JP4590157B2 - アッセイ、方法および手段 - Google Patents

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プフ，クリストファー，ウィリアム
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スコフィールド，クリストファー，ジョゼフ
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アイシス イノヴェイション リミテッド
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Description

本発明は、低酸素誘導因子α（HIF-α）に作用しかつHIFの細胞性代謝回転の調節に関与するヒドロキシラーゼに関する。これらの酵素の活性をモジュレーションするための化合物、方法および手段を提供する。
転写因子HIF（低酸素誘導因子）系は、低酸素状態に対する応答の重要な調節因子であり、多種多様な生物の酸素恒常性において中心的な位置を占めている（1）。血管新生、赤血球生成、エネルギー代謝、炎症、血管運動機能およびアポトーシス／増殖応答において決定的に重要な役割を果たす多数の転写標的が同定されている（1）。この系は正常な発生に必須であり（2, 3）、虚血／低酸素状態に対する病態生理学的応答において中心的な役割を果たす（1）。HIFは癌においても重要であり、癌では通常それがアップレギュレーションされ、腫瘍増殖および血管新生に大きな影響を及ぼす（1）。HIF DNA結合複合体はαサブユニットとβサブユニットとのヘテロ二量体よりなる（4）。酸素による調節はαサブユニットのヒドロキシル化により生じ、酸素化細胞においては該αサブユニットはプロテアソームにより急速に破壊される（5, 6, 7）。これは、フォン・ヒッペル-リンダウ腫瘍抑制タンパク質（pVHL）がHIF-αサブユニットに結合することを伴い（8）、pVHLは、HIF-αサブユニット中の特異的配列との相互作用を介してユビキチン依存性タンパク質分解を促進するユビキチンリガーゼに対する認識成分として又はその一部として作用する（11, 12, 13, 14）。低酸素状態では、この過程が抑制されてHIF-αを安定化し、HIFα-βを介した転写活性化を可能にする。
本発明者らによる研究は、HIF-αとVHLとの相互作用が、HIF-αタンパク質中の決定的に重要なプロリン残基の酸化により制御されることを明らかにした。ヒトHIF-1αタンパク質においては、これらはPro 402およびPro 564であるが、同等の残基は他のHIF-α形態においても存在し、線虫シー・エレガンス（C. elegans）においても保存されている。このことは、これらが、進化を経て保存された決定的に重要な成分であることを示している。
本明細書中のデータは、HIF-α中のPro 564のようなプロリン残基のヒドロキシル化が、本明細書ではHIFヒドロキシラーゼと称される特異的プロリル-ヒドロキシラーゼのファミリー（これは、シー・エレガンス（C. elegans）タンパク質EGL-9およびヒトタンパク質PHD1-3を含む）により媒介されることを示している。これらの酵素は、プロリルヒドロキシル化のための保存コアLXXLAPモチーフを認識する。このファーミリーの各メンバーは、HIF-α中のヒドロキシル化部位に異なって作用し、また、該組換え酵素の活性は酸素分圧、鉄利用能および第一コバルトイオンにより直接的にモジュレーションされる。
HIFヒドロキシラーゼの活性はHIFαを制御するための新規標的に相当する。活性を遮断すると、HIFαのヒドロキシル化が減少し、細胞内のHIF-αの蓄積が生じるであろう。これは更に、血管新生、赤血球生成、エネルギー代謝、炎症、血管運動機能の促進またはモジュレーションを引き起こし、アポトーシス応答／増殖応答にも影響を及ぼすであろう。したがって、HIFヒドロキシラーゼの活性（特に、そのプロリル-ヒドロキシラーゼ活性）を遮断、阻害、減少または低下させるメカニズムは、ある標的細胞において治療目的に利用される。
逆に、腫瘍において一般に見出されるような低酸素状態では、ヒドロキシル化の欠如は、HIFαの蓄積、およびそれに伴う、血管新生および他の増殖促進事象の促進を招きうる。したがって、HIFヒドロキシラーゼの活性（特に、該酵素のプロリル-ヒドロキシラーゼ活性）をレスキュー、刺激、増強または増加するメカニズムは、ある標的細胞に対する異なる治療目的に利用される。
したがって、本発明の1つの態様は、試験物質の存在下でHIFヒドロキシラーゼと該ヒドロキシラーゼの基質とを接触させ、HIFヒドロキシラーゼと該基質との相互作用または相互作用の欠如を確認することを含む、HIFヒドロキシラーゼと該ヒドロキシラーゼの基質との相互作用をモジュレーションする物質を同定するためのアッセイ方法を提供する。
HIFヒドロキシラーゼと試験物質とは、HIFヒドロキシラーゼが、通常、該ヒドロキシラーゼの基質と相互作用する条件下で接触させることができる。
HIFヒドロキシラーゼと基質との相互作用または相互作用の欠如は、試験物質の存在下および／または非存在下で確認することができる。試験物質の非存在下に対するその存在下での相互作用の変化（すなわち、増加または減少）は、試験物質が相互作用のモジュレーターであることを示す。
相互作用は、一連の通常の技術のいずれかにより測定することが可能であり、後記のとおりの該基質のプロリルヒドロキシル化の測定を含みうる。そのようなアッセイにおける相互作用はどのような機能的相互関係であってもよい。
したがって、本発明は、低酸素誘導因子（HIF）ヒドロキシラーゼと該ヒドロキシラーゼの基質との相互作用をモジュレーションする物質を同定するためのアッセイ方法であって、
・該ヒドロキシラーゼが試験物質の非存在下で該基質と相互作用する条件下、該ヒドロキシラーゼの基質の存在下でHIFヒドロキシラーゼと試験物質とを接触させ、
・該ヒドロキシラーゼと該基質との相互作用、または相互作用の欠如を確認する、
ことを含んでなるアッセイ方法を提供する。
本発明は、HIFヒドロキシラーゼ自体をも提供する。したがって、本発明は、
（a）配列番号2、4、6または8のアミノ酸配列、
（b）配列番号2、4、6または8のアミノ酸配列に対して少なくとも60％の同一性を有しかつHIFヒドロキシラーゼ活性を有するその変異体、または
（c）HIFヒドロキシラーゼ活性を有するそれらのいずれかの断片、
を含んでなるポリペプチドを提供する。
好ましくは、本発明のポリペプチドはプロリルヒドロキシラーゼ活性を有する。
本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。したがって、本発明のもう1つの態様においては、ポリヌクレオチドは、
（i）配列番号1、3、5もしくは7またはその相補的配列、
（ii）ストリンジェントな条件下、（i）に記載の配列にハイブリダイズする配列、
（iii）遺伝暗号の結果として、（i）または（ii）に記載の配列に縮重している配列、
（iv）（i）に記載の配列に対して少なくとも60％の同一性を有する配列、または
（v）ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドまたはHIFヒドロキシラーゼに特異的な抗体を産生しうるポリペプチドをコードする、配列（i）、（ii）、（iii）または（iv）のいずれかの断片を含む。
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクター、および本発明のポリペプチドに特異的に結合しうる抗体に関する。
本発明はまた、健常（または正常）レベルと比較して変化したHIFレベルに関連した症状または疾患あるいはHIF活性を変化させることが望ましい症状の治療における、本発明のアッセイにより同定された物質の使用および本発明のペプチドの活性のインヒビターの使用に関する。
発明の詳細な説明
配列番号1は、PHD1のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を含む。
配列番号2は、PHD1のアミノ酸配列を含む。
配列番号3は、PHD2のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を含む。
配列番号4は、PHD2のアミノ酸配列のみを含む。
配列番号5は、PHD3のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を含む。
配列番号6は、PHD3のアミノ酸配列のみを含む。
配列番号7は、EGL-9のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を含む。
配列番号8は、EGL-9のアミノ酸配列のみを含む。
配列番号9〜16は、HIFαサブユニットとVHLとの相互作用に拮抗する幾つかのポリペプチドを表す。
配列番号17〜22は、いくつかのHIFヒドロキシラーゼ配列モチーフを表す。
配列番号23は、HIF-1αのpVHL最小結合ドメインのアミノ酸配列を示す。
配列番号24は、HIF-2αのpVHL最小結合ドメインのアミノ酸配列を示す。
配列番号25は、アフリカツメガエル（X. laevis）由来のHIF-αのpVHL最小結合ドメインのアミノ酸配列を示す。
配列番号26は、キイロショウジョウバエ（D. melanogaster）由来のHIF-αのpVHL最小結合ドメインのアミノ酸配列を示す。
配列番号27は、シー・エレガンス（C. elegans）由来のHIF-αのpVHL最小結合ドメインのアミノ酸配列を示す。
配列番号28〜34は、HIF-1α/pVHL相互作用を遮断する能力に関して評価された幾つかの合成ペプチドのアミノ酸配列を表す。
配列番号35は、ヒトHIF-αのアミノ酸配列のみを含む。
配列番号36は、シー・エレガンス（C. elegans）HIF-αのアミノ酸配列のみを含む。
配列番号37は、VHL依存性ユビキチン化に関与しLxxLAPモチーフを含有するHIF-1αの一部のアミノ酸配列を含む。
配列番号38は、VHL依存性ユビキチン化に関与しLxxLAPモチーフを含有するHIF-2αの一部のアミノ酸配列を含む。
配列番号39は、VHL依存性ユビキチン化に関与しLxxLAPモチーフを含有するHIF-1αのもう1つの部分のアミノ酸配列を含む。
配列番号40は、シー・エレガンス（C. elegans）HIFヒドロキシラーゼEGL-9の推定ゼリーロールコアのアミノ酸配列を含む。
配列番号41は、PHD1の推定ゼリーロールコアのアミノ酸配列を含む。
配列番号42は、PHD2の推定ゼリーロールコアのアミノ酸配列を含む。
配列番号43は、PHD3の推定ゼリーロールコアのアミノ酸配列を含む。
配列番号44は、ラットSM20の推定ゼリーロールコアのアミノ酸配列を含む。
配列番号45は、ストレプトマイセス（Streptomyces）由来のプロリル-3-ヒドロキシラーゼのラットSM20の推定ゼリーロールコアのアミノ酸配列を含む。
配列番号46および47は、突然変異誘発されたceHIFを得るために使用する2つのプライマーのヌクレオチド配列を示す。
配列番号48は、可能なHIFヒドロキシラーゼモチーフのアミノ酸配列を示す。
HIFヒドロキシラーゼ
本発明は、本明細書でHIFヒドロキシラーゼと称される新規ヒドロキシラーゼのファミリー、その機能的変異体、およびHIFヒドロキシラーゼまたはその変異体の機能的断片に関する。PHDポリペプチド（PHD 1、2および3）と称される3つのヒトHIFヒドロキシラーゼに関する配列情報を、配列番号1、3および5（ヌクレオチドおよびアミノ酸）ならびに配列番号2、4および6（対応アミノ酸配列を含む）に記載する。シー・エレガンス（C. elegans）HIFヒドロキシラーゼEGL-9に関する配列情報を、配列番号7（ヌクレオチドおよびアミノ酸）および配列番号8（対応アミノ酸配列を含む）に記載する。したがって、本発明のポリペプチドは、実質的に、配列番号2、4、6もしくは8のアミノ酸配列またはこれらの配列のいずれかの変異体またはこれらの配列のいずれかの断片または該断片の変異体よりなる。
PHD1、2および3は、2-オキソグルタル酸（2-オキソグルタラート）依存性でヘム鉄非依存性のジオキシゲナーゼである。これらのジオキシゲナーゼはヒドロキシラーゼ活性を有し、特に、それらはHIF1αのヒドロキシル化を媒介する。それらは、プロリン-3-ヒドロキシラーゼのような結晶構造が公知（Cliftonら, Eur. J. Biochem., 2001, 268, 6625-6636）の非ヘムオキシゲナーゼに配列上関連している。PHD1、2および3はシー・エレガンス（C. elegans）のEGL9に関連しており、本明細書ではそれぞれEGLN2、1および3と称されることもある。PHD1、2および3ならびにEGL9ヒドロキシラーゼは全て、本発明のHIFヒドロキシラーゼであるとみなされる。本発明のHIFヒドロキシラーゼ、特にヒトHIFヒドロキシラーゼは、EGLNポリペプチドと称されることもある。
好ましい実施形態においては、本発明のHIFヒドロキシラーゼはプロリル-ヒドロキシラーゼである。典型的には、HIFヒドロキシラーゼはヒトHIFヒドロキシラーゼであり、特に、それはPHD1、2または3である。好ましい実施形態においては、本発明の種々のアッセイ、方法、医薬および他の実施形態はヒトHIFヒドロキシラーゼ、特にPHD1、2または3を使用し、あるいはそれに関連している。
本発明のポリペプチドは、単離および／または精製された形態であったり、あるいはそれに天然で付随している物質［例えば、他のポリペプチド、または例えば、HIFヒドロキシラーゼをコードする遺伝子（特にPHD-1、-2または-3遺伝子）によりアミノ酸配列がコードされているヒトポリペプチド以外のヒトポリペプチド］を含有しない又は実質的に含有しないものであったり、あるいは（例えば、原核細胞内での発現により産生された場合に）天然グリコシル化を欠くポリペプチド（例えば、非グリコシル化体）でありうる。
該ポリペプチドは、該ポリペプチドの意図される目的を妨げない担体または希釈剤と混合されうると理解され、その場合にも、実質的に単離されているとみなされる。実質的に精製された形態のポリペプチドは、一般には、製剤（調製物）中のポリペプチドに対して50重量％以上、例えば、80重量％、90重量％、95重量％または99重量％以上が本発明のポリペプチドとなるよう該製剤中に該ポリペプチドを含む。本発明のタンパク質を精製および／または合成するためには常法を用いることが可能である。そのような方法は当業者によく理解されており、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, CSH Laboratory Press, 1989（その開示の全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に開示されているような技術を含む。
「変異体」なる語は、少なくとも1つの特性または機能を配列番号2、4、6または8（特に配列番号2、4または6）のHIFヒドロキシラーゼと共有するポリペプチドを意味する。また、本発明の「断片」は、配列番号2、4、6または8（特に配列番号2、4または6）のHIFヒドロキシラーゼの機能または特性の少なくとも1つを有する。本発明のHIFヒドロキシラーゼは、ペプチド中のアミノ酸残基をヒドロキシル化する能力を有するヒドロキシラーゼである。好ましくは、本発明のポリペプチドは、ペプチド基質のプロリル残基の1個以上をヒドロキシル化しうる。本発明の好ましい態様においては、本発明のHIFヒドロキシラーゼ、変異体または断片は、1個以上のHIF-1αの残基の、好ましくは、HIFのプロリル残基、特にHIF-1αまたはHIF-1αのペプチド類似体またはそれらの断片（当該プロリルを含むもの）のPro 564および／またはPro 402をヒドロキシル化する能力を有する。好ましくは、本発明のHIFヒドロキシラーゼの変異体は、配列番号2、4、6または8、特に、配列番号2、4または6のアミノ酸配列に対して少なくとも60％の配列同一性を有する。
本発明はまた、本発明のポリペプチドの活性部分、断片、誘導体および機能的模擬体を含む。ポリペプチドの「活性部分」は、前記の完全長ポリペプチドより短いが、ヒドロキシラーゼ活性を保有し、特にHIFヒドロキシラーゼ活性（好ましくはHIFプロリルヒドロキシラーゼ活性）を維持するペプチドを意味する。そのような活性断片は、例えば、異なる（すなわち異種）リガンドに対する結合部分を含む融合タンパク質の一部として含まれていてもよい。
ポリペプチドの「断片」は、一般には、少なくとも約5個連続したアミノ酸、しばしば少なくとも約7個連続したアミノ酸、典型的には少なくとも約9個連続したアミノ酸、より好ましくは少なくとも約13個連続したアミノ酸、より好ましくは少なくとも約20〜30個またはそれ以上連続したアミノ酸のアミノ酸残基のストレッチを意味する。HIFヒドロキシラーゼ配列の断片は、該アミノ酸配列の一部に対する抗体を産生させるのに有用な抗原決定基、すなわちエピトープを含みうる。ポリペプチド中のペプチドモチーフを見つけ出して厳密化するためには、一般には、アラニンスキャンを用いる。これは、各残基を順番にアミノ酸アラニンで系統的に置換し、ついで生物活性を評価するというものである。したがって、そのようなスキャンは本発明の好ましい断片の同定に用いることができる。
本発明のポリペプチドは、一般にはヒドロキシラーゼ活性、好ましくはプロリルヒドロキシラーゼ活性を有する。したがって、本発明はまた、特に、HIFのような基質上でのヒドロキシラーゼ活性のアッセイにおいて使用するための、そのようなポリペプチドに関する。該ポリペプチドは、適当な基質のヒドロキシル化、特に、そのような基質のプロリルヒドロキシル化にも使用することができる。本発明のHIFヒドロキシラーゼの変異体または活性断片は、典型的には、後記に更に詳しく説明するとおりヒドロキシラーゼ活性をモニターすることにより同定することができる。好ましい実施形態においては、HIFヒドロキシラーゼは、プロリル-4-ヒドロキシラーゼ活性のようなプロリルヒドロキシラーゼ活性を有する。
そのようなHIFヒドロキシラーゼは真核性ポリペプチド、好ましくは哺乳類ポリペプチド、より好ましくはヒトポリペプチドでありうる。
HIFヒドロキシラーゼは、好ましくは、HIFプロリルヒドロキシラーゼ（HPH）活性を有し、好ましくは、基質アミノ酸配列モチーフLXXLXP、特にLXXLAP、またはLXXLRP（ここで、Xは任意のアミノ酸である）を認識し及び／又はそれに対する特異性を有し、すなわち、LXXLXPまたはLXXLAPモチーフを含むポリペプチドの該モチーフのプロリン残基をヒドロキシル化する。
HIFヒドロキシラーゼは、好ましくは、少なくとも8個のストランドよりなるβバレルゼリーロール構造を含有する。典型的には、該ゼリーロール構造は8個のストランドを有しうる。図9は、種々のHIFヒドロキシラーゼのアラインメントを示し、該ゼリーロールモチーフのβバレルストランドの8個の位置が示されている。該ゼリーロール構造の概要図を図10に示す。
好ましいHIFヒドロキシラーゼは、配列;
HXD[X]nH
（ここで、Xは任意のアミノ酸であり、nは1〜200、20〜150、または30〜100アミノ酸、例えば10、20、30、40、50、60、70、80、90または100アミノ酸である）を含む。
特に好ましい実施形態においては、該モチーフのHXD部分はHIFヒドロキシラーゼのゼリーロールモチーフの第2ストランド上に位置し、残りのHは該モチーフの第2ストランド上またはその近くに位置する。
単離されたPHD 1、2および3酵素に関連した幾つかの酵素（例えば、クラバミン酸シンターゼ）においては、HXDモチーフがHXEモチーフにより置換されている。したがって、本発明はまた、HXDモチーフの代わりにHXEモチーフを有するHIFヒドロキシラーゼを含む。これは、HIFヒドロキシラーゼが、通常、そのようなモチーフを有するためであり、あるいは、元々存在したHXDモチーフがHXEモチーフにより置換されたためである。したがって、本明細書に記載のHXDモチーフのいずれにおいても、本発明は、アスパラギン酸残基がグルタミン酸残基により置換されたモチーフを含有する酵素をも含む。
適当なHXD[X]nHモチーフは、Egl-9配列に基づけば、残基His487、Asp489およびHis 548を含みうる。したがって、適当なHIFヒドロキシラーゼは、配列;
HXD[X]58H
を含んでなる又は含むことが可能である。
本明細書に記載のアミノ酸残基は、特に示さない限り、EGL-9配列（GI5923812）に基づき番号付けされている。EGL-9および他のHIFヒドロキシラーゼの触媒領域の配列を図9に示す。配列中の変異により、他のHIFヒドロキシラーゼ中の同等または対応残基は、異なる番号を有しうると理解されるであろう。EGL-9配列に基づく残基に対する本明細書中の言及は、他のHIFヒドロキシラーゼ中の同等の残基を含むと理解される。
好ましいHIFヒドロキシラーゼは以下の残基を1個以上含みうる：Met473, Asp494, Tyr502, Leu517, Pro532, Asp543, Val550, Arg557。
そのような好ましいポリペプチドは以下のアミノ酸配列を含みうる：
M(X)13HXD(X)4D(X)7Y(X)14L(X)14P(X)10D(X)4HXV(X)6R
（ここで、Xは任意のアミノ酸残基である）。
特に好ましいHIFヒドロキシラーゼは更に、以下の残基を1個以上含みうる：
Arg469, Tyr477, Pro478, Gly479, Asn480, Gly481, Tyr584, Val585, Val488, Asn490, Pro491, Gly495, Arg496, Cys497, Thr499, Ile501, Tyr503, Asn505, Trp508, Asp509, Gly514, Gly515, Phe520, Pro521, Glu522, Asp535, Arg536, Leu537, Phe539, Trp541, Ser542, Arg544, Arg545, Asn546, Pro547, Glu549, Pro552, Ala559, Thr561, Val562, Trp563, Tyr564, Asp566, Glu569, Arg570, Ala573, Ala575, Lys576, Lys578。
そのような特に好ましいポリペプチドは、例えば、以下のアミノ酸配列を含みうる：
RXXXMXXXYP GNGXXYVXHV DNPXXDGRCX TXIYYXNXXW D(X)4GGXLX XFPE(X)9PX XDRLXFXWSD RRNPHEVXP(X)4 RXAXTVWYXD XXERXXAXAK XK
（ここで、Xは任意のアミノ酸残基である）。
他の好ましい実施形態においては、前記配列の以下の変異の1以上が存在しうる。残基478はAsn、残基485はIle、残基496はLys、残基497はVal、残基515はSer、残基520はTyr、残基530はIle、ValまたはMet、残基536はLys、残基537はIle、残基539はIle、残基546はThr、残基559はSer、残基560はIle、MetまたはLeu、残基561はCys、および／または残基564はPheでありうる。
適当なHIFヒドロキシラーゼは、表1に示すとおりのSM20（NCBI受託番号NP071334）、EGL-9（GI5923812）、CG1114（AAF52050）、C1orf12（NP071334）、EGLN1/PHD2（gi1457146）、EGLN2/PHD1（gi1457148）、EGLN3/PHD3（gi14547150）、FALKOR（gi13649965）、およびFLJ21620（BAB15101）よりなる群から選ばれるポリペプチド配列を含みうる。
本発明のポリペプチドは更に、前記アミノ酸配列の1つに対して約60％以上、好ましくは約70％以上、より好ましくは約80％以上、より好ましくは約90％以上、最も好ましくは約95％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含みうる。適当な配列はプロリルヒドロキシラーゼ、特にHIFプロリルヒドロキシラーゼ活性を有する。
1つの実施形態においては、本発明は、PHD2（EGLN1）遺伝子にコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも60％の配列同一性を有するポリペプチドを提供する。
本発明の更なる態様は、HIFヒドロキシラーゼの同定方法に関する。そのような方法は、
配列;
M(X)13HXD(X)4D(X)7Y(X)14L(X)14P(X)10D(X)4HXV(X)6R
