部位的面積及數目變得更小，使得成功移植的可能性更小。另外，毛髮移植手術可為令人失望的，此係因為其導致供體部位處之毛髮密度減少，且由於缺乏供體毛囊，遍及整個頭皮之毛髮密度將永遠不能達到脫髮前密度。最近，已批准雷射療法用於治療遺傳性脫髮，然而此療法之長期效果不明確。因此，需要新治療策略來促進長期毛髮生長而不需要無限期服藥或依賴於供體毛囊之有限供應。

有前景的治療策略可為使用幹細胞再填充毛囊內之細胞。類似於如何可利用骨髓移植逆轉造血疾病，可利用毛囊幹細胞(HFSC)逆轉脫髮。此療法將在不需要依賴於患者供體毛囊之有限來源的情況下，藉由使用可自我更新且實現脫髮長期逆轉的細胞來提供毛髮移植的益處。

使用HFSC之主要挑戰為獲得用於療法中之有效量的能力。HFSC普遍率低且必須自現有毛囊採集。此外，不存在將非毛囊幹(HFS)細胞轉分化成誘導毛囊幹細胞(iHFSC)的已知方法。因此，自非HFS細胞有效產生iHFSC且有效地移植其至患者皮膚的任何方法將在脫髮治療中作為有前景的步驟呈現。

本發明係關於將非毛囊幹(HFS)細胞轉分化成(iHFSC)且隨後使用此等細胞來治療脫髮的系統之組合物及其使用方法。

本文提供用於轉分化之組合物，該組合物包含非HFS細胞群體；表現選自由以下組成之群之一或多種標記的非聽覺iHFSC群體：上皮鈣黏蛋白(ECAD)、角蛋白15 (KRT15)、克呂佩爾樣因子5 (Kruppel Like Factor 5；KLF5)、HR離胺酸去甲基酶及核受體輔抑制物(HR)、SRY-Box轉錄因子9 (SOX9)、轉錄因子AP-2α (TFAP2A)、整合素次單元α6 (ITGA6)、BAF染色質重塑複合物次單元BCL11B (CTIP2)、上皮剪接調節蛋白1 (ESRP1)及T-box轉錄因子1 (TBX1)；及毛囊幹細胞重編程(HFSCR)系統，其包含選自由以下組成之群之一或多種HFSCR因子：p53劑、NF-I劑、Lhx劑、TFAP2劑、IRX劑及Myc劑，其中該HFSCR系統使得一或多個非HFS細胞轉分化成一或多個非聽覺iHFSC。

在一些實施例中，與非HFS細胞群體相比，非聽覺iHFSC群體中之一或多種選自由以下組成之群之標記的表現增加至少兩倍：ECAD、KRT15、KLF5、HR、SOX9、TFAP2A、ITGA6、CTIP2、ESRP1及TBX1。在一些實施例中，與非HFS細胞群體相比，非聽覺iHFSC群體中之一或多種選自由以下組成之群之標記的表現增加至少五倍：ECAD、KRT15、KLF5、HR、SOX9、TFAP2A、ITGA6、CTIP2、ESRP1及TBX1。在一些實施例中，與非HFS細胞群體相比，非聽覺iHFSC群體中之一或多種選自由以下組成之群之標記的表現增加至少十倍：ECAD、KRT15、KLF5、HR、SOX9、TFAP2A、ITGA6、CTIP2、ESRP1及TBX1。在一些實施例中，該一或多種標記之表現維持至少一個細胞繼代。在一些實施例中，該一或多種標記之表現係藉由信使RNA分析、使用選自由以下組成之群的方法測定：定量聚合酶鏈反應(PCR)、逆轉錄PCR、RNA-Seq或北方墨點法。在一些實施例中，該一或多種標記之表現係藉由蛋白質分析、使用選自由流式細胞分析技術或西方墨點法組成之群的方法測定。

在一些實施例中，該p53劑為與滲透域融合之p53多肽或其功能片段。在一些實施例中，該p53劑為編碼p53多肽或其功能片段之核酸。在一些實施例中，該NF-I劑為與滲透域融合之NF-I多肽或其功能片段。在一些實施例中，該NF-I劑為編碼NF-I多肽或其功能片段之核酸。在一些實施例中，該Lhx劑為與滲透域融合之Lhx多肽或其功能片段。在一些實施例中，該Lhx劑為編碼Lhx多肽或其功能片段之核酸。在一些實施例中，該TFAP2劑為與滲透域融合之TFAP2多肽或其功能片段。在一些實施例中，該TFAP2劑為編碼TFAP2多肽或其功能片段之核酸。在一些實施例中，該IRX劑為與滲透域融合之IRX多肽或其功能片段。在一些實施例中，該IRX劑為編碼IRX多肽或其功能片段之核酸。在一些實施例中，該Myc劑為與滲透域融合之Myc多肽或其功能片段。在一些實施例中，該Myc劑為編碼Myc多肽或其功能片段之核酸。在一些實施例中，該核酸包含四環素反應啟動子。在一些實施例中，該核酸係在病毒粒子之衣殼內。在一些實施例中，該滲透域包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 1)、RKKRRQRRR (HIV-1 tat之胺基酸49-57；SEQ ID NO: 2)、TRQARRNRRRRWRERQR (HIV-1 rev之胺基酸34-50；SEQ ID NO: 3)、RRRRRRRRR (R9；SEQ ID NO: 4)及RRRRRRRR (R8；SEQ ID NO: 5)。

在一些實施例中，該非HFS細胞群體為哺乳動物細胞。在一些實施例中，該非HFS細胞群體為人類或鼠類細胞。在一些實施例中，該非HFS細胞係選自由真皮細胞、上皮細胞、脂肪細胞及造血細胞組成之群。在一些實施例中，真皮細胞係選自由纖維母細胞、平滑肌細胞及結締組織細胞組成之群。

本文亦提供一種製造非聽覺iHFSC群體之方法，該方法包含獲得非HFS細胞群體；使該非HFS細胞群體與包含選自由以下組成之群的一或多種HFSCR因子的HFSCR系統接觸：p53劑、NF-I劑、Lhx劑、TFAP2劑、IRX劑及Myc劑；及在該HFSCR系統存在下培育該非HFS細胞群體，其中一或多種該非HFS細胞轉分化成一或多個非聽覺iHFSC。

在本文所提供之方法之一些實施例中，非HFS細胞樣品係收集自哺乳動物個體，例如人類或鼠類個體。在一些實施例中，該非HFS細胞係選自由真皮細胞、上皮細胞、脂肪細胞及造血細胞組成之群。在一些實施例中，真皮細胞係選自由纖維母細胞、平滑肌細胞及結締組織細胞組成之群。在一些實施例中，在HFSCR系統存在下培育該非HFS細胞群體24小時至6週的時段。在一些實施例中，非HFS細胞係自投與轉分化之一或多個非聽覺iHFSC的個體收集。在一些實施例中，非HFS細胞係自與投與轉分化之一或多個非聽覺iHFSC之個體不同的個體收集。

在本文所提供之方法之一些實施例中，一或多個非聽覺iHFSC表現選自由以下組成之群的一或多種標記：ECAD、KRT15、KLF5、HR、SOX9、TFAP2A、ITGA6、CTIP2、ESRP1及TBX1。在一些實施例中，與非HFS細胞群體相比，非聽覺iHFSC群體中之一或多種選自由以下組成之群之標記的表現增加至少兩倍：ECAD、KRT15、KLF5、HR、SOX9、TFAP2A、ITGA6、CTIP2、ESRP1及TBX1。在一些實施例中，與非HFS細胞群體相比，非聽覺iHFSC群體中之一或多種選自由以下組成之群之標記的表現增加至少五倍：ECAD、KRT15、KLF5、HR、SOX9、TFAP2A、ITGA6、CTIP2、ESRP1及TBX1。在一些實施例中，與非HFS細胞群體相比，非聽覺iHFSC群體中之一或多種選自由以下組成之群之標記的表現增加至少十倍：ECAD、KRT15、KLF5、HR、SOX9、TFAP2A、ITGA6、CTIP2、ESRP1及TBX1。

在一些實施例中，方法包含將非聽覺iHFSC繼代至少一次。在一些實施例中，該一或多種標記之表現維持至少一個細胞繼代。

在本文所提供之方法的一些實施例中，p53劑為與滲透域融合之p53多肽或其功能片段。在一些實施例中，該p53劑為編碼p53多肽或其功能片段之核酸。在一些實施例中，該NF-I劑為與滲透域融合之NF-I多肽或其功能片段。在一些實施例中，該NF-I劑為編碼NF-I多肽或其功能片段之核酸。在一些實施例中，該Lhx劑為與滲透域融合之Lhx多肽或其功能片段。在一些實施例中，該Lhx劑為編碼Lhx多肽或其功能片段之核酸。在一些實施例中，該TFAP2劑為與滲透域融合之TFAP2多肽或其功能片段。在一些實施例中，該TFAP2劑為編碼TFAP2多肽或其功能片段之核酸。在一些實施例中，該IRX劑為與滲透域融合之IRX多肽或其功能片段。在一些實施例中，該IRX劑為編碼IRX多肽或其功能片段之核酸。在一些實施例中，該Myc劑為與滲透域融合之Myc多肽或其功能片段。在一些實施例中，該Myc劑為編碼Myc多肽或其功能片段之核酸。在一些實施例中，該核酸包含四環素反應啟動子。在一些實施例中，該核酸係在病毒粒子之衣殼內。在一些實施例中，該滲透域包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 1)、RKKRRQRRR (HIV-1 tat之胺基酸49-57；SEQ ID NO: 2)、TRQARRNRRRRWRERQR (HIV-1 rev之胺基酸34-50；SEQ ID NO: 3)、RRRRRRRRR (R9；SEQ ID NO: 4)及RRRRRRRR (R8；SEQ ID NO: 5)。

在本文所提供之方法之一些實施例中，該非聽覺iHFSC群體基於一或多種標記之表現而選擇且富集，該一或多種標記選自由以下組成之群：ECAD、KRT15、KLF5、HR、SOX9、TFAP2A、ITGA6、CTIP2、ESRP1及TBX1。在一些實施例中，選擇及富集包含螢光活化細胞分選(FACS)或磁活化細胞分選(MACS)。在一些實施例中，選擇及富集包含解離該非聽覺iHFSC群體以形成細胞懸浮液及添加真皮細胞群體至細胞懸浮液。在一些實施例中，真皮細胞係選自由以下組成之群：纖維母細胞、平滑肌細胞、結締組織細胞、真皮乳頭細胞及脂肪細胞。

在本文所提供之方法之一些實施例中，該非聽覺iHFSC群體經解離以形成細胞懸浮液且添加真皮細胞群體至該細胞懸浮液。在一些實施例中，真皮細胞係選自由纖維母細胞、平滑肌細胞、結締組織細胞、真皮乳頭細胞及脂肪細胞組成之群。

在本文所提供之方法之一些實施例中，非聽覺iHFSC在支架上培養。在一些實施例中，該支架由塑膠、基質膠或類似基底膜萃取物、明膠、膠原蛋白或層連結蛋白構成。在一些實施例中，非聽覺iHFSC在支架上培養30分鐘至48小時。

在本文提供之方法之一些實施例中，將支架上之非聽覺iHFSC移植至個體。在一些實施例中，將至少100,000個非聽覺iHFSC移植至個體。在一些實施例中，將至少1,000,000個非聽覺iHFSC移植至個體。在一些實施例中，將至少10,000,000個非聽覺iHFSC移植至個體。在一些實施例中，將支架上之非聽覺iHFSC及真皮細胞移植至個體。在一些實施例中，將至少100,000個非聽覺iHFSC及真皮細胞移植至個體。在一些實施例中，將至少1,000,000個非聽覺iHFSC及真皮細胞移植至個體。在一些實施例中，將至少10,000,000個非聽覺iHFSC及真皮細胞移植至個體。

本發明亦提供一種用於治療患有脫髮病狀之個體之方法，該方法包含投與組合物，該組合物包含：非HFS細胞群體；表現選自由以下組成之群之一或多種標記的非聽覺iHFSC群體：ECAD、KRT15、KLF5、HR、SOX9、TFAP2A、ITGA6、CTIP2、ESRP1及TBX1；及包含選自由以下組成之群之一或多種HFSCR因子的HFSCR系統：p53劑、NF-I劑、Lhx劑、TFAP2劑、IRX劑及Myc劑，其中該HFSCR系統使得一或多個非HFS細胞轉分化成一或多個非聽覺iHFSC。

在一些實施例中，本文所提供之組合物以治療脫髮病狀之方法投與個體。舉例而言，在一些實施例中，脫髮病狀係選自由以下組成之群：雄激素禿髮、斑禿、休止期落髮、拔毛癖、牽引性禿髮、頭癬、瘢痕性禿髮、燒傷或疤痕。在一些實施例中，非聽覺iHFSC自獲自個體之非HFS細胞轉分化而成。在一些實施例中，非聽覺iHFSC自獲自與組合物所投與之個體不同之個體的非HFS細胞轉分化而成。

本發明亦提供一種iHFSC組合物，其由包含以下之方法製成：獲得非聽覺iHFSC群體、獲得非HFS細胞群體；使非HFS細胞群體與包含選自由以下組成之群的一或多種HFSCR因子的HFSCR系統接觸：p53劑、NF-I劑、Lhx劑、TFAP2劑、IRX劑及Myc劑；及在HFSCR系統存在下培育非HFS細胞群體，其中一或多個非HFS細胞轉分化成一或多個非聽覺iHFSC。

相關申請案之交互參考

本申請案主張2021年9月1日申請之美國臨時專利申請案第63/239,474號之權益及優先權，該申請案之揭示內容以全文引用之方式併入本文中以用於所有目的。

本發明提供來自非毛囊幹(HFS)細胞群體之非聽覺誘導毛囊幹細胞(iHFSC)群體的組合物以及其使用及產生方法。此等方法及組合物可用於產生毛囊幹細胞(HFSC)及其毛囊先驅細胞(HFPC)以用於移植；作為實驗模型用於評估療法；及作為譜系特異性及細胞特異性產物之來源，及其類似者，例如用於治療人類脫髮病狀，諸如雄激素禿髮、斑禿、休止期落髮、拔毛癖、牽引性禿髮、頭癬及瘢痕性禿髮。亦提供根據使非HFS細胞轉分化成非聽覺iHFSC的活性來篩檢候選劑的組合物及方法。在閱讀如下文更充分所描述之本發明組合物及方法的細節後，本發明之此等及其他目標、優點及特徵將對熟習此項技術者變得顯而易見。

除非另外定義，否則本文中所用之所有技術及科學術語均具有與本發明所屬領域之一般技術者通常所理解相同之含義。為便於理解本發明，下文定義多個術語及片語。

除非本文另外明確規定，否則如本文所用，單數形式「一(a/an)」及「該」包括複數個提及物。因此，舉例而言，提及「一細胞」包括複數個此類細胞，且提及「該肽」包括提及熟習此項技術者已知之一或多種肽及其等效物(例如多肽)，諸如此類。

術語「多能」或「多能性」係指細胞能夠產生後代，該後代可在適當條件下分化成細胞類型，該等細胞類型共同展現與來自三個胚層(內胚層、中胚層及外胚層)之細胞譜系相關的特徵。

「幹細胞」係具有以下特徵的細胞：經由有絲分裂型細胞分裂達成自我更新之能力及分化成促成組織或器官之細胞類型的潛力。在哺乳動物幹細胞中，可區分胚胎幹細胞及體幹細胞。術語「胚胎幹細胞」用以指胚胎囊胚之內細胞團之多能幹細胞。此等細胞能夠產生整個有機體。術語「體幹細胞」係指分化成且維持胎兒、幼兒及成人組織的任一多能或多潛能幹細胞。不同於胚胎幹細胞，體幹細胞無法產生整個有機體。

包括胚胎幹細胞、胚胎生殖細胞及誘導多能細胞之多能幹細胞可促成分娩前、分娩後或成年有機體之組織。

術語「初代細胞」、「初代細胞株」及「初代培養物」在本文中可互換地用以指衍生自個體且允許培養物在活體外生長有限次數之繼代(亦即，分裂次數)的細胞及細胞培養物。

術語「治療(treatment/treating/treat)」及其類似術語在本文中一般用於指獲得所需藥理學及/或生理學效果。該效果就完全或部分預防疾病或其症狀而言可具預防性，且/或就疾病部分或完全穩定或治癒及/或可歸因於該疾病之不良影響而言可具治療性。如本文所用之「治療」涵蓋哺乳動物、尤其人類之疾病的任何治療，且包括：(a)預防可能易患該疾病或症狀但尚未診斷出患有該疾病或症狀之個體中發生該疾病或症狀；(b)抑制疾病症狀，亦即，遏制其發展；及/或(c)緩解疾病症狀，亦即，使疾病或症狀消退。