を含むポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームに関してデータベースをスクリーニングし、
該オープンリーディングフレームを発現させて該ポリペプチドを産生させ、
本明細書に記載のHIFポリペプチドのプロリルまたは他の残基をヒドロキシル化する該ポリペプチドの能力を測定することを含みうる。HIFヒドロキシラーゼ活性についての後続のアッセイにおいて使用するための他のHIFヒドロキシラーゼを同定するために、結晶学的情報を用いることも可能である。
本発明のもう1つの態様においては、本発明のHIFヒドロキシラーゼは、HIFヒドロキシラーゼと同じ活性を示さないが該野生型ポリペプチドの機能を抑制する変異体でありうる。例えば、修飾または変異HIFヒドロキシラーゼは、HIFヒドロキシラーゼの基質に関して競合するがそのような基質のプロリルヒドロキシル化を引き起こさないものでありうる。そのような変異体は本発明の種々の実施形態において使用することができる。
アミノ酸配列の同一性
ポリペプチドは、本明細書中に記載または言及されているポリペプチド配列に対して約60％以上、約70％以上、約80％以上、約90％以上、約95％以上または約98％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含みうる。
アミノ酸の「相同性」は、例えばアルゴリズムGAP（後記のとおり）を使用して測定される同一性であると理解されうる。
アミノ酸の同一性は、一般には、アルゴリズムGAP（Genetics Computer Group, Madison, WI）を基準にして定義される。GAPは、2つの完全な配列を整列させるために、マッチ数を最大にしギャップ数を最小にするNeedlemanおよびWunschアルゴリズムを使用する。一般には、デフォルトパラメーターを使用し、ギャップ生成ペナルティー = 12、ギャップ伸長ペナルティー = 4である。GAPの使用が好ましいかもしれないが、他のアルゴリズム、例えば、BLAST（これはAltschulら, (1990) J. Mol. Biol. 215: 405-410の方法を用いる）、gapped BLAST、PSI-BLAST（Altshul S. (1997) Nucleic Acid Res.17 3389-33402）、FASTA（これはPearsonおよびLipman (1988) PNAS USA 85: 2444-2448の方法を用いる）またはSmith-Watermanアルゴリズム（SmithおよびWaterman (1981) J. Mol Biol. 147: 195-197）を使用することも可能である。一般には、デフォルトパラメーターを使用し、ギャップ生成ペナルティー = 12、ギャップ伸長ペナルティー = 4とする。
配列比較は、本明細書に示す関連配列の完全長にわたり行うことが可能であり、あるいは、より好ましくは、約20、25、30、33、40、50、67、133、167、200、233、267、300、333、400個またはそれ以上のアミノ酸の連続した配列にわたり関連アミノ酸配列と比較するものでありうる。
これらのプログラムのデフォルトパラメーターまたは他の特徴が修正される場合には、該プログラムおよびそのパラメーターに対する言及は本出願の優先日当時のものであると理解されるべきである。
本発明のポリペプチドに施される置換は、例えば、以下の表（この場合、第2列中の同じ分類、好ましくは、第3列中の同じ行のアミノ酸が、互いに置換されうる）に従う同類置換を含みうる。
Figure 0004590157
あるいは、任意のアミノ酸を、小さな脂肪族アミノ酸、好ましくはグリシンまたはアラニンにより置換することが可能である。
また、欠失および挿入（例えば、1個から該アミノ酸の最大40％に当たる5個まで）を施すことも可能である。挿入は、好ましくは、小さな脂肪族アミノ酸、例えばグリシンまたはアラニンの挿入であるが、他の挿入が除外されるわけではない。
また、本発明のポリペプチドに関して本明細書に記載されている方法のいずれかにより、変異体ポリペプチドを修飾することができる。これには、例えば、「逆」（C末端からN末端への）配列、合成アミノ酸、グリコシル化ペプチド、リン酸化ペプチドが含まれ、さらには、カルシウム、亜鉛、鉄またはマンガンのような金属イオンで修飾された側鎖の付加、および標識が含まれる。ポリペプチドは、該ポリペプチドの複数のコピーを含有する分子の形態（またはポリペプチドの混合物）で提供されうる。例えば、リシンの側鎖のアミノ基は、アミノ酸のカルボキシ末端に対する結合部分として利用されうる。したがって、2つのアミノ酸がカルボニル結合によりリシンに結合して、1回以上分枝しうる分枝構造を与えうる。例えば、構造Pep4-Lys2-Lys-X［ここで、PepはHIFヒドロキシラーゼまたはその変異体（所望により、異種融合体の形態であってもよい）からのポリペプチドであり、Lysはリシンであり、Xは、Pep4-MAPペプチドを合成するための樹脂のような固相支持体へのMAPコアの結合をもたらし、一旦合成が完了したら該支持体から除去されうるβ-アラニンのような末端基である］の多重抗原ペプチド（MAP）のようなMAPには、本発明のポリペプチドの4コピーが結合しうる。
他の多重ポリペプチド構造は、Luら, 1991, Mol Immunol, 28, 623-30; Briandら, 1992, J Immunol Methods, 156, 255-65; Ahlborg, 1995, J Immunol Methods, 179, 269-75に記載のMAPコアを使用して得ることができる。
本発明の多量体が提供される場合には、それらは、本発明の異なるポリペプチドを含んでいたり、あるいは、同じポリペプチドの多量体でありうる。
特に示されている場合を除き、本明細書に記載のポリペプチド配列は、通常の1文字表記でN末端からC末端への配向で示されている。また、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列は、非天然アミノ酸を含むよう又は化合物のin vivoでの安定性を増強するよう更に修飾されうる。該化合物を合成手段により製造する場合には、そのようなアミノ酸は製造中に導入することができる。該化合物は、合成的または組換え的な製造の後にも修飾することができる。
本発明のポリペプチドは、Dアミノ酸を使用して合成的に製造することも可能である。そのような場合には、CからNへの配向で、逆配列で該アミノ酸を結合させることができる。βアミノ酸（またはより高度なホモログ）を使用することも可能である。
アミノ酸に関する多数の側鎖修飾が当技術分野で公知であり、本発明のポリペプチドの側鎖に施されうる。そのような修飾には、例えば、アルデヒドとの反応およびそれに続くNaBH4での還元による還元的アルキル化、メチルアセトイミダートでのアミド化または無水酢酸でのアシル化によるアミノ基の修飾が含まれる。
アルギニン残基のグアニジノ基は、2,3-ブタンジオンまたはグリオキサールのような試薬とのヘテロ環縮合生成物の形成により修飾することができる。スルフヒドリル基は、カルボキシメチル化のような方法により修飾することができる。トリプトファン残基は、インドール環の酸化またはアルキル化により修飾することができる。ヒスチジンのイミダゾール環はアルキル化により修飾することができる。
カルボキシ末端および任意の他のカルボキシ側鎖は、エステル基（例えば、C1-6アルキルエステル）の形態で保護することができる。
アミノ酸の修飾の前記具体例は網羅的なものではない。当業者は、必要に応じて、当技術分野において自体公知の化学を用いて、アミノ酸側鎖を修飾することが可能である。
ポリペプチドは、当技術分野において広く利用可能な技術を用いて合成的または組換え的に製造することができる。合成的製造は、一般には、所望の配列のポリペプチドが製造されている反応容器へ個々のアミノ酸残基を逐次的に加えることを含む。
ポリヌクレオチド
本発明はまた、HIFヒドロキシラーゼまたはその変異体もしくは断片をコードするヌクレオチド配列、およびそれらに相補的なヌクレオチド配列を含む。特に、本発明は、ヒトHIFヒドロキシラーゼまたはヒトHIFヒドロキシラーゼの断片もしくは変異体をコードするヌクレオチド配列、およびこれらの配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列を提供する。該ヌクレオチド配列はRNAまたはDNA（ゲノムDNA、合成DNAまたはcDNAを含む）でありうる。好ましくは、該ヌクレオチド配列はDNA配列であり、最も好ましくは、cDNA配列である。本発明はまた、本発明の配列を含むPNA（タンパク質核酸）分子を含む。ヒトPHD 1、2および3に関するヌクレオチド配列情報は、それぞれ配列番号1、3および5に示されている。シー・エレガンス（C. elegans）のEGL9ポリペプチドに関するヌクレオチド配列情報は配列番号7に示されている。そのようなヌクレオチドは、当技術分野でよく知られた方法（例えば、Sambrookら, 1989に記載の方法）に従い、細胞から単離すること又は合成することが可能である。
典型的には、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号1、3、5または7のコード配列または該コード配列の相補体（特に、配列番号1、3または5のコード配列または相補体）に選択的条件下でハイブリダイズしうるヌクレオチドの連続的配列を含む。
本発明のポリヌクレオチドは、配列番号1、3、5または7のコード配列または該コード配列の相補体（特に、配列番号1、3または5のコード配列または相補体）に、バックグラウンドを有意に超えるレベルでハイブリダイズしうる。バックグラウンドハイブリダイゼーションは、例えば、cDNAライブラリー中に存在する他のcDNAにより生じうる。本発明のポリヌクレオチドと配列番号1、3、5または7のコード配列または該コード配列の相補体との相互作用により生成したシグナルレベルは、典型的には、他のポリヌクレオチドと配列番号1、3、5または7のコード配列との相互作用の少なくとも10倍、好ましくは少なくとも100倍強力である。相互作用の強度は、プローブを例えば32Pで放射能標識することにより測定することができる。選択的ハイブリダイゼーションは、典型的には、中等度ないしは高いストリンジェンシーの条件を用いることにより達成されうる。しかし、そのようなハイブリダイゼーションは、当技術分野で公知の任意の適当な条件下で行うことができる（Sambrookら, 1989を参照されたい）。例えば、高いストリンジェンシーが要求される場合には、適当な条件は60℃〜65℃で0.1〜0.2×SSCを含む。低いストリンジェンシーが要求される場合には、適当な条件は60℃で2×SSCを含む。
配列番号1、3、5または7のコード配列は、ヌクレオチドの置換、例えば、1、2または3個〜10、25、50または100個の置換により修飾することができる。その代わりに又はそれに加えて、配列番号1、3、5または7のポリヌクレオチドは、1以上の挿入および／または欠失により、および／または一方または両方の末端における伸長により修飾することができる。ポリヌクレオチドは1以上のイントロンを含むことが可能であり、例えば、ゲノムDNAを含むことが可能である。該修飾ポリヌクレオチドは、一般には、HIFヒドロキシラーゼ活性、典型的にはヒドロキシラーゼ活性、特にプロリルヒドロキシラーゼ活性を有するポリヌクレオチドをコードする。あるいは、ポリヌクレオチドは、HIFヒドロキシラーゼ活性をモジュレーションするポリペプチドまたはポリペプチドのリガンド結合部分をコードする。縮重置換を施したり、および／または、該修飾配列が翻訳された場合に同類アミノ酸置換（例えば前記表に示されているもの）が生じる置換を施すことが可能である。
配列番号1、3、5または7のDNAコード配列の相補体に選択的にハイブリダイズしうるヌクレオチド配列は、一般には、配列番号1、3、5または7の少なくとも20、好ましくは少なくとも30、例えば少なくとも40、少なくとも60、より好ましくは少なくとも100個の連続したヌクレオチドの領域にわたり又は最も好ましくは配列番号1、3、５または7の全長にわたり、配列番号1、3、5または7のコード配列に対して少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも88％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％または少なくとも99％の配列同一性を有する。好ましくは、該ヌクレオチド配列は、前記で更に詳しく説明されているHIFヒドロキシラーゼと同じドメイン構造を有するポリペプチドをコードする。
例えば、UWGCGパッケージは、相同性を算出するために使用しうるBESTFITプログラム（例えば、そのデフォルト設定で使用される）を提供する（Devereuxら, (1984) Nucleic Acids Research 12, p387-395）。PILEUPおよびBLASTアルゴリズムは、例えば、Altschul (1993) J. Mol. Evol. 36:290-300; Altschulら, (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10に記載されているとおり、（典型的にはそのデフォルト設定で）相同性を算出したり配列を整列させるために使用することができる。
BLAST分析を行うためのソフトウェアは、National Centre for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)から公に入手可能である。このアルゴリズムは、まず、データベース配列中の同じ長さのワードと整列した場合に或る正の閾値スコアTに合致する又はそれを満足するクエリー配列中の長さWの短いワードを同定することによりHSP（high scoring sequence pair）を同定することを含む。Tは隣接ワードスコア閾値と称される（Altschulら, 1990）。これらの初期隣接ワードヒットは、それらを含有するHSPを見出すために検索を開始するためのシードとして用いられる。累積アラインメントスコアが増加しうるまで、該ワードヒットを各配列に沿って両方向に伸長させる。各方向へのワードヒットの伸長は、累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Xだけ減少した場合、1以上の負スコア残基アラインメントの蓄積のために累積スコアが0以下になった場合、またはいずれかの配列の末端に達した場合に停止する。BLASTアルゴリズムパラメーターW、TおよびXは該アラインメントの感度および速度を定める。BLASTプログラムは、11のワード長（W）、50のBLOSUM62スコアリングマトリックス（HenikoffおよびHenikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919を参照されたい）アラインメント（B）、10の期待値（E）、M=5、N=4および両鎖の比較をデフォルトとして用いる。
BLASTアルゴリズムは、2つの配列間の類似性の統計解析を行う（例えば、KarlinおよびAltschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787、ならびにAltschulおよびGish (1996) Methods Enzymol. 266: 460-480を参照されたい）。BLASTアルゴリズムにより提供される類似性の1つの尺度は最小総和確率（smallest sum probability）（P(N)）であり、これは、2つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間のマッチが偶然に生じる確率の指標を与える。例えば、第2配列に対する第1配列の比較における最小総和確率が約1未満、好ましくは約0.1未満、より好ましくは約0.01未満、最も好ましくは約0.001未満の場合には、配列は、もう1つの配列に類似しているとみなされる。
本発明のポリヌクレオチドを定義するためには、前記の配列同一性と最小サイズとの任意の組合せを用いることが可能であり、より厳密な組合せ（すなわち、より長い長さにわたる、より高い配列同一性）が好ましい。したがって、例えば、25、好ましくは30ヌクレオチドにわたり少なくとも90％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、および40ヌクレオチドにわたり少なくとも95％の配列同一性を有するポリヌクレオチドが、本発明の1つの態様を構成する。
本発明のヌクレオチドは標識を含みうる。例えば、それらは放射能標識または蛍光標識されうる。該標識は、相補的核酸に対するハイブリダイゼーションが生じた場合にのみ可視化されるようなものでありうる。例えば、該標識はハイブリダイゼーションまでは消光されうる。本発明のヌクレオチドは、膜またはマイクロアレイのような支持体に固定化されうる。
本発明のヌクレオチドは、in vitro、in vivoまたはex vivoで生じうる本発明のタンパク質の製造において有用である。したがって、本発明は、本発明のポリヌクレオチド、特に配列番号1、3、5または7にコードされるポリペプチドを提供する。本発明は、PHD遺伝子、特にPHD 1、2または3遺伝子にコードされるPHDポリペプチドを含む。本発明はまた、HIFヒドロキシラーゼ活性、特にプロリルヒドロキシラーゼ活性を有するそのようなポリペプチドの断片を提供する。
該ヌクレオチドは、組換えタンパク質の合成において使用したり、あるいは更には、それ自体を、遺伝子治療技術において利用される治療剤として使用することが可能である。HIFヒドロキシラーゼをコードするヌクレオチドに相補的なヌクレオチド、またはアンチセンス配列、または干渉RNAも、遺伝子治療において使用することができる。
本発明はまた、本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む。そのような発現ベクターは分子生物学の技術で常套的に構築され、例えば、プラスミドDNAと、タンパク質を発現させるために必要となることがあり正しい配向で配置される適当なイニシエーター、プロモーター、エンハンサーおよび他のエレメント、例えばポリアデニル化シグナルとの使用を伴いうる。他の適当なベクターは当業者に明らかであろう。これに関しての更なる具体例は、Sambrookら, 1989を参照されたい。
また、本発明のポリヌクレオチドは、アンチセンスRNAの産生をもたらすためにアンチセンス配向で前記ベクター中に挿入することができる。アンチセンスRNAまたは他のアンチセンスポリヌクレオチドは、合成手段によっても製造することができる。そのようなアンチセンスポリヌクレオチドは、本発明のアッセイにおける試験化合物として使用することが可能であり、あるいは療法によるヒトまたは動物の治療方法において有用でありうる。
本発明のポリヌクレオチドは、RNA干渉において使用する二本鎖RNAを設計するためにも使用することができる。そのようなRNAは、標的mRNAと同じ配列を有する短い伸長の二本鎖RNAを含む。そのような配列は、該mRNAの翻訳を抑制するために使用することができる。あるいは、プラスミド中に背中合わせ（back to back）でクローニングされた、HIFヒドロキシラーゼをコードする遺伝子の小さな断片が提供されうる。発現は所望の二本鎖RNAの産生を招く。そのような短い干渉RNA（siRNA）は、例えば、アッセイまたは治療方法において本発明のHIFヒドロキシラーゼの発現を減弱または抑制するために使用することができる。本発明はまた、そのようなsiRNAに関する。そのようなsiRNAは、それらの配列を本発明のHIFヒドロキシラーゼのコード遺伝子中の保存配列の領域に基づいたものとすることにより、該ヒドロキシラーゼ群を抑制するよう設計することができる。あるいは、抑制される特定のヒドロキシラーゼ遺伝子のコード遺伝子に特有の配列を選択することにより、該siRNAを、特定のHIFヒドロキシラーゼに特異的なものとすることが可能である。
好ましくは、ベクター中の本発明のポリヌクレオチドは、宿主細胞による該コード配列の発現をもたらしうる制御配列に、機能しうる形で連結されている。すなわち、該ベクターは発現ベクターである。「機能しうる形で連結されている」なる表現は、記載されている成分が、それらがそれらの意図される様態で機能しうる関係で配置されていることを意味する。コード配列に「機能しうる形で連結された」調節配列（例えば、プロモーター）は、該調節配列に適合した条件下で該コード配列の発現が達成されるよう位置している。
該ベクターは、例えば、複製起点、場合によっては該ポリヌクレオチドの発現のためのプロモーターおよび場合によっては該プロモーターの調節因子が備わったプラスミド、ウイルスまたはファージベクターでありうる。該ベクターは人工染色体でありうる。該ベクターは、1以上の選択マーカー遺伝子、例えば、細菌プラスミドの場合にはアンピシリン耐性遺伝子または真菌ベクター用の耐性遺伝子を含有しうる。ベクターは、例えば、DNAまたはRNAの製造のためにin vitroで使用することが可能であり、あるいは宿主細胞、例えば哺乳類宿主細胞をトランスフェクトまたは形質転換するために使用することが可能である。該ベクターはまた、in vivo、例えば遺伝子治療法での使用に適合させることができる。
プロモーターおよび他の発現調節シグナルは、発現が意図される宿主細胞に適合するよう選択することができる。例えば、酵母プロモーターには、エス・セレビシエ（S. cerevisiae）GAL4およびADHプロモーター、エス・ポンベ（S. pombe）nmt1およびadhプロモーターが含まれる。哺乳類プロモーターには、カドミウムのような重金属に応答して誘導されうるメタロチオネインプロモーターが含まれる。ウイルスプロモーター、例えばSV40ラージT抗原プロモーターまたはアデノウイルスプロモーターも使用することができる。IRESプロモーターも使用することができる。すべてのこれらのプロモーターは当技術分野において容易に入手可能である。
βアクチンプロモーターのような哺乳類プロモーターを使用することができる。組織特異的プロモーターが特に好ましい。誘導性プロモーターも好ましい。例えば、低酸素状態により誘導されうるプロモーターを使用することができる。ウイルスプロモーターを使用することも可能であり、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス長末端反復（MMLV LTR）、ラウス肉腫ウイルス（RSV）LTRプロモーター、SV40プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（CMV）IEプロモーター、アデノウイルス、HSVプロモーター（例えば、HSV IEプロモーター）またはHPVプロモーター、特にHPV上流調節領域（URR）が挙げられる。ウイルスプロモーターは当技術分野において容易に入手可能である。
該ベクターは更に、真核ゲノム配列、好ましくは哺乳類ゲノム配列またはウイルスゲノム配列に相同な配列を含むポリヌクレオチドを与える該ポリヌクレオチドに隣接した配列を含みうる。これは、相同組換えによる真核細胞またはウイルスのゲノム内への本発明のポリヌクレオチドの導入を可能にする。特に、ウイルス配列に隣接した発現カセットを含むプラスミドベクターは、本発明のポリヌクレオチドを哺乳類細胞に運搬するのに適したウイルスベクターを製造するために使用することができる。相同組換えは、HIFヒドロキシラーゼをコードする細胞内の内因性配列を破壊したり突然変異させるためにも用いることができる。適当なウイルスベクターの他の具体例には、単純ヘルペスウイルスベクターおよびレトロウイルス、例えばレンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびHPVウイルスが含まれる。これらのウイルスを使用する遺伝子導入技術は当業者に公知である。レトロウイルスベクターは、例えば、該ポリヌクレオチドを宿主ゲノム内に安定に組み込むために使用することができる。これに対して、複製欠損型アデノウイルスベクターはエピソームのままであり、したがって、一過性発現を可能にする。
本発明はまた、本発明のHIFヒドロキシラーゼを発現するよう修飾された細胞を含む。そのような細胞は、一過性の又は好ましくは安定な高等真核細胞系、例えば哺乳類細胞、または例えばバキュロウイルス発現系を使用する昆虫細胞、下等真核細胞、例えば酵母または原核細胞が含まれる。本発明のポリペプチドをコードするベクターの挿入により修飾されうる細胞の個々の具体例には、哺乳類胸腺上皮細胞、繊維芽細胞、HEK293T、U20S、CHO、HeLa、BHK、3T3およびCOS細胞が含まれる。