術語「個人」、「個體」、「宿主」及「患者」在本文中可互換使用且係指需要診斷、治療或療法之任何哺乳動物個體，尤其人類。 毛囊幹細胞及毛囊先驅細胞

如本文中所使用，術語「毛囊幹細胞」(HFSC)係指產生毛囊譜系的自我更新多能細胞。自我更新意謂當其進行有絲分裂時，其能夠產生至少一個為HFSC之子細胞。多潛能意謂其能夠產生毛囊先驅細胞，該等毛囊先驅細胞產生毛囊及分化毛髮的細胞類型，亦即，毛幹的細胞譜系、內根鞘細胞譜系及/或外根鞘細胞譜系。當使用熟習此項技術者已知的技術時，HFSC能夠在活體內促成新毛髮結構。HFSC並非多能的，亦即，其不能夠產生其他非外胚層器官之細胞。

如本文所用，術語「毛囊先驅細胞」(HFPC)及「毛囊先驅體」(HFP)係指在發育期間出現之HFSC之下游後代。HFPC具有有限的自我更新能力。自我更新意謂當其進行有絲分裂時，其產生至少一個為HFPC之子細胞。有限自我更新能力意謂HFPC可在產生兩個不再為HFPC之子細胞之前，以有限數目次有絲分裂(亦即，1、2、3、5或10次有絲分裂)自我更新。HFPC可為多潛能或單潛能的。多潛能意謂其能夠產生HFPC，該等HFPC產生毛囊及分化毛髮的不同細胞類型，亦即，毛幹的細胞譜系、內根鞘細胞譜系及/或外根鞘細胞譜系。單潛能意謂HFPC能夠產生HFPC，該等HFPC進而產生毛囊及分化毛髮的單一細胞類型，亦即，毛幹的細胞譜系、內根鞘細胞譜系及/或外根鞘細胞譜系。HFPC並非多能的，意謂其不能夠產生其他非外胚層譜系之細胞。另外，HFPC為有絲分裂的，且因此可將BrdU併入至其DNA中或展現如熟習此項技術者已知之細胞分裂證據，諸如在細胞繼代期間發生之細胞分裂。當使用熟習此項技術者已知的技術時，HFPC能夠在活體內促成新毛髮結構。因為HFPC功能特性與HFSC類似的實情，所以其通常被稱作HFSC且此處將如此提及。術語「誘導毛囊幹細胞」(iHFSC)涵蓋藉由實驗操縱而由非HFS細胞產生的HFSC或HFPC。iHFSC展現與如上文所定義之HFSC或HFPC相同的表型及功能特性。除非另外指明，否則如本文中所使用，術語iHFSC係指非聽覺iHFSC。

術語「毛髮單元」涵蓋表皮細胞與真皮細胞之組合。表皮細胞可含有HFSC、HFPC及/或iHFC。真皮細胞可包含真皮乳頭細胞、真皮鞘細胞、在功能上等效於此等細胞類型之已知構成真皮或細胞的其他細胞類型。毛髮單元可在培養皿中產生毛髮。毛髮單元亦可在活體內移植後產生毛髮。

HFSC表現一或多種標記，包括上皮鈣黏蛋白(ECAD)(亦稱為鈣黏蛋白1 (CDH1))、角蛋白15 (KRT15)、克呂佩爾樣因子5 (KLF5)、HR離胺酸去甲基酶及核受體輔抑制物(HR)、SRY-Box轉錄因子9 (SOX9)、轉錄因子AP-2α (TFAP2A)、整合素次單元α6 (ITGA6)、BAF染色質重塑複合物次單元BCL11B (CTIP2)、上皮剪接調節蛋白1 (ESRP1)、T-box轉錄因子1 (TBX1)及熟習此項技術者已知之其他標記。在一些實施例中，HFSC表現一種、兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種或全部選自由以下組成之群的標記：ECAD、KRT15、KLF5、HR、SOX9、TFAP2A、ITGA6、CTIP2、ESRP1及TBX1。在一些實施例中，選自由以下組成之群的一或多種標記之表現量隨時間及/或根據培養條件調節：ECAD、KRT15、KLF5、HR、SOX9、TFAP2A、ITGA6、CTIP2、ESRP1及TBX1。舉例而言，HFSC對選自由ECAD、KRT15、KLF5、HR、SOX9、TFAP2A、ITGA6、CTIP2、ESRP1及TBX1組成之群之一或多種標記的表現可為非HFS細胞群體的至少兩倍以上、至少3倍以上、至少4倍以上、至少5倍以上、至少6倍以上、至少7倍以上、至少8倍以上、至少9倍以上或至少10倍以上。在一實施例中，一或多種標記之表現係使用免疫螢光染色(例如流式細胞分析技術或免疫組織化學)或西方墨點分析來量測。在一較佳實施例中，一或多種標記之表現係使用流式細胞分析技術來量測。在一些實施例中，量測編碼一或多種標記之mRNA的表現量。舉例而言，在一些實施例中，mRNA水準使用定量聚合酶鏈反應(qPCR)、逆轉錄聚合酶鏈反應(RT PCR)、RNA-Seq或北方墨點分析量測。在一較佳實施例中，一或多種標記之mRNA水準係使用qPCR來量測。另外，HFSC為有絲分裂的，且因此可將BrdU併入至其DNA中或展現如熟習此項技術者已知之細胞分裂證據，諸如在細胞繼代期間發生之細胞分裂。在一些實施例中，HFSC維持選自由以下組成之群之一或多種標記在至少一個細胞繼代(例如至少一個細胞繼代、至少兩個細胞繼代、至少3個細胞繼代、至少4個細胞繼代或至少5個細胞繼代)內的表現：ECAD、KRT15、KLF5、HR、SOX9、TFAP2A、ITGA6、CTIP2、ESRP1及TBX1。 非毛囊幹細胞

如本文所用，術語「非毛囊幹(HFS)細胞」涵蓋在正常生理條件下無法產生構成毛囊之細胞的有機體中之任何細胞。此術語可涵蓋其他幹細胞、造血細胞、上皮細胞、真皮細胞或在不存在基因操縱或受傷(例如割傷、燒傷或疤痕)之正常生理條件下無法產生毛囊細胞的任何其他細胞類型。非HFS細胞可來自任何哺乳動物，包括人類、靈長類、家畜及農畜、以及動物園動物、實驗室動物或寵物，諸如狗、貓、牛、馬、綿羊、豬、山羊、兔、大鼠、小鼠等。在一些實施例中，非HFS細胞為人類或鼠類細胞且為真皮細胞(例如纖維母細胞、平滑肌細胞或結締組織細胞)、上皮細胞、脂肪細胞或造血細胞。

在一些實施例中，非HFS細胞可為已建立之細胞株，或其可為初代細胞，其中「初代細胞」、「初代細胞株」及「初代培養物」在本文中可互換地用以指衍生自個體且允許在試管內生長有限次數之繼代的細胞及細胞培養物。舉例而言，初代培養物為可已繼代0次、1次、2次、4次、5次、10次或15次，但次數不足以經過危機階段的培養物。通常，本發明之初代細胞株在試管內維持少於10次繼代。非HFS細胞可自新鮮或冷凍細胞分離，該等細胞可來自新生兒、幼兒或成人，且可來自組織，包括皮膚、肌肉、骨髓、周邊血液、臍帶血、脾臟、膀胱、肝臟、胰臟、肺、腸、胃、脂肪及其他分化組織。組織可藉由活供體生檢或血球分離術獲得，或獲自死亡約48小時內之死亡或瀕死供體；或新鮮冷凍組織；死亡約12小時內冷凍且在低於約−20℃維持的組織，通常無限期地在約液氮溫度(−190℃)下維持的組織。為自組織分離細胞，適當溶液可用於分散或懸浮。此類溶液一般將為平衡鹽溶液，例如標準生理食鹽水、PBS、漢克氏(Hank's)平衡鹽溶液等，其宜補充有胎牛血清或其他天然存在之因子以及低濃度(一般為5-25 mM)之可接受緩衝劑。適宜之緩衝劑包括HEPES、磷酸鹽緩衝劑、乳酸鹽緩衝劑等。 轉分化及毛囊幹細胞重編程系統

術語「轉分化」係指使用基因或生物化學操縱(諸如將外源衍生基因或蛋白質引入細胞中)有意誘導細胞或細胞組轉變成不同細胞類型。此不同於正常的分化或去分化過程，其可經由標準細胞培養程序或用生長因子或其他信號傳導分子處理而人工誘導。

術語「毛囊幹細胞重編程因子」或「HFSCR因子」係指作用於非HFS細胞以促進靶細胞重編程(亦即，轉分化)為非聽覺iHFSC的一或多種生物活性因子(亦即，混合物)。如本文所用，術語「HFSCR系統」促使非HFS細胞重編程(亦即，轉分化)為非聽覺iHFSC的試劑及培養條件，其中非HFS細胞可為體細胞或可為多能細胞。HFSCR系統包含非HFS細胞與HFSCR因子中之一或多者，亦即，混合物。HFSCR系統亦可視情況包含其他試劑，諸如促使細胞重編程之劑、促使HFSC存活及分化的劑、促使HFSC亞型分化的劑、促使HFPC存活及分化的劑、促使HFPC亞型分化的劑及其類似劑，如此項技術中已知。HFSCR系統不誘導非HFS細胞在轉化為非聽覺iHFSC的過程中變得多能，例如誘導多能幹細胞(iPSC)。換言之，HFSCR系統誘導一個譜系之非HFS細胞轉分化成非聽覺iHFSC，或誘導多能細胞變成非聽覺iHFSC。

在一些實施例中，HFSCR系統包含誘導來自個體之非HFS細胞轉化成非聽覺iHFSC；或誘導多能細胞轉化成iHFSC的條件。在一些實施例中，非HFS細胞在試管內與包含一或多種非HFS細胞與HFSC重編程因子(HFSCR因子)的HFSCR系統接觸。在一些實施例中，一或多種HFSCR因子作為核作用多肽提供。換言之，使個體細胞與在細胞核中起作用之HFSCR多肽接觸。

為了促使HFSCR多肽跨越細胞膜轉運，可將HFSCR多肽序列與多肽滲透域融合。多種滲透域為此項技術中已知且可用於本發明之核作用多肽中，包括肽、肽模擬物及非肽載劑。舉例而言，滲透肽可衍生自黑腹果蠅( Drosophila melanogaster)轉錄因子觸角足之第三α螺旋，稱為穿透蛋白，其包含胺基酸序列RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 1)。作為另一實例，滲透肽包含HIV-1 tat鹼性區域胺基酸序列，其可包括例如天然存在之tat蛋白之胺基酸49-57 (SEQ ID NO: 2)。其他滲透域包括多精胺酸模體，例如HIV-1 rev蛋白之胺基酸34-50 (SEQ ID NO: 3)、九精胺酸(SEQ ID NO: 4)、八精胺酸(SEQ ID NO: 5)及其類似區域(參見例如Futaki等人 (2003) Curr Protein Pept Sci. 2003年4月; 4(2): 87-96；及Wender等人 (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A2000年11月21日; 97(24):13003-8；公開之美國專利申請案20030220334；20030083256；20030032593；及20030022831，該等文獻關於易位肽及類肽的教示內容以引用之方式特別併入本文中)。九精胺酸(R9；SEQ ID NO: 4)序列為已表徵之更高效PTD中之一者(Wender等人 2000；Uemura等人 2002)。

HFSCR多肽可藉由試管內合成，使用此項技術中已知之習知方法來製備。各種商業合成裝置為可用的，例如Applied Biosystems, Inc., Beckman之自動化合成器等。藉由使用合成器，天然存在之胺基酸可經非天然胺基酸取代。製備之特定次序及方式將由便利性、經濟因素、所需之純度及其類似者決定。在無細胞系統中製備多肽之其他方法包括例如美國申請案第61/271,000號中所教示之彼等方法。

HFSCR多肽亦可根據重組合成之習知方法來分離及純化。裂解物可由表現宿主製備且裂解物使用HPLC、排阻層析、凝膠電泳、親和層析或其他純化技術純化。在大多數情況下，就與製備產物及其純化方法有關的摻雜物而言，所使用之組合物將包含至少20重量%所需產物，更通常至少約75重量%，較佳至少約95重量%，且用於治療目的，通常至少約99.5重量%。通常，百分比將基於總蛋白質。HFSCR多肽不僅可直接以重組方式產生，而且可以與異源多肽(例如在成熟蛋白或多肽之N末端具有特異性裂解位點的多肽)之融合多肽形式產生。表現載體通常含有選擇基因，亦稱為可選標記。此基因編碼在選擇性培養基中生長之經轉型宿主細胞存活或生長所需的蛋白質。

在藉由此項技術中通常已知之方法純化之後，HFSCR多肽藉由標準蛋白質轉導方法提供至個體細胞。在一些情況下，蛋白質轉導方法包括使細胞與含有載劑及至少一種純化HFSCR多肽的組合物接觸。適合載劑及其使用方法的實例包括(但不限於)市售試劑，諸如描述於美國專利第6,841,535號中之Chariot™ (Active Motif, Inc., Carlsbad, Calif.)；Bioport™ (Gene Therapy Systems, Inc., San Diego, Calif.)、GenomeONE (Cosmo Bio Co., Ltd., Tokyo, Japan)及ProteoJuice™ (Novagen, Madison, Wis.)或奈米粒子蛋白質轉導試劑。

在其他實施例中，一或多種HFSCR因子為編碼HFSCR多肽(亦即HFSCR核酸)之核酸(例如聚核苷酸)。核酸可為去氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或功能類似衍生物。用於向個體細胞提供HFSCR核酸之載體通常包含適用於驅動核酸之表現(即轉錄活化)的啟動子。此可包括廣泛作用啟動子，例如CMV-β-肌動蛋白啟動子或誘導性啟動子，諸如在特定細胞群體中有活性或對諸如四環素之藥物的存在有反應之啟動子。藉由轉錄活化，意欲在靶細胞中之轉錄作用增加比基礎水準高至少約10倍、至少約100倍、更通常至少約1000倍。另外，用於提供核酸之載體可包括之後必須移除之基因，例如使用重組酶系統(諸如Cre/Lox)移除之基因；或使得表現其等之細胞被破壞之基因，例如藉由包括允許選擇性毒性之基因，諸如疱疹病毒TK、bcl-xs等。

HFSCR核酸可直接提供至個體細胞。換言之，使細胞與包含HFSCR核酸之載體接觸，使得該等載體被細胞吸收。此項技術中熟知使細胞與核酸載體接觸之方法，諸如電穿孔、氯化鈣轉染及脂質體轉染。以此方式遞送核酸之載體通常係以游離方式(例如呈質體或微環DNA狀態)保持。

可替代地，核酸可經由病毒提供至個體細胞。換言之，使細胞與包含HFSCR核酸之病毒粒子接觸。逆轉錄病毒(例如慢病毒)尤其適合於此類方法。常用逆轉錄病毒載體為「有缺陷的」，亦即無法產生為生產性感染所需要的病毒蛋白質。確切而言，載體複製作用需要在封裝細胞株中生長。為了產生包含所關注核酸之病毒粒子，藉由封裝細胞株將包含核酸之逆轉錄病毒核酸封裝至病毒衣殼中。不同的封裝細胞株提供不同的包膜蛋白以併入衣殼中，此包膜蛋白決定病毒粒子對細胞之特異性。包膜蛋白具有至少三種類型：親嗜性、雙嗜性及嗜異性。封裝有親嗜性包膜蛋白之逆轉錄病毒(例如MMLV)能夠感染大部分鼠類及大鼠細胞類型，且藉由使用親嗜性封裝細胞株來產生，諸如BOSC23 (Pear等人 (1993) Proc . Natl . Acad . Sci . U . S . A .90:8392-8396)。帶有雙嗜性包膜蛋白之逆轉錄病毒(例如，4070A (Danos等人，前述))能夠感染大部分哺乳動物細胞類型，包括人類、狗及小鼠，且藉由使用雙嗜性封裝細胞株來產生，諸如PA12 (Miller等人 (1985) Mol. Cell. Biol.5:431-437)；PA317 (Miller等人 (1986) Mol. Cell. Biol.6:2895-2902)；GRIP (Danos等人 (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.85:6460-6464)。封裝有嗜異性包膜蛋白之逆轉錄病毒(例如，AKR env)能夠感染大部分哺乳動物細胞類型，鼠類細胞除外。適當封裝細胞株可用於確保封裝病毒粒子靶向個體細胞。將包含HFSCR核酸之逆轉錄病毒載體引入至封裝細胞株中且收集由封裝株產生之病毒粒子的方法為此項技術中所熟知。

可用於接觸非HFS細胞之HFSCR系統的有效量為誘導培養物中至少0.01%細胞中之一或多種基因(例如KRT15、ECAD (CDH1)、KLF5、HR、SOX9、TFAP2A、TBITGA6、CTIP2、ESRP1及TBX1)表現增強的量，該等基因在此項技術中已知且在HFSC命運被獲取後受到更高的表現。

有效量係誘導此等基因之表現增加的量，例如比無HFSCR系統不存在下觀測到之表現量高約1.5倍、2倍、3倍、4倍、6倍或10倍。基因表現量可容易地藉由此項技術中之許多熟知方法中之任一者測定，例如藉由用諸如(但不限於) RT-PCR、定量RT-PCR、RNA-Seq及北方墨點法之方法量測RNA水準；及藉由用諸如(但不限於)西方墨點法、ELISA及螢光活化細胞分選之方法量測蛋白質水準。

此處應注意，所接觸之非HFS細胞不需要根據此項技術中已知可促進多能性之方法培養以便轉化成iHFSC。多能性意謂細胞能夠分化成有機體中之所有類型的細胞。

HFSCR系統的重編程效率可藉由分析在細胞培養物中發育之iHFSC的數目來測定，例如藉由分析表現由HFSC表現之基因(例如KLF5、HR、SOX9、TFAP2A、ITGA6、CTIP2、ESRP1及TBX1)的細胞之數目來測定。

對於HFSCR系統而言，遵循本發明之方法，所接觸之非HFS細胞將以重編程效率/轉化效率轉化成iHFSC或HFPC，該等iHFSC或HFPC為最初培養之非HFS細胞之總數的至少約0.01%，例如約0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、12%、14%、16%、20%或更多。

有時，視供體年齡、組織來源或培養條件而定，可達成較高效率。此重編程效率為相較於在HFSCR系統不存在下可觀測到之效率增強的效率。增強意謂非HFS細胞培養物具有產生所需細胞類型的能力，該能力比未與HFSCR因子接觸之非HFS細胞培養物之能力大至少150%，例如未接觸群體之能力的至少150%、至少200%、至少300%、至少400%、至少600%、至少800%、至少1000%、或至少2000%。換言之，對於經HFSCR系統處理之細胞而言，非HFS細胞培養物產生的iHFSC數目為未與HFSCR系統接觸之非HFS細胞群體所產生之iHFSC數目的至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少6倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少50倍、至少100倍或至少200倍。

在一些情況下，基因可引入非HFS細胞或其衍生細胞中，亦即iHFSC或分化後代細胞，隨後轉移至個體以用於多種目的，例如(但不限於)替換具有功能損失型突變(例如ECAD、KRT15、KLF5、HR、SOX9、TFAP2A、ITGA6、CTIP2、ESRP1及/或TBX1中之功能損失型突變)的基因或提供標記基因(例如，綠色螢光蛋白或抗生素抗性基因)。可替代地，引入表現反義mRNA或核酶之載體，藉此阻斷非所需基因之表現。基因療法之其他方法為引入抗藥性基因以使得正常先驅細胞能夠具有優點且經受選擇性壓力，例如多重抗藥性基因(MDR)或抗細胞凋亡基因，諸如Bcl-2。此項技術中已知之各種技術可用於將核酸引入靶細胞中，例如電穿孔、鈣沈澱DNA、融合、轉染、脂質體轉染、感染及其類似者，如上文所論述。引入核酸之特定方式對於本發明之實施並非關鍵的。

為確認非HFS細胞或其衍生細胞已經基因修飾，亦即，轉分化成iHFSC或分化後代細胞，可採用各種技術。細胞之基因體、總轉錄本或蛋白質體可受限制且在擴增或不擴增之情況下使用。聚合酶鏈反應；凝膠電泳；限制分析；南方、北方及西方墨點法；定序；或其類似方法均可用以確認基因操縱。細胞可在各種條件下生長以確保細胞能夠成熟成為所有毛囊譜系。可採用各種試管內及活體內測試以確保iHFSC或所衍生細胞之分化後代細胞表型已得到維持。 毛囊幹細胞重編程 ( HFSCR ) 因子

以下描述前述部分中所描述之HFSCR系統的HFSCR因子。

HFSCR因子為作用於細胞以改變轉錄、從而將細胞轉化成HFSC (亦即iHFSC)的生物活性因子。HFSCR因子在HFSCR系統之情況下係提供至體細胞或多能細胞。HFSCR因子之實例包括Lhx劑、NF-I劑、TFAP2劑、Irx劑、p53劑及Myc劑。

如本文所用，術語「功能性片段」係指全長蛋白質之一部分，其維持執行全長蛋白質之細胞功能及/或與全長蛋白質之蛋白質結合搭配物相互作用的能力。

術語Lhx劑用以指Lhx (亦稱為LIM同源匣)多肽、其功能片段及編碼其之核酸。術語Lhx劑亦可指Lhx相關蛋白質或調節Lhx活性之蛋白質之多肽及編碼其之核酸(例如聚核苷酸)。在一些實施例中，Lhx多肽或其功能片段與滲透域融合。Lhx劑亦可指調節Lhx表現及/或活性的小分子。Lhx多肽為具有LIM域(富含半胱胺酸之鋅結合域)之含同源域轉錄因子。術語「Lhx基因產物」、「Lhx多肽」及「Lhx蛋白質」在本文中可互換地用於指能夠調節轉錄的天然序列Lhx多肽、Lhx多肽變異體、Lhx多肽片段及嵌合Lhx多肽。天然序列Lhx多肽包括蛋白質Lhx1 (亦稱作LIM1；GenBank登錄號NM _—005568.2及NP _—005559.2)；Lhx2 (GenBank登錄號NM _—004789.3及NP _—004780.3)；Lhx3 (GenBank登錄號NM _—178138.3及NP 835258.1 (同功型a)，及NM _—014564.2及NP _—055379.1 (同功型b))；Lhx4 (GenBank登錄號NM _—033343.2及NP _—203129.1)；Lhx5 (GenBank登錄號NM _—022363.2及NP _—071758.1)；Lhx6 (GenBank登錄號NM _—014368.3及NP _—055183.2 (同功型1)，及NM _—199160.2及NP _—954629.2 (同功型2))；Lhx7 (亦稱作Lhx8；GenBank登錄號NM _—001001933.1及NP _—001001933.1)；及Lhx9 (GenBank登錄號NM _—020204.2及NP _—064589.2 (同功型1)，及NM _—001014434.1及NP _—001014434.1 (同功型2))。Lhx多肽，例如與以上GenBank登錄號中提供之序列至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、95%、97%、99%或100%一致的多肽，可用作本發明中之重編程因子，編碼此等多肽或其轉錄活性域之核酸及包含此等核酸的載體亦如此。在一些實施例中，Lhx劑為Lhx2劑。在某些實施例中，Lhx劑為編碼Lhx2多肽之聚核苷酸。

術語NF-I劑用以指NF-I (核因子I)多肽、其功能片段及編碼其之核酸。術語NF-I劑亦可指NF-I相關蛋白質或調節NF-I活性之蛋白質之多肽及編碼其之核酸(例如聚核苷酸)。在一些實施例中，NF-I多肽或其功能片段與滲透域融合。NF-I劑亦可指調節NF-I表現及/或活性的小分子。NF-I多肽為DNA結合蛋白之NFI (核因子I)家族成員。術語「NF-I基因產物」、「NF-I多肽」及「NF-I蛋白質」在本文中可互換地用以指可調節轉錄之天然序列NF-I多肽、NF-I多肽變異體、NF-I多肽片段及嵌合NF-I多肽。天然序列NF-I多肽包括蛋白質NFIA (GenBank登錄號NM_001134673.4及NP_001128145.1 (同功型1)，GenBank登錄號NM_005595.5及NP_005586.1 (同功型2)，GenBank登錄號NM_001145511.2及NP_001138983.1 (同功型3)，及GenBank登錄號NM_001145512.2及NP_001138984.1 (同功型4))；NFIB (GenBank登錄號NM_001190737.2及NP_001177666.1 (同功型1)，GenBank登錄號NM_001190738.2及NP_001177667.1 (同功型2)，GenBank登錄號NM_005596.3及NP_005587.2 (同功型3)，GenBank登錄號NM_001282787.2及NP_001269716.1 (同功型4)，GenBank登錄號NM_001369458.1及NP_001356387.1 (同功型5)，GenBank登錄號NM_001369459.1及NP_001356388.1 (同功型6)，GenBank登錄號NM_001369460.1及NP_001356389.1 (同功型7)，GenBank登錄號NM_001369461.1及NP_001356390.1 (同功型8)，GenBank登錄號NM_001369462.1及NP_001356391.1 (同功型9)，GenBank登錄號NM_001369463.1及NP_001356392.1 (同功型10)，GenBank登錄號NM_001369464.1及NP_001356393.1 (同功型11)，GenBank登錄號NM_001369465.1及NP_001356394.1 (同功型12)，GenBank登錄號NM_001369466.1及NP_001356395.1 (同功型13)，GenBank登錄號NM_001369467.1及NP_001356396.1 (同功型14)，GenBank登錄號NM_001369468.1及NP_001356397.1 (同功型15)，GenBank登錄號NM_001369469.1及NP_001356398.1 (同功型16)，GenBank登錄號NM_001369470.1及NP_001356399.1 (同功型17)，GenBank登錄號NM_001369471.1及NP_001356400.1 (同功型18)，GenBank登錄號NM_001369472.1及NP_001356401.1 (同功型19)，GenBank登錄號NM_001369473.1及NP_001356402.1 (同功型20)，GenBank登錄號NM_001369474.1及NP_001356403.1 (同功型21)，GenBank登錄號NM_001369475.1及NP_001356404.1 (同功型22)，GenBank登錄號NM_001369476.1及NP_001356405.1 (同功型23)，GenBank登錄號NM_001369477.1及NP_001356406.1 (同功型24)，GenBank登錄號NM_001369478.1及NP_001356407.1 (同功型25)，GenBank登錄號NM_001369479.1及NP_001356408.1 (同功型26)，GenBank登錄號NM_001369480.1及NP_001356409.1 (同功型27)，GenBank登錄號NM_001369481.1及NP_001356410.1 (同功型28))；NFIC (GenBank登錄號NM_001245002.2及NP_001231931.1 (同功型1)，GenBank登錄號NM_205843.3及NP_995315.1 (同功型2)，GenBank登錄號NM_001245004.2及NP_001231933.1 (同功型3)，GenBank登錄號NM_001245005.2及NP_001231934.1 (同功型4)，及GenBank登錄號NM_005597.4及NP_005588.2 (同功型5))；及NFIX (GenBank登錄號NM_001271043.2及NP_001257972.1 (同功型1)，GenBank登錄號NM_002501.4及NP_002492.2 (同功型2)，GenBank登錄號NM_001271044.3及NP_001257973.1 (同功型3)，GenBank登錄號NM_001365902.3及NP_001352831.1 (同功型4)，GenBank登錄號NM_001365982.2及NP_001352911.1 (同功型5)，GenBank登錄號NM_001365983.2及NP_001352912.1 (同功型6)，GenBank登錄號NM_001365984.2及NP_001352913.1 (同功型7)，GenBank登錄號NM_001365985.2及NP_001352914.1 (同功型8)，GenBank登錄號NM_001378404.1及NP_001365333.1 (同功型9)，及GenBank登錄號NM_001378405.1及NP_001365334.1 (同功型10))。NFI多肽，例如與以上GenBank登錄號中提供之序列至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、95%、97%、99%或100%一致的多肽，可用作本發明中之重編程因子，編碼此等多肽或其轉錄活性域之核酸及包含此等核酸的載體亦如此。在某些實施例中，NFI劑為NFIB劑。在一些實施例中，NF-I藥劑為編碼NFIB多肽之聚核苷酸。

術語TFAP2劑用以指TFAP2 (轉錄因子AP-2α2)多肽、其功能片段及編碼其之核酸。術語TFAP2劑亦可指TFAP2相關蛋白質或調節TFAP2活性之蛋白質之多肽及編碼其之核酸(例如聚核苷酸)。在一些實施例中，TFAP2多肽或其功能片段與滲透域融合。TFAP2劑亦可指調節TFAP2表現及/或活性的小分子。TFAP2多肽為轉錄因子之AP-2 (活化蛋白2)家族成員。術語「TFAP2基因產物」、「TFAP2多肽」及「TFAP2蛋白質」在本文中可互換地用以指可調節轉錄之天然序列TFAP2多肽、TFAP2多肽變異體、TFAP2多肽片段及嵌合TFAP2多肽。天然序列TFAP2多肽包括蛋白質TFAP2A (GenBank登錄號NM_001372066.1及NP_001358995.1 (同功型a)，GenBank登錄號NM_001032280.3及NP_001027451.1 (同功型b)，GenBank登錄號NM_001042425.3及NP_001035890.1 (同功型c))；TFAP2B (GenBank登錄號NM_003221.3及NP_003212.2)；TFAP2C (GenBank登錄號NM_003222.3及NP_003213.1)；TFAP2D (GenBank登錄號NM_172238.3及NP_758438.2)及TFAP2E (GenBank登錄號NM_178548.3及NP_848643.2)。TFAP2多肽，例如與以上GenBank登錄號中提供之序列至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、95%、97%、99%或100%一致之彼等多肽，可用作本發明中之重編程因子，編碼此等多肽或其轉錄活性域之核酸及包含此等核酸的載體亦如此。在某些實施例中，TFAP2劑為TFAP2A劑。在一些實施例中，TFAP2劑為編碼TFAP2A多肽之聚核苷酸。

術語Irx劑用以指Irx (易洛魁(Iroquois)同源匣因子)多肽、其功能片段及編碼其之核酸。術語Irx劑亦可指Irx相關蛋白質或調節Irx活性之蛋白質之多肽及編碼其之核酸(例如聚核苷酸)。在一些實施例中，Irx多肽或其功能片段與滲透域融合。Irx劑亦可指調節Irx表現及/或活性的小分子。Irx多肽為Irx (易洛魁同源匣因子)轉錄因子家族成員。術語「Irx基因產物」、「Irx多肽」及「Irx蛋白質」在本文中可互換地用以指可調節轉錄之天然序列Irx多肽、Irx多肽變異體、Irx多肽片段及嵌合Irx多肽。天然序列Irx多肽包括蛋白質Irx1 (GenBank登錄號NM_024337.3及NP_077313.3)；Irx2 (GenBank登錄號NM_033267.4及NP_150366.1 (變異體1)及GenBank登錄號NM_001134222.2及NP_001127694.1 (變異體2))；Irx3 (GenBank登錄號NM_024336.2及NP_077312.2)；Irx4 (GenBank登錄號NM_001278632.1及NP_001265561.1 (變異體1)，GenBank登錄號NM_001278633.1及NP_001265562.1 (變異體2)，GenBank登錄號NM_001278634.2及NP_001265563.1 (變異體3)，GenBank登錄號NM_001278635.2及NP_001265564.1 (變異體4)，及GenBank登錄號NM_016358.3及NP_057442.1 (變異體5))；Irx5 (GenBank登錄號NM_005853.5及NP_005844.4 (變異體1)及GenBank登錄號NM_001252197.1及NP_001239126.1 (變異體2))；Irx6 (GenBank登錄號NM_024335.2及NP_077311.2)。Irx多肽，例如與以上GenBank登錄號中提供之序列至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、95%、97%、99%或100%一致之Irx多肽，可用作本發明中之重編程因子，編碼此等多肽或影響轉錄之其域的核酸及包含此等核酸之載體亦如此。在某些實施例中，Irx劑為Irx4劑。在一些實施例中，Irx藥劑為編碼Irx4多肽之聚核苷酸。