本発明のポリペプチドは、トランスジェニック非ヒト動物、典型的には哺乳類、好ましくはげっ歯類、より好ましくはマウスの細胞内で発現させることができる。該動物は、より大きな動物、例えばブタまたはヒツジでありうる。本発明のポリペプチドを発現するトランスジェニック非ヒト動物は本発明の範囲に含まれる。本発明のポリペプチドの発現を抑制するよう設計されたアンチセンスRNA、siRNAまたはリボザイムを発現するトランスジェニック動物も含まれる。本発明のトランスジェニック動物は、破壊された又は突然変異した内因性HIFヒドロキシラーゼをコードする遺伝子を有しうる。例えば、内因性HIFヒドロキシラーゼが不活性にされヒドロキシラーゼ活性を欠いていることが可能である。
抗体
もう1つの態様においては、本発明はまた、本発明のポリペプチドに特異的な抗体に関する。そのような抗体は、例えば、免疫沈降技術を用いる精製、単離またはスクリーニングにおいて有用であり、更には、それ自体が治療剤として有用である。抗体は、本発明のポリペプチドの特異的エピトープに対して産生されうる。
抗体は、HIFヒドロキシラーゼ機能を損なわせるために使用することができる。抗体または他の化合物が「特異的に結合」するとは、それが、特異的なタンパク質には優先的に又は高い親和性で結合するが、他のタンパク質には実質的に結合しないか又は低い親和性でしか結合しない場合を意味する。抗体の特異的結合能を測定するための競合結合アッセイまたはラジオメトリックアッセイに関する種々のプロトコールが当技術分野でよく知られている（例えば、Maddoxら, J. Exp. Med. 158, 1211-1226, 1993を参照されたい）。そのようなイムノアッセイは、典型的には、特異的タンパク質とその抗体との複合体の形成、および複合体形成の測定を含む。
本発明の抗体は、ヒトポリペプチドに対する抗体またはそのフラグメントでありうる。本発明の目的においては、「抗体」なる語は、特に示さない限り、本発明のポリペプチドに結合するフラグメントを含む。そのようなフラグメントには、Fv、F(ab')およびF(ab')2フラグメントならびに一本鎖抗体が含まれる。さらに、該抗体およびそのフラグメントはキメラ抗体、CDRグラフト化抗体またはヒト化抗体でありうる。
抗体は、生物学的サンプル中の本発明のポリペプチドを検出するための方法において使用することができる。該方法は、
I 本発明の抗体を準備し、
II 抗体-抗原複合体の形成を可能にする条件下、生物学的サンプルを該抗体と共にインキュベートし、
III 該抗体を含む抗体-抗原複合体が形成したかどうかを判定する、
ことを含む。
サンプルは、例えば、組織抽出物、血液、血清および唾液でありうる。本発明の抗体は、固相支持体に結合させたり、および／または、適当な試薬、対照物質、説明書などと共に適当な容器内のキットにパッケージングすることが可能である。抗体は表示用標識と結合させることが可能であり、したがって、in vivo HIFヒドロキシラーゼイメージングの方法で使用するのに適している。
本発明の抗体は任意の適当な方法により製造することができる。抗体を製造し特徴づけるための手段は当技術分野においてよく知られており、例えば、HarlowおよびLane (1988) “Antibodies: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.を参照されたい。例えば、抗体は、全ポリペプチドまたはその断片、例えばその抗原エピトープ（以下、「免疫原」と称される）に対する抗体を宿主動物において産生させることにより製造することができる。
ポリクローナル抗体の製造方法は、適当な宿主動物（例えば、実験動物）を免疫原で免疫し、該動物の血清から免疫グロブリンを単離することを含む。したがって、該動物に免疫原を接種し、ついで該動物から血液を取り出し、IgG画分を精製することができる。
モノクローナル抗体の製造方法は、所望の抗体を産生する細胞を不死化することを含む。ハイブリドーマ細胞は、接種された実験動物からの脾細胞を腫瘍細胞と融合することにより製造することができる（KohlerおよびMilstein (1975) Nature 256, 495-497）。
所望の抗体を産生する不死化細胞は、通常の方法により選択することができる。該ハイブリドーマを培養下で増殖させるか、あるいは腹水の形成のために腹腔内に又は同種異系宿主もしくは免疫無防備状態の宿主の血流内に注射する。ヒト抗体は、ヒトリンパ球のin vitro免疫およびそれに続くエプスタイン・バーウイルスでの該リンパ球の形質転換により、ならびにヒト抗体を産生しうるトランスジェニックマウスにおいて製造することができる。
モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の両方の製造のための実験動物としては、ヤギ、ウサギ、ラットまたはマウスが適している。所望により、免疫原が例えばアミノ酸残基の1つの側鎖を介して適当な担体に結合しているコンジュゲートとして、免疫原を投与することができる。該担体分子は、典型的には、生理的に許容される担体である。該免疫原は、例えば、アジュバントと共に投与することができる。得られた抗体を単離し、所望により精製することができる。
アッセイ
本発明者らのデータは、HIF-αのヒドロキシル化が、HIF-αに対する特異性または選択性を有するヒドロキシラーゼ酵素により媒介されることを示している。その関与する酵素はHIFヒドロキシラーゼと称され、EGL-9ならびにPHD 1、2および3を含む。HIFヒドロキシラーゼ、特にヒトHIFヒドロキシラーゼの作用は、HIFαの制御のための新規標的に相当する。HIFヒドロキシラーゼ活性を遮断することにより、これはHIF-αのヒドロキシル化を減少させて細胞内のHIF-αの蓄積を招くであろう。そしてこれは、血管新生、赤血球生成、エネルギー代謝、炎症、血管運動機能を含みうる低酸素状態または虚血に対する全身性局所性防御の活性化を招き、アポトーシス／増殖応答にも影響を及ぼすであろう。
本発明者らは、HIFヒドロキシラーゼ活性、特にプロリルヒドロキシラーゼ活性のモジュレーターまたは細胞内のHIF-αレベルの調節に影響を及ぼし、従ってHIF媒介活性に影響を及ぼすモジュレーターを同定するために実施しうる多種多様なアッセイを後記で更に詳しく説明する。これらのアッセイのいくつかは、HIFポリペプチドおよびVHLポリペプチド、特に本発明のHIFヒドロキシラーゼを使用する。典型的には、該アッセイは、ヒトHIFヒドロキシラーゼ、例えばPHD 1、2もしくは3、またはヒトHIFヒドロキシラーゼの断片もしくは変異体を使用する。好ましい実施形態においては、HIFプロリルヒドロキシラーゼ活性を有する酵素を使用することができる。これらの成分については、後記で更に詳しく説明する。これらの成分のそれぞれは、必要に応じて、精製または未精製形態、例えば細胞抽出物として、あるいはそのような抽出物からの関連成分の精製により提供されうる。あるいは、該関連成分を、組換え発現技術を用いて発現させ、該アッセイでの使用のために精製することができる。あるいは、該成分を、細胞に基づくアッセイでの使用のために細胞内で組換え的に発現させることができる。
典型的には、該関連成分をコードするポリヌクレオチドは発現ベクター中に含有された形態で提供される。そのような発現ベクターは当技術分野において常套的に構築され、例えば、プラスミドDNAと、完全なタンパク質発現を可能にするために必要となることがあり正しい配向で配置される適当なイニシエーター、プロモーター、エンハンサーおよび他のエレメント、例えばポリアデニル化シグナルとの使用を伴いうる。適当なベクターは当業者に明らかであり、例えば、HIFヒドロキシラーゼに関して本明細書中に詳しく説明されているものが挙げられる。プロモーター配列は、選択したアッセイ形式に応じて、誘導的または構成的プロモーターでありうる。該プロモーターは組織特異的であってもよい。発現ベクター中で使用するプロモーターおよび他のフランキング配列の具体例は、本発明のHIFヒドロキシラーゼ、特に本発明のヒトヒドロキシラーゼに関して本明細書中に詳しく説明されている。
HIFポリペプチドおよびペプチド類似体
本発明のアッセイにおいては、HIFヒドロキシラーゼの基質、特に該酵素のプロリル含有基質を使用することができる。特に、そのような基質は、HIFヒドロキシラーゼ活性のモジュレーターの活性をモニターするためのアッセイにおいて使用することができる。該基質はHIFポリペプチドまたはそのペプチド類似体でありうる。典型的には、HIFポリペプチドを該基質として使用する。
残基、好ましくはプロリン残基が配列番号2、4、6または8のHIFヒドロキシラーゼによりヒドロキシル化される任意の適当な基質、特に配列番号2、4または6のHIFヒドロキシラーゼによりヒドロキシル化される基質を使用することが可能である。本発明の好ましい実施形態においては、そのような基質は、HIFポリペプチド、例えばHIF-1αもしくはHIF-2αサブユニットタンパク質、またはそれらのいずれかの断片、または該サブユニットもしくは断片のペプチド類似体である。好ましくは、HIF-αペプチドは、酸素調節応答（酸素により調節される応答）を伝達する。より好ましくは、HIF-αペプチドはpVHLへの酸素調節結合の能力を有する。好ましくは、そのようなHIFポリペプチド、断片またはペプチド類似体は、HIF-1αに基づき定義されるPro 564および／またはPro 402と同等のプロリン残基を含む。HIF-1αのPro 564および／またはPro 402と同等のプロリンは、最良の配列アラインメントが得られるようHIF変異体、断片または類似体をHIF-1αの配列に対して整列させ、それにより、HIF-1αのPro 564および／またはPro 402と同等のプロリンを同定することにより決定することができる。本発明のアッセイにおいては、これらのプロリンの一方または両方のヒドロキシル化を確認することができる。
HIFポリペプチドは、真核生物由来、特にヒトまたは他の哺乳類のHIF-αサブユニットタンパク質またはその断片でありうる。あるいは、該ポリペプチドはシー・エレガンス（C. elegans）由来でありうる。HIF-αとVHLとの相互作用およびそれに続くVHLによるHIF-αの破壊を介してHIF-αのヒドロキシル化をモニターするアッセイにおいては、HIFポリペプチドは野生型完全長pVHLタンパク質に結合する能力を有しており、該結合は、酸素正常状態の細胞環境中で、HIF-αサブユニットを破壊へと導きうる。すなわち、該ポリペプチドはpVHL結合ドメインを含む。
いくつかのHIFαサブユニットタンパク質がクローニングされている。これらには、HIF-1α（その配列はGenbank登録番号U22431として入手可能である）、HIF-2α（Genbank登録番号U81984として入手可能である）およびHIF-3α（Genbank登録番号AC007193およびAC079154として入手可能である）が含まれる。これらはすべて、ヒトHIFαサブユニットタンパク質であり、すべて、本発明において使用することができる。他の種に由来するHIF-αサブユニットタンパク質、例えば、マウスHIF-1α（登録番号AF003695、U59496およびX95580）、ラットHIF-1α（登録番号Y09507）、マウスHIF-2α（登録番号U81983およびD89787）およびマウスHIF-2α（登録番号AF060194）も、本発明において使用することができる。他の哺乳類、脊椎動物、無脊椎動物または他のホモログは、pVHLホモログを得るための前記方法に類似した技術により得ることができる。
特に関心が持たれる1つのHIF-αタンパク質はシー・エレガンス（C. elegans）HIF-αサブユニットタンパク質である。調節のHIF-α/VHL系はシー・エレガンス（C. elegans）において保存されており、したがって、シー・エレガンス（C. elegans）系は、本発明のアッセイにおいて使用することができる。
それらの2つのHIF-1αサブユニットタンパク質において見出される多数の共通の構造的特徴が、現在までに同定されている。これらの特徴の幾つかはO'Rourkeら（1999, J. Biol. Chem., 274; 2060-2071）により同定されており、HIF-1αサブユニットタンパク質のトランス活性化機能に関与している可能性がある。これらの共通の構造的特徴の1以上はHIFポリペプチドの好ましい特徴である。
HIF-1αまたはペプチド類似体の断片は、好ましくは、プロリン残基402および／または564（U22431）（これらはHIFプロリルヒドロキシラーゼによりヒドロキシル化される）を含む。適当な断片は、残基344-698、特に残基364-678、より厳密には残基364-638または384-638、さらに厳密には残基364-598または394-598を含みうる又はそれらよりなりうる。他の適当な断片は、残基549-652、より一層厳密には、VHLタンパク質と相互作用するそのN末端領域を含みうる又はそれよりなりうる。C末端断片は、残基549-582、特に556-574を含みうる。他の適当な断片は、残基344-417、より好ましくは380-417を含みうる又はそれらよりなりうる。そのような領域、または他のHIF-αサブユニットタンパク質中のその等価体は、望ましくは、本明細書に記載のHIFαポリペプチド中に存在する。本発明のアッセイにおいて使用する基質は、典型的には、ヒトHIF-1α配列の残基549-582を含みうる。
前記HIF-1αサブユニットの変異体を使用することが可能であり、それらには、例えば、天然に存在するHIF-1αサブユニットに対して（特にヒトHIF-αサブユニット、例えばHIF-1αに対して）少なくとも45％のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、95％または98％の同一性を有する合成変異体が挙げられる。そのような変異体は、HIFヒドロキシラーゼに関して前記したとおりの置換または修飾を含みうる。アミノ酸活性も、HIFヒドロキシラーゼに関して前記したとおりに算出することが可能である。
HIF断片は非ペプチジル官能基を含むことも可能であり、同一性のレベルが低下するよう該HIF断片をアッセイ目的に最適化させることが可能である。そのような官能基は、糖のように共有結合型であったり、あるいは金属イオンのように非共有結合型でありうる。
本明細書に記載のHIFαポリペプチドは、前記のHIF-αサブユニットタンパク質または変異体の断片でありうる。ただし、該断片は、野生型pVHL、好ましくは野生型ヒトpVHLと相互作用する能力を保有していなければならない。タンパク質性アミノ酸残基を使用する場合には、そのような断片は、望ましくは、少なくとも20、好ましくは少なくとも40、50、75、100、200、250または400アミノ酸のサイズを有する。望ましくは、そのような断片は、プロリン残基402および／または564を含む。いくつかの好ましい断片は、ヒトHIF-1α中に見出される領域556-574、または他のHIF-1αサブユニットタンパク質中のその同等領域、例えばHIF-2αの517-542を含む。場合によっては、該断片はまた、トランス活性化を引き起こすタンパク質のドメインの1以上を含む。HIF-1αポリペプチドまたはHIF-αサブユニットタンパク質に対する本明細書中の言及は、前後関係と明らかに矛盾しない限り、前記の突然変異体および断片、またはVHLタンパク質に機能的に結合しうる他のHIF-α断片を含む。
本発明の、細胞に基づくアッセイは、内因性HIF-αのアップレギュレーションまたは組換え技術によるHIF-α（特にHIF-1α）の発現を含みうる。
VHL
本発明の幾つかのアッセイでは、VHLを使用し、特に、ヒドロキシル化HIFとVHLとの相互作用およびそれに続くHIF-αの破壊をモニターする。VHLは任意の適当な哺乳類VHL、特にヒトVHLでありうる。それはシー・エレガンス（C. elegans）VHLであってもよい。ヒトVHLは既にクローニングされており、該遺伝子源は当業者により容易に同定されうる。その配列はGenbank登録番号AF010238およびL15409として入手可能である。他の哺乳類VHL、例えば、マウスVHL（登録番号U12570）およびラットVHL（登録番号U14746およびS80345）も入手可能である。非哺乳類ホモログには、シー・エレガンス（C. elegans）のVHL様タンパク質（登録番号F08G12.4）が含まれる。VHL遺伝子配列は、通常のクローニング技術によっても得ることが可能であり、例えば、ヒトVHL遺伝子配列の全部または一部をプローブとして使用して、他の種におけるVHL遺伝子の配列を回収し決定することにより得ることができる。このためには多種多様な技術が利用可能であり、例えば、適当なmRNA源（例えば、胚または肝細胞）を使用し、哺乳動物、脊椎動物、無脊椎動物または他の起源に由来するcDNAライブラリー（例えば、前記起源の1つからcDNAライブラリー）を得、ストリンジェントな条件下で該ライブラリーを本発明のポリヌクレオチドでプローブし、その哺乳動物のVHLタンパク質の全部または一部をコードするcDNAを回収する、該遺伝子のクローニングおよびPCR増幅が挙げられる。適当なストリンジェントな条件は、固相支持体（フィルター）上でのハイブリダイゼーション、50％ ホルムアミド、5×SSC（750mM NaCl、75mM クエン酸ナトリウム）、50mM リン酸ナトリウム（pH7.6）、5×デンハルト液、10％ デキストラン硫酸および20μg/ml サケ精子DNAを含有する溶液中、42℃で一晩のインキュベーション、およびそれに続く、0.2×SSC中、約50℃〜約60℃での洗浄を含む。部分cDNAが得られる場合には、プライマー伸長技術により完全長コード配列を決定することができる。
もう1つのアプローチは、前記で同定された配列をクエリー配列として使用して、相同遺伝子配列または部分遺伝子配列（特にEST）に関してデータベースを検索するものである。同定されたマッチを調べ、実際の又は推定上のVHL配列が見出された場合には、例えば、該マッチの配列に基づくPCRおよびRACE-PCRを用いる物理的クローニングにより該遺伝子を回収することができる。
野生型VHLが好ましいが、HIF-αサブユニットと直接的に相互作用する能力を尚も保有するVHLの突然変異体および変異体も使用することができる。VHL突然変異体の具体例は当技術分野でよく知られており、エロンガン（Elongin）C相互作用インターフェース（interacting interface）への変化を有するStebbinsら（Science, 1999, 284; 55-61）により記載されている突然変異体を含む。
突然変異体および他の変異体は、一般には、野生型哺乳類VHLに基づくものであり、野生型哺乳類VHL（好ましくはヒトVHL）に対して望ましくは少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、90％、95％または更には98％相同であるアミノ酸同一性を有する。
本発明のアッセイに全VHLタンパク質（その突然変異体および他の変異体を含む）を使用することは、必ずしも必要でない。VHLの断片がHIFαサブユニットの標的ドメインと相互作用する能力を保有する限り、そのような断片を使用することが可能である。所望により、該断片は、エロンガンC相互作用インターフェースドメインを含みうる。VHLの断片は、当業者に公知の任意の適当な方法により作製することができる。適当な方法には、VHLをコードするDNAの断片の組換え発現が含まれるが、これらに限定されるものではない。そのような断片を作製するには、VHLをコードするDNAを得、発現される部分の両側の適当な制限酵素認識部位を同定し、該部分を該DNAから切り出す。ついで該部分を、標準的な商業的に入手可能な発現系内の適当なプロモーターに、機能しうる形で連結する。もう1つの組換えアプローチは、該DNAの関連部分を適当なPCRプライマーで増幅するものである。小さなVHL断片（約20〜30アミノ酸まで）は、当技術分野でよく知られたペプチド合成法によっても作製することができる。一般に、断片は、少なくとも40、好ましくは少なくとも50、60、70、80または100アミノ酸のサイズである。
特に好ましい断片は、213アミノ酸のヒトVHLタンパク質の断片63-156内に位置するβドメインまたは他の変異体中の同等ドメインに基づく断片を含む。好ましい実施形態においては、そのようなドメインは、ヒトVHLの64-156断片に対して少なくとも70％、好ましくは80％、90％、95％または更には98％の配列同一性を有する。この領域の及びその変異体の断片を使用することが可能である。これらの断片は15〜80アミノ酸長、例えば20〜80、例えば30〜60アミノ酸長でありうる。断片は、ヒトVHLの領域71-90もしくは90-109または前記変異体中のそれらの等価体を含みうる。望ましくは、該βドメインの野生型配列が保有されている。
使用しうる1つの断片は、該タンパク質の最大53個のN末端残基（例えば、1個からn個まで、ここでnは2〜53の整数である）が欠失しており、残部が野生型であるものである。
適当な断片がHIFαサブユニット（またはその断片）に結合する能力は、インタクトなVHLに関して本明細書中の実施例に記載されているような通常の方法を用いて試験することができる。前後関係と明らかに矛盾しない限り、VHLタンパク質への本明細書での言及には、HIFαサブユニットに機能的に結合しうる前記の突然変異体および断片が含まれる。
ヒドロキシラーゼ
本発明のアッセイの幾つかにおいては、ヒドロキシラーゼ酵素を準備する。好ましい実施形態においては、該ヒドロキシラーゼ酵素は本発明のHIFヒドロキシラーゼである。該酵素は、好ましくは、プロリルヒドロキシラーゼである。本発明の特に好ましい実施形態においては、使用するHIFヒドロキシラーゼは、
（a）配列番号2、4、6または8のアミノ酸配列、
（b）配列番号2、4、6または8のアミノ酸配列に対して少なくとも60％の同一性を有しかつHIFヒドロキシラーゼ活性を有するその変異体、または
（c）HIFヒドロキシラーゼ活性を有するそれらのいずれかの断片、
を含む。
そのようなヒドロキシラーゼ酵素、特にプロリル-ヒドロキシラーゼ、例えば4-プロリルヒドロキシラーゼは、HeLa、RCCまたはCHO-K1細胞のような培養下の不死化哺乳類細胞を含む哺乳類細胞の抽出物、初代細胞、組織または初代細胞溶解物（例えば、ウサギ網状赤血球またはヒト胎盤溶解物）から入手可能である。細胞抽出物は、本明細書中の実施例を参考にして当技術分野において利用可能な標準的な技術により調製することができる。あるいは、アッセイは、ヒドロキシラーゼ酵素が内因的に発現される細胞に基づくアッセイとして行うことができる。
本発明のアッセイのいずれかの好ましい実施形態においては、該アッセイは、本発明のHIFヒドロキシラーゼ、典型的にはヒトHIFヒドロキシラーゼ、特にPHDヒドロキシラーゼを使用する。アッセイの前または経過中に、そのようなヒドロキシラーゼをアップレギュレーションすることが可能である。あるいは、該酵素を組換え的に発現させて、そのような組換え発現系から本発明のHIFヒドロキシラーゼを精製または未精製形態で単離して該アッセイにおいて使用することが可能である。あるいは、本発明のHIFヒドロキシラーゼを発現する発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた細胞を準備することが可能である。そのような方法は、HIFヒドロキシラーゼの個々の活性を特異的または普遍的に抑制、促進またはモジュレーションする物質に関するアッセイを提供する。該方法は、HIFヒドロキシラーゼ群（例えば、PHD 1、2および3の全て、またはそれらの3つの酵素のうちのいずれか2つ）の活性を抑制、促進またはモジュレーションする物質を同定するためにも用いることができる。
本発明のアッセイは、EGLNポリペプチド、例えば、EGLN1（gil457146）、EGLN2（gil457148）、EGLN3（gil4547150）、FLJ21620（BAB15101）またはClorf12（NP071334）を使用することができる。
一般に、本発明のHIFヒドロキシラーゼは鉄依存性である。すなわち、それらは、典型的には、活性のために第一鉄（FeII）イオンを必要とする。したがって、本発明のアッセイの目的が第一鉄イオンの非存在の効果を判定するためのものでない限り、また、第一鉄イオンが存在しない対照反応を実施することが望ましい場合でない限り、本発明のアッセイは、典型的には、第一鉄化合物を含むであろう。
アッセイ方法
本発明は、低酸素誘導因子（HIF）ヒドロキシラーゼと該ヒドロキシラーゼの基質との相互作用をモジュレーションする物質を同定するためのアッセイ方法であって、
・HIFヒドロキシラーゼが試験物質の非存在下で該基質と相互作用する条件下、該ヒドロキシラーゼの基質の存在下でHIFヒドロキシラーゼと試験物質とを接触させ、
・該ヒドロキシラーゼと該基質との相互作用、または相互作用の欠如を確認する、
ことを含んでなるアッセイ方法を提供する。該ヒドロキシラーゼと該基質との相互作用は、該ヒドロキシラーゼのヒドロキシラーゼ活性を測定することにより確認することができる。
ヒドロキシラーゼと基質との相互作用は物理的相互作用または機能的相互作用を意味する。したがって、該相互作用は、基質への該ヒドロキシラーゼの結合、該基質に対する該ヒドロキシラーゼの活性、あるいは該基質に対する該ヒドロキシラーゼの作用に関連した任意の活性、例えば、該ヒドロキシル化反応において使用または産生された補因子または副産物のレベル、あるいは該基質のヒドロキシル化により媒介される下流効果などの任意の適当な方法により測定することができる。
本発明のもう1つの態様においては、HIF-αまたはそのペプチド類似体を準備し、試験物質の非存在下でHIF-αのヒドロキシル化を可能にする条件下、HIF-αまたは該ペプチド類似体を該試験物質と共にインキュベートし、HIF-αのヒドロキシル化をモニターすることを含んでなる、HIF-αの破壊またはHIF-αの転写不活性化のインヒビターに関するアッセイを提供する。好ましくは、HIF-αまたはそのペプチド類似体は、HIF-αのPro564および／またはPro402のようなプロリル残基またはペプチド類似体中の同等のプロリルを含み、該アッセイは、該試験物質の非存在下でのPro564および／またはPro402のヒドロキシル化およびPro564および／またはPro402のヒドロキシル化のモニターを可能にする条件下で行う。
もう1つの態様においては、
・HIF-α VHL結合ドメイン中のプロリン残基のヒドロキシル化に適した条件下、HIF-α、またはVHL結合部分を含むその断片を、その同族（cognate）プロリル-ヒドロキシラーゼと共に供給し、
・ヒドロキシル化の推定モジュレーターを供給し、
・該プロリン残基のヒドロキシル化の量が該推定モジュレーターによりモジュレーションされたかどうかを判定する、
ことを含んでなる、VHLにより媒介されるHIF-α破壊のインヒビターに関するアッセイを提供する。本発明の1つの実施形態においては、該同族プロリル-ヒドロキシラーゼはプロリル-4-ヒドロキシラーゼである。
逆に、腫瘍において一般に見出されるような低酸素状態では、HIFのヒドロキシル化、特にプロリンのヒドロキシル化の欠如が、HIFαの蓄積、およびそれに伴う、血管新生および他の増殖促進事象の促進を招きうる。あるいは、正常レベルのHIF活性が存在する虚血／低酸素状態においては、既存のHIF活性を増加させることも望ましいかもしれない。したがって、HIFヒドロキシラーゼをアップレギュレーションする、またはHIFヒドロキシラーゼの活性を増加させる、または該ヒドロキシラーゼをレスキューもしくは迂回するメカニズムが、そのような細胞における標的となる。
本発明はまた、HIF-αのヒドロキシル化、例えばPro564および／またはPro402のプロリルヒドロキシル化の促進物質（プロモーター）に関するアッセイであって、HIF-αまたはペプチド類似体を準備し、試験物質の非存在下ではHIF-αのヒドロキシル化が生じない低酸素条件下、HIF-αまたは該ペプチド類似体をインキュベートし、Pro564および／またはPro402のようなHIF-αまたはそのペプチド類似体のヒドロキシル化をモニターすることを含んでなるアッセイを提供する。
したがって、
・低酸素条件下、HIF-α、またはVHL結合部分を含むその断片（ただし、該HIF-αまたはその断片はVHL結合ドメイン中にプロリン残基を含有する）を供給し、
・推定ヒドロキシル化促進物質を供給し、
・該物質が該プロリンのヒドロキシル化を引き起こすかどうかを判定する、
ことを含んでなる、HIF-α中のプロリン残基のヒドロキシル化の促進物質（プロモーター）に関するアッセイを提供する。
本明細書に記載の実験において、HIFヒドロキシラーゼ、特にPHDポリペプチドは、pVHL結合ドメイン内の1個以上のプロリン残基においてHIF-αをヒドロキシル化することが判明した。このヒドロキシル化はpVHL結合を媒介する。したがって、本発明は、HIFヒドロキシラーゼ活性のモジュレーターに関するアッセイであって、HIFヒドロキシラーゼと該ヒドロキシラーゼの基質（好ましくはプロリル含有基質）とを試験物質の存在下で接触させ、該HIFヒドロキシラーゼ（特に、そのプロリルヒドロキシラーゼ）のヒドロキシラーゼ活性を測定することを含んでなるアッセイを提供する。
そのようなアッセイは、HIFヒドロキシラーゼ活性のインヒビターを同定するために用いることが可能であり、したがって、好ましくは、ヒドロキシル化、特にプロリルヒドロキシル化が該試験物質の非存在下で生じる条件下で行われる。あるいは、該アッセイは、例えば、試験物質の非存在下で行うアッセイと比較して増加したプロリン基質のヒドロキシル化を探索することにより、ヒドロキシラーゼ活性の促進物質を探索するために用いることができる。あるいは、該アッセイを、ヒドロキシル化が減少した又は存在しない条件下（例えば低酸素条件下）で行って、そのような条件下でのヒドロキシル化の存在または増加をモニターすることが可能である。
そのようなアッセイ方法は、特異的HIFヒドロキシラーゼポリペプチドを使用しているため、そのポリペプチドの活性のインヒビターまたは促進物質（プロモーター）に特異的でありうる。また、そのHIFヒドロキシラーゼに特異的であるが、異なるHIFヒドロキシラーゼに対しては活性でないか又はそれほど活性ではないインヒビターまたはアクチベーターを規定するために、該アッセイ方法を比較として用いることが可能である。特に、そのようなアッセイは、PHD 1、2または3などの特定のヒトHIFヒドロキシラーゼに特異的なインヒビターまたはアクチベーターを同定するために用いることができる。
HIFヒドロキシラーゼの活性をモジュレーションする物質を得るためのアッセイ方法は、
・HIFヒドロキシラーゼポリペプチドとその基質（例えば、HIFαポリペプチド）とを試験物質の存在下で接触させ、
・該HIFヒドロキシラーゼのヒドロキシラーゼ活性（好ましくは、そのプロリルヒドロキシラーゼ活性またはHIF-αヒドロキシラーゼ活性）を測定することを含みうる。
1つの実施形態においては、該アッセイ方法は、EGLNポリペプチドの活性をモジュレーションする物質を得るためのものでありうる。該アッセイ方法は、
・EGLNポリペプチドがHIFポリペプチドのプロリルヒドロキシル化を正常に触媒する条件下、EGLNポリペプチドと試験物質とをHIFポリペプチドの存在下で接触させ、
・該EGLNポリペプチドのHIFプロリルヒドロキシル活性を測定することを含みうる。
そのようなアッセイは、HIFヒドロキシラーゼ／ELGNポリペプチドがHIFαポリペプチドのヒドロキシル化（特にプロリルヒドロキシル化）を通常に触媒する条件下で行うことができる。適当な条件としては、2-オキソグルタル酸、ジオキシゲンおよび好ましくはアスコルビン酸と第一鉄イオンの存在下、適当なバッファー（例えば、Tris.HClまたはMOPS）中でのpH 6.6〜8.5が挙げられる。
活性を最適化するために、ジチオトレイトールまたはトリス(カルボキシエチル)ホスフィンのような還元剤を存在させることも可能である。活性の最適化のためには、カタラーゼおよびタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのような他の酵素を使用することも可能である。タンパク質ジスルフィドイソメラーゼのような酵素は、精製または未精製形態で加えることができる。タンパク質ジスルフィドイソメラーゼの活性を促進または増強しうる更なる成分を加えることも可能である。
もう1つの実施形態においては、本発明は、EGLNポリペプチドとHIFポリペプチドとの相互作用をモジュレーションする物質を同定するためのアッセイ方法であって、
・EGLNポリペプチドがHIFポリペプチドと正常に相互作用する条件下、EGLNポリペプチドと試験化合物とをHIFポリペプチドの存在下で接触させ、
・該HIFポリペプチドと該EGLNポリペプチドとの相互作用を測定することを含んでなるアッセイ方法を提供する。
本発明はまた、HIFヒドロキシラーゼの同定、特に、HIFプロリルヒドロキシラーゼの同定のためのアッセイ方法を提供する。該方法は、典型的には、
（a）試験ポリペプチドを準備し、
（b）HIFポリペプチドがHIFヒドロキシラーゼによりヒドロキシル化される条件下、HIFポリペプチドと該試験ポリペプチドとを接触させ、
（c）HIFポリペプチドがヒドロキシル化されたかどうかを確認することを含む。
1つの実施形態においては、該アッセイ方法は、工程（b）において、HIFポリペプチドがPHD（EGLN）ポリペプチドによりヒドロキシル化される条件下でHIFポリペプチドと試験ポリペプチドとを接触させることが可能である。
典型的には、HIFヒドロキシラーゼを同定するために、試験ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングすることが可能であり、例えば、特定の種または組織由来の発現ライブラリー、あるいは特定の組合せの条件下で得られた発現ライブラリーをスクリーニングすることができる。あるいは、配列相同性のような基準または特定のタンパク質構造に基づいて同定された候補HIFヒドロキシラーゼを評価し、それらのヒドロキシラーゼ活性を確認することが可能である。
スクリーニングで使用するHIFポリペプチドは、本明細書に記載の任意のものでありうる。それはヒトHIFポリペプチド、または別の種由来のホモログ（例えば、ceHIF）でありうる。それは、試験ポリペプチドのライブラリーが誘導される種に由来するものでありうる。HIFポリペプチドのヒドロキシル化、特にプロリンのヒドロキシル化は、本明細書に記載の方法のいずれかにより確認することができる。例えば、ヒドロキシル化は、HIFポリペプチドに対する該ヒドロキシル化の影響（例えば、その安定性の低下）に基づく機能アッセイを用いて確認することができる。
HIFヒドロキシラーゼが同定されたら、例えば、それがオキサロリルグリシンの前駆体またはプロドラッグであるジメチルオキサロリルグリシン（DMOG）のような化合物により抑制されるかどうかを評価することにより、HIFヒドロキシラーゼを更に特徴づけることができる。HIFヒドロキシラーゼが同定された生物または組織において、HIFヒドロキシラーゼがHIFの安定性に及ぼす影響を評価することが可能である。同定されたヒドロキシラーゼは、本発明のその他のヒドロキシラーゼと同様に使用することができ、特に、本発明のアッセイおよび治療用途において使用することができる。
本発明はまた、本発明のHIFヒドロキシラーゼの別の基質を同定するためのアッセイ方法を提供する。したがって、ヒドロキシル化されうる（特にプロリン残基がヒドロキシル化されうる）ポリペプチドまたはポリペプチド類似体を同定することができる。該アッセイ方法は、典型的には、
（b）本発明のHIFヒドロキシラーゼによりHIFが正常にヒドロキシ化される条件下、試験ポリペプチドを該ヒドロキシラーゼと接触させ、
（c）該ポリペプチドがヒドロキシル化されるかどうかを判定することを含む。
典型的には、試験物質のヒドロキシル化、特にプロリルヒドロキシル化は、本明細書に記載の方法のいずれかを用いて確認することができる。
本発明はまた、本発明のHIFヒドロキシラーゼと特異的に相互作用しうる（特に、該酵素の通常の基質の結合を模倣する様式または該結合に類似した様式でHIFヒドロキシラーゼの活性部位に特異的に結合しうる）ポリペプチドまたはポリペプチド類似体を同定するためのアッセイ方法を提供する。該方法は、典型的には、
（a）HIFが本発明のヒドロキシラーゼに結合する条件下、試験ポリペプチドを該ヒドロキシラーゼと接触させ、
（b）該試験ポリペプチドまたは類似体が該ヒドロキシラーゼに結合するかどうかを判定することを含む。
該ヒドロキシラーゼへの試験ポリペプチドの結合は、本明細書に記載の技術のいずれかにより確認することができる。1つの実施形態においては、HIFヒドロキシラーゼへの該ポリペプチドの結合は、該試験ポリペプチドと該ヒドロキシラーゼとの共沈を調べることにより同定することができる。該ヒドロキシラーゼへのHIFの結合を抑制する該試験ポリペプチドの能力も利用することができる。
本発明のヒドロキシラーゼに特異的に結合しうると確認された別のポリペプチド基質およびポリペプチドは、本発明のアッセイ方法（例えば、モジュレーターを同定するためのアッセイ方法）において使用することができる。HIFと本発明のヒドロキシラーゼとの正常な相互作用を妨げうるポリペプチドは、治療用にも使用することができる。
また、本発明のアッセイは、同定された物質を修飾することを含みうる。該アッセイはまた、同定された物質を医薬組成物に製剤化することを含みうる。典型的には、そのような医薬組成物は、HIFのレベルまたは活性の増加または減少に関連した症状を治療するためのものでありうる。
モジュレーションのモニター方法
本発明のスクリーニングまたはアッセイ方法の精確なフォーマットは、通常の技量および知識を用いて当業者により種々に改変されうる。当業者は、適当な対照実験を追加的に行う必要性について十分に認識しているであろう。本発明のアッセイは、適当な基質のヒドロキシル化をモニターすること（特に、プロリルヒドロキシル化をモニターすること）、基質および補基質の利用をモニターすること、該酵素とその基質との間の予想産物の産生をモニターすることを含みうる。本発明のアッセイ方法はまた、系内の成分間の直接的相互作用に関してスクリーニングすることを含みうる。あるいは、VHLによるHIFの結合およびそれに続く破壊のような下流効果、系内のHIFのレベルの変化、ならびにHIF媒介転写のようなHIFにより媒介される下流効果に関して適当なレポーター構築物を使用してモニターすることにより、あるいはHIFにより直接的または間接的に調節されることが知られている遺伝子のアップレギュレーションまたは遺伝子の発現パターンの変化をモニターすることにより、アッセイを行うことが可能である。
ヒドロキシル化を測定するための種々の方法が当技術分野で公知であり、本明細書に記載され例示されている。基質または補基質の利用、産物の出現（例えば、ペプチドのヒドロキシル化）あるいはヒドロキシル化または非ヒドロキシル化産物により媒介される下流効果などによりHIFヒドロキシラーゼの活性を測定するためには、任意の適当な方法を用いることができる。
HIF-1αのPro564残基がプロリル-ヒドロキシラーゼによりヒドロキシル化されるという本発明者らの知見は、この過程のインヒビターまたは促進物質（プロモーター）をスクリーニングするように設計されたアッセイ方法の基礎をもたらす。HIF-1αまたはHIFポリペプチドもしくはその類似体のヒドロキシル化をモニターするためには、任意の適当な方法を用いることができる。関連プロリン残基または別の位置のヒドロキシル化を直接的にモニターするためにアッセイを行うことができる。あるいは、補因子および補基質の枯渇をモニターするためにアッセイを行うことができる。あるいは、そのようなアッセイは、例えば、HIFとVHLとの相互作用、HIFタンパク質のレベルまたはHIF媒介転写をモニターすることにより、HIFのヒドロキシル化の下流効果または実際にはHIFのヒドロキシル化の抑制をモニターするものでありうる。あるいは、HIF調節型プロモーターにより駆動されるレポーター遺伝子構築物を使用することが可能である。これらの酵素のHIFヒドロキシラーゼ活性、特にHIFプロリルヒドロキシラーゼ活性のエンハンサーを同定するためのアッセイも提供する。該アッセイは、ヒトHIFヒドロキシラーゼ、特にPHD 1、2または3のエンハンサーを同定するために用いることが可能である。そのようなエンハンサーは、HIFα活性を低下させるために使用することが可能である。
1つの実施形態においては、VHLにより媒介されるHIF-α破壊のインヒビターに関するアッセイを行うために、HIFヒドロキシラーゼの適当な基質が提供される。これは、HIF-α、またはVHL結合部分を含みかつPro564および／またはPro402残基を含むその断片でありうる。該基質は、Pro564および／またはPro402位でヒドロキシル化されなくてもよい。これは、合成ポリペプチド基質を供給することにより、あるいは細菌細胞、昆虫細胞もしくは哺乳類細胞またはin vitro転写・翻訳系においてHIF-αポリペプチドを産生させることにより達成されうる。あるいは、アッセイ中に最初は非ヒドロキシル化形態で基質が産生されるように、選択した時間経過にわたってアッセイを行うことができる。
基質、酵素および潜在的インヒビター化合物は、インヒビターの非存在下でPro564および／またはPro402のヒドロキシル化をもたらす条件下で一緒にインキュベートし、基質のヒドロキシル化を測定することによりインヒビターの効果を測定することができる。これは任意の適当な手段により行うことができる。小さなポリペプチド基質は回収して、マススペクトロメトリーやクロマトグラフィーのような物理的分析に付したり、あるいはVHLに結合して（またはVHLからレポーター分子を追い出し）破壊に向かわせる能力などの機能分析に付すことができる。そのような方法は当技術分野で公知であり、通常の技量および知識を用いて実施することができる。測定は定量的または定性的でありうる。どちらの場合も（特に後者の場合には）、定性的測定は、適当な対照（例えば、潜在的インヒビターの非存在下でインキュベートされる基質）と比較して行うことができる。
このようにして同定したインヒビター化合物は、本発明のポリペプチドに関して前記したとおりに回収し、製剤化することが可能である。
本発明のもう1つのアッセイは、HIF-αサブユニットのヒドロキシル化の促進物質（プロモーター）に関するものである。典型的には、HIF-αサブユニットまたはその一部を、前記のとおりに製造し、低酸素条件下でインキュベートする。「低酸素」とは、5％未満、好ましくは3％未満、より好ましくは1％未満、更に好ましくは0.5％未満、例えば0.1％未満のO2を意味する。HIF-αサブユニットは、前記のHIFヒドロキシラーゼを含む細胞抽出物と共に、所望により更に第一鉄イオン（FeII）源および／またはアスコルビン酸源の存在下でインキュベートする。適当な濃度の第一鉄イオンは1〜500μM、例えば25〜250μM、特に50〜200μMの範囲である。第一鉄イオンは、塩化第一鉄、硫酸第一鉄などの形で供給することができる。アスコルビン酸は、アスコルビン酸ナトリウムのような塩の形で、0.1〜10mM、例えば1〜5mMの範囲の濃度で供給することができる。もう1つの補因子はα-ケトグルタル酸であり、これも、0.1〜5mM、例えば1〜5mMの範囲の塩の形で供給することができる。
本発明のこの実施形態においては、基質を潜在的ヒドロキシル化促進物質の存在下でインキュベートし、Pro564および／またはPro402のヒドロキシル化を測定することにより該物質の効果を判定する。前記の本発明のその他の態様のアッセイの場合と同様、測定は定量的または定性的でありうる。いずれの場合も、適当な対照と比較して測定することが可能である。
検出可能な標識で一方のポリペプチドを標識し、固相支持体上に固定化されたもう一方のポリペプチドとそれを接触させることにより、それらのポリペプチド間の相互作用をin vitroで調べることができる。適当な検出可能な標識には、35S（これは、組換え的に産生されたペプチドおよびポリペプチド中に取り込まれうる）が含まれる。組換え的に産生されたペプチドおよびポリペプチドは、抗体による標識が可能なエピトープを含有する融合タンパク質としても発現させることができる。
融合タンパク質は、例えば、組換えタンパク質のN末端またはC末端に6個のヒスチジン残基を含みうる。そのようなヒスチジンタグは、ニッケルまたはコバルトの金属イオンを含有する市販のカラム（Clontech, Palo Alto, CA, USA）を使用して該タンパク質を精製するために使用することができる。これらのタグは、6個のヒスチジン残基に対する市販のモノクローナル抗体（Clontech, Palo Alto, CA, USA）を使用して該タンパク質を検出するためにも使用することができる。
固相支持体上に固定化されるタンパク質は、固相支持体に結合させたそのタンパク質に対する抗体を使用して又は自体公知の他の技術により固定化することができる。好ましいin vitro相互作用は、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）を含む融合タンパク質を利用しうる。これは、グルタチオンアガロースビーズ上に固定化することが可能である。前記のタイプのin vitroアッセイフォーマットにおいては、試験化合物が固定化GST-融合ポリペプチドに結合する標識ペプチドまたはポリペプチドの量を減少させる能力を測定することにより、該試験化合物をアッセイすることができる。これは、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動でグルタチオン-アガロースビーズを分画することにより測定することができる。あるいは、該ビーズを洗って未結合タンパク質を除去し、例えば、適当なシンチレーションカウンターで標識の存在量を計数することにより結合タンパク質の量を測定することができる。
したがって、本発明のアッセイは、VHLとHIFとの相互作用をモニターすることを含みうる。HIFとVHLとの相互作用はHIFのヒドロキシル化により媒介される。VHL-HIF相互作用はHIFのユビキチン化を招く。HIFとVHLとの相互作用を妨げる（特に、HIFのヒドロキシル化を妨げる）試験物質をモニターするためのアッセイは、HIFに関連した調節を用いる適当な方法でモニターすることができる。例えば、本発明の組換えHIFヒドロキシラーゼを使用するアッセイ系またはHIFヒドロキシラーゼの発現が細胞内でアップレギュレーションされるアッセイ系においては、細胞内のHIFのレベルをモニターすることで試験物質の効果をモニターすることができる。あるいは、HIFの存在によりアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされることが知られている遺伝子の転写および発現をモニターすることが可能であろう。特に、HIFにより調節される遺伝子のアップレギュレーションはプロリルヒドロキシル化の抑制を示し、一方、ダウンレギュレーションはプロリルヒドロキシル化の増強または促進を示すであろう。
別の実施形態においては、レポーター構築物が提供され、ここではHIFにより媒介されるプロモーターがレポーター遺伝子に機能しうる形で連結されている。適当なレポーター遺伝子（例えば、比色、蛍光測定、蛍光共鳴または分光測定アッセイで後に使用しうる酵素）はどれも使用することが可能であろう。
HIFヒドロキシラーゼは、以下の反応（式中、RはHIFαであり、ROHは単独でヒドロキシル化HIFαを示す）を触媒する2OG依存性オキシゲナーゼである。
Figure 0004590157
典型的には、ヒドロキシル化はプロリルヒドロキシル化である。ヒドロキシラーゼはHIF-αの2以上のヒドロキシル化を触媒することができる。
本明細書に記載のアッセイ方法においては、典型的には、HIFヒドロキシラーゼと該ヒドロキシラーゼの基質とを、2-オキソグルタル酸（2OG）のような補基質の存在下で接触させる。HIFヒドロキシラーゼのヒドロキシラーゼ活性は、補基質の代謝回転を測定することにより調べることができる。これは、ヒドロキシル化基質またはコハク酸のような反応生成物の存在および／または量を測定することにより行うことができる。生成物の量は、基質の量に対して求めることができる。典型的には、そのような実施形態において、基質はHIF-αポリペプチドであり、例えば、測定する生成物はヒドロキシル化HIF-αポリペプチドでありうる。
HIFαプロリルヒドロキシラーゼ活性は、Myllyharju J.ら EMBO J. 16 (6): 1173-1180 (1991)またはCunliffe C.J.ら Biochem. J. 240 617-619 (1986)に記載のとおり、2OGのコハク酸とCO2への代謝回転を測定することにより、あるいはCO2、ビカーボネート(bicarbonate)またはコハク酸の生成に関する他の適当なアッセイにより測定することができる。これらの方法は、本発明のアッセイにおいて、特に本発明のHIFヒドロキシラーゼのHIF-αプロリルヒドロキシラーゼ活性（ヒトHIFヒドロキシラーゼ、特に本発明のPHDまたはEGLNポリペプチドの活性を含む）を評価するために用いることができる。そのようなアッセイは、ハイスループットフォーマットに改変することが可能であり、本発明は、ヒドロキシラーゼ活性に関するそのようなハイスループットアッセイを含む。