術語p53劑用以指p53多肽、其功能片段及編碼其之核酸。術語p53劑亦可指p53相關蛋白質或調節p53活性之蛋白質之多肽及編碼其之核酸(例如聚核苷酸)。在一些實施例中，p53多肽或其功能片段與滲透域融合。p53劑亦可指調節p53表現及/或活性的小分子。p53多肽為p53轉錄因子家族成員。術語「p53基因產物」、「p53多肽」及「p53蛋白質」在本文中可互換地用以指可調節轉錄之天然序列p53多肽、p53多肽變異體、p53多肽片段及嵌合p53多肽。天然序列p53多肽包括蛋白質TP53 (GenBank登錄號NM_000546.6及NP_000537.3 (同功型a)，GenBank登錄號NM_001126114.3及NP_001119586.1 (同功型b)，GenBank登錄號NM_001126113.3及NP_001119585.1 (同功型c)，GenBank登錄號NM_001126115.2及NP_001119587.1 (同功型d)，GenBank登錄號NM_001126116.2及NP_001119588.1 (同功型e)，GenBank登錄號NM_001126117.2及NP_001119589.1 (同功型f)，GenBank登錄號NM_001126118.2及NP_001119590.1 (同功型g)，GenBank登錄號NM_001276695.3及NP_001263624.1 (同功型h)，GenBank登錄號NM_001276696.3及NP_001263625.1 (同功型i)，GenBank登錄號NM_001276697.3及NP_001263626.1 (同功型j)，GenBank登錄號NM_001276698.3及NP_001263627.1 (同功型k)及GenBank登錄號NM_001276699.3及NP_001263628.1 (同功型l))；TP63 (GenBank登錄號NM_003722.5及NP_003713.3 (同功型1)，GenBank登錄號NM_001114978.2及NP_001108450.1 (同功型2)，GenBank登錄號NM_001114979.2及NP_001108451.1 (同功型3)，GenBank登錄號NM_001114980.2及NP_001108452.1 (同功型4)，GenBank登錄號NM_001114981.2及NP_001108453.1 (同功型5)，GenBank登錄號NM_001114982.2及NP_001108454.1 (同功型6)，GenBank登錄號NM_001329144.2及NP_001316073.1 (同功型7)，GenBank登錄號NM_001329145.2及NP_001316074.1 (同功型8)，GenBank登錄號NM_001329146.2及NP_001316075.1 (同功型9)，GenBank登錄號NM_001329148.2及NP_001316077.1 (同功型10)，GenBank登錄號NM_001329149.2及NP_001316078.1 (同功型11)，GenBank登錄號NM_001329150.2及NP_001316079.1 (同功型12)，及GenBank登錄號NM_001329964.2及NP_001316893.1 (同功型13))；及TP73 (GenBank登錄號NM_005427.4及NP_005418.1 (同功型a)，GenBank登錄號NM_001126240.3及NP_001119712.1 (同功型b)，GenBank登錄號NM_001126241.3及NP_001119713.1 (同功型c)，GenBank登錄號NM_001126242.3及NP_001119714.1 (同功型d)，GenBank登錄號NM_001204189.2及NP_001191118.1 (同功型e)，GenBank登錄號NM_001204190.2及NP_001191119.1 (同功型f)，GenBank登錄號NM_001204191.2及NP_001191120.1 (同功型g)，GenBank登錄號NM_001204184.2及NP_001191113.1 (同功型h)，GenBank登錄號NM_001204185.2及NP_001191114.1 (同功型i)，GenBank登錄號NM_001204186.2及NP_001191115.1 (同功型j)，GenBank登錄號NM_001204187.2及NP_001191116.1 (同功型k)，GenBank登錄號NM_001204188.2及NP_001191117.1 (同功型l)，GenBank登錄號NM_001204192.2及NP_001191121.1 (同功型m))。p53多肽，例如與以上GenBank登錄號中提供之序列至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、95%、97%、99%或100%一致之彼等多肽，可用作本發明中之重編程因子，編碼此等多肽或影響轉錄之其域的核酸及包含此等核酸之載體亦如此。在一些實施例中，p53劑為TP63劑。在一些實施例中，p53劑為編碼TP63多肽之聚核苷酸。

術語Myc劑用以指Myc多肽、其功能片段及編碼其之核酸。術語Myc劑亦可指Myc相關蛋白質或調節Myc活性之蛋白質之多肽及編碼其之核酸(例如聚核苷酸)。在一些實施例中，Myc多肽或其功能片段與滲透域融合。Myc劑亦可指調節Myc表現及/或活性的小分子。Myc多肽為Myc轉錄因子家族成員。術語「Myc基因產物」、「Myc多肽」及「Myc蛋白質」在本文中可互換地用以指可調節轉錄之天然序列Myc多肽、Myc多肽變異體、Myc多肽片段及嵌合Myc多肽。天然序列Myc多肽包括蛋白質MYC (GenBank登錄號NM_002467.6及NP_002458.2 (同功型1)，及GenBank登錄號NM_001354870.1及NP_001341799.1 (同功型2))；MYCL (GenBank登錄號NM_001033081.3及NP_001028253.1 (同功型1)，GenBank登錄號NM_005376.5及NP_005367.2 (同功型2)，及GenBank登錄號NM_001033082.3及NP_001028254.2 (同功型3))；及MYCN (GenBank登錄號NM_001293228.2及NP_001280157.1)，GenBank登錄號NM_001293231.2及NP_001280160.1 (同功型2)，及GenBank登錄號NM_001293233.2及NP_001280162.1 (同功型3))。Myc多肽，例如與以上GenBank登錄號中提供之序列至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、95%、97%、99%或100%一致的多肽，可用作本發明中之重編程因子，編碼此等多肽或影響轉錄之其域的核酸及包含此等核酸的載體亦如此。在某些實施例中，Myc劑為MYC劑。在一些實施例中，Myc劑為編碼MYC多肽之聚核苷酸。

在一些實施例中，僅提供一種HFSCR因子，例如p53劑、NF-I劑、Lhx劑、TFAP2劑、Irx劑或Myc劑。舉例而言，在某些實施例中，僅提供一種HFSCR因子，其選自由以下組成之群：TP63劑、NFIB劑、LHX2劑、TFAP2A劑、IRX4劑及MYC劑。在一些實施例中，僅提供一種HFSCR因子，其選自由以下組成之群：編碼TP63多肽之聚核苷酸、編碼NFIB多肽之聚核苷酸、編碼LHX2多肽之聚核苷酸、編碼TFAP2A多肽之聚核苷酸、編碼IRX4多肽之聚核苷酸及編碼MYC多肽之聚核苷酸。

在一些實施例中，提供至少兩種劑之集合，例如p53劑及NF-I劑、p53劑及Lhx劑、p53劑及TFAP2劑、p53劑及Irx劑、p53劑及Myc劑、NF-I劑及Lhx劑、NF-I劑及TFAP2劑、NF-I劑及Lhx劑、NF-I劑及Irx劑、NF-I劑及Myc劑、LHX2劑及TFAP2劑、LHX2劑及Irx劑、LHX2劑及Myc劑、TFAP2劑及Irx劑、TFAP2劑及Myc劑或Irx劑及Myc劑。在一些實施例中，提供選自由以下組成之群之至少兩種劑之集合：TP63劑及NFIB劑、TP63劑及LHX2劑、TP63劑及TFAP2A劑、TP63劑及IRX4劑、TP63劑及MYC劑、NFIB劑及LHX2劑、NFIB劑及TFAP2A劑、NFIB劑及LHX2劑、NFIB劑及IRX4劑、NFIB劑及MYC劑、LHX2劑及TFAP2A劑、LHX2劑及IRX4劑、LHX2劑及MYC劑、TFAP2A劑及IRX4劑、TFAP2A劑及MYC劑以及IRX4劑及MYC劑。在一些實施例中，提供選自由以下組成之群之至少兩種劑之集合：編碼TP63多肽之聚核苷酸及編碼NFIB多肽之聚核苷酸、編碼TP63多肽之聚核苷酸及編碼LHX2多肽之聚核苷酸、編碼TP63多肽之聚核苷酸及編碼TFAP2A多肽之聚核苷酸、編碼TP63多肽之聚核苷酸及編碼IRX4多肽之聚核苷酸、編碼TP63多肽之聚核苷酸及編碼MYC多肽之聚核苷酸、編碼NFIB多肽之聚核苷酸及編碼LHX2多肽之聚核苷酸、編碼NFIB多肽之聚核苷酸及編碼TFAP2A多肽之聚核苷酸、編碼NFIB多肽之聚核苷酸及編碼LHX2多肽之聚核苷酸、編碼NFIB多肽之聚核苷酸及編碼IRX4多肽之聚核苷酸、編碼NFIB多肽之聚核苷酸及編碼MYC多肽之聚核苷酸、編碼LHX2多肽之聚核苷酸及編碼TFAP2A多肽之聚核苷酸、編碼LHX2多肽之聚核苷酸及編碼IRX4多肽之聚核苷酸、編碼LHX2多肽之聚核苷酸及編碼MYC多肽之聚核苷酸、編碼TFAP2A多肽之聚核苷酸及編碼IRX4多肽之聚核苷酸、編碼TFAP2A多肽之聚核苷酸及編碼MYC多肽之聚核苷酸以及編碼IRX4多肽之聚核苷酸及編碼MYC多肽之聚核苷酸。

在一些實施例中，提供至少三種劑之集合，例如p53劑、NF-I劑及Lhx劑；p53劑、NF-I劑及TFAP2劑；p53劑、NF-I劑及Irx劑；p53劑、NF-I劑及Myc劑；p53劑、Lhx劑及TFAP2劑；p53劑、Lhx劑及Irx劑；p53劑、Lhx劑及Myc劑；p53劑、TFAP2劑及Irx劑；p53劑、TFAP2劑及Myc劑；p53劑、Irx劑及Myc劑；NF-I劑、Lhx劑及TFAP2劑；NF-I劑、Lhx劑及Irx劑；NF-I劑、Lhx劑及Myc劑；NF-I劑、TFAP2劑及Irx劑；NF-I劑、TFAP2劑及Myc劑；NF-I劑、Irx劑及Myc劑；Lhx劑、TFAP2劑及Irx劑；Lhx劑、TFAP2劑及Myc劑；Lhx劑Irx劑及Myc劑；或TFAP2劑Irx劑及Myc劑。在一些實施例中，提供選自由以下組成之群之至少三種劑的集合：TP63劑、NF-I劑及Lhx2劑；TP63劑、NF-I劑及TFAP2A劑；TP63劑、NF-I劑及IRX4劑；TP63劑、NF-I劑及MYC劑；TP63劑、Lhx2劑及TFAP2A劑；TP63劑、Lhx2劑及IRX4劑；TP63劑、Lhx2劑及MYC劑；TP63劑、TFAP2A劑及IRX4劑；TP63劑、TFAP2A劑及MYC劑；TP63劑、IRX4劑及MYC劑；NF-I劑、Lhx2劑及TFAP2A劑；NF-I劑、Lhx2劑及IRX4劑；NF-I劑、Lhx2劑及MYC劑；NF-I劑、TFAP2A劑及IRX4劑；NF-I劑、TFAP2A劑及MYC劑；NF-I劑、IRX4劑及MYC劑；Lhx2劑、TFAP2A劑及IRX4劑；Lhx2劑、TFAP2A劑及MYC劑；Lhx2劑、IRX4劑及MYC劑；或TFAP2A劑、IRX4劑及MYC劑。在一些實施例中，提供選自由以下組成之群之至少三種劑的集合：編碼TP63多肽之聚核苷酸、編碼NFIB多肽之聚核苷酸及編碼Lhx2多肽之聚核苷酸；編碼TP63多肽之聚核苷酸、編碼NFIB多肽之聚核苷酸及編碼TFAP2A多肽之聚核苷酸；編碼TP63多肽之聚核苷酸、編碼NFIB多肽之聚核苷酸及編碼IRX4多肽之聚核苷酸；編碼TP63多肽之聚核苷酸、編碼NFIB多肽之聚核苷酸及編碼MYC多肽之聚核苷酸；編碼TP63多肽之聚核苷酸、編碼Lhx2多肽之聚核苷酸及編碼TFAP2A多肽之聚核苷酸；編碼TP63多肽之聚核苷酸、編碼Lhx2多肽之聚核苷酸及編碼IRX4多肽之聚核苷酸；編碼TP63多肽之聚核苷酸、編碼Lhx2多肽之聚核苷酸及編碼MYC多肽之聚核苷酸；編碼TP63多肽之聚核苷酸、編碼TFAP2A多肽之聚核苷酸及編碼IRX4多肽之聚核苷酸；編碼TP63多肽之聚核苷酸、編碼TFAP2A多肽之聚核苷酸及編碼MYC多肽之聚核苷酸；編碼TP63多肽之聚核苷酸、編碼IRX4多肽之聚核苷酸及編碼MYC多肽之聚核苷酸；編碼NFIB多肽之聚核苷酸、編碼Lhx2多肽之聚核苷酸及編碼TFAP2A多肽之聚核苷酸；編碼NFIB多肽之聚核苷酸、編碼Lhx2多肽之聚核苷酸及編碼IRX4多肽之聚核苷酸；編碼NFIB多肽之聚核苷酸、編碼Lhx2多肽之聚核苷酸及編碼MYC多肽之聚核苷酸；編碼NFIB多肽之聚核苷酸、編碼TFAP2A多肽之聚核苷酸及編碼IRX4多肽之聚核苷酸；編碼NFIB多肽之聚核苷酸、編碼TFAP2A多肽之聚核苷酸及編碼MYC多肽之聚核苷酸；編碼NFIB多肽之聚核苷酸、編碼IRX4多肽之聚核苷酸及編碼MYC多肽之聚核苷酸；編碼Lhx2多肽之聚核苷酸、編碼TFAP2A多肽之聚核苷酸及編碼IRX4多肽之聚核苷酸；編碼Lhx2多肽之聚核苷酸、編碼TFAP2A多肽之聚核苷酸及編碼MYC多肽之聚核苷酸；編碼Lhx2多肽之聚核苷酸、編碼IRX4多肽之聚核苷酸及編碼MYC多肽之聚核苷酸劑；或編碼TFAP2A多肽之聚核苷酸、編碼IRX4多肽之聚核苷酸及編碼MYC多肽之聚核苷酸。舉例而言，在一些實施例中，提供三種劑之集合，其包括編碼LHX2之聚核苷酸、編碼TFAP2A多肽之聚核苷酸及編碼MYC多肽之聚核苷酸。

在一些實施例中，提供至少四種劑之集合，例如，p53劑、NF-I劑、Lhx劑及TFAP2劑；p53劑、NF-I劑、Lhx劑及Irx劑；p53劑、NF-I劑、Lhx劑及Myc劑；p53劑、Lhx劑、TFAP2劑及Irx劑；p53劑、Lhx劑、TFAP2劑及Myc劑；p53劑、TFAP2劑、Irx劑及Myc劑；p53劑、TRAF2劑、Irx劑及Myc劑；NF-I劑、Lhx劑、TFAP2劑及Irx劑；NF-I劑、Lhx劑、TFAP2劑及Myc劑；或Lhx劑、TFAP2劑、Irx劑及Myc劑。在一些實施例中，提供選自由以下組成之群之至少四種劑的集合：TP63劑、NFIB劑、Lhx2劑及TFAP2A劑；TP63劑、NFIB劑、Lhx2劑及IRX4劑；TP63劑、NFIB劑、Lhx2劑及MYC劑；TP63劑、Lhx2劑、TFAP2A劑及IRX4劑；TP63劑、Lhx2劑、TFAP2A劑及MYC劑；TP63劑、TFAP2A劑、IRX4劑及MYC劑；TP63劑、TRAF2劑、IRX4劑及MYC劑；NFIB劑、Lhx2劑、TFAP2A劑及IRX4劑；NFIB劑、Lhx2劑、TFAP2A劑及MYC劑；及Lhx2劑、TFAP2A劑、IRX4劑及MYC劑。在一些實施例中，提供選自由以下組成之群之至少四種劑的集合：編碼TP63多肽之聚核苷酸、編碼NFIB多肽之聚核苷酸、編碼Lhx2多肽之聚核苷酸及編碼TFAP2A多肽之聚核苷酸；編碼TP63多肽之聚核苷酸、編碼NFIB多肽之聚核苷酸、編碼Lhx2多肽之聚核苷酸及編碼IRX4多肽之聚核苷酸；編碼TP63多肽之聚核苷酸、編碼NFIB多肽之聚核苷酸、編碼Lhx2多肽之聚核苷酸及編碼MYC多肽之聚核苷酸；編碼TP63多肽之聚核苷酸、編碼Lhx2多肽之聚核苷酸、編碼TFAP2A多肽之聚核苷酸及編碼IRX4多肽之聚核苷酸；編碼TP63多肽之聚核苷酸、編碼Lhx2多肽之聚核苷酸、編碼TFAP2A多肽之聚核苷酸及編碼MYC多肽之聚核苷酸；編碼TP63多肽之聚核苷酸、編碼TFAP2A多肽之聚核苷酸、編碼IRX4多肽之聚核苷酸及編碼MYC多肽之聚核苷酸；編碼TP63多肽之聚核苷酸、聚核苷酸編碼TRAF2、編碼IRX4多肽之聚核苷酸及編碼MYC多肽之聚核苷酸；編碼NFIB多肽之聚核苷酸、編碼Lhx2多肽之聚核苷酸、編碼TFAP2A多肽之聚核苷酸及編碼IRX4多肽之聚核苷酸；編碼NFIB多肽之聚核苷酸、編碼Lhx2多肽之聚核苷酸、編碼TFAP2A多肽之聚核苷酸及編碼MYC多肽之聚核苷酸；及編碼Lhx2多肽之聚核苷酸、編碼TFAP2A多肽之聚核苷酸、編碼IRX4多肽之聚核苷酸及編碼MYC多肽之聚核苷酸。舉例而言，在一些實施例中，提供四種劑之集合，其包括編碼TP63多肽之聚核苷酸、編碼LHX2之聚核苷酸、編碼TFAP2A多肽之聚核苷酸及編碼MYC多肽之聚核苷酸。

在一些實施例中，提供至少五種劑之集合，例如，p53劑、NF-I劑、Lhx劑、TFAP2劑及Irx劑；p53劑、NF-I劑、Lhx劑、TFAP2劑及Myc劑；p53劑、Lhx劑、TFAP2劑、Irx劑及Myc劑；p53劑、NF-I劑、TFAP2劑、Irx劑及Myc劑；p53劑、NF-I劑、Lhx劑、Irx劑及Myc劑；p53劑、NF-I劑、Lhx劑、TFAP2劑及Myc劑；NF-I劑、Lhx劑、TFAP2劑、Irx劑及Myc劑。在一些實施例中，提供選自由以下組成之群之至少五種劑的集合：TP63劑、NFIB劑、LHX2劑、TFAP2A劑及IRX4劑；TP63劑、NFIB劑、LHX2劑、TFAP2A劑及MYC劑；TP63劑、LHX2劑、TFAP2A劑、IRX4劑及MYC劑；TP63劑、NFIB劑、TFAP2A劑、IRX4劑及MYC劑；TP63劑、NFIB劑、LHX2劑、IRX4劑及MYC劑；TP63劑、NFIB劑、LHX2劑、TFAP2A劑及MYC劑；NFIB劑、LHX2劑、TFAP2A劑、IRX4劑及MYC劑。在一些實施例中，提供選自由以下組成之群之至少五種劑的集合：編碼TP63多肽之聚核苷酸、編碼NFIB多肽之聚核苷酸、編碼LHX2多肽之聚核苷酸、編碼TFAP2A多肽之聚核苷酸及編碼IRX4多肽之聚核苷酸；編碼TP63多肽之聚核苷酸、編碼NFIB多肽之聚核苷酸、編碼LHX2多肽之聚核苷酸、編碼TFAP2A多肽之聚核苷酸及編碼MYC多肽之聚核苷酸；編碼TP63多肽之聚核苷酸、編碼LHX2多肽之聚核苷酸、編碼TFAP2A多肽之聚核苷酸、編碼IRX4多肽之聚核苷酸及編碼MYC多肽之聚核苷酸；編碼TP63多肽之聚核苷酸、編碼NFIB多肽之聚核苷酸、編碼TFAP2A多肽之聚核苷酸、編碼IRX4多肽之聚核苷酸及編碼MYC多肽之聚核苷酸；編碼TP63多肽之聚核苷酸、編碼NFIB多肽之聚核苷酸、編碼LHX2多肽之聚核苷酸、編碼IRX4多肽之聚核苷酸及編碼MYC多肽之聚核苷酸；編碼TP63多肽之聚核苷酸、編碼NFIB多肽之聚核苷酸、編碼LHX2多肽之聚核苷酸、編碼TFAP2A多肽之聚核苷酸及編碼MYC多肽之聚核苷酸；編碼NFIB多肽之聚核苷酸、編碼LHX2多肽之聚核苷酸、編碼TFAP2A多肽之聚核苷酸、編碼IRX4多肽之聚核苷酸及編碼MYC多肽之聚核苷酸。

在一些實施例中，提供至少六種劑之集合，例如p53劑、NFI劑、Lhx劑、TFAP2劑、Irx劑及Myc劑。在一些實施例中，提供至少六種劑之集合，其包括TP63劑、NFIB劑、LHX2劑、TFAP2A劑、IRX4劑及MYC劑。在一些實施例中，提供至少六種劑之集合，其包括編碼TP63多肽之聚核苷酸、編碼NFIB多肽之聚核苷酸、編碼LHX2多肽之聚核苷酸、編碼TFAP2A多肽之聚核苷酸、編碼IRX4多肽之聚核苷酸及編碼MYC多肽之聚核苷酸。

截至此優先權申請案歸檔日期，本文所揭示之所有Genbank登錄號序列皆存在於國家衛生研究院(NIH)基因序列資料庫(GenBank)中。 細胞培養

試管內與試劑之HFSCR系統接觸的細胞可以在試劑存在下培育約1小時至約8週，例如，1小時至8週、2小時至8週、4小時至8週、6小時至8週、12小時至8週、18小時至8週、24小時至8週、48小時至8週、72小時至8週、96小時至8週、1週至8週、2週至8週、4週至8週、1小時至6週、2小時至6週、4小時至6週、6小時至6週、12小時至6週、18小時至6週、24小時至6週、48小時至6週、72小時至6週、96小時至6週、1週至6週、2週至6週、4週至6週、1小時至4週、2小時至4週、4小時至4週、6小時至4週、12小時至4週、18小時至4週、24小時至4週、48小時至4週、72小時至4週、96小時至4週、1週至4週、2週至4週、1小時至2週、2小時至2週、4小時至2週、6小時至2週、12小時至2週、18小時至2週、24小時至2週、48小時至2週、72小時至2週、96小時至2週或1週至2週。舉例而言，在一些實施例中，在HFSCR系統存在下培育非HFS細胞群體1小時至6週之時段。在一些實施例中，HFSCR系統之置換可以約每天至約每14天之頻率置換，例如，每天、每1.5天、每2天、每3天、每4天、每5天、每6天、每7天或每14天。可將試劑提供至個體細胞一或多次，例如一次、兩次、三次或超過三次，且在進行各接觸事件後，使細胞與試劑一起培育一定時間量，例如24小時至6週，其後用新鮮培養基替換培養基且進一步培養細胞。

在非HFS細胞與HFSCR系統接觸之後，可培養所接觸的細胞以便促進HFSC、HFPC或分化毛囊之存活。用於培養細胞、HFSC、HFPC及分化毛囊及用於分離HFSC、HFPC及分化毛囊的方法及試劑為此項技術中所熟知，其中任一者可用於本發明中以培養及分離iHFSC及/或分化後代。

舉例而言，非HFS細胞(與HFSCR系統接觸前或接觸後)可接種於基質膠或類似基底膜萃取物、合成水凝膠、明膠、膠原蛋白、層連結蛋白或如此項技術中已知之其他受質上。細胞可在補充有因子之培養基(諸如DMEM)中培養。可替代地，接觸細胞可在液氮溫度下冷凍且儲存較長時段，能夠在解凍時使用。若冷凍，則細胞通常儲存於10% DMSO、50% FCS、40% RPMI 1640培養基中。解凍後，細胞可藉由使用與HFSC存活及分化相關之生長因子及/或基質細胞擴增。

在一些實施例中，非聽覺iHFSC群體經解離以形成細胞懸浮液。細胞解離方法為此項技術中熟知且可包括酶解離(例如胰蛋白酶解離)、化學解離(例如EDTA或EGTA解離)或機械解離。在一些實施例中，將真皮細胞群體添加至非聽覺iHFSC之解離群體中。舉例而言，在一些實施例中，真皮細胞群體係纖維母細胞、平滑肌細胞、結締組織細胞、真皮乳頭細胞及脂肪細胞。

在一些實施例中，在支架上培養非聽覺iHFSC。舉例而言，支架可包括(但不限於)塑膠、基質膠或類似基底膜萃取物、明膠、膠原蛋白或層連結蛋白基質。在一些實施例中，將非聽覺iHFSC在支架上培養30分鐘至48小時，例如30分鐘至24小時、30分鐘至12小時、30分鐘至6小時、30分鐘至3小時、30分鐘至2小時、30分鐘至1小時、1小時至48小時、1小時至24小時、1小時至12小時、1小時至6小時、1小時至3小時或1小時至2小時。在一些實施例中，將非聽覺iHFSC在支架上與真皮細胞組合培養30分鐘至48小時，例如30分鐘至24小時、30分鐘至12小時、30分鐘至6小時、30分鐘至3小時、30分鐘至2小時、30分鐘至1小時、1小時至48小時、1小時至24小時、1小時至12小時、1小時至6小時、1小時至3小時或1小時至2小時。 治療方法

藉由以上試管內方法產生之iHFSC或分化後代細胞可用於細胞置換或細胞移植療法以治療疾病。特定言之，iHFSC及/或分化後代可轉移至患有具有脫髮組分(亦即具有脫髮症狀)之廣泛疾病、病狀或病症的個體，例如以復原或補充受者之毛髮形成單元。該療法可旨在治療疾病之病因；或可替代地，該療法可用以治療疾病或病狀之影響。舉例而言，療法可旨在置換毛囊，該等毛囊的死亡或衰老引起疾病。

iHFSC及/或分化後代細胞可轉移至或接近於個體之受損位點；或可以允許細胞遷移或回歸至受損位點之方式將該等細胞引入至個體中。轉移的細胞可有利地置換損傷或受損細胞，且允許個體之總體病狀得到改善。在一些情況下，轉移的細胞可刺激組織再生或修復。

在一些情況下，iHFSC及/或分化後代細胞或iHFSC子群體及/或分化後代細胞可在轉移至個體之前自細胞培養物之其餘部分純化或分離。換言之，可執行一或多個步驟以富集iHFSC及/或分化後代細胞或iHFSC子群體或分化後代細胞，亦即提供經富集之iHFSC群體或分化後代細胞或iHFSC子群體或分化後代細胞。在一些情況下，將對HFSC細胞或分化後代譜系的標記或HFSC細胞子群體或分化後代譜系的標記具有特異性之一或多種抗體與細胞群體一起培育且分離出彼等結合細胞。在其他情況下，iHFSC或分化後代細胞或iHFSC子群體或分化後代細胞表現標記，該標記為處於HFSC特異性、HFPC特異性或分化毛髮細胞特異性啟動子之控制下的報導基因(例如EGFP、dsRED、lacz及其類似者)，隨後利用該標記純化或分離iHFSC或分化後代細胞或其子群體。

標記意謂在包含已重編程將變為iHFSC之非HFS細胞的培養物中，標記由培養物中將發育、正發育及/或已發育成毛囊的細胞表現。熟習此項技術者應瞭解，所述表現量反映細胞上或細胞中標記蛋白之可偵測量。對染色呈陰性之細胞(標記特異性試劑之結合水準可偵測地與同型匹配對照組無差異)仍可表現少量標記。且雖然此項技術中提及細胞對特定標記呈「陽性」或「陰性」為常見的，但實際表現量為數量表徵。細胞表面上之分子數目可變化若干對數，但仍表徵為「陽性」。

所關注細胞，亦即表現所選標記之細胞可藉由此項技術中熟知之多種方法富集，亦即與細胞群體中的其餘部分分開。舉例而言，流式細胞分析技術(例如螢光活化細胞分選(FACS))可用於基於標記之內源螢光或標記與特定螢光試劑之結合(例如，螢光團結合的抗體)以及其他參數(諸如細胞大小及光散射)分離細胞群體。換言之，細胞選擇可能受流式細胞分析技術影響。儘管染色之絕對水準可因特定螢光染料及試劑製備而異，但資料可相對於對照組標準化。為使分佈相對於對照組標準化，記錄各種細胞具有特定染色強度之資料點。可根據對數標度顯示此等資料點，其中量度單位為任意染色強度。在一個實例中，樣品中之最亮染色細胞的強度可比未染色細胞強多達4個對數。當以此方式顯示時，顯而易見，落在最高染色強度對數中之細胞為明亮的，而最低強度中之細胞為陰性的。「低」陽性染色細胞的染色水準超過同型匹配對照組之亮度，但強度不如群體中正常發現之最亮染色細胞。替代對照組可利用在表面上具有定義標記密度的受質(例如製成的珠粒或細胞株)，其提供強度之陽性對照組。

其他基於標記之分離方法(亦即可藉以影響細胞選擇的方法)包括例如磁活化細胞分選(MACS)、免疫淘選(immunopanning)及雷射擷取顯微切割。

在使非HFS細胞與HFSCR系統接觸之後約3天或以上，例如在使非HFS細胞與HFSCR系統接觸之後3天、4天、5天、6天、7天、10天、14天、21天、30天或40天，可對iHFSC群體或iHFSC子群體或分化後代細胞進行富集。藉由根據一或多種標記之表現進行選擇而富集的群體通常將具有至少約80%細胞、更通常至少90%細胞為所選表型且可有95%細胞或更多為所選表型。需要毛髮移植療法之個體，例如患有與脫髮或異常功能之毛囊相關之病狀的個體，可尤其受益於利用藉由本發明之方法衍生之細胞的療法。此類疾病、病症及病狀之實例包括影響毛髮生長之病症，包括雄激素禿髮、斑禿、休止期落髮、拔毛癖、牽引性禿髮、頭癬、瘢痕性禿髮。可影響毛髮生長之其他病狀的實例包括皮膚之疤痕及外傷，包括化學或熱致燒傷。在一些方法中，可將重編程的非HFS細胞(亦即iHFSC或分化後代)直接移植至受損位點以治療脫髮病狀或與此項技術中已知之此類技術(諸如毛囊單位移植、毛囊單位條帶移植及其類似技術)組合。在其他方法中，藉由本發明之方法衍生之細胞經工程改造以回應於可靶向其遷移至現有表皮、毛囊、真皮或皮膚組分中的線索。iHFSC可在生理學上可接受之任何培養基中投與。iHFSC可在分化之前提供，亦即其可以未分化狀態提供且允許活體內分化，或其可允許活體外分化一段時間且在分化之後提供。iHFHC可在投與之前培養及/或分化，且其可在投與之前作為共培養物一起培養及/或分化，例如以支持其在其所移植的組織中生長及/或組織化。iHFSC可單獨提供或與適合受質、基質(例如，塑膠、基質膠或類似基底膜萃取物、明膠、膠原蛋白或層連結蛋白基質)組合提供，或與細胞(諸如真皮細胞)組合提供以例如支持其在其所移植的組織中生長及/或組織化。舉例而言，在一些實施例中，真皮細胞為纖維母細胞、平滑肌細胞、結締組織細胞、真皮乳頭細胞或脂肪細胞。在一些實施例中，向個體投與至少1×10 ⁵個細胞、至少1×10 ⁶個細胞或至少1×10 ⁷個細胞。細胞可藉由體表外科手術、注射或其類似方式引入個體。局部遞送方法之實例包括毛囊單位移植、毛囊單位條帶療法或藉由植入其上已可逆地貼附細胞之裝置。舉例而言，在一些實施例中，將支撐至少100,000個非聽覺iHFSC、至少1x10 ⁶個非聽覺iHFSC或至少1x10 ⁷個非聽覺iHFSC的支架移植至個體上。在一些實施例中，將支撐至少100,000個非聽覺iHFSC及真皮細胞、至少1x10 ⁶個非聽覺iHFSC及真皮細胞或至少1x10 ⁷個非聽覺iHFSC及真皮細胞的支架移植至個體上。

對個體之治療投與次數可不同。將iHFSC及/或分化後代細胞引入個體中可為單次事件；但在某些情況下，此類治療引起的改善可維持的時段有限且需要持續的一系列重複治療。在其他情況下，在觀測到效果之前可能需要多次投與iHFSC及/或分化後代細胞。準確方案視所治療之個別個體之疾病或病狀、疾病階段及參數而定。 實驗或篩檢用途

另外地或可替代地，以上試管內方法產生之iHFSC及/或分化後代可用作基本研究或藥物發現工具，例如評估遺傳疾病之表型，例如更佳理解疾病之病因學以鑑別用於治療性治療之靶蛋白，鑑別具有疾病緩解活性之候選劑，亦即調節患有脫髮疾病或病症之個體的HFSC或分化後代細胞之存活或功能的活性，例如鑑別將有效治療個體之劑。舉例而言，候選劑可添加至包含來源於個體體細胞之iHFSC及/或分化後代細胞的細胞培養物中，且藉由本文及此項技術中所描述之方法、藉由監測輸出參數(諸如iHFSC或分化後代細胞存活率、iHFSC或分化後代細胞形成毛髮或促使毛髮生長之能力、iHFSC及/或分化後代細胞連續產生毛髮之程度及其類似者評估候選劑之效果。