あるいは、エンドポイント（end-point）測定は、HIFαまたはHIFα由来のペプチド断片が検出可能な生成物へ変換されることに基づくものでありうる。ペプチドを修飾してアッセイを促進することができ、こうして、アッセイを迅速に実施できるように、また、ハイスループットスクリーニングに適するようにすることができる。
例えば、本明細書中に例示する逆相HPLC（C-18オクタデシルシランカラム）を使用して、HIFヒドロキシラーゼの出発合成ペプチド基質をヒドロキシル化産物から分離することができる。なぜなら、後者はカラム内での保持時間が比較的短いからである。HIFヒドロキシラーゼ活性に関するこのアッセイまたは別のアッセイの改変は、例えば、当技術分野で公知の質量分光、分光および／または蛍光技法を用いるものでありうる（Masimirembwa C.ら Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening (2001) 4 (3) 245-263, Owicki J. (2000) J. Biomol. Screen. 5 (5) 297-305, Gershkovich Aら (1996) J. Biochem. & Biophys. Meths. 33 (3) 135-162, Kraaft G.ら (1994) Meths. Enzymol. 241 70-86）。蛍光技法は、分光アッセイまたは蛍光アッセイを実施し又は最適化するために修飾された基質の改変体を使用するものでありうる。
例えば、HIFαポリペプチドをビーズまたはプレートなどに固定化し、適当な残基のヒドロキシル化を検出することができるが、かかる検出には、プロリン402またはプロリン564のようなプロリン残基がヒドロキシル化されている場合には該残基がヒドロキシル化されていない場合とは異なる親和性でHIFαのpVHL結合ドメインに結合する抗体または他の結合分子を使用する。そのような抗体は、当技術分野でよく知られている標準的な技術により（例えば、ヒドロキシル化HIFαペプチドを使用して）得ることができる。
HIFαポリペプチドのヒドロキシル化形態と非ヒドロキシル化形態とを識別する分子の結合は、適当な標識の存在の判定を含みうる当業者に利用可能な任意の技術を用いて評価することができる。
HIFヒドロキシラーゼのインヒビター、特にHIFプロリルヒドロキシラーゼ（HPH）のインヒビターの活性に関してスクリーニングするためのアッセイは、コラーゲン生合成に関与するヒトプロリルヒドロキシラーゼ（CPH）について記載されているアッセイ（Cunliffeら, Biochemical J. 240 611-619 (1986); Cunliffe CJら, Biochem. J. 239 311-315 (1986), Franklin TJおよびHitchen M Biochem. J. 261: 127- 130 (1989) Franklin TJら, Biochemical Society Transactions 19 (4): 812-815 (1991)）と同様に行うことができる。
HIFヒドロキシラーゼポリペプチドのHIFプロリル-ヒドロキシラーゼ活性は、使用するHIFヒドロキシラーゼの基質（これは典型的にはHIFαポリペプチドである）の1個以上のプロリン残基のヒドロキシル化、好ましくは、HIF-αポリペプチドのpVHL結合ドメイン内の1個以上のプロリン残基（例えば、プロリン402および／またはプロリン564）のヒドロキシル化を測定することにより調べることができる。便宜上、これらのプロリン残基は本明細書ではPro402およびPro564、または402位および564位と称される。この用語は、564個よりはるかに少ない残基を含有するポリペプチド、および若干異なる位置に同等のプロリン残基が存在する他のHIF-αアイソフォームにも適用されることが理解されよう。
本発明のアッセイ方法は、in vivoアッセイの形を採ることもできる。in vivoアッセイは酵母株のような細胞系において行うことができ、その際には該細胞内に導入された1以上のベクターから関連ポリペプチドまたはペプチドが発現される。
シー・エレガンス（C. elegans）アッセイ系
HIF-VHL相互作用がシー・エレガンス（C. elegans）において保存されているという本発明者らの知見は、in vivo環境における該相互作用およびその結果を研究するための系を提供するものである。
したがって、もう1つの態様においては、本発明は、HIF-VHL相互作用のモジュレーターに関するアッセイを提供し、該アッセイは、
・酸素正常状態または低酸素状態（低酸素状態は先に定義したとおりである）において野生型HIFおよびVHL遺伝子を有するシー・エレガンス（C. elegans）を準備し、
・該シー・エレガンス（C. elegans）をHIF-VHL相互作用の潜在的モジュレーターにさらし、
・該シー・エレガンス（C. elegans）において該モジュレーターがHIFとVHLとの相互作用を促進または軽減する度合を測定する、
ことを含んでなる。該測定は、HIF成分およびVHL成分の一方または他方を免疫沈降させ、ついで該免疫沈降タンパク質と会合したHIF成分およびVHL成分の他方の成分の量を、例えば抗体検出により、測定することを含みうる。それら2つのタンパク質のうちの一方の放射能標識は、捕捉されたVHLまたはHIFの量の測定を可能にしうる。あるいは、レポーター遺伝子をHIF応答性プロモーターに連結させ、対象シー・エレガンス（C. elegans）におけるHIFの量を、レポーター遺伝子産物（例えば、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、βガラクトシダーゼなど）の活性を測定することにより測定することが可能である。
本発明の別の態様においては、2-オキソグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼ（特に本発明のプロリルヒドロキシラーゼ）の供給源は本発明によるHIFヒドロキシラーゼである。そのようなポリペプチドは、前記HIFヒドロキシラーゼにおいて示差的（differential）効果を示す抑制性、促進性、遮断性または他の調節活性のアッセイを可能にするように、組換え系を使用して導入することができる。
in vivoアッセイ
かかるアッセイは、in vivoで実施される細胞に基づくアッセイ、器官に基づくアッセイまたは全動物体アッセイを用いて行うことができる。そのようなアッセイは、HIFヒドロキシラーゼヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの内因性発現を利用しうる。本発明の他の形態においては、特定の内因性HIFヒドロキシラーゼのアップレギュレーションを、その発現の刺激剤により達成することが可能である。そのような刺激剤は、特定のHIFヒドロキシラーゼをアップレギュレーションすることが知られている増殖因子（例えば血小板由来増殖因子またはアンジオテンシンII）または化学物質（例えばホルボールエステル）でありうる。本発明のもう1つの形態においては、1以上の特異的HIFヒドロキシラーゼの産生を増加させるために細胞またはトランスジェニック動物内にヌクレオチド構築物を導入することができる。あるいは、1以上の特異的HIFヒドロキシラーゼの発現を抑制または妨げるために細胞内にヌクレオチド構築物を導入することができる。相同組換え、アンチセンス発現、リボザイム発現およびRNA干渉を含む（これらに限定されるものではない）適当な方法は本明細書に概説されており、当業者に公知である。
本発明の前記形態により得られた組織培養細胞、器官、動物および他の生物系は、HIFヒドロキシラーゼの別の供給源を得るために、あるいは特定のHIFヒドロキシラーゼの活性を抑制、増強、遮断またはモジュレーションしうる試験物質の活性のアッセイ（特に比較アッセイ）のために、使用することができる。
HIFヒドロキシラーゼの活性は、前記方法のいずれかにより、あるいはin vivoで実施される細胞アッセイ、組織アッセイまたは他のアッセイ（HIFヒドロキシラーゼの改変された活性の効果を測定するもの）によりアッセイすることができる。これらのアッセイの好ましい形態は、PHDポリペプチドの基質であるHIF-αポリペプチドのレベルまたはHIF-αポリペプチドの活性のレベルを測定するものである。
HIF-αペプチドのレベルは、特異的抗体を使用する免疫ブロット法、免疫沈降法または他の免疫学的方法のような方法および当業者に公知の方法により測定することができる。HIFαペプチドの量および活性は互いに関連していることもあるが、必ずしも互いに関連しているわけではない。したがって、本発明のもう1つの形態においては、HIFヒドロキシラーゼの標的であるHIF-αペプチドの活性を、HIF-αポリペプチドの転写活性または別の特性を測定することによりアッセイする。
HIF-αポリペプチドは、他のHIFサブユニットおよびコアクチベーター分子（例えば、p300）を含む他の分子と複合体を形成することが公知である。この形態においては、HIF複合体が、HIF複合体により調節される内因性遺伝子のプロモーターおよび／またはエンハンサー中に見出される低酸素応答エレメントを活性化する。また、そのような低酸素応答エレメントを単離し、機能しうる形でレポーター遺伝子に連結して、該レポーター遺伝子またはその産物の検出および／または定量により該HIF複合体の活性をアッセイすることができる。したがって、本発明のもう1つの形態においては、対応するHIFヒドロキシラーゼにより調節されるHIF-αポリペプチドの活性は、HIF結合性低酸素応答エレメントに機能的に連結された内因性遺伝子またはレポーター遺伝子の発現に及ぼすHIF複合体の効果を測定することによりアッセイする。このようにして調節される内因性遺伝子の例は、遺伝子発現の低酸素誘導におけるアリール炭化水素核輸送体（ARNT）の役割において見出されるであろう。例えば、Studies in ARNT-deficient cells（ARNT欠損細胞における研究）, S.M. Wood, J.M. Gleadle, C.W. Pugh, O. Hankinson, P.J. Ratcliffe, Journal of Biological Chemistry 271 (1996) 15117-15123、およびHypoxia inducible expression of tumor-associated carbonic anhydrases（腫瘍関連カルボニックアンヒドラーゼの低酸素誘導発現）, C.C. Wykoff, N.J.P. Beasley, K.J. Turner, J. Pastorek, A. Sibtain. G.D. Wilson, H. Turley, K. Talks, P.H. Maxwell, C.W. Pugh, P.J. Ratcliffe, A.L. Harris, Cancer Research 60 (2000) 7075-7083を参照されたい。例として、グルコース輸送体アイソフォーム1、ホスホグリセリン酸キナーゼ-1、炭酸脱水酵素アイソフォーム9、血管内皮増殖因子が含まれるが、これらに限定されるものではない。前記遺伝子のそれぞれは1以上の低酸素応答エレメントを含有し、該低酸素応答エレメントを単離して、HIFヒドロキシラーゼの活性に応じて変化するHIF-αポリペプチドの活性を測定するためにレポーター遺伝子に機能しうる形で単一コピーまたは複数コピーとして連結させることが可能である。
HIFヒドロキシラーゼの活性に応じてHIF-αポリペプチドにより調節される遺伝子または遺伝子産物の活性は、なんらかの方法で細胞の、器官の及び動物の生理学に影響を及ぼし、これは本発明の更なる態様を提供する。したがって、本発明のもう1つの実施形態は、HIFヒドロキシラーゼの活性に応じたHIF-αポリペプチドの活性に従って調節される特定の機能的応答を利用するアッセイを提供する。そのような応答には、代謝されないグルコースまたはグルコース類似体の摂取率、血管新生による血管の内部成長、炭酸脱水酵素の活性が含まれる。細胞レベルまたは全身レベルで作用する多数の他の応答が、HIFヒドロキシラーゼの活性に応じたHIF-αポリペプチドの活性により制御され、本発明の更なる態様においてHIFヒドロキシラーゼ活性のアッセイとして利用可能であることは理解されよう。
HIFヒドロキシラーゼの基質であるHIF-αポリペプチドは、別のポリペプチドに融合させて、HIFヒドロキシラーゼの活性が該融合ペプチドの活性を調節するようにすることが可能である。したがって、本発明のもう1つの形態は、融合ポリペプチドの活性のアッセイを提供する。その好ましい形態においては、そのような融合ポリペプチドは、異種転写因子に連結されてその対応DNA応答エレメントと共に発現されるHIF-αポリペプチドの全部または一部、例えば、HIF-1α残基344-698、344-417、554-698、652-826または775-826を含有しうる。Gal結合性上流活性化配列（UAS）と共にアミノ酸1-143を含むGal4 DNA結合ドメインは、そのような転写因子と対応DNA応答エレメント（その機能は当業者によりアッセイしうる）の一例である。
好ましい実施形態においては、本明細書に記載のアッセイは、ヒトHIFヒドロキシラーゼ、特にPHD 1、2または3に関係し、あるいはそれらを利用するものである。これらはEGLNポリペプチドと称されることもある。
試験化合物
本明細書に記載のアッセイ方法を用いてスクリーニングしうる化合物は、薬物スクリーニング計画において使用される天然または合成化合物でありうる。特徴づけされている又は特徴づけされていない幾つかの成分を含有する植物、微生物または他の生物の抽出物を使用することも可能である。
コンビナトリアルライブラリー技術（固相合成および並列合成法を含む）は、潜在的に莫大な数の各種物質を、相互作用をモジュレーションする能力について試験する効率的な方法を提供する。そのようなライブラリーおよびそれらの使用は、とりわけ、天然物、小分子およびペプチドのすべての様式に関して当技術分野で公知である。ある状況においてはペプチドライブラリーの使用が好ましいかもしれない。
潜在的インヒビター化合物は、ポリペプチド、小分子、例えば市販のコンビナトリアルライブラリーに由来する分子などでありうる。使用可能な小分子化合物としては、該酵素の作用を抑制する2-オキソグルタル酸類似体、またはHIF-α類似体、または2-オキソグルタル酸とHIF-αの両方の特性を有するものが挙げられる。本発明者らは、特に、化合物ジメチル-オキサリルグリシン、N-オキサリルグリシンおよびN-オキサリル-2S-アラニンならびに特定のチオール類が全て、HIF-αヒドロキシラーゼのインヒビターとして作用することを見出した。N-オキサリル-2S-アラニンのエナンチオマーであるN-オキサリル-2R-アラニンもHIFヒドロキシラーゼのインヒビターであり、本発明において使用することができる。したがって、本発明は、血管新生のような細胞増殖の促進を必要とする患者の症状の治療用の医薬を製造するための、ヒドロキシラーゼインヒビター、特にプロリルヒドロキシラーゼインヒビターとして作用する化合物の使用を提供する。本発明はまた、細胞増殖を促進させることにより治療できる症状に罹患した患者の治療方法であって、HIFヒドロキシラーゼインヒビターの有効量を該患者に投与することを含んでなる治療方法を提供する。そのようなインヒビターには、ジメチル-オキサリルグリシン、N-オキサリルグリシンおよびN-オキサリル-2S-アラニンならびにそれらの塩が含まれる。より一般的には、そのようなインヒビターには、他のN-オキサリル-アミノ酸化合物およびその塩が含まれ、この場合、該アミノ酸は、インヒビターとして作用する化合物を与える側鎖を有する天然アミノ酸または合成アミノ酸である。そのような側鎖には、N、OまたはSのような1個または2個のヘテロ原子を有していてもよく、また、ハロゲン（特にフルオロ、クロロ、ブロモまたはヨード）、チオール、ヒドロキシ、メトキシ、アミノ、モノもしくはジ-C1-3アルキルアミノまたはニトロのような基で置換されていてもよい、直鎖状または分枝状でありうる炭素鎖を含有するヒドロカルビル側鎖が含まれる。塩には、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩などのような製薬上許容される塩が含まれる。
潜在的な促進物質は、多種多様な起源、特に、市販されている小さな化合物のライブラリーからスクリーニングすることができる。スクリーニングされる候補化合物には、酸素含有化合物、例えば2-オキソグルタル酸類似体が含まれうる。
CPHインヒビター
2-OG依存性酵素であるコラーゲンプロリルヒドロキシラーゼ（CPH）のインヒビターは当技術分野でよく知られており、肺線維症、皮膚線維症（強皮症）、アテローム性動脈硬化症、およびコラーゲン生合成に関連した他の症状の治療用として既に提示されている。パラヒドロキシフェニルピルビン酸オキシゲナーゼ（補因子として第一鉄イオンを利用する非ヘムオキシゲナーゼ）のインヒビター（例えばトリケトン類）が除草剤として使用されている（Lee D.ら (1998) Pestic. Sci. 54(4) 377-384）。
本発明者らは、今回、これらのCPHインヒビターの幾つかがHIFヒドロキシラーゼの生物活性、特に、HIFのプロリルヒドロキシル化を触媒するHIFヒドロキシラーゼの能力（HPH活性）をも抑制することを見出した。
したがって、本発明のもう1つの態様は、低い又は最適以下のHIFレベルまたは活性に関連した症状、例えば虚血、創傷治癒、自家、同種および異種移植、全身性高血圧、癌ならびに炎症性疾患の治療用の医薬の製造における、HIFヒドロキシラーゼの生物活性（特にHPH活性）を抑制するCPHインヒビターまたは改変インヒビターの使用を提供する。1つの実施形態においては、PHDポリペプチド（EGLNポリペプチド）のようなヒトHIFヒドロキシラーゼの生物活性を抑制するCPHインヒビターを使用することができる。
HIFヒドロキシラーゼ、特に、HIFヒドロキシラーゼのプロリルヒドロキシラーゼ活性（HPH活性）を抑制するCPHインヒビターは、HIFヒドロキシラーゼ、特にHPH活性の選択的インヒビターを生成するように改変することが可能である。さらに、この知見は、比較スクリーニングアッセイを用いることにより、HIFヒドロキシラーゼ（特にHPH）を抑制しないコラーゲンプロリルヒドロキシラーゼインヒビターの開発を可能にする。
したがって、本発明のもう1つの態様は、前記および後記のようなHIFレベルまたは活性の低下に関連した症状の治療用医薬の製造における、HIFヒドロキシラーゼのモジュレーターの使用を提供する。
そのようなモジュレーターは選択的インヒビターでありうる。選択的インヒビターは、コラーゲンプロリルヒドロキシラーゼを含む他の酵素に対してよりもHIFヒドロキシラーゼに対して大きなレベルの抑制を示すインヒビターである。特に、選択的インヒビターは、前記のようにCPH活性との対比においてHPH活性を抑制するものである。
HPHモジュレーター
HIFヒドロキシラーゼによるHIF-αのヒドロキシル化を抑制、促進、増強または刺激するモジュレーターの種々の方法および用途が、本発明の更なる態様において提供される。
HIFヒドロキシラーゼによるHIF-1αのヒドロキシル化の破壊、阻害またはモジュレーションの目的は、前記および後記のとおり、すべてHIFαにより媒介される血管新生、赤血球生成、エネルギー代謝、炎症、マトリックス代謝、血管運動機能およびアポトーシス／増殖応答ならびに虚血／低酸素状態に対する病態生理学応答のような細胞機能をモジュレーションすることにあろう。
HIF-αポリペプチドのヒドロキシル化を増強し、促進し、刺激し、破壊し、減弱し、阻害し又は完全に若しくは部分的に破壊しそれによりHIFのヒドロキシル化活性をモジュレーションしうる試験化合物は、本明細書に記載のアッセイ方法を用いて同定し及び／又は得ることができる。
HIFのヒドロキシル化（特にプロリルヒドロキシル化）を増強または促進する物質は、陽性試験結果を与える物質の非存在下でヒドロキシル化を制限または妨げる条件下で同定し及び／又は得ることができる。そのような物質は、HIFヒドロキシラーゼの機能を促進、増強、強化または刺激するために使用することが可能であり、腫瘍において見出されるような低酸素状態（この場合、ヒドロキシル化の欠如が、HIFαの蓄積、およびそれに伴う、血管新生および他の増殖促進事象の促進を招く）の細胞に影響を及ぼしうる。
「物質」なる語は、本明細書に記載の式I〜XXVIIIの1つを有する化合物、特に、表3に示す化合物を含む。
試験サンプル中のHIFヒドロキシラーゼの存在を判定し、所望によりそれを定量する方法は、診断または予後評価における目的、例えば、本明細書に記載の任意の医学的状態（例えば、癌のような増殖性疾患）の診断もしくは予後評価における目的、またはそのような状態を治療するための療法の評価における目的を有しうる。
種々の態様において、本発明は、本発明のスクリーニング方法によりHIFαのヒドロキシル化のモジュレーター（例えば、HIFヒドロキシラーゼのヒドロキシラーゼ活性を抑制または減弱、増強または促進する物質）であると同定された物質または化合物を提供する。
モジュレーターの同定後、該物質を精製しおよび／または更に研究し（例えば修飾し）および／または製造することが可能である。例えば当技術分野でよく知られた方法及び本明細書に記載の方法により、ペプチジルまたは非ペプチジル模擬体を得るために、モジュレーターを使用することができる。モジュレーターは、例えば、本明細書に記載の選択性を増加させるために修飾することが可能である。それは後記の治療的状況において使用することが可能である。
HIF-αのヒドロキシル化のモジュレーション、それにしたがうHIFの細胞内レベルのモジュレーションによってその細胞機能の1以上をモジュレーションするのに有用である本発明の物質は、HIFヒドロキシラーゼのヒドロキシラーゼ活性をモジュレーションしうる。そのような物質は、HIF-αの適当な残基をヒドロキシル化するHIFヒドロキシラーゼ（特にPHDポリペプチド）の能力を特異的に抑制しうる。前記のとおり、本発明は、HIF-αのヒドロキシル化のモジュレーションおよびそれによるHIF-αの機能をモジュレーションにする物質自体、およびその使用と共に、そのような物質に関するアッセイおよびスクリーニングを提供する。
HIFヒドロキシラーゼによるHIF-αのヒドロキシル化を抑制しうる物質には、該ヒドロキシラーゼの酵素活性部位の触媒特性に影響を及ぼしうる物質が含まれうる。ヒドロキシル化のインヒビターは、活性プロリルヒドロキシラーゼドメイン内、例えば本明細書に記載のHXD[X]nHまたはゼリーロールモチーフ内あるいはHXE[X]nHモチーフ内でHIFヒドロキシラーゼと相互作用しうる。このドメイン内の残基はHIF-αとの相互作用およびヒドロキシル化の触媒作用に関与する。インヒビターは、例えば、EGLN2/PHD1配列のHis358もしくはARG557（EGL9の番号付けにより示されている）または他のHIFヒドロキシラーゼの同等の残基と相互作用するか、あるいはPHD1配列のゼリーロールモチーフの残基369-389の領域内の残基または他のHIFヒドロキシラーゼの同等の残基と相互作用しうる。該ドメイン以外の残基もHIF-αとの相互作用に関与する可能性があり、そのような相互作用を妨げる物質も、本明細書に記載のヒドロキシル化に影響を及ぼしうる。その代わりに又はそれに加えて、該インヒビターはジオキシジェンの結合を抑制するように結合しうる。例えば、ジオキシジェン(dioxygen)は、HIF-α基質とは異なる方向から、特に、ゼリーロールモチーフの中心を通るトンネルを通ってHIFヒドロキシラーゼ中の鉄に接近すると理解される。インヒビターはこのトンネル内またはこのトンネルの入口の残基に結合しうる。
本発明の更なる態様は、細胞内のHIFポリペプチドの量をモジュレーションするための方法に関する。そのような方法は、HIFヒドロキシラーゼのヒドロキシラーゼ活性（特にそのプロリルヒドロキシラーゼ活性）を抑制する物質と該細胞とを接触させることを含みうる。
適当な物質は本明細書に記載の物質である。そのような方法においては、選択的HIFヒドロキシラーゼである物質を使用することができる。選択的HIFヒドロキシラーゼインヒビターは、本明細書に記載のとおり、HIFヒドロキシラーゼの生物活性を抑制するがコラーゲンプロリルヒドロキシラーゼの生物活性を抑制しないインヒビターであり、特に、HIFヒドロキシラーゼのHPH活性を抑制するがコラーゲンプロリルヒドロキシラーゼのCPH活性を抑制しないインヒビターである。