參數為細胞之可定量組分，詳言之，可理想地在高通量系統中精確量測之組分。參數可為任何細胞組分或細胞產物，包括細胞表面決定子、受體、蛋白質或其構形或轉譯後修飾、脂質、碳水化合物、有機分子或無機分子、核酸(例如mRNA、DNA等)或衍生自此類細胞組分之部分或其組合。儘管大部分參數將提供定量讀出，但在一些情況下，半定量或定性結果將為可接受的。讀出可包括單個測定值，或可包括平均值、中值或方差等。在特徵上，將針對各參數自多個相同分析獲得一系列參數讀出值。可變性為預期的，且將使用標準統計方法獲得測試參數集中之各者的值範圍，使用常見統計方法提供單值。

用於篩檢之所關注候選藥劑包括已知及未知化合物，該等化合物涵蓋眾多化學類別，主要為有機分子(其可包括有機金屬分子)、無機分子、基因序列等。本發明之一重要態樣為評估候選藥物，包括毒性測試及其類似者。

候選劑包括包含結構相互作用(尤其氫鍵結)所需之官能基的有機分子，且通常至少包括胺、羰基、羥基或羧基，常常包括至少兩個化學官能基。候選劑通常包含經以上官能基中之一或多者取代之環狀碳或雜環結構及/或芳族或聚芳族結構。候選藥劑亦發現於生物分子中，包括肽、聚核苷酸、醣類、脂肪酸、類固醇、嘌呤、嘧啶、衍生物、結構類似物或其組合。包括藥理學活性藥物、基因活性分子等。所關注之化合物包括化學治療劑、激素或激素拮抗劑等。適合於本發明之例示性藥劑為以下文獻中之彼等物：「The Pharmacological Basis of Therapeutics」Goodman及Gilman, McGraw-Hill, New York, N. Y., (1996), 第九版。

包括候選劑之化合物獲自廣泛多種來源，包括合成或天然化合物庫。舉例而言，眾多方式可用於廣泛多種有機化合物之隨機及定向合成，該等有機化合物包括生物分子，包括無規寡核苷酸及寡肽之表現。可替代地，天然化合物庫可以細菌、真菌、植物及動物萃取物形式獲得或容易產生。另外，天然或以合成方式產生之庫及化合物容易經由習知化學、物理及生物化學方式修飾，且可用於產生組合庫。已知藥理學劑可經歷定向或隨機化學修飾，諸如醯化、烷化、酯化、醯胺化等以產生結構類似物。

藉由將劑添加至一個或複數個細胞樣品(通常併有缺乏該劑之細胞)中來針對生物活性篩檢候選劑。量測劑回應於參數而發生的變化，且藉由與用其他劑獲得等的參考培養物比較(例如在劑存在及不存在下)來評估結果。

劑宜以溶液或易溶形式添加至培養中之細胞的培養基中。該等劑可以間歇流或連續流形式添加在流通式系統中，或可替代地以單獨或遞增方式添加化合物藥團至原本靜態的溶液中。在流通式系統中，使用兩種流體，其中一者為生理學中性溶液，且另一者為添加有測試化合物之相同溶液。使第一流體、第二流體依次經過細胞。在單一溶液方法中，將測試化合物藥團添加至細胞周圍培養基之體積中。培養基組分的整體濃度不應隨著藥團的添加或在流通式方法中之兩種溶液之間發生顯著變化。

複數個分析可在不同劑濃度存在下並行進行以獲得對各種濃度之不同反應。如此項技術中已知，測定劑之有效濃度通常使用由1:10產生之濃度範圍或其他對數標度稀釋。必要時，可以用第二系列稀釋液進一步改進濃度。通常，此等濃度之一充當陰性對照組，亦即在零濃度或低於劑偵測水準下或在或低於使表型產生不可偵測之變化的劑濃度下。

前述內容僅說明本發明之原理。應瞭解，熟習此項技術者將能夠設計各種配置，儘管並未在本文中明確地描述或展示，但該等配置體現本發明之原理且包括於其精神及範疇內。此外，本文中所敍述之所有實例及條件語言主要旨在輔助讀者理解本發明之原理及由本發明人貢獻之概念以促進此項技術，且所有實例及條件語言應被理解為不限於此等所特定引述之實例及條件。此外，本文中敍述本發明之原理、態樣及實施例以及其具體實例的所有陳述意欲涵蓋其結構上及功能上的等效物。另外，希望此類等效物包括當前已知的等效物及未來開發的等效物兩者，亦即，不管結構如何，執行相同功能的任何元件。因此，本發明之範疇不意欲限於本文所顯示且描述之例示性實施例。相反，本發明之範疇及精神係藉由隨附申請專利範圍體現。實例

現大體上所描述之本發明將參考以下實例更容易理解，該等實例僅出於說明本發明之某些態樣及實施例的目的而包括在內，且不意欲以任何方式限制本發明之範疇。實例1：人類誘導毛囊幹細胞之產生及驗證

藉由在人類纖維母細胞生長培養基中將含有四環素誘導性啟動子之慢病毒載體中之編碼TP63、NFIB、LHX2、TFAP2A、IRX4及MYC的聚核苷酸轉導至人類纖維母細胞(購自Cell Applications之HF)中來產生誘導毛囊幹細胞(iHFSC)。將HF與此等病毒粒子一起培育12-24小時以促進轉導。此時段之後，將培養基置換為補充有四環素之新鮮人類纖維母細胞生長培養基。在24-36小時之後，將培養基置換為補充有四環素之毛囊幹細胞(HFSC)生長培養基。在補充有四環素之HFSC生長培養基中進一步再培養細胞1-4週，其中每1-3天置換培養基。培養物在匯合後作為混合細胞群體繼代。在此1-4週時段期間，超過0.1%之轉分化細胞獲得上皮細胞樣形態且稱為推定iHFSC。iHFSC繼續在HFSC生長培養基中生長且在達到匯合後在細胞冷凍培養基中繼代或冷凍。

使用定量聚合酶鏈反應(qPCR)分析量測相對於管家基因肌動蛋白標準化之已知HFSC標記(ECAD、KRT15、KLF5、HR、SOX9、TFAP2A、ITGA6、CTIP2、ESRP1及TBX1)之表現。為進行qPCR分析，根據製造商說明，用Qiagen RNeasy套組自iHFSC及陰性對照HF細胞分離mRNA。根據製造商說明，用BioRad iScript逆轉錄混合液產生cDNA。根據製造商說明，用BioRad SsoAdvanced Universal SYBR ^®Green超混液在BioRadC1000 ^™儀器上進行qPCR，且使用以下擴增方案：95℃進行30秒，隨後進行40個循環之[95℃，15秒；60℃，30秒]。用於qPCR分析之引子核苷酸序列列於下表1中。表 1 -用於對HFSC標記基因進行qPCR分析的引子

基因	有義引子	反義引子
肌動蛋白	ccaaccgcgagaagatga (SEQ ID NO:6)	ccagaggcgtacagggatag (SEQ ID NO:7)
ECAD	ggccaggaaatcacatccta (SEQ ID NO:8)	ggcagtgtctctccaaatcc (SEQ ID NO:9)
KRT15	agatgctgcttgacataaagacac (SEQ ID NO:10)	gctaccaccacctcctgaag (SEQ ID NO:11)
KLF5	ggctttactcaagcagatctcatc (SEQ ID NO:12)	cccttacccatgttgagacg (SEQ ID NO:13)
HR	ggacagcatgatgagcagaa (SEQ ID NO:14)	caggcatggtatgtcctgaa (SEQ ID NO:15)
SOX9	aaacaccttgagccttaaaacg (SEQ ID NO:16)	aggcaggaggaaatgcacta (SEQ ID NO:17)
TFAP2A	tgggaccacctggtattctg (SEQ ID NO:18)	ccagcacaactcaatacaatgc (SEQ ID NO:19)
ITGA6	agcctcttcggcttctcg (SEQ ID NO:20)	ttggctctctgcagtggaa (SEQ ID NO:21)
CTIP2	ctgggagagcaagtgttgg (SEQ ID NO:22)	ggaacatacaaccagggaccta (SEQ ID NO:23)
ESRP1	cccaaagaatgggtttgtattt (SEQ ID NO:24)	tggaggtttcaagatcaccat (SEQ ID NO:25)
TBX1	gtgccggtggacgataag (SEQ ID NO:26)	gagtccgggtggtagtgc (SEQ ID NO:27)

如圖1A至圖1J中所示，與HF相比，經轉導細胞顯示毛髮幹細胞標記基因ECAD (圖1A)、KRT15 (圖1B)、KLF5 (圖1C)、HR (圖1D)、SOX9 (圖1E)、TFAP2A (圖1F)、ITGA6 (圖1G)、CTIP2 (圖1H)、ESRP1 (圖1I)及TBX1 (圖1J)表現增加，指示其轉分化成iHFSC。交叉臨限值(CT)截止值設定為30個循環。ND表示未偵測到值或在30個循環之CT截止值以上偵測到值。

亦藉由在上皮細胞(EPI)生長培養基中將含有四環素誘導性啟動子之慢病毒載體中之編碼TP63、NFIB、LHX2、TFAP2A、IRX4及MYC或TP63、LHX2、TFAP2A及MYC的聚核苷酸轉導至人類上皮細胞中來產生iHFSC。將EPI與此等病毒粒子一起培育12-24小時以促進轉導。此時段之後，將培養基置換為補充有四環素之新鮮人類上皮細胞生長培養基。在24-36小時之後，將培養基置換為補充有四環素之毛囊幹細胞(HFSC)生長培養基。在補充有四環素之HFSC生長培養基中進一步再培養細胞1-4週，其中每1-3天置換培養基。培養物在匯合後作為混合細胞群體繼代。在此1-4週時段期間，超過0.1%之轉分化細胞獲得毛囊幹細胞樣形態且稱為推定iHFSC。iHFSC繼續在HFSC生長培養基中生長且在達到匯合後在細胞冷凍培養基中繼代或冷凍。

使用定量聚合酶鏈反應(qPCR)分析量測相對於管家基因肌動蛋白標準化之已知HFSC標記(ECAD、KRT15、KLF5、HR、SOX9、TFAP2A、ITGA6、CTIP2、ESRP1及TBX1)之表現。為進行qPCR分析，根據製造商說明，用Qiagen RNeasy套組自iHFSC及陰性對照EPI細胞分離mRNA。根據製造商說明，用BioRad iScript逆轉錄混合液產生cDNA。根據製造商說明，用BioRad SsoAdvanced Universal SYBR ^®Green超混液在BioRadC1000 ^™儀器上進行qPCR，且使用以下擴增方案：95℃進行30秒，隨後進行40個循環之[95℃，15秒；60℃，30秒]。用於qPCR分析之引子核苷酸序列列於表1中。

如圖6A至圖6J及圖7至圖7J中所示，與EPI相比，經轉導細胞顯示毛髮幹細胞標記基因ECAD (圖6A、圖7A)、KRT15 (圖6B、圖7B)、KLF5 (圖6C、圖7C)、HR (圖6D、圖7D)、SOX9 (圖6E、圖7E)、TFAP2A (圖6F、圖7F)、ITGA6 (圖6G、圖7G)、CTIP2 (圖6H、圖7H)、ESRP1 (圖6I、圖7I)及TBX1 (圖6J、圖7J)表現持續或增加，指示其轉分化成iHFSC。交叉臨限值(CT)截止值設定為30個循環。ND表示未偵測到值或在30個循環之CT截止值以上偵測到值。

亦藉由在人類纖維母細胞(HF)生長培養基中將含有四環素誘導性啟動子之慢病毒載體中之編碼TP63、LHX2、TFAP2A及MYC或LHX2、TFAP2A及MYC的聚核苷酸轉導至人類纖維母細胞中來產生iHFSC。將HF與此等病毒粒子一起培育12-24小時以促進轉導。此時段之後，將培養基置換為補充有四環素之新鮮人類纖維母細胞生長培養基。在24-36小時之後，將培養基置換為補充有四環素之毛囊幹細胞(HFSC)生長培養基。在補充有四環素之HFSC生長培養基中進一步再培養細胞1-4週，其中每1-3天置換培養基。培養物在匯合後作為混合細胞群體繼代。在此1-4週時段期間，超過0.1%之轉分化細胞獲得毛囊幹細胞樣形態且稱為推定iHFSC。iHFSC繼續在HFSC生長培養基中生長且在達到匯合後在細胞冷凍培養基中繼代或冷凍。

使用qPCR分析量測相對於管家基因肌動蛋白標準化之已知HFSC標記(ECAD、KRT15、KLF5、HR、SOX9、TFAP2A、ITGA6、CTIP2、ESRP1及TBX1)之表現。為進行qPCR分析，根據製造商說明，用Qiagen RNeasy套組自iHFSC及陰性對照HF細胞分離mRNA。根據製造商說明，用BioRad iScript ^™逆轉錄混合液產生cDNA。根據製造商說明，用BioRad SsoAdvanced Universal SYBR ^®Green超混液在BioRadC1000 ^™儀器上進行qPCR，且使用以下擴增方案：95℃進行30秒，隨後進行40個循環之[95℃，15秒；60℃，30秒]。用於qPCR分析之引子核苷酸序列列於表1中。

如圖8A至圖8J及圖9A至圖9J中所示，與HF相比，經轉導細胞顯示毛髮幹細胞標記基因ECAD (圖8A、圖9A)、KRT15 (圖8B、圖9B)、KLF5 (圖8C、圖9C)、HR (圖8D、圖9D)、SOX9 (圖8E、圖9E)、TFAP2A (圖8F、圖9F)、ITGA6 (圖8G、圖9G)、CTIP2 (圖8H、圖9H)、ESRP1 (圖8I、圖9I)及TBX1 (圖8J、圖9J)表現持續或增加，指示其轉分化成iHFSC。交叉臨限值(CT)截止值設定成30個循環。ND表示未偵測到值或在30個循環之CT截止值以上偵測到值。

免疫螢光顯微法用於驗證HFSC標記於經轉導細胞中之蛋白質水準表現。對於免疫螢光染色而言，細胞培養物在室溫下用含4%多聚甲醛之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)固定20分鐘，在PBS中洗滌3次，且在染色溶液(含5% CCS、0.1% Triton-X 100之PBS)中培育20分鐘。培養物隨後與抗體溶液一起培育，該等抗體溶液包含以1:20稀釋於染色溶液中1小時之山羊抗ECAD (R&D Systems)、以1:50稀釋於染色溶液中之雞抗KRT15 (BioLegend)、以1:200稀釋於染色溶液中之兔抗KLF5 (Abcam)或以1:50稀釋於染色溶液中1小時之兔抗SOX9 (Invitrogen)。細胞隨後在PBS中洗滌3次，與選自以下之其對應抗體一起培育：驢IgG (H+L)抗山羊Alexa Fluor ^™488 (Invitrogen)、驢IgY (IgG)(H+L)抗雞Alexa Fluor ^™488 (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)、驢IgG (H+L)抗兔Alexa Fluor ^™488 (Invitrogen)，以1:1000在染色溶液中稀釋30分鐘。對於ITGA6染色而言，將細胞在染色溶液(含有5% CCS的PBS)中培育20分鐘。接著對於ITGA6可視化而言，將細胞與以1:200在染色溶液中稀釋1小時之大鼠抗人類CD49f異硫氰酸螢光素(FITC)(BD Pharmingen)抗體溶液一起培育。所有培養物接下來在PBS中洗滌3次，隨後在於PBS中稀釋至1 μg/ml之4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(Sigma)中培育5分鐘，接著沖洗且再懸浮於PBS中。

圖2A至圖2O顯示經轉導細胞(頂部顯微圖)或陰性對照組HF (底部顯微圖)之顯微影像。圖2A、2D、2G、2J及2M顯示20倍相差影像，圖2B、2E、2H、2K及2N顯示DAPI染色以便核可視化，且圖2C、2F、2I、2L及2O顯示分別針對ECAD、KRT15、KLF5、SOX9及ITGA6之染色，如Alexa Fluor ^™488或FITC可視化。比例尺表示200 µm。對於所有製造商而言，經轉導細胞中的染色顯著且對照細胞中的染色不可見，指示經轉導細胞轉分化成iHFSC。實例2：人類iHFSCS之分離

對使用實例1中所描述之方案產生的iHFSC使用螢光活化細胞分選術(FACS)。iHF培養物在TrypLE (ThermoFisher Scientific)中解離5分鐘，在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中洗滌，在300 X g下離心5分鐘且再懸浮於染色溶液(含0.5% BSA之PBS)中。細胞經由40 µm細胞過濾器過濾且在染色之前在300 g下離心5分鐘。對於染色而言，將細胞與均在冰上以1:25稀釋於染色溶液中之雞抗KRT15 (BioLegend)及山羊抗ECAD (R&D Systems)一起培育30分鐘。接著用染色溶液洗滌細胞，在300 X g下離心5分鐘，用染色溶液洗滌，在300 X g下離心5分鐘，接著與均在冰上以1:1000稀釋於染色溶液中之驢IgY (IgG)(H+L)抗雞Alexa Fluor ^™488 (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)及驢IgG (H+L)抗山羊Alexa Fluor ^™647 (Invitrogen)一起培育30分鐘。接著用染色溶液洗滌細胞，在300 X g下離心5分鐘，再次用染色溶液洗滌且在300 X g下離心5分鐘，接著根據製造商說明書再懸浮於補充有EDTA及碘化丙錠(Invitrogen)之染色溶液中。使用Attune NxT流式細胞儀，根據製造商說明書分析染色樣品。

針對iHFSC之流式細胞術分析展示於圖3A至圖3E中，而陰性對照HF展示於圖3F至圖3J中。根據細胞大小之圈選參數展示於圖3A至圖3C及圖3F至圖3H中。如圖3D及圖3I中所示，藉由碘化丙錠(PI)染色排除死細胞。KRT15及ECAD染色展示於圖3E及圖3J中。該等方框及隨附編號指示KRT15/ECAD雙陽性細胞群體，證明經轉導細胞轉分化成iHFSC。此外，此等iHFSC可基於KRT15/ECAD雙陽性、藉由FACS自主體細胞群體中分離及純化，以供進一步實驗或使用。實例3：具有自我更新能力之人類iHFSC

標記基因表現之維持用於分析iHFSC自我更新之能力。實例1之方案用於產生iHFSC。藉由使用實例1之方案對自繼代(P)第2、5、7及10代之iHFSC及陰性對照人類纖維母細胞(HF)分離之mRNA進行qPCR分析來評估標記基因表現。用於偵測肌動蛋白、KRT15及ECAD之引子核苷酸序列列於上表1中。CT截止值設定成30個循環。ND表示未偵測到值或在30個循環之CT截止值以上偵測到值。顯示iHFSC及陰性對照HF對KRT15 (圖4A)及ECAD (圖4B)之表現值(相對於肌動蛋白)。iHFSC在多次繼代之後維持上調水準之KRT15及ECAD，而在陰性對照HF中均未偵測到兩種標記，指示iHFSC能夠自我更新。實例4：人類iHFSC在裸小鼠模型中產生人類毛髮

裸小鼠模型用於測試經移植iHFSC產生毛髮之能力。實例1之方案用於產生iHFSC。對於移植而言，將iHFSC與自C57BL/6 (Charles River)圍產期幼鼠分離之小鼠真皮細胞組合。為分離真皮細胞，分離出背側皮膚，在1:1分散酶:F12或TrpLE中在4℃下培育隔夜，人工地自真皮移除表皮且丟棄，真皮在0.35%膠原蛋白酶中在37℃下進一步培育50分鐘，用10% FBS淬滅，接著經由40 µm細胞過濾器過濾。接著計數細胞且將2.5x10 ⁶個小鼠真皮細胞與5x10 ⁶個iHFSC組合，以300X g離心5分鐘，再懸浮於DMEM:F12中，接種於塑膠薄片上且在37℃下培育1小時。隨後在移植位點處切除宿主皮膚之後，將此等成型件移植於缺乏毛髮生長的裸SCID小鼠(Charles River, Crl:NU(NCr)-Foxn1nu)上。移植後第4週(圖5A)，藉由與時間匹配陰性對照組(圖5B)相比來評估毛髮生長。移植後第6週及第9週，利用各別實驗進一步評估頭髮生長(分別為圖5C及圖5D)。由於iHFSC產生的毛髮呈黑色及長度延長，因此可將移植產生的毛髮生長與白色裸SCID小鼠短毛髮區分開來。實例5：人類iHFSC移植至人類患者上

iHFSC用於使人類患者之毛髮生長以便治療人類脫髮病狀，諸如雄激素禿髮、斑禿、休止期落髮、拔毛癖、牽引性禿髮、頭癬及瘢痕性禿髮。實例1中所描述之方法用於自患者自身細胞、自同種異體供者或自經培養之細胞株產生iHFSC。將適當數目個細胞(例如但不限於100,000、1,000,000或10,000,000個iHFSC)置放於適合載體上，諸如實例4中所描述之塑膠薄片或包含以下之另一適合載體：基質膠、類似基底膜萃取物、合成水凝膠或基於細胞外膜蛋白之支架(例如膠原蛋白、纖維結合蛋白、明膠或層連結蛋白)。iHFSC視情況與人類真皮細胞或功能上等效於自患者、同種異體供者或細胞株獲得之真皮細胞的細胞組合。將載體移植至患者的適當部位上。短期(亦即數週至數月)監測所移植iHFSC在移植部位產生毛髮之能力以及所移植iHFSC長期(亦即數年至數十年)引起持續毛髮生長之能力。監測不良反應，諸如皮膚刺激或可由iHFSC移植產生之其他病狀，以評估iHFSC移植之安全性。參考文獻併入

本文所提及之專利文獻及科學論文中之每一者的全部揭示內容以引用之方式併入以達成所有目的。等效物

本發明可在不脫離其精神或基本特徵之情況下以其他特定形式實施。因此，前述實施例應在所有方面中視為說明而不限制本文所描述的本發明。因此，本發明之範疇由隨附申請專利範圍而非前述描述指示，且本文意欲涵蓋申請專利範圍等效物之含義及範圍內出現之所有變化。

圖1A至圖1J為顯示人類iHFSC所表現之典型毛髮幹細胞標記之qPCR分析的圖，該等人類iHFSC由經培養之人類纖維母細胞(HF)過度表現TP63、NFIB、LHX2、TFAP2A、IRX4及MYC而產生。將以下毛髮幹細胞標記基因之表現與對照HF進行比較：上皮鈣黏蛋白(ECAD；圖1A)、角蛋白15 (KRT15；圖1B)、克呂佩爾樣因子5 (KLF5；圖1C)、HR離胺酸去甲基酶及核受體輔抑制物(HR；圖1D)、SRY-Box轉錄因子9 (SOX9；圖1E)、轉錄因子AP-2α (TFAP2A；圖1F)、整合素次單元α6 (ITGA6；圖1G)、BAF染色質重塑複合物次單元BCL11B (CTIP2；圖1H)、上皮剪接調節蛋白1 (ESRP1；圖1I)及T-box轉錄因子1 (TBX1；圖1J)。

圖2A至圖2O為顯示人類HFSC蛋白質標記之免疫螢光染色的顯微圖。圖2A、圖2D、圖2G、圖2J及圖2M顯示20倍相差影像，圖2B、圖2E、圖2H、圖2K及圖2N顯示DAPI染色以便核可視，且圖2C、圖2F、圖2I、圖2L及圖2O分別顯示在相同條件下染色之過度表現TP63、NFIB、LHX2、TFAP2A、IRX4及MYC的iHFSC (頂部顯微圖)及陰性對照HF (底部顯微圖)中之ECAD、KRT15、KLF5、SOX9及ITGA6染色。比例尺表示200 µm。

圖3A至圖3E顯示過度表現TP63、NFIB、LHX2、TFAP2A、IRX4及MYC之iHFSC的流式細胞分析圖，且圖3F至3J顯示陰性對照HF之流式細胞分析圖。圖3A至圖3C及圖3F至圖3H顯示針對細胞大小之正向散射(FSC)及側向散射(SSC)圈選參數。圖3D及圖3I顯示用於排除死細胞之碘化丙錠(PI)染色。圖3E及圖3J顯示角蛋白15及上皮鈣黏蛋白表現。所示矩形圈選及百分比指示KRT15+/ECAD+細胞群體。

圖4顯示繼代(P)第2、5、7及10代之iHFSC在過度表現TP63、NFIB、LHX2、TFAP2A、IRX4及MYC之後之基因表現以及陰性對照人類纖維母細胞HF中之基因表現的圖，如藉由qPCR所評估。KRT15 (圖4A)及ECAD (圖4B)之表現值相對於肌動蛋白標準化。

圖5顯示在移植iHFSC後之小鼠皮膚之影像。圖5A及圖5B分別顯示移植後第4週的iHFSC移植及時間匹配陰性對照的圖片。圖5C及圖5D顯示來自兩個獨立移植實驗之圖片，其中毛髮生長在移植後第6週(圖5C)及在移植後第9週(圖5D)評估。

圖6A至圖6J為顯示人類iHFSC所表現之典型毛髮幹細胞標記之qPCR分析的圖，該等人類iHFSC由經培養之人類上皮細胞(EPI)過度表現TP63、NFIB、LHX2、TFAP2A、IRX4及MYC而產生。將以下毛髮幹細胞標記基因之表現與對照EPI進行比較：ECAD (圖6A)、KRT15 (圖6B)、KLF5 (圖6C)、HR (圖6D)、SOX9 (圖6E)、TFAP2A (圖6F)、ITGA6 (圖6G)、CTIP2 (圖6H)、ESRP1 (圖6I)及TBX1 (圖6J)。

圖7A至圖7J為顯示人類iHFSC所表現之典型毛髮幹細胞標記之qPCR分析的圖，該等人類iHFSC由經培養之人類上皮細胞(EPI)過度表現TP63、LHX2、TFAP2A及MYC而產生。將以下毛髮幹細胞標記基因之表現與對照EPI進行比較：ECAD (圖7A)、KRT15 (圖7B)、KLF5 (圖7C)、HR (圖7D)、SOX9 (圖7E)、TFAP2A (圖7F)、ITGA6 (圖7G)、CTIP2 (圖7H)、ESRP1 (圖7I)及TBX1 (圖7J)。

圖8A至圖8J為顯示人類iHFSC所表現之典型毛髮幹細胞標記之qPCR分析的圖，該等人類iHFSC由經培養之人類纖維母細胞(HF)過度表現TP63、LHX2、TFAP2A及MYC而產生。將以下毛髮幹細胞標記基因之表現與對照HF進行比較：ECAD (圖8A)、KRT15 (圖8B)、KLF5 (圖8C)、HR (圖8D)、SOX9 (圖8E)、TFAP2A (圖8F)、ITGA6 (圖8G)、CTIP2 (圖8H)、ESRP1 (圖8I)及TBX1 (圖8J)。

圖9A至圖9J為顯示人類iHFSC所表現之典型毛髮幹細胞標記之qPCR分析的圖，該等人類iHFSC由經培養之人類纖維母細胞(HF)過度表現LHX2、TFAP2A及MYC而產生。將以下毛髮幹細胞標記基因之表現與對照HF進行比較：ECAD (圖9A)、KRT15 (圖9B)、KLF5 (圖9C)、HR (圖9D)、SOX9 (圖9E)、TFAP2A (圖9F)、ITGA6 (圖9G)、CTIP2 (圖9H)、ESRP1 (圖9I)及TBX1 (圖9J)。