HPHモジュレーターの具体例
2OGオキシゲナーゼ、特にコラーゲン 4-プロリルヒドロキシラーゼをモジュレーションする化合物はHIFプロリルヒドロキシラーゼのモジュレーターとして有用でありうる。あるいは該化合物は、HIFプロリルヒドロキシラーゼのモジュレーター、特に選択的モジュレーターを開発するために修飾および／または最適化されうる「リード」化合物として使用することができる。
これらの化合物の幾つかは、一般には、式：
R1-A*B*C*D(R2)y (A)
（式中、R1は、触媒反応中に他の残基と共に2-オキソグルタル酸の5-カルボキシラートに結合するアルギニンの側鎖との静電的相互作用を引き起こしうる；A*Bは、独立して炭素、酸素、窒素または硫黄である2つの原子の鎖であり、該鎖は官能基化されていてもよい；yは0または1である；C*Dは、独立して炭素、酸素、窒素または硫黄である2つの原子の鎖であり、該鎖は官能基化されていてもよい；A、B、CおよびDは単結合および／または二重結合および／または三重結合により互いに連結されており、yが0または1である場合には、それらの原子の少なくとも1つは、金属基とキレート形成する能力を有し、yが1である場合には、該鎖は、金属基とキレート形成しうるR2に結合している）で表される。一般に、A、B、CおよびDの少なくとも1つは炭素以外である。典型的な鎖には、C-N-C-C、C-C-C=OおよびC-O-C-Cが含まれる。該鎖原子は、ピロリジンおよびテトラヒドロピラン、それらの不飽和誘導体、例えばピリジンおよびピラン、または部分水素化ピランのような環の一部を形成しうる。該環は縮合していてもよい。y=0である場合、Cおよび／またはDは、例えば、=S、=O、-SHまたは-OHに結合している。典型的には、R1は、カルボキシラート、-SO3H、-B(OH)2または-PO3H2のような酸基である。R2で表される典型的な基には、-SH、-OH、-CO2H、-SO3H、-B(OH)2または-PO3H2、-NHOH、-CONHR3、-CONHOR3、-CONR3OHおよび-CONR3OR3（ここで、R3は、官能基化されていてもよい炭素数1〜6の分枝状または直鎖状アルキル基である）が含まれる。好ましい化合物においては、2以上の基（例えば、すべての基）が、典型的な基を有するであろう。
HIFαヒドロキシラーゼの活性、特にそのプロリルヒドロキシラーゼ活性をモジュレーションすることが判明している化合物のクラスの1つとして、以下の一般式（I〜IV）の1つで表されるオキサロ誘導体（例えば、式V、VIまたはVIIの化合物）を含むオキサロアミノ酸誘導体が挙げられる。
Figure 0004590157
Figure 0004590157
［式中、R1およびRは、独立して、H、分枝状または直鎖状C1-C6アルキル鎖（特にメチル）（これは例えば-C2H4CO2C2H5のように官能基化されていてもよい）、任意の天然アミノ酸側鎖（例えばアラニン、バリンおよびグルタミン酸）、所望により1または2個のN、S、OまたはP原子を含有していてもよい4〜7員複素環、あるいは所望により1または2個のN、OまたはS原子を含有していてもよい5または6員芳香環（例えばフェニルまたはナフチル）（これは、もう1つの環と、又は前記芳香環により置換された前記アルキル鎖と縮合していてもよい）でありうる；
R2は、官能基化されていてもよいC1-C6アルキル鎖でありR2は(CR1R1)n（ここで、R1基は同一であっても異なっていてもよく、前記と同意義を有する）となるか、または存在しない；
Xは、NH、NR''（ここで、R''は、OH、官能基化されていてもよい分枝状または直鎖状C1-C6アルキル鎖）またはOである（すなわち、XRは、分枝状または直鎖状C1-C6アルキル鎖を有するO-アルキル、特にMeOであり、これは官能基化されていてもよい）；
Yは、OまたはSである］。
前記アルキル基および鎖は、典型的には、フッ素、アルコール、チオール、カルボン酸、ホスホン酸、ホスフィン酸、スルホン酸または他のキレート形成基により官能基化されており、鎖の場合には典型的にはアルキル基を介して官能基化されている。
式Iは更に、化合物IS3およびオキサリルグリシン（IS2）により例示され、式IIはオキサロイルアミノ-L-アラニンにより例示され、式IIIは表3中の化合物IS1およびジメチルオキサロイルグリシン（MMOG）ならびにメチルオキサリル-L-アラニンのメチルエステル（IS80）、メチルオキサリル-D-アラニンのメチルエステル（IS81）、メチルオキサリル-L-アラニン（IS68）、メトキサリル-D-アラニン（IS69）、ジエチル N-メトキシオキサリル-L-グルタメート（IS12）、-オキサリル-L-グルタメート（IS13）、オキサリル S-アラニン（IS70）およびオキサリル R-アラニン（IS71）により例示される。
これらの化合物は、Cunliffeら (1992) J. Med. Chem. 35 2652〜2658に記載の合成法により得ることができる。
本発明者らは、コラーゲンプロリル-ヒドロキシラーゼ（CPH）を抑制することが知られている、アミノ酸のN-オキサロ誘導体が、HIFヒドロキシラーゼによるHIF-αの修飾を、特にそのプロリルヒドロキシラーゼ活性（HPH）を阻害することにより抑制することを見出した。これはpVHL結合の減少および細胞HIFレベルの上昇を招く。
N-オキサログリシンはCPHおよびHPHの両方のインヒビターであることが判明している。一方、(R,S)-N-オキサロアラニンは、N-オキサログリシンと比較して、CPHのインヒビターとしては劣り、(S)オキサロアラニンはHIFヒドロキシラーゼ（特にHPH活性）の好ましいインヒビターである（後記のとおり）。(S)-オキサロバリンは、HPHインヒビターとしての活性をほとんど又は全く有さない。
個々のHIFヒドロキシラーゼに対する選択性は、オキサログリシン骨格の修飾により増加または増強させることができる。E. Baederら (1994) Biochem. J. 300.525〜530に記載され、また表2に例示されているとおり、N-オキサロアミノ酸誘導体は、「プロドラッグ」として使用するためのメチルまたはエチルエステル形態に変換することができる。
HIFヒドロキシラーゼ（特にHPH活性）のモジュレーションにおいて使用するための対象となる化合物のもう1つのクラスとして、一般式（VIII-XII）のヒドロキサム酸誘導体が挙げられる。
Figure 0004590157
Figure 0004590157
Figure 0004590157
［式中、RI〜RVIIIは、独立して、H、OH、所望により1、2、3、4または5個のハロ置換を有していてもよく官能基化されていてもよい分枝状または直鎖状C1-C6アルキル鎖、所望により1または2個のN、S、OまたはP原子を含有していてもよい4〜7員複素環、あるいは所望により1または2個のN、OまたはS原子を含有していてもよい5または6員芳香環（これは、もう1つの環と、又は前記芳香環により置換された前記アルキル鎖と縮合していてもよい）であることが可能であり、RIIIは、NH2またはその塩（例えば、HCl塩）またはNHRIX（ここで、RIXはアシル、例えば、非置換または置換アルカノイル、例えば、アセチルまたはフェノキシアセチルである）であることも可能である；
XRは、OH、NH2またはNHRX（ここで、RXは、OH、分枝状または直鎖状C1-C6アルキル鎖、あるいは分枝状または直鎖状C1-C6アルキル鎖を有するO-アルキルである）である］。
好ましい化合物は、Rがメチルまたはベンジルであり、および／または、RIIが水素であり、および／または、RIIIがNH2またはNHCOCH2O6H5である化合物である。
ヒドロキサム酸は、Walter M. W.ら (1999) Bioorg. Chem. 27 (1): 35-40に記載されているとおりに得ることができる。
アラホプシン（alahopcin）（Higashide Eら, (1995) J. Antibiotics 38: 285-295）のような環状の天然物を含むヒドロキサム酸はCPHのインヒビターであることが公知であり、したがって、HIFヒドロキシラーゼ（特にHPM）の抑制に関して関心が持たれている。HPHに特異的であるこれらの化合物に基づくモジュレーターを、本明細書に記載の方法を用いて開発することが可能である。
式Xの化合物はベンゾ-ヒドロキサム酸により例示され、式XIの化合物（これは式Xのサブクラスである）は表3中の化合物NK45、NK46、NK47およびNK84により例示される。
HIFヒドロキシラーゼ（特にHPH活性）のモジュレーションにおいて使用するための対象となる化合物のもう1つのクラスは、ヒドロキシル化芳香族化合物、例えばカテコール、フェナントロリンおよびヒドロキシアントロキノン、例えば以下の式のヒドロキシアントロキノンである。
Figure 0004590157
［式中、R1〜R11は、独立して、H、分枝状または直鎖状C1-C6アルキル鎖、OH、所望により1または2個のN、OまたはS原子を含有していてもよい分枝状または直鎖状C1-C6アルキル鎖を有するO-アルキル、COOH、分枝状または直鎖状C1-C6アルキルエステル（アルコキシカルボニル）、所望により1または2個のN、S、OまたはP原子を含有していてもよい4〜7員複素環、あるいは所望により1以上のN、OまたはS原子を含有していてもよい5または6員芳香環（これは、もう1つの環と、又は前記芳香環により置換された前記アルキル鎖と縮合していてもよい）であることが可能であり、
Figure 0004590157
表3に示すジヒドロキシベンゾアート（EDB）および3,4-ジヒドロキシ安息香酸（プロトカテク酸）は式XVの化合物の具体例である。式XIVのこれらの化合物は公知のCPHインヒビターである（Franklinら (2001) Biochem. J. 353: 333-338, Cunliffeら Biochem J. (1986) 239(2) 311-315, Franklinら (1989) Biochem. J. 261 (1) 127-130）。HPHに特異的なこれらの化合物に基づくモジュレーターを、本明細書に記載の方法を用いて開発することが可能である。式XVAの具体的な化合物には以下のものが含まれる。
Figure 0004590157
したがって、典型的には、R1、R3、R7、R8およびR11は水素であり、R2、R4、R9およびR10はOHである。HIFヒドロキシラーゼ（特にHPH活性）のモジュレーションにおいて使用するための対象となる化合物のもう1つのクラスは、以下の一般式の1つを有するN含有複素環化合物である。
XVI: 3-ヒドロキシキノロン-2-カルボキシイミド誘導体
Figure 0004590157
［式中、R1〜R5は、H、分枝状または直鎖状C1-C6アルキル鎖、例えばMe、所望により1以上のN、S、OまたはP原子を含有していてもよい4〜7員複素環、あるいは所望により1以上のN、OまたはS原子を含有していてもよい5または6員芳香環（これは、もう1つの環と、又は前記芳香環により置換された前記アルキル鎖と縮合していてもよい）であることが可能であり、A = 置換アルキレン、B = CO2H、NHSO2CF3、テトラゾリル、イミダゾリルまたは3-ヒドロキシイソオキサゾリル、mは0または1である］。
XVII: ピリジンおよびピリジンN-オキシド誘導体
Figure 0004590157
Figure 0004590157
［式中、RI〜RIVは、独立して、H、分枝状または直鎖状C1-C6アルキル鎖、ハロゲン基（すなわち、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨード）、カルボキシラート基、所望により1以上のN、S、OまたはP原子を含有していてもよい4〜7員複素環、所望により1以上のN、OまたはS原子を含有していてもよい5または6員芳香環（これは、もう1つの環と、又は前記芳香環により置換された前記アルキル鎖と縮合していてもよい）、あるいは以下のとおりに定義されるC(=O)XR基でありうる；
Xは、O、NH、NR（ここで、Rは、H、OH、官能基化されていてもよい分枝状または直鎖状C1-C6アルキル、官能基化されていてもよい分枝状または直鎖状C1-C6アルキルを含有するアルコキシ、所望により1または2個のN、S、OまたはP原子を含有していてもよい4〜7員複素環、所望により1または2個のN、OまたはS原子を含有していてもよい5または6員芳香環であり、これは、もう1つの環と縮合していてもよい）であり、RXは、典型的には、直鎖状または分枝状C1-C6アルコキシであり、mは0または1である］。
Figure 0004590157
式中、R1は、EP0114031に定義されているとおりであり、すなわち、メチルのようなC1-C4アルキル鎖を有するアルコキシ基で置換されていてもよいC1-C4アルキル鎖（例えばC2H4）であり、CONHR1基は、典型的には、2および4位に位置する。したがって、R1は、典型的にはメトキシエチルである。
式XVIIおよびXVIIIの化合物は2,5-(C8)、2,4-(C9)、2,3-(C10)および3,4-(C11)-ピリジンジカルボン酸により例示され、式XIXの化合物は表3中の化合物IS4、IS5、IS6、IS7、IS8およびIS9により例示される。
もう1つの適当なN含有複素環は以下の式を有しうる。
Figure 0004590157
［式中、X = O、Y = NまたはCR3、m = 0または1、A = 置換アルキレン、B = CO2H、NHSO2CF3、テトラゾリル、イミダゾリルまたは3-ヒドロキシイソオキサゾリル、R1、R2およびR3は、独立して、H、OH、ハロ、シアノ、CF3、NO2、CO2H、アルキル、シクロアルキル、シクロアルコキシ、アリール、アラルキニル、アルキニルカルボニル、アルキルカルボニルオキシ、カルバモイル、アルキニルオキシアルキル、アルケニルオキシ、アルコキシアルコキシ、アルキニル、レチニルオキシカルボニル、アルケニルオキシカルボニルオキシ（R1およびR2、またはR2およびR3 = (CH2)oの場合、飽和またはC:C不飽和鎖のCH2基の1または2個はO、S、SO、SO2またはイミノにより置換されていてもよい）、o = 3〜5、R4 = H］。
XXII: 3-アルコキシピリジン-2-カルボキサミド誘導体
Figure 0004590157
［式中、A、BおよびR4はWO97/41103において定義されているとおりである：A = (置換アルキレン)、B = (修飾)カルボキシ、テトラゾリル、イミダゾリル、3-ヒドロキシイソオキサゾリル、R4 = H、OH、ハロ、シアノ、CF3、NO2、CO2H、アルキル（例えば、分枝または直鎖C1-C6アルキル）、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、シクロアルキルアルコキシ、シクロアルコキシアルキル、アリール、アラルキル、アラルコキシ、ヒドロキシアルキル、アルケニル、アルキニル、アルキニルオキシアルキル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、シンナモイル、アルケニルカルボニル、アリールカルバモイルまたはアラルコキシカルボニルオキシ］。
種々の-含有複素環および誘導体がCPHのインヒビターであることが公知である。それらの作用メカニズムは、該複素環の2位に位置するカルボニル基と芳香族窒素（またはそのN-オキシド）との二座キレート形成を介したものであると考えられている。適当な化合物は、Bickelら Hepatology 28(2) 404-411, DE-A-1974628, EP-A-0846685, WO-A-9741103, EP07865871, DE-A-19504226, EP-A-0673932, EP-A-0673931およびEP-A-0673930に記載されている。
医薬用に適当に誘導体化されたこれらの化合物の類似体は、本明細書に記載の方法を用いて、HIFヒドロキシラーゼ（特にHPH活性）に対して選択的なものにすることができる。
2,4-ジエチルピリジンジカルボキシラートは、HPHを抑制しないことが判明している公知のCPHインヒビターである（Friedman L.ら (2000) PNAS 97 (9) 4736-4741）。このことは、選択的HIFヒドロキシラーゼインヒビター、特に選択的HPHインヒビターが可能であることを示している。
HIFヒドロキシラーゼ（特にHPH活性）のモジュレーションに使用するための対象となる化合物のもう1つのクラスは一般式（XXV〜XXVIII、XXVIIIAおよびXXVIIIB）を有する。
Figure 0004590157
［式中、R、RI〜RVIは、独立して、H、分枝状または直鎖状C1-C6アルキル鎖、所望により1または2個のN、S、OまたはP原子を含有していてもよい4〜7員複素環、所望により1または2個のN、OまたはS原子を含有していてもよい5または6員芳香環（これは、もう1つの環と、又は前記芳香環により置換された前記アルキル鎖と縮合していてもよい）であることが可能であり、好ましくはHまたはメチルである；R20は、水素またはアシル、典型的には芳香族アシル、例えばベンゾイルである；
Xは、NH、NR''（ここで、R''は、OH、Me、アルキル、OMe、Oアルキル（これはC1-C6アルキル鎖を有する）である）である；および
YはOまたはSである］。
Figure 0004590157
［式中、A*B*C*D*は、式(A)に関して定義されているとおりである；R21は、水素またはアシル、典型的には芳香族アシル、例えばベンゾイルである；Rは、式IIIに関して定義されたとおりである；nは1〜5であり、xは1〜5であり、yは1〜5であり、グルタチオン（γ-グルタミル-システイニル-グリシン）（C16）およびシステイニル-グリシン（CO166）の場合のように、生じるメチレン鎖は、Rに関して定義された1以上の基により又はNH2により官能基化されていてもよい］。
これらの化合物は、商業的入手源（例えば、Sigma Chemical Co.）から入手することが可能であり、あるいは標準的な方法を用いて製造することができる。
N-(メルカプトプロピオニル)グリシンおよびグルタチオンはHPHのインヒビターであることが判明している。このことは、適切に官能基化されたチオールが2OG依存性オキシゲナーゼのインヒビターとなりうることを示している。N-(メルカプトプロピオニル)グリシンは、標準的なアッセイ条件下、ストレプトマイセス・クラブリゲルス（Streptomyces clavligerus）由来のクラバミン酸（clavaminate）シンターゼのインヒビターではなかった。このことは、化合物のこのファミリーが、異なる2OGオキシゲナーゼに選択的でありうることを示している。N-(メルカプトプロピオニル)グリシンの修飾はHPHに対する選択性を改善しうる。これらの化合物は、それらのエステル「プロドラッグ」形態への変換により、有用な薬剤に製されうる。これらは、その他のものも可能であるが、一般にはメチルまたはエチルエステルである。
N-(メルカプトプロピオニル)グリシンおよびグルタチオンは、イソエペニシリン-N-シンターゼ（IPNS）の基質であるL-δ(α-アミノアジポイル)-L-システイニル-D-バリン（ACV）と構造的に関連している。IPNSは、2OG補基質を利用しないものの、配列および構造においては2OG依存性オキシゲナーゼと密接に関連したオキシダーゼである。グルタチオンは、細胞内の適切な酸化還元電位の維持において重要であり、それがHPHのインヒビターであるという知見は生理的に重要な意味を有している可能性がある。
式XXVIIIの化合物には、N-(3-メルカプトプロパノイル)-L-アラニン（IS37）および対応するD異性体（IS38）ならびにN-(3-ベンゾイルチオプロピオノイル)-L-アラニン（IS20）および対応するD異性体（IS21）が含まれる。他の化合物には以下のものが含まれる。
Figure 0004590157
Figure 0004590157
［式中、R1は、H、官能基化されていてもよい分枝状または直鎖状C1-C6アルキル鎖、任意の天然アミノ酸側鎖（例えば、グルタミン酸）、所望により1または2個のN、S、OまたはP原子を含有していてもよい4〜7員複素環、所望により1または2個のN、OまたはS原子を含有していてもよい5または6員芳香環（これは、もう1つの環と、又は前記芳香環により置換された前記アルキル鎖と縮合していてもよい）である；R2〜R6のそれぞれは、同一であっても異なっていてもよく、R1に関して定義されているとおりであるか又はNH2もしくはOR7（ここで、R7は、R'に関して定義されているとおりである）である；Eは単環系、例えばチオフェンまたはピランである；E’は存在しないか又はEと共に二環系、例えばナフタレンまたはインドールを形成し、E’は典型的にはベンゼンである］。該環は、それらの炭素原子の任意の位置において、R'に関して定義されている基で官能基化されていてもよい。典型的な化合物には、2-ヒドロキシ-馬尿酸、N(2-ヒドロキシ-ベンゾイル)-グリシン（C14）およびN-ベンゾイル-グルタミン酸（C15）が含まれる。
適当な場合には、該酸は塩、例えばナトリウム塩の形態でありうる。
HIFヒドロキシラーゼまたはHIF-αポリペプチドの配列に由来するペプチド断片は、モジュレーション活性を有しうる化合物のもう1つのクラスを形成する。そのようなペプチドをコードする核酸、そのような核酸を含有するベクターおよび宿主細胞、ならびにそのようなペプチドをコードする核酸を発現させる方法は、本発明の更なる態様である。好ましい実施形態においては、そのような断片は、ヒトHIFヒドロキシラーゼ（特にPHD 1、2または3のいずれか）の断片である。
適当なモジュレーターは、HIFヒドロキシラーゼによるHIFプロリルヒドロキシル化の主要基質であるHIFαの類似体でありうる。該モジュレーターは、例えば、HIFαの競合インヒビターとして又は別のメカニズムにより（例えば、HIFヒドロキシラーゼを不可逆的に修飾することにより）作用しうる。HIF-αの競合阻害の事象においては、補基質2OGの脱共役酸化が尚も生じうる。
HIF-αポリペプチドの好適な断片は、その完全長ポリペプチドにおいてHIFヒドロキシラーゼによりヒドロキシル化される及びそれ自体でHIFヒドロキシラーゼによりヒドロキシル化されうるプロリン残基を含みうる。その一例として、ヒトHIF-1α配列のプロリン残基402または564に対応するプロリン残基を含有する断片が挙げられる。例えば欠失分析またはアラニンスキャニングのような技術を用いて同定された、より小さな断片ならびにこれらの断片の類似体および変異体を同様に使用することが可能である。
したがって、HIFα配列についての知見、特に、ヒドロキシル化される残基の同定は、ヒドロキシル化反応が抑制されるようヒドロキシル化位置にプロリン類似体を有するインヒビターの設計を可能にする。
特に、ヒドロキシル化されるプロリン残基（例えば、プロリン564）が、HIFヒドロキシラーゼ基質ではないプロリン類似体（例えば、5-オキサプロリン、3,4-デヒドロプロリンおよび4-チアプロリン）（Wuら (1999) J. Am. Chem. Soc. 121(3)587-588, DE-A-3818850）により置換された、HIFαまたはその類似体のペプチド断片が、モジュレーター、例えばインヒビターに含まれうる。該プロリンインヒビター類似体を修飾して、それが該ヒドロキシラーゼの2-オキソグルタル酸結合残基に結合するようにすることが可能である。
プロリン類似体の具体例としては以下のものが挙げられる。
Figure 0004590157
［式中、YまたはXのうちの一方がOであり（オキサプロリン）、もう一方は-CR'R''-であるか、又はYはSであり（4-チアプロリン）；あるいはXおよびYのうちの一方がC=Oまたは-SO2または-P(=O)O(H)であり、もう一方は-CR'R''-である；Rはペプチドまたはペプチド類似体であり、R、RI、RIIは、H、分枝状または直鎖状C1-C6アルキル鎖、所望により1以上のF、N、S、OまたはP原子を含有していてもよい4〜7員複素環、所望により1以上のN、OまたはS原子を含有していてもよい5または6員芳香環（これは、もう1つの環と縮合していてもよい）である］。
本発明での使用に適したペプチドまたはペプチド類似体はたいていは短く、約40アミノ酸長以下、好ましくは約35アミノ酸長以下、より好ましくは約30アミノ酸長以下、より好ましくは約25アミノ酸長以下、より好ましくは約20アミノ酸以下、より好ましくは約15アミノ酸以下、より好ましくは約10アミノ酸以下、または9、8、7、6、5アミノ酸長またはそれ未満である。本発明のペプチドは、約10〜40アミノ酸長、約5〜10、約10〜15、約10〜20、約10〜30、約20〜30、または約30〜40アミノ酸長でありうる。HIFα断片であるペプチドは、一般には、関連プロリン残基の1以上を含む。