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Claims

一種組合物，其包含：非毛囊幹(hair follicle stem；HFS)細胞群體；表現選自由以下組成之群之一或多種標記的非聽覺誘導毛囊幹細胞(induced hair follicle stem cell；iHFSC)群體：上皮鈣黏蛋白(E-Cadherin；ECAD)、角蛋白15 (keratin 15；KRT15)、克呂佩爾樣因子5 (Kruppel Like Factor 5；KLF5)、HR離胺酸去甲基酶及核受體輔抑制物(HR)、SRY-Box轉錄因子9 (SOX9)、轉錄因子AP-2α (TFAP2A)、整合素次單元α6 (ITGA6)、BAF染色質重塑複合物次單元BCL11B (CTIP2)、上皮剪接調節蛋白1 (ESRP1)及T-box轉錄因子1 (TBX1)；及毛囊幹細胞重編程(hair follicle stem cell reprogramming；HFSCR)系統，其包含選自由以下組成之群之一或多種毛囊幹細胞重編程因子：p53劑、NF-I劑、Lhx劑、TFAP2劑、IRX劑及Myc劑，其中該HFSCR系統使得一或多個非HFS細胞轉分化成一或多個非聽覺iHFSC。
如請求項1之組合物，其中該非聽覺iHFSC群體與該非毛囊幹細胞群體相比，其選自以下組成之群之一或多種標記具有至少兩倍經增加表現：ECAD、KRT15、KLF5、HR、SOX9、TFAP2A、ITGA6、CTIP2、ESRP1及TBX1。
如請求項1或2之組合物，其中該非聽覺iHFSC群體與該非毛囊幹細胞群體相比，其選自以下組成之群之一或多種標記具有至少五倍經增加表現：ECAD、KRT15、KLF5、HR、SOX9、TFAP2A、ITGA6、CTIP2、ESRP1及TBX1。
如請求項1至3中任一項之組合物，其中該非聽覺iHFSC群體與該非毛囊幹細胞群體相比，其選自以下組成之群之一或多種標記具有至少十倍經增加表現：ECAD、KRT15、KLF5、HR、SOX9、TFAP2A、ITGA6、CTIP2、ESRP1及TBX1。
如請求項1至5中任一項之組合物，其中該一或多種標記之表現係藉由使用選自由以下組成之群的方法進行信使RNA分析來測定：定量聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction；PCR)、逆轉錄PCR、RNA-Seq或北方墨點法。
如請求項1至5中任一項之組合物，其中該一或多種標記之表現係藉由使用選自由流式細胞分析技術或西方墨點法組成之群的方法進行蛋白質分析來測定。
如請求項1至6中任一項之組合物，其中該一或多種標記之表現維持至少一個細胞繼代。
如請求項1至7中任一項之組合物，其中該p53劑為與滲透域融合之p53多肽或其功能片段。
如請求項1至7中任一項之組合物，其中該NF-I劑為與滲透域融合之NF-I多肽或其功能片段。
如請求項1至7中任一項之組合物，其中該Lhx劑為與滲透域融合之Lhx多肽或其功能片段。
如請求項1至7中任一項之組合物，其中該TFAP2劑為與滲透域融合之TFAP2多肽或其功能片段。
如請求項1至7中任一項之組合物，其中該IRX劑為與滲透域融合之IRX多肽或其功能片段。
如請求項1至7中任一項之組合物，其中該Myc劑為與滲透域融合之Myc多肽或其功能片段。
如請求項8至13中任一項之組合物，其中該滲透域包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 1)、RKKRRQRRR (HIV-1 tat之胺基酸49-57；SEQ ID NO: 2)、TRQARRNRRRRWRERQR (HIV-1 rev之胺基酸34-50；SEQ ID NO: 3)、RRRRRRRRR (R9；SEQ ID NO: 4)及RRRRRRRR (R8；SEQ ID NO: 5)。
如請求項1至7中任一項之組合物，其中該p53劑為編碼p53多肽或其功能片段之核酸。
如請求項1至7中任一項之組合物，其中該p53劑為編碼TP63多肽之聚核苷酸。
如請求項1至7中任一項之組合物，其中該NF-I劑為編碼NF-I多肽或其功能片段之核酸。
如請求項1至7中任一項之組合物，其中該NF-I劑為編碼NFIB多肽之聚核苷酸。
如請求項1至7中任一項之組合物，其中該Lhx劑為編碼Lhx多肽或其功能片段之核酸。
如請求項1至7中任一項之組合物，其中該Lhx劑為編碼LHX2多肽之聚核苷酸。
如請求項1至7中任一項之組合物，其中該TFAP2劑為編碼TFAP2多肽或其功能片段之核酸。
如請求項1至7中任一項之組合物，其中該TFAP2劑為編碼TFAP2A多肽之聚核苷酸。
如請求項1至7中任一項之組合物，其中該IRX劑為編碼IRX多肽或其功能片段之核酸。
如請求項1至7中任一項之組合物，其中該IRX劑為編碼IRX4多肽之聚核苷酸。
如請求項1至7中任一項之組合物，其中該Myc劑為編碼Myc多肽或其功能片段之核酸。
如請求項1至7中任一項之組合物，其中該Myc劑為編碼MYC多肽之聚核苷酸。
如請求項15至26中任一項之組合物，其中該核酸存在於病毒載體內。
如請求項26之組合物，其中該病毒載體包含四環素反應啟動子。
如請求項28之組合物，其中該病毒載體存在於病毒粒子之衣殼內。
如請求項1至7中任一項之組合物，其中該HFSCR包含選自由以下組成之群之至少三種毛囊幹細胞重編程因子：編碼p53多肽之核酸、編碼NF-I多肽之核酸、編碼Lhx多肽之核酸、編碼TFAP2多肽之核酸、編碼IRX多肽之核酸及編碼Myc多肽之核酸。
如請求項30之組合物，其中該HFSCR包含選自由以下組成之群之至少三種毛囊幹細胞重編程因子：編碼TP63多肽之核酸、編碼NFIB多肽之核酸、編碼LHX2多肽之核酸、編碼TFAP2A多肽之核酸、編碼IRX4多肽之核酸及編碼MYC多肽之核酸。
如請求項30或31之組合物，其中該HFSCR包含編碼LHX2多肽之核酸、編碼TFAP2A多肽之核酸及編碼MYC多肽之核酸。
如請求項30至32中任一項之組合物，其中編碼該等至少三種毛囊幹細胞重編程因子之該等核酸存在於至少一種病毒載體內。
如請求項1至7中任一項之組合物，其中該HFSCR包含選自由以下組成之群之至少四種毛囊幹細胞重編程因子：編碼p53多肽之核酸、編碼NF-I多肽之核酸、編碼Lhx多肽之核酸、編碼TFAP2多肽之核酸、編碼IRX多肽之核酸及編碼Myc多肽之核酸。
如請求項34之組合物，其中該HFSCR包含選自由以下組成之群之至少四種毛囊幹細胞重編程因子：編碼TP63多肽之核酸、編碼NFIB多肽之核酸、編碼LHX2多肽之核酸、編碼TFAP2A多肽之核酸、編碼IRX4多肽之核酸及編碼MYC多肽之核酸。
如請求項34或35之組合物，其中該HFSCR包含編碼TP63多肽之核酸、編碼LHX2多肽之核酸、編碼TFAP2A多肽之核酸及編碼MYC多肽之核酸。
如請求項34至36中任一項之組合物，其中編碼該等至少四種毛囊幹細胞重編程因子之該等核酸存在於至少一種病毒載體內。
如請求項1至7中任一項之組合物，其中該HFSCR包含包括以下之至少六種毛囊幹細胞重編程因子：編碼p53多肽之核酸、編碼NF-I多肽之核酸、編碼Lhx多肽之核酸、編碼TFAP2多肽之核酸、編碼IRX多肽之核酸及編碼Myc多肽之核酸。
如請求項38之組合物，其中該HFSCR包含編碼TP63多肽之核酸、編碼NFIB多肽之核酸、編碼LHX2多肽之核酸、編碼TFAP2A多肽之核酸、編碼IRX4多肽之核酸及編碼MYC多肽之核酸。
如請求項38或39之組合物，其中編碼該等至少六種毛囊幹細胞重編程因子之該等核酸存在於至少一種病毒載體內。
如請求項33、37及40中任一項之組合物，其中該至少一種病毒載體包含四環素反應性啟動子。
如請求項41之組合物，其中該至少一種病毒載體存在於至少一個病毒粒子之衣殼內。
如請求項1至42中任一項之組合物，其中該非HFS細胞群體為哺乳動物細胞。
如請求項43之組合物，其中該非HFS細胞群體為人類或鼠類細胞。
如請求項43或44之組合物，其中該非HFS細胞群體係選自由以下組成之群：真皮細胞、上皮細胞、脂肪細胞及造血細胞。
如請求項45之組合物，其中真皮細胞係選自由以下組成之群：纖維母細胞、平滑肌細胞及結締組織細胞。
一種製造非聽覺誘導毛囊幹細胞(iHFSC)群體的方法，其包含：獲得非毛囊幹(HFS)細胞群體；使該非HFS細胞群體與毛囊幹細胞重編程(HFSCR)系統接觸，該系統包含選自由以下組成之群之一或多種毛囊幹細胞重編程因子：p53劑、NF-I劑、Lhx劑、TFAP2劑、IRX劑及Myc劑；及在該HFSCR系統存在下培育該非HFS細胞群體，其中一或多個非HFS細胞轉分化成一或多個非聽覺iHFSC。
如請求項47之方法，其中獲得該非HFS群體包含自人類或鼠類個體收集非HFS細胞樣品。
如請求項47或48之組合物，其中該非HFS細胞群體係選自由以下組成之群：真皮細胞、上皮細胞、脂肪細胞及造血細胞。
如請求項49之方法，其中真皮細胞係選自由以下組成之群：纖維母細胞、平滑肌細胞及結締組織細胞。
如請求項47至50中任一項之方法，其中該非HFS細胞群體在該HFSCR系統存在下培育1小時至6週之時段。
如請求項47至51中任一項之方法，其中該一或多個非聽覺iHFSC表現選自由以下組成之群之一或多種標記：上皮鈣黏蛋白(ECAD)、角蛋白15 (KRT15)、克呂佩爾樣因子5 (KLF5)、HR離胺酸去甲基酶及核受體輔抑制物(HR)、SRY-Box轉錄因子9 (SOX9)、轉錄因子AP-2α (TFAP2A)、整合素次單元α6 (ITGA6)、BAF染色質重塑複合物次單元BCL11B (CTIP2)、上皮剪接調節蛋白1 (ESRP1)及T-box轉錄因子1 (TBX1)。
如請求項52之方法，其中該非聽覺iHFSC群體與該非毛囊幹細胞群體相比，其選自以下組成之群之一或多種標記具有至少兩倍經增加表現：ECAD、KRT15、KLF5、HR、SOX9、TFAP2A、ITGA6、CTIP2、ESRP1及TBX1。
如請求項52或53之方法，其中該非聽覺iHFSC群體與該非毛囊幹細胞群體相比，其選自以下組成之群之一或多種標記具有至少五倍經增加表現：ECAD、KRT15、KLF5、HR、SOX9、TFAP2A、ITGA6、CTIP2、ESRP1及TBX1。
如請求項52至54中任一項之組合物，其中該非聽覺iHFSC群體與該非毛囊幹細胞群體相比，其選自以下組成之群之一或多種標記具有至少十倍經增加表現：ECAD、KRT15、KLF5、HR、SOX9、TFAP2A、ITGA6、CTIP2、ESRP1及TBX1。
如請求項52至55中任一項之方法，其中該一或多種標記之表現係藉由使用選自由以下組成之群的方法進行信使RNA分析來測定：定量聚合酶鏈反應(PCR)、逆轉錄PCR、RNA-Seq或北方墨點法。
如請求項52至55中任一項之方法，其中該一或多種標記之表現係藉由使用選自由流式細胞分析技術或西方墨點法組成之群的方法進行蛋白質分析來測定。
如請求項52至57中任一項之方法，其進一步包含使該等非聽覺iHFSC繼代至少一次。
如請求項52至58中任一項之方法，其中該一或多種標記之表現維持至少一個細胞繼代。
如請求項47至59中任一項之方法，其中該p53劑為與滲透域融合之p53多肽或其功能片段。
如請求項47至59中任一項之方法，其中該NF-I劑為與滲透域融合之NF-I多肽或其功能片段。
如請求項47至59中任一項之方法，其中該Lhx劑為與滲透域融合之Lhx多肽或其功能片段。
如請求項47至59中任一項之方法，其中該TFAP2劑為與滲透域融合之TFAP2多肽或其功能片段。
如請求項47至59中任一項之方法，其中該IRX劑為與滲透域融合之IRX多肽或其功能片段。
如請求項47至59中任一項之方法，其中該Myc劑為與滲透域融合之Myc多肽或其功能片段。
如請求項60至65中任一項之方法，其中該滲透域包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 1)、RKKRRQRRR (HIV-1 tat之胺基酸49-57；SEQ ID NO: 2)、TRQARRNRRRRWRERQR (HIV-1 rev之胺基酸34 -50；SEQ ID NO: 3)、RRRRRRRRR (R9；SEQ ID NO: 4)及RRRRRRRR (R8；SEQ ID NO: 5)。
如請求項47至59中任一項之方法，其中該p53劑為編碼p53多肽或其功能片段之核酸。
如請求項47至59中任一項之方法，其中該p53劑為編碼TP63多肽之核酸。
如請求項47至59中任一項之方法，其中該NF-I劑為編碼NF-I多肽或其功能片段之核酸。 [請求項68] 如請求項47至59中任一項之方法，其中該NF-I劑為編碼NFIB多肽之核酸。 [請求項69] 如請求項47至59中任一項之方法，其中該Lhx劑為編碼Lhx多肽或其功能片段之核酸。
如請求項47至59中任一項之方法，其中該Lhx劑為編碼LHX2多肽之核酸。
如請求項47至59中任一項之方法，其中該TFAP2劑為編碼TFAP2多肽或其功能片段之核酸。
如請求項47至59中任一項之方法，其中該TFAP2劑為編碼TFAP2A多肽之核酸。
如請求項47至59中任一項之方法，其中該IRX劑為編碼IRX多肽或其功能片段之核酸。
如請求項47至59中任一項之方法，其中該IRX劑為編碼IRX4多肽之核酸。
如請求項47至59中任一項之方法，其中該Myc劑為編碼Myc多肽或其功能片段之核酸。
如請求項47至59中任一項之方法，其中該Myc劑為編碼MYC多肽之核酸。
如請求項67至76中任一項之方法，其中該核酸存在於病毒載體內。
如請求項77之方法，其中該病毒載體包含四環素反應啟動子。
如請求項78之方法，其中該病毒載體存在於病毒粒子之衣殼內。
如請求項47至59中任一項之方法，其中該HFSCR包含選自由以下組成之群之至少三種毛囊幹細胞重編程因子：編碼p53多肽之核酸、編碼NF-I多肽之核酸、編碼Lhx多肽之核酸、編碼TFAP2多肽之核酸、編碼IRX多肽之核酸及編碼Myc多肽之核酸。
如請求項80之方法，其中該HFSCR包含選自由以下組成之群之至少三種毛囊幹細胞重編程因子：編碼TP63多肽之核酸、編碼NFIB多肽之核酸、編碼LHX2多肽之核酸、編碼TFAP2A多肽之核酸、編碼IRX4多肽之核酸及編碼MYC多肽之核酸。
如請求項80或81之方法，其中該HFSCR包含編碼LHX2多肽之核酸、編碼TFAP2A多肽之核酸及編碼MYC多肽之核酸。
如請求項80至82中任一項之方法，其中編碼該等至少三種毛囊幹細胞重編程因子之該等核酸存在於至少一個病毒載體內。
如請求項47至59中任一項之方法，其中該HFSCR包含選自由以下組成之群之至少四種毛囊幹細胞重編程因子：編碼p53多肽之核酸、編碼NF-I多肽之核酸、編碼Lhx多肽之核酸、編碼TFAP2多肽之核酸、編碼IRX多肽之核酸及編碼Myc多肽之核酸。
如請求項84之方法，其中該HFSCR包含選自由以下組成之群之至少四種毛囊幹細胞重編程因子：編碼TP63多肽之核酸、編碼NFIB多肽之核酸、編碼LHX2多肽之核酸、編碼TFAP2A多肽之核酸、編碼IRX4多肽之核酸及編碼MYC多肽之核酸。
如請求項84或85之方法，其中該HFSCR包含編碼TP63多肽之核酸、編碼LHX2多肽之核酸、編碼TFAP2A多肽之核酸及編碼MYC多肽之核酸。
如請求項84至86中任一項之方法，其中編碼該等至少四種毛囊幹細胞重編程因子之該等核酸存在於至少一個病毒載體內。
如請求項47至59中任一項之方法，其中該HFSCR包含包括以下的至少六種毛囊幹細胞重編程因子：編碼p53多肽之核酸、編碼NF-I多肽之核酸、編碼Lhx多肽之核酸、編碼TFAP2多肽之核酸、編碼IRX多肽之核酸及編碼Myc多肽之核酸。
如請求項88之方法，其中該HFSCR包含編碼TP63多肽之核酸、編碼NFIB多肽之核酸、編碼LHX2多肽之核酸、編碼TFAP2A多肽之核酸、編碼IRX4多肽之核酸及編碼MYC多肽之核酸。
如請求項88或89之方法，其中編碼該等至少六種毛囊幹細胞重編程因子之該等核酸存在於至少一種病毒載體內。
如請求項83、87及90中任一項之方法，其中該至少一種病毒載體包含四環素反應性啟動子。
如請求項91之方法，其中該至少一種病毒載體存在於至少一個病毒粒子之衣殼內。
如請求項47至92中任一項之方法，其進一步包含基於選自由以下組成之群之一或多種標記的表現來選擇及富集該非聽覺iHFSC群體：上皮鈣黏蛋白(ECAD)、角蛋白15 (KRT15)、克呂佩爾樣因子5 (KLF5)、HR離胺酸去甲基酶及核受體輔抑制物(HR)、SRY-Box轉錄因子9 (SOX9)、轉錄因子AP-2α (TFAP2A)、整合素次單元α6 (ITGA6)、BAF染色質重塑複合物次單元BCL11B (CTIP2)、上皮剪接調節蛋白1 (ESRP1)及T-box轉錄因子1 (TBX1)。
如請求項93之方法，其中選擇及富集包含螢光活化細胞分選(fluorescence-activated cell sorting；FACS)或磁活化細胞分選(magnetic-activated cell sorting；MACS)。
如請求項47至94中任一項之方法，其進一步包含解離該非聽覺iHFSC群體以形成細胞懸浮液及向該細胞懸浮液中添加真皮細胞群體。
如請求項95之方法，其中該真皮細胞群體係選自由以下組成之群：纖維母細胞、平滑肌細胞、結締組織細胞、真皮乳頭細胞及脂肪細胞。
如請求項95或96之方法，其進一步包含在支架上培養該等非聽覺iHFSC。
如請求項97之方法，其中該支架為塑膠、基質膠或類似基底膜萃取物、明膠、膠原蛋白或層連結蛋白基質。
如請求項97或98之方法，其中該等非聽覺iHFSC在該支架上培養30分鐘至48小時。
如請求項97至99中任一項之方法，其進一步包含將支架上之該等非聽覺iHFSC移植至個體上。
如請求項100之方法，其中將至少100,000個非聽覺iHFSC移植至該個體上。
如請求項100或101之方法，其中將至少1,000,000個非聽覺iHFSC移植至該個體上。
如請求項100至102中任一項之方法，其中將至少10,000,000個非聽覺iHFSC移植至該個體上。
如請求項100之方法，其中將至少100,000個非聽覺iHFSC及真皮細胞移植至該個體上。
如請求項104之方法，其中將至少1,000,000個非聽覺iHFSC及真皮細胞移植至該個體上。
如請求項105之方法，其中將至少10,000,000個非聽覺iHFSC及真皮細胞移植至該個體上。
一種治療患有脫髮病狀之個體的方法，其包含向該個體投與如請求項1至46中任一項之組合物。
如請求項107之方法，其中該脫髮病狀係選自由以下組成之群：雄激素禿髮、斑禿、休止期落髮、拔毛癖、牽引禿髮、頭癬、瘢痕性禿髮、燒傷或疤痕。
如請求項107或108之方法，其中該等非聽覺iHFSC係由獲自該個體之非HFS細胞轉分化而成。
如請求項107或108之方法，其中該等非聽覺iHFSC係由獲自與該組合物所投與之該個體不同之個體的非HFS細胞轉分化而成。
如請求項107至110中任一項之方法，其中投與包含將支架上培養之該一或多個非聽覺iHFSC移植至該個體上。
如請求項111之方法，其中該一或多個非聽覺iHFSC與真皮細胞群體一起培養。
如請求項112之方法，其中該真皮細胞群體係選自由以下組成之群：纖維母細胞、平滑肌細胞、結締組織細胞、真皮乳頭細胞及脂肪細胞。
如請求項111至113中任一項之方法，其中該支架為塑膠、基質膠或類似基底膜萃取物、明膠、膠原蛋白或層連結蛋白基質。
如請求項114之方法，其中將至少100,000個非聽覺iHFSC移植至該個體上。
如請求項115之方法，其中將至少1,000,000個非聽覺iHFSC移植至該個體上。
如請求項116之方法，其中將至少10,000,000個非聽覺iHFSC移植至該個體上。
如請求項117之方法，其中將至少100,000個非聽覺iHFSC及真皮細胞移植至該個體上。
如請求項118之方法，其中將至少1,000,000個非聽覺iHFSC及真皮細胞移植至該個體上。
如請求項119之方法，其中將至少10,000,000個非聽覺iHFSC及真皮細胞移植至該個體上。
一種非聽覺誘導毛囊幹細胞(iHFSC)群體，其藉由如請求項47至92中任一項之方法產生。