本明細書に開示された特異的配列を有するペプチドの誘導体であるペプチドモジュレーターは、ある実施形態においては、該特異的ペプチドと同じ長さであってもそれより短くてもよい。他の実施形態においては、HIF-1ポリペプチドまたはHIFヒドロキシラーゼの追加的部分を含んでいても含んでいなくてもよい、前記の、より大きなペプチド中に、該ペプチド配列またはその変異体が含まれうる。HIFヒドロキシラーゼまたはHIF-ポリペプチドの関連特異的ペプチド断片に隣接した又はそれに対して異種の1、2、3、4または5個またはそれ以上の追加的なアミノ酸が、該ペプチドの一方または両方の末端に含まれていてもよい。
ペプチドは、例えばアミド結合を置換することにより及び／又はLαアミノ酸もしくはβアミノ酸の代わりにD体を使用することにより又はコンホメーション拘束手段を用いることにより、例えば医薬として使用するために修飾することができる。
前記のクラスの潜在的なHIFヒドロキシラーゼ（特にHPH活性）インヒビターの具体例を表3に示す。
本明細書に記載の式において、分枝状または直鎖状C1-C6アルキル鎖は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、iso-ブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、ネオペンチル、tert-ペンチルまたは第1級、第2級または第3級ヘキシル基でありうる。好ましくは、該アルキル基はメチルまたはエチルであり、好ましい複素環はピロリジンまたはテトラヒドロピランであり、芳香環はベンゼン、ナフタレンまたはピリジンである。
特定のいずれのメカニズムにも限定されるものではないが、ACVおよびFe(II)と錯体形成したIPNSの構造の分析ならびにN-(メルカプトプロピオニル)グリシン、2OGおよびN-オキサログリシンの間の構造上の関係は、N-(メルカプトプロピオニル)グリシンのチオールがFe(II)に結合しそのカルボキシラートが2OGのS-カルボキシラートと同じ残基に結合してなる錯体を介して、N-(メルカプトプロピオニル)グリシンがHIFヒドロキシラーゼ（特にHPH活性）を抑制することを示している。
HPH選択性
HIFプロリルヒドロキシラーゼ活性を有する幾つかの異なるHIFヒドロキシラーゼがヒトにおいて存在し、単一の標的として又は選択されたグループおよびファミリー全体においてこれらを選択的にモジュレーションすることが有利であるかもしれない。したがって、HIFヒドロキシラーゼ活性（特にHIFプロリルヒドロキシラーゼ活性）をモジュレーションする物質は、好ましくは特異的である。すなわち、それらは、後記のとおり、他の2OG依存性オキシゲナーゼ（特にコラーゲンプロリルヒドロキシラーゼ（CPH））に対する場合と比較して高い又は強力な、HIFヒドロキシラーゼに対する効果を有する。そのような物質は、特定のヒトHIFヒドロキシラーゼ、特にPHD 1、2または3に特異的でありうる。
したがって、本明細書に記載のアッセイ方法は更に、2OG依存性オキシゲナーゼが正常に活性である条件下、試験化合物を1以上の2OG依存性オキシゲナーゼと接触させ、該オキシゲナーゼの活性を測定することを含みうる。
試験化合物の存在下と非存在下との活性の相違は、該試験化合物が前記の1以上の2OG依存性オキシゲナーゼの活性をモジュレーションすることを示す。
前記の1以上の2OG依存性オキシゲナーゼと比較してHIFヒドロキシラーゼのモジュレーションの増加または増強を引き起こす試験化合物は、HIFヒドロキシラーゼに対する選択性または特異性を示す。
2OG依存性オキシゲナーゼには、例えば、クラバミン酸シンターゼ、デアセトキシセファロスポリンCシンターゼ、コラーゲン-プロリル-4-ヒドロキシラーゼ、コラーゲンプロリル-3-ヒドロキシラーゼ、リシルヒドロキシラーゼ、アスパルチルヒドロキシラーゼ、フィタノイル補酵素Aヒドロキシラーゼまたはγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼが含まれうる。2OG依存性オキシゲナーゼは哺乳類ポリペプチド、好ましくはヒトポリペプチドでありうる。
以下のような種々の2-OGオキシゲナーゼ酵素の構造が報告されている：オキシゲナーゼクラバミン酸シンターゼ（Zhang Z.ら (2000) Nature Structural Biol. 7 127-133）、デアセトキシセファロスポリンCシンターゼ（Lloydら (1999) J. Mol. Biol. 287 943-960）、セファロスポリンシンターゼ（Valegard K.ら (1998) Nature 394 805-809）、イソペニシリン N-シンターゼ（Roach P.(1995) Nature 375 700-704）および2OG依存性オキシゲナーゼ（Schofield, C. & Zhang, Z. (1999) Curr. Opin. Struct. Biol. 9 722-731）。
また、HIFヒドロキシラーゼ（特にHPH活性）には選択的であるが他の2OG依存性オキシゲナーゼには選択的でない物質、他のヒドロキシラーゼおよびプロリルヒドロキシラーゼに対するよりもHIFヒドロキシラーゼ（特にHIFプロリルヒドロキシラーゼ活性）に対して選択的である物質、特定のHIFヒドロキシラーゼに特異的である物質を同定するために、本発明のアッセイを使用することができる。特定のヒトHIFヒドロキシラーゼに選択的である（例えば、配列番号2または配列番号4または配列番号6のアミノ酸配列を有する酵素に特異的である）物質を同定するために、該アッセイを使用することができる。
本発明は、HIFの活性レベルの減少をともなう状態を治療するための医薬の製造における、このようなHIFヒドロキシラーゼ選択的インヒビターの使用を提供する。
本発明のもう1つの態様においては、該アッセイは、他の2OG依存性オキシゲナーゼのインヒビターまたはアクチベーターと同定された物質が、そのようなオキシゲナーゼに特異的であるのか、あるいは少なくとも、本発明のポリペプチドのHIFヒドロキシラーゼ（特にHIFプロリルヒドロキシラーゼ活性）には影響を及ぼさないのかどうかを確認するために使用することができる。特に、該アッセイは、そのような物質がヒトHIFヒドロキシラーゼには影響を及ぼさないことを確認するために使用することができる。したがって、2OG依存性オキシゲナーゼ（例えばコラーゲンプロリルヒドロキシラーゼ）のインヒビターと同定された物質を使用して該アッセイを行い、そのような物質がコラーゲンプロリルヒドロキシラーゼに特異的であり、HIFヒドロキシラーゼ（特にそのプロリルヒドロキシラーゼ活性）に対しては活性でないか又は活性の減少を示さないかどうかを確認することが可能である。
アッセイフォーマット
スクリーニングまたはアッセイ方法は、対象となる試験化合物、物質または因子を混合物または抽出物から精製および／または単離すること、すなわち、該混合物または抽出物の成分（例えば、通常は該試験物質に付随している成分）の少なくとも1つの含量を減少させることを含みうる。該スクリーニング方法またはアッセイ方法は、試験混合物または抽出物の画分の1以上がHIFヒドロキシラーゼのヒドロキシラーゼ（特にHIFヒドロキシラーゼのプロリル活性、典型的にはHIF-αに対するこれらの活性）をモジュレーションする能力を判定することを含みうる。
該精製および／または単離には、当業者に公知の任意の方法を用いることが可能である。本明細書に記載のアッセイ方法を用いて入手および／または同定した物質または化合物は、例えば、他の2OG依存性オキシゲナーゼ（CPH）に対する場合と比較してHIFヒドロキシラーゼに対する選択性を増加させるために修飾することが可能である。
特定の官能基を含有する化合物のクラスを修飾して特定の酵素に選択的なものとするためのアプローチはよく知られており、例えば、様々に修飾されたトリフルオロケトン、クロロメチルケトン、βラクタムまたは他の包括的セリンプロテアーゼインヒビターによる特異的セリンプロテアーゼの抑制が挙げられる（Walker B. & Lynas J. (2001) Cell. Mol. Life Sci. 58(4) 596-624, Rai R. (2001)ら Curr. Med. Chem. 8 (2) 101-119, Marquis R. (2000) Ann. Rep. Med. Chem. 35 309-320, Lebon, F. & Ledecq, M. (2000) Curr. Med. Chem. 7 (4) 455-477）。
特定のHIFヒドロキシラーゼに対する選択性は、複数の異なるHIFヒドロキシラーゼを使用して本明細書に記載のアッセイを行うことにより確認することができる。それにより、1以上のHIFヒドロキシラーゼのHIFヒドロキシラーゼ活性（特にプロリルヒドロキシラーゼ活性）がその他のHIFヒドロキシラーゼに比して優先的または選択的に試験化合物によりモジュレーションされるかどうかを判定することができる。同様に、HIFヒドロキシラーゼのPHDファミリーに対する選択性は、複数の異なる2-オキソグルタル酸依存性オキシゲナーゼを使用して本明細書に記載のアッセイを行うことにより確認することができる。それにより、1以上のPHDヒドロキシラーゼのHIFヒドロキシラーゼ活性が他の2-オキソグルタル酸依存性オキシゲナーゼの活性に比して優先的または選択的に試験化合物によりモジュレーションされるかどうかを判定することができる。
また、HIFヒドロキシラーゼと他の2-オキソグルタル酸依存性オキシゲナーゼとの構造上の相違を同定するために、構造情報、例えば一次配列データおよび3D情報、例えば結晶学的データを使用することも可能である。これらの相違は、本明細書に記載のHIFヒドロキシラーゼを他の2-オキソグルタル酸依存性オキシゲナーゼに比して選択的または優先的にモジュレーションする化合物を設計するために利用することができる。
構造解析および論理的ドラッグデザイン
非ヘム鉄配位性HXD[X]nHモチーフを触媒部位に配置する一般的なゼリーロール構造を与えるようHIFヒドロキシラーゼが折り畳まれる（フォールディングされる）ことが、二次構造分析から予想される。
このクラスのオキシゲナーゼにおける触媒メカニズムの速度論的および時間分解結晶学的研究は、鉄（II）、2-オキソグルタル酸および誘発（prime）基質の秩序だった結合を示している（Zhangら, (2000) 前掲; Zhouら (1998) J. Am. Chem. Soc. 120 13539-13540）。
誘発基質の結合は、おそらく鉄から水分子を追い出すことにより、ジオキシジェンが不可逆的に結合するよう該酵素を「誘発」する。鉄の中心における弱い結合は、補因子が鉄（II）を要求することに関連している。該組換え酵素の活性には鉄が必要であり、該活性は、触媒中心における置換によりコバルトイオンにより直接的に抑制される。鉄の結合を妨げるがその他の点では三次元構造を変化させないと予想される突然変異（EGLN2/PHD1; H358A）は酵素活性を完全に消失させることが観察された。
SM20は、その活性部位に、残基His313およびAsp315と錯体形成した鉄原子を含むことが、構造分析および配列研究から示されている（Acc No: af229245またはgi11320937）。図8に示すとおり、関連酵素であるクラバミン酸シンターゼ（CAS）およびデアセトキシセファロスポリンCシンターゼ（DAOCS）も、活性部位において鉄の配位を示す。
インヒビターは配位鉄原子と共に単座配位、二座配位または三座配位錯体を形成して、酵素の活性を抑制しうる。そのようなインヒビターの具体例には、本明細書に記載のヒドロキサマートおよびヒドロキシアントロキノンが含まれる。鉄原子へのインヒビターの配位は分光分析または結晶学により測定することができる。
前記のとおり、物質はペプチド性物質、例えば、前記配列を含むペプチドまたはそのようなペプチドの機能性類似体でありうる。
本発明で用いる「機能性類似体」なる表現は、HIFヒドロキシラーゼによるHIFαのヒドロキシル化（特にプロリルヒドロキシル化）を妨げうる、問題のペプチドと同じ機能活性を有するペプチド変異体または有機化合物に関するものである。そのような類似体の具体例には、接触領域またはpVHL結合ドメイン（特に、プロリン564を含む鍵アミノ酸残基の配置）におけるHIFヒドロキシラーゼの基質（HIFα）の三次元構造を模擬するようモデル化された化合物が含まれる。
もう1つの態様においては、本発明は、HIFヒドロキシラーゼの活性部位と相互作用しHIFヒドロキシラーゼによるHIFαのプロリン残基（すなわちプロリン402または564）のヒドロキシル化をモジュレーションしうるペプチドまたは非ペプチジル模擬体の設計方法における、HIFαポリペプチド（特に、HIFヒドロキシラーゼによるヒドロキシル化を受けるペプチド断片）の使用を提供する。
したがって、本発明は、HIFヒドロキシラーゼによるプロリン残基のヒドロキシル化をモジュレーションする、例えばHIFαポリペプチドの模擬体の設計方法であって、
（i）生物学的活性に必須かつ重要であるアミノ酸残基を決定するために物質を分析して、薬作用発生団（ファーマコフォア）を定め、
（ii）該薬作用発生団をモデル化して、記載されているとおりヒドロキシル化をモジュレーションする候補模擬体を設計および／またはスクリーニングすることを含んでなる方法を提供する。
好適なモデル化技術は当技術分野で公知である。これは、HIFヒドロキシラーゼとHIF-αとの間の結合を調べ、その結合が再現されうるよう配置された対応官能基を含有する化合物を設計することを含む。
HIFヒドロキシラーゼの活性部位の鉄原子は通常は6配位である（が、触媒作用時には5配位でありうる）。該アミノ酸配列は3つのリガンドを付与するため、3つの位置が空いており、それらがインヒビターへの結合に用いられる。したがって、インヒビター分子は、これらの3つの位置において鉄原子に配位するよう設計することができる。
薬学的に活性な公知化合物を模擬した模擬体の設計は、「リード」化合物（例えば、本明細書に記載の化合物）に基づく薬の開発のための公知アプローチのひとつである。これは、該活性化合物の合成が困難であるか又は高価となる場合、あるいはそれが個々の投与方法に適さない場合（例えば、HIF-αまたはHIFヒドロキシラーゼ、特にそれらに由来するペプチドは、消化管内でプロテアーゼにより急速に分解される傾向にあるため、経口組成物用の活性物質としてはそれほど適していないかもしれない）に望ましいであろう。
ある一定の標的特性を有する化合物から模擬体を設計する場合には、一般には幾つかの工程が採用される。まず、該標的特性の決定においてクリティカルおよび／または重要である化合物の特定の部分を決定する。ペプチドの場合には、これは、該ペプチド中のアミノ酸残基を系統的に変化させることにより（例えば、各残基を順次置換することにより）行うことができる。該化合物の活性領域を構成するこれらの部分または残基は、その「薬作用発生団（ファーマコフォア）」として公知である。
薬作用発生団を見出したら、一定範囲からのデータ（例えば、分光学的技術、X線回折データおよびNMR）を用いて、その物理的特性（例えば、立体化学、結合、サイズおよび／または電荷）に従いその構造をモデル化する。このモデル化法においては、コンピューター解析、類似性マッピング（これは、原子間の結合ではなく薬作用発生団の電荷および／または体積をモデル化する）および他の技術を用いることができる。
前記アプローチの変法においては、リガンドとその結合相手との三次元構造をモデル化する。これは、該リガンドおよび／または結合相手が結合の際にコンホメーションを変化させる場合に特に有用となることがあり、該模擬体の設計において、該モデルがこの点を考慮することを可能にする。
本発明のポリペプチドインヒビター
本発明はまた、配列番号9 DLDLEMLAP*YIPMDDDFQL（ここで、P*は4-ヒドロキシプロリンである）のポリペプチドを提供する。そのようなペプチドは、単離された形態で提供されうる。本発明はまた、前記配列番号9の変異体を提供する。変異体は、HIF-αサブユニットとVHLとの相互作用に拮抗する能力を保有する。このことは、細胞内に該変異体が存在すると、該ポリペプチドの非存在下に存在するHIF-αサブユニットタンパク質の量と比較してHIF-αサブユニットタンパク質が増加することを意味する。
そのような置換体の特定の具体例には以下のものが含まれる：
DLDLEMLAP*YISMDDDFQL; 配列番号10、
DLDLEMLLP*YIPMDDDFQL; 配列番号11、
DLDLEMLVP*YIPMDDDFQL; 配列番号12、
DLDLEMIAP*YIPMDDDFQL; 配列番号13、
DLDLEMIAP*YIPMEDDFQL; 配列番号14および
DLDLEMLVP*YISMDDDFQL; 配列番号15。
本発明はまた、配列番号9の変異体である単離されたポリペプチドであって、該変異体がP*以外のいずれかのアミノ酸の1〜4個のアミノ酸置換を含み、該変異体が、HIF-αサブユニットとVHLとの相互作用に拮抗する能力を保有することを特徴とする単離されたポリペプチドを提供する。
後者のタイプの特定のポリペプチドとしては、
PFSTQDTDLDLEMLAPYIPMDDDFQLRSFDQLSP (配列番号16)
または前記配列番号9に関して定義したとおりのその変異体、および配列番号16を含有する35〜50アミノ酸よりなるポリペプチドが挙げられる。
P*残基を保有し、また少なくとも6、好ましくは少なくとも10、例えば少なくとも12または少なくとも15アミノ酸長であるこれらのポリペプチドの断片も、本発明のもう1つの態様であり、本発明において、本発明のポリペプチドと称される。好ましくは、これらの断片は、モチーフLXP*、例えばLAP*を保有し、より好ましくは、該断片は、LXXLXP*、例えばLXXLAP*を保有する。「X」は任意のアミノ酸を意味する。特に、そのようなポリペプチドは配列LAP*YIPを有する又は含む。したがって、本発明はまた、HIFとVHLとの相互作用に拮抗する能力を有し配列LAP*YIPを含む又は有するペプチドに関する。そのようなペプチドは、配列番号9のペプチドに関して記載されているとおりに製剤化または使用することが可能である。
本発明者らは、HIF-1α中の2番目のプロリン残基がヒドロキシル化を受けることも見出した。本発明者らの知見は、残基402が「LXXLAP」の共通モチーフを564位のヒドロキシル化部位と共有することを示している。本発明者らの知見はこの部位を示している。この領域の配列に基づく少なくとも8個、例えば少なくとも10個、少なくとも12個、少なくとも15個または少なくとも18個のアミノ酸、50個以下、35個以下または20個以下のアミノ酸のポリペプチドも、本発明のもう1つの態様を形成する。そのようなポリペプチドには、402位のプロリンがヒドロキシ化されるポリペプチドが含まれる。置換、修飾、精製、単離および／または合成は、前記HIFヒドロキシラーゼに関して記載されているとおりに行うことができる。
本発明のヒドロキシル化ペプチドは、VHLとHIFとの相互作用を抑制する物質に関してモニターするためのアッセイにおいて使用することができる。本発明のこの態様においては、前記のヒドロキシル化ポリペプチドを、試験物質の存在下、VHLまたはそのHIF結合領域と共にインキュベートし、該ヒドロキシル化ポリペプチドとVHLポリペプチドとの相互作用をモニターする。該ポリペプチドは、インヒビターに関するハイスループットアッセイにおける置換プローブとしても使用されうる。
本発明のこれらのポリペプチドは、医薬製剤として製剤化することができる。そのような製剤は、適当な担体、希釈剤および賦形剤と共に該ポリペプチドを含むであろう。典型的には、それらは、薬学的に許容されるポリペプチドと共に該ポリペプチドを含む。そのような製剤は本発明のもう1つの態様を形成する。
経口、頬側、局所、筋肉内、静脈内、皮下などを含む任意の所望の投与経路に適した製剤を製造することが可能である。
皮膚への局所投与用の製剤は、該ポリペプチドに対する皮膚の透過性を増強する成分を含みうる。そのような製剤は、軟膏剤、クリーム剤、経皮パッチなどの形態でありうる。
注射（筋肉内、静脈内、皮下など）による投与のための製剤は、生理食塩水のような無菌担体を、場合によっては、該ポリペプチドを保存または安定化する物質と共に含む。アルブミンが好適な物質でありうる。
ポリペプチドの製剤は特に、虚血状態、例えば器官虚血（例えば、冠状血管、脳血管および末梢血管の不全において見られるようなもの）の治療方法において使用することができる。任意の虚血が治療対象である。該療法は、２つの方法で行うことができる。すなわち、明らかな組織損傷、例えば心筋梗塞の後に（組織損傷を抑制するために）行い、あるいは虚血を予防するために予防的に（例えば、狭心症の治療における冠状側副枝の促進のために）行う。またさらに、血管運動の制御はHIFにより調節を受ける。HIFの活性化は、全身の血管抵抗に影響し、したがって全身血圧に影響を及ぼしうる。
また、ポリペプチドは、血管新生の促進物質と共に使用することができる。これらには、血管内皮増殖因子ならびに他の血管新生増進因子、例えば塩基性繊維芽細胞増殖因子およびチミジンホスホリラーゼ、および血管新生促進剤（pro-angiogenic）が含まれ、それらを併用療法において使用することが可能であろう。併用しうると考えられる他の化合物としては、2-デオキシリボースおよびプロスタグランジンEが挙げられる。
本発明のポリペプチドを対象に投与する際には、用量は、治療すべき患者および状態における必要性を考慮して、医師の判断により決定される。一般には、所望の作用部位において0.1μM〜1mM、例えば1〜10μMの範囲の濃度を示す用量が投与される。
治療的用途
HIFヒドロキシラーゼのヒドロキシラーゼ活性（特に、そのプロリルヒドロキシラーゼ活性）に影響を及ぼしうることが判明している化合物、物質または因子は、記載されている幾つかの場合において、治療上の可能性および他の可能性を有する。治療用には、そのような化合物は、任意の他の活性物質、例えば抗腫瘍療法には別の抗腫瘍化合物または療法、例えば放射線療法または化学療法と共に使用することができる。
1以上の一次スクリーニングを（例えば、無細胞系において）用いて、HIFヒドロキシラーゼのHIFαヒドロキシル化活性をモジュレーションしうると同定された物質を、1以上の二次スクリーニングを用いて更に評価してもよい。二次スクリーニングは、例えば、細胞内に存在するHIF標的遺伝子または標的となるプロセスのレベルにより表されるようなHIF-αの量またはHIF活性が、該物質の存在下で、該物質の非存在下と比較して増加または減少しているかどうかに関して試験することを含みうる。
HIFヒドロキシラーゼまたはHIFポリペプチドは、完全長ポリペプチドまたはその断片もしくはその他の修飾ポリペプチド（例えば、安定性を増強したり、標的化を確実にするためのものであり、抗体のような他の活性剤との組合せが含まれる）での治療を含む療法において使用することができる。
一般には、本発明のモジュレーターである物質、化合物または因子は、単離および／または精製された形態、すなわち、実質的に純粋な形態で提供される。これは、それが活性成分に対して少なくとも約90％、より好ましくは少なくとも約95％、より好ましくは少なくとも約98％に相当する組成物中に存在することを含みうる。しかし、任意のそのような組成物は、不活性担体物質または他の製薬上および生理的に許容される賦形剤（例えば、活性物質の適切な輸送、放出および／または安定化に要求されるもの）を含みうる。後記のとおり、本発明の組成物は、開示されているモジュレーター化合物に加えて、1種以上の他の治療用分子（例えば、抗腫瘍剤）を含みうる。
本発明のアッセイにより得られる産物
本発明は更に、本発明のアッセイ方法により得られた化合物、および該化合物を含む組成物（例えば、製薬上許容される担体または希釈剤と該化合物とが混合されてなる医薬組成物）を提供する。該担体は、液体（例えば、食塩水、エタノール、グリセロールおよびそれらの混合物）、または固体（例えば、錠剤の形態）、または半固体形態（例えば、デポ剤として製剤化された又は経皮パッチのように経皮的に投与されうるビヒクル中に製剤化されたゲル）でありうる。
本発明は更に、HIFヒドロキシラーゼによるHIFαポリペプチドの標的残基のヒドロキシル化を妨げる物質を患者に投与することを含む治療方法を提供する。そのような物質は、ヒドロキシラーゼ活性（典型的には、プロリルヒドロキシラーゼ活性、特に、HIFに関連したこれらの活性）のインヒビターを含みうる。HIFプロリルヒドロキシラーゼ活性のインヒビターの具体例には、具体的には、本明細書に記載の構造I〜XXVIIIの化合物が含まれる。そのような治療の典型的な目的は本明細書中に記載されている。
本発明は更に、種々の治療方法、（i）HIF-1に結合しうるHIFヒドロキシラーゼ、（ii）本発明のスクリーニング方法により同定されたモジュレーター、（iii）HIF-1またはHIFヒドロキシラーゼに結合しうる前記物質あるいは本発明のポリペプチドのいずれかの模擬体から選ばれる1以上の物質の使用を提供する。
そのような方法または使用の治療／予防目的は、例えばプロリン402、564または他のプロリン残基で生じうるHIFαのヒドロキシル化のモジュレーション（例えば、破壊または妨害）による細胞内のHIFαレベルのモジュレーションでありうる。HIFαのヒドロキシル化は、前記のとおりHIFαのユビキチン依存性タンパク質分解を招くpVHL結合を促進する。
該治療／予防目的は、低下したもしくは最適以下もしくは上昇したHIFレベルまたは活性に関連した状態、あるいは正常なHIFレベルを有するがHIFレベルのモジュレーション（例えば、HIFレベルの増加または減少）が望ましい状態、例えば以下の状態の治療に関連づけられうる。
（i）虚血状態、例えば器官虚血（冠状血管、脳血管および末梢血管の不全を含む）。該療法は、２つの方法［すなわち、明らかな組織損傷、例えば心筋梗塞の後に（組織損傷を抑制するために）、あるいは虚血を予防するために予防的に（例えば、狭心症の治療における冠状側副枝の促進）］で行うことができる。
（ii）創傷治癒および器官再生、
（iii）自家、同種および異種移植、
（iv）全身性高血圧、
（v）癌（HIFαは一般には腫瘍細胞内でアップレギュレーションされ、腫瘍増殖および血管新生に大きな影響を及ぼす）、
（vi）炎症性疾患、
（vii）肺動脈血圧、神経変性疾患。
医薬組成物
したがって、更なる種々の態様において、本発明は、そのような目的のための医薬組成物、医薬、薬または他の組成物（該組成物は、HIFヒドロキシラーゼインヒビター、特にそれらのHIFプロリルヒドロキシラーゼ（HPH）活性のインヒビター、例えば式I〜XXVIIIの化合物を含む本明細書に記載の1以上の物質、化合物または因子を含む）、医学的治療方法におけるそのような組成物の使用、そのような組成物を例えば前記の医学的状態の治療（これは予防的治療を含みうる）のために患者に投与することを含む方法、任意のそのような目的（例えば、本明細書に記載の状態の治療）のために投与する組成物、医薬または薬の製造におけるそのような物質、化合物または因子の使用、ならびに製薬上許容される賦形剤、ビヒクルまたは担体および場合により他の成分とそのような物質、化合物または因子とを混合することを含む医薬組成物の製造方法を提供する。
1つの実施形態においては、医薬組成物を提供するための方法は、典型的には、
（a）本発明のアッセイ方法により物質を同定し、
（b）そのようにして同定された物質を、製薬上許容される賦形剤と共に製剤化することを含む。
本発明の医薬組成物は、本発明の物質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクターまたは抗体と、製薬上許容される賦形剤とを含みうる。
該物質は、単独の活性物質として使用したり、相互に組合せて、又は任意の他の活性物質、例えば抗腫瘍療法用の物質、他の抗腫瘍化合物または放射線療法もしくは化学療法などの療法と組合せて使用することが可能である。
本発明の医学的治療方法においてどのような物質を使用するにしても、投与は、好ましくは、「予防的に有効な量」または「治療的に有効な量」（予防は療法とみなされうるが、場合に応じて判断される）で行い、これは、個体に対して利益を示すのに十分な量である。実際の投与量ならびに投与の速度および時間経過は、治療対象の性質および重症度に左右される。治療の処方、例えば投与量などに関する決定は、一般医および他の医師の責任において行われる。
物質または組成物は、例えば前記のような治療すべき状態に応じて、単独で、あるいは他の治療と組合せて同時に又は逐次的に投与することができる。
本発明の及び本発明で使用する医薬組成物は、有効成分に加えて、製薬上許容される賦形剤、担体、バッファー、安定剤または当技術分野においてよく知られた他の配合物を含みうる。特に、それらは、製薬上許容される賦形剤を含みうる。そのような配合物は無毒性であるべきであり、有効成分の効力を妨げるものであってはならない。担体または他の配合物の厳密な性質は投与経路（これは、経口投与または注射、例えば皮膚、皮下または静脈内注射でありうる）に左右される。
経口投与用の医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤または液体の形態でありうる。錠剤は、固体担体、例えばゼラチンまたは添加剤を含みうる。液体医薬組成物は、一般には、液体担体、例えば水、石油、動物油、植物油、鉱油または合成油を含む。生理食塩水、デキストロースまたは他の糖溶液またはグリコール、例えばエチレングリコール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールも含まれうる。
静脈内、皮膚または皮下注射、あるいは罹患部位への注射の場合には、有効成分は、適当なpH、等張性および安定性を有し発熱物質を含有しない非経口的に許容される水溶液の形態となろう。当業者は、例えば等張ビヒクル、例えばSodium Chloride Injection、Ringer's Injection、Lactated Ringer's Injectionを使用して、適当な溶液を製造することが十分に可能である。必要に応じて、保存剤、安定剤、バッファー、抗酸化剤および／または他の添加剤を含有させることも可能である。
輸送製剤においては、リポソーム、特にカチオニックリポソームを使用することが可能である。前記の技術およびプロトコールの具体例はRemington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (編), 1980に記載されている。
該物質または組成物は、特定の部位に局所的に投与することが可能であり、あるいは、例えば動脈内ステントに基づく輸送を用いて、それが特定の細胞または組織を標的とするよう輸送することが可能である。
あるタイプの細胞に、より特異的に活性物質を運搬するためには、抗体または細胞特異的リガンドのような標的化（ターゲッティング）系を使用した標的化療法を用いることができる。標的化は、様々な理由（例えば、該物質が、許容し得ない程度に毒性である、あるいは標的化しなければそれが余りにも高い用量を必要とする、あるいは標的化しなければそれが標的細胞に進入し得ない）により望ましいであろう。
もう1つの実施形態においては、本発明は、HIFのレベルまたは活性の増加または減少に関連した状態の治療のための医薬の製造における、本発明の物質の使用を提供する。該状態は、例えば、虚血、創傷治癒、自家、同種および異種移植、全身性高血圧、癌、および炎症性疾患よりなる群から選ばれうる。
遺伝子治療
本発明のHIFヒドロキシラーゼは、標的細胞におけるHIF-αのヒドロキシル化を促進または増強するために使用することができる。したがって、ヒドロキシル化のそのような促進は、HIF-αのユビキチン化およびそれに続く破壊を促進して、細胞内のHIF-αの蓄積を減少させうる。これは、血管新生の軽減に有用であり、標的細胞における他のアポトーシスおよび増殖応答に影響を及ぼす。したがって、本発明のこの態様においては、HIFヒドロキシラーゼをコードする核酸の供給を、それを要する標的細胞に対して行うことが可能である。
該物質がペプチドまたはポリペプチドである場合には、標的細胞内に導入したコード化核酸（例えば、ウイルスベクター）からの発現により、それらを標的細胞内で産生させることが可能である。該ベクターは、治療すべき特定の細胞に標的化することが可能であり、あるいはそれは、多少なりとも選択的に標的細胞によりスイッチが入れられる調節要素を含有することが可能である。
HIFヒドロキシラーゼによるHIFαのプロリルヒドロキシル化をモジュレーション（例えば阻害）しうるペプチドなどの物質をコードする核酸を、例えば疾患を（完全または部分的に）予防または治療するために、例えば個体の治療において、遺伝子治療法で使用することができる。
また、本明細書に記載のHIFヒドロキシラーゼをコードする核酸は、細胞内のHIFヒドロキシラーゼ活性（特にHIFプロリルヒドロキシラーゼ活性）のアンチセンス調節において使用することができる。
HIFヒドロキシラーゼをコードする遺伝子の発現のダウンレギュレーションは、アンチセンス技術またはRNA干渉を用いて達成することができる。
遺伝子発現をダウンレギュレーションするためにアンチセンス遺伝子または部分遺伝子配列を使用する場合には、標的遺伝子の「センス」鎖から転写される正常なmRNAに相補的なRNAが転写により得られるよう、プロモーターの制御下に「逆配向」でヌクレオチド配列を配置する。例えば、Smithら, (1988) Nature 334, 724-726を参照されたい。アンチセンス技術は、Flavell, (1994) PNAS USA 91, 3490-3496においても概説されている。
コード配列の逆配向に対応する完全な配列を使用する必要はない。例えば、十分な長さの断片を使用することが可能である。アンチセンス抑制のレベルを最適化するためにコード配列の種々の部分からの及び種々のサイズの断片をスクリーニングすることは、当業者にとっては常套手段である。開始メチオニンATGコドン、そして恐らくは、該開始コドンの上流の1以上のヌクレオチドを含有させることが有利かもしれない。もう1つの可能性は、遺伝子の保存配列（例えば、調節配列のような1以上の遺伝子に特徴的な配列）を標的化することである。
使用する配列は500ヌクレオチド以下、恐らくは約400ヌクレオチド、約300ヌクレオチド、約200ヌクレオチドまたは約100ヌクレオチドでありうる。それより遥かに短い長さの14〜23ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを使用することが可能かもしれないが、可能であれば、より長い断片、一般には500ヌクレオチドより更に長い断片が好ましい。
核酸の相補的配列、プレmRNAまたは成熟mRNAにハイブリダイズして、ある与えられたDNA配列にコードされるHIFヒドロキシラーゼ（例えば、天然ポリペプチドまたはその突然変異体）の産生を妨げて、その発現が軽減または完全に妨げられるよう、アンチセンスオリゴヌクレオチドを設計することができる。コード配列、遺伝子の制御配列（例えば、5’フランキング配列におけるもの）を標的化して、アンチセンスオリゴヌクレオチドが制御配列を妨げうるよう、アンチセンス技術を用いることができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドはDNAまたはRNAであることが可能であり、約14〜23ヌクレオチド長、特に約15〜18ヌクレオチド長でありうる。アンチセンス配列の構築およびそれらの使用は、PeymanおよびUlman, Chemical Reviews, 90:543-584, (1990)、ならびにCrooke, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 32:329-376, (1992)に記載されている。
標的配列の発現のダウンレギュレーションに使用する配列と標的配列においては、完全な配列同一性が存在することが好ましいかもしれないが、配列の完全な相補性または類似性が必須であるわけではない。使用する配列中の1以上のヌクレオチドが標的遺伝子と異なっていてもよい。したがって、本発明の遺伝子発現のダウンレギュレーションにおいて使用する配列は、入手可能な野生型配列（例えば遺伝子）から選ばれる野生型配列（例えば遺伝子）であることが可能であり、あるいは1以上のヌクレオチドの挿入、付加、欠失または置換によるそのような配列の突然変異体、誘導体、変異体または対立遺伝子でありうる。
該配列はオープンリーディングフレームを含んでいる必要はなく、翻訳可能なRNAを特定している必要もない。それぞれのセンスRNA分子がハイブリダイズするのに十分な相同性が存在するのが好ましいであろう。使用する配列と標的遺伝子との間に約5％、10％、15％または20％またはそれ以上のミスマッチが存在する場合でさえ、遺伝子発現のダウンレギュレーションが生じうる。
HIFヒドロキシラーゼの発現をモジュレーションするために使用しうる遺伝子の特異的ダウンレギュレーションのための他のアプローチはよく知られており、それらには、特異的核酸配列を切断するよう設計されたリボザイムの使用が含まれる。リボザイムは、一定の配列においてmRNAのような一本鎖RNAを特異的に切断する核酸分子、実際にはRNAであり、その特異性を操作することが可能である。ハンマーヘッドリボザイムが好ましい。なぜなら、それは約11〜18塩基長の塩基配列を認識し、したがって、約4塩基長の配列を認識するテトラヒメナ型のリボザイムより大きな特異性を有するからである。尤も、後者の型のリボザイムも或る状況においては有用である。リボザイムの使用に関する参考文献には、Marschallら, Cellular and Molecular Neurobiology, 1994. 14(5): 523、Hasselhoff, Nature 334: 585 (1988)、およびCech, J. Amer. Med. Assn., 260: 3030 (1988)が含まれる。
核酸を多種多様な標的細胞内に導入するためには、ウイルスベクターのようなベクターが先行技術において使用されている。典型的には、所望のペプチドの発現から有用な治療効果または予防効果を得るのに十分な細胞比率でトランスフェクションが生じうるよう、ベクターを標的細胞にさらす。トランスフェクトされた核酸は、標的細胞のそれぞれのゲノム内に永久的に取り込まれ、長く持続する効果を与えうる。あるいは、そうでなければ、処理を定期的に繰返す必要があるかもしれない。
ウイルスベクターおよびプラスミドベクターの両方の種々のベクターが当技術分野で公知である。米国特許第5,252,479号およびWO93/07282を参照されたい。特に、遺伝子導入ベクターとして幾つかのウイルスが使用されており、それらには、パポバウイルス、例えばSV40、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、例えばHSVおよびEBV、ならびにレトロウイルスが含まれる。先行技術における多数の遺伝子治療プロトコールは、不活化マウスレトロウイルスを使用している。
遺伝子治療におけるウイルスベクターの使用に代わる、核酸を細胞内に導入する他の公知方法には、マイクロインジェクションのような機械的技術、リボソームにより媒介される導入、および受容体媒介DNA導入が含まれる。
受容体媒介遺伝子導入（この場合、核酸がポリリシンを介してタンパク質リガンドに連結されており、該リガンドは、標的細胞の表面上に存在する受容体に特異的である）は、特定の細胞に対し核酸を特異的に標的化するための技術の一例である。
したがって、更なる種々の態様においては、本発明は、前記の医学的状態の治療方法において使用するための医薬組成物、医薬、薬または他の組成物（該組成物は、本明細書に記載の単離された核酸分子を含む）、医学的治療方法におけるそのような組成物の使用、そのような組成物を例えば前記の医学的状態の治療（これは予防的治療を含みうる）のために患者に投与することを含む方法、任意のそのような目的（例えば、本明細書に記載の状態の治療）のために投与する組成物、医薬または薬の製造におけるそのような物質、化合物または因子の使用、ならびに製薬上許容される賦形剤、ビヒクルまたは担体および場合によっては他の成分とそのような物質、化合物または因子とを混合することを含む医薬組成物の製造方法を提供する。
ポリペプチドによるHIF-αの残基のプロリルヒドロキシル化をモジュレーションまたは阻害する能力を有するペプチドまたは他の物質、あるいはその能力を有するペプチドをコードする核酸分子は、キット（例えば、外部環境から内容物を保護する適当な容器内に密封されたキット）として提供されうる。そのようなキットは使用説明書を含みうる。
ポリペプチドの使用
本発明のもう1つの態様は、HIFポリペプチドまたはHIFヒドロキシル化のプロリン含有基質のヒドロキシル化、特にプロリルヒドロキシル化のための、本明細書に記載のHIFヒドロキシラーゼまたはその断片の使用を提供する。
本発明のもう1つの態様は、HIFヒドロキシラーゼの製造方法であって、
（a）適当な発現系において、HIFヒドロキシラーゼをコードする核酸からの発現を引き起こさせて、該ポリペプチドを組換え的に産生させ、
（b）組換え的に産生されたポリペプチドによるHIFαポリペプチドのプロリルヒドロキシル化を確認することを含んでなる製造方法を提供する。該方法により発現されるポリペプチドはPHD（EGLN）ポリペプチドでありうる。
適当な発現系が当技術分野においてよく知られている。HIFヒドロキシラーゼは、大腸菌（E. coli）のような原核生物、サッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）のような下等真核生物、または哺乳類細胞のような高等真核細胞、例えばCHOまたはCOS細胞において発現させることができる。
HIFαポリペプチドのプロリルヒドロキシル化（特に、残基402または564のようなpVHL結合ドメイン内におけるもの）は、本明細書に記載のとおりに確認することができる。
本発明のもう1つの態様は、
（a）試験ポリペプチドを準備し、
（b）HIFαポリペプチドがHIFヒドロキシラーゼによりヒドロキシル化される条件下、HIFαポリペプチドと該試験ポリペプチドとを接触させ、
（c）HIFαポリペプチドのヒドロキシル化、特にプロリルヒドロキシル化を確認することを含んでなる、HIFヒドロキシラーゼ、特にHIFαプロリルヒドロキシラーゼを同定／入手するためのアッセイ方法を提供する。
本発明のHIFヒドロキシラーゼポリペプチドは、HIFヒドロキシラーゼの更なる基質を同定するためにも使用することができる。例えば、他のヒドロキシラーゼによりヒドロキシル化されることが既に示されているペプチド、または他のペプチドを、本発明のHIFヒドロキシラーゼと接触させ、そのようなペプチドのヒドロキシル化をモニターすることが可能である。本発明のヒドロキシラーゼによるヒドロキシル化を増強することが知られている物質および補因子の準備を含む、任意の好適な条件を選択することができる。好ましい態様においては、プロリル含有基質を本発明のHIFヒドロキシラーゼと接触させ、該プロリル残基のヒドロキシル化をモニターする。該基質のヒドロキシル化は、補因子またはヒドロキシル化の副産物のレベルのモニターを含む任意の適当な方法によりモニターすることができる。
本発明はまた、HIFヒドロキシラーゼ（例えば、EGLNポリペプチド）の4-プロリルヒドロキシラーゼ活性を抑制する物質と細胞とを接触させることを含んでなる、細胞内のHIFポリペプチドの量をモジュレーションする方法を提供する。該物質は、例えば、本発明の物質でありうる。好ましい実施形態においては、該物質は、HIFヒドロキシラーゼ（例えば、EGLNポリペプチド）の生物活性を抑制するが、コラーゲンプロリルヒドロキシラーゼの生物学的活性を抑制しない。
本発明の更なる種々の態様および実施形態は、本開示を考慮すれば、当業者に明らかであろう。
以下、本発明の或る態様および実施形態を、後記で説明する図面を参照しながら実施例により例示する。
酵素的プロリルヒドロキシル化による酸素調節修飾は、HIF-αを標的としてフォン・ヒッペル-リンダウ ユビキチン化複合体へ導く
本実施例においては、HIF-1αサブユニットの特異的ドメインとpVHLとの相互作用が、酸素および鉄依存的に、プロリン残基（HIF-1α P564）の酵素的ヒドロキシル化により調節されることを示す。補基質としてのジオキシジェンおよび補因子としての鉄を該酵素が絶対的に要求することは、細胞の酸素センシング（sensing）の直接的なメカニズムを示唆している。
HIF-α/pVHL相互作用に関するこれまでの研究において、本発明者らは、コバルトイオンおよび鉄キレーターを用いた細胞の処理がHIF-α/pVHL会合を妨げることを見出したが、このことは、酸素センシングメカニズムがこのタンパク質相互作用に直接的に影響を及ぼしうることを示唆している（8）。驚くべきことに、これらの研究は、低酸素細胞からはHIF-α/pVHL複合体が無傷のまま回収されうることを示した。酸素化細胞におけるHIF-αのpVHL依存的タンパク質分解が迅速であると仮定して、本発明者らは、細胞溶解中の細胞抽出物の再酸素化が、観察されたHIF-α/pVHL相互作用をin vitroで促進した可能性があると考えた。これを確かめるために、本発明者らは、低酸素状態にさらされ低酸素実験室中で脱酸素バッファーを使用して回収された、又は低酸素状態にさらされ通常の方法で回収された35S-メチオニン/システイン標識細胞の抽出物において、pVHL免疫共沈降実験を繰返した（18）。
実験は、赤血球凝集素（HA）で標識されたVHLを発現する、安定にトランスフェクトされた腎癌細胞（RCC4/VHL.HA）上で行った（11）。pVHLを欠くRCC4細胞を対照として使用した。プロテアソームインヒビターMG132の存在下、酸素正常状態または低酸素状態で4時間にわたり、RCC4/VHL.HA細胞を35S-アミノ酸で標識した。低酸素実験室中またはベンチ上で細胞を氷上で細胞溶解した。RCC4細胞も同様に標識し細胞溶解し、標識および細胞溶解の両方を酸素正常条件下で行った。pVHLおよび会合タンパク質を抗HA抗体で捕捉した。既に報告されているとおり（8）、抗HA免疫沈降体は、プロテアソーム的に遮断された酸素正常状態の細胞からは、HIF-αサブユニット（HIF-1αおよびHIF-2α）を効率的に捕捉した。一方、低酸素RCC4/VHL.HA細胞を低酸素条件下で細胞溶解した場合には、HIF-αサブユニットは、HIF-1α免疫ブロットにより示されるとおり該溶解物中に豊富に存在するにもかかわらず、pVHLと共に共沈しなかった。これは、脱酸素化されていない通常のバッファーを使用した場合の結果（この場合、HIF-αサブユニットが非常に効率的に捕捉された）とは対照的であった。pVHLならびにエロンギンBおよびCの捕捉は全てのRCC4/VHL.HAサンプルにおいて類似していることが判明した。
既に公開されているデータと総合すると、これらの結果は、酸素および鉄の利用能（およびコバルトイオンによる阻害）による調節の古典的な特徴がin vivoでのHIF-α/pVHL相互作用において反映されていること、および酸素により媒介される相互作用の促進が細胞抽出物の調製中に迅速に生じうることを示している。
1.1 HIF-α/pVHL相互作用の酸素感受性
35S-メチオニン標識HIF-1αサブユニットおよびpVHL.HAを網状赤血球溶解物（網状赤血球溶解液）中でIVTT（in vitro転写および翻訳）により産生させ分離した。IVTTを種々の条件下で行い、混合し、相互作用を抗HA免疫共沈降によりアッセイした。これらのin vitroアッセイは、該組換えタンパク質を使用するHIFα/pVHL相互作用の分析を可能にした。
Co(II)、デスフェリオキサミンまたはFe(II)の存在下または非存在下、網状赤血球溶解物（IVTT）中で標識HIF-1αおよびpVHL.HAを別々に調製した。溶解物を種々の組合せで混合し、抗HA免疫沈降により相互作用をアッセイした。HIF-1α IVTTにおけるFe(II)（塩化第一鉄、100μM）の添加は、pVHL.HAによる捕捉を著しく増加させ、一方、Co(II)（塩化第一コバルト、100μM）またはデスフェリオキサミン（DFO、100μM）を該HIF-1α IVTTに加えると捕捉が著しく減少することが見出された。これとは対照的に、これらの種々の条件下で行ったpVHL IVTTは、HIF-1α相互作用の支持において、全て同等に有効であった。
低酸素条件下のIVTTの産生の効果を確認するために、更なる実験を行った。外界条件下または低酸素実験室中、Fe(II)の存在下または非存在下、IVTT反応において標識HIF-1αを調製した。ついでサンプルを低酸素実験室中でバッファーで希釈し、精製組換えGST-VHL-エロンギンC-エロンギンBを加えた。グルタチオン-アガロースを使用して、VHLおよび会合タンパク質を捕捉した。示された結果によると、HIF-1α IVTTを低酸素条件下で調製した場合には、低酸素状態は、pVHLと相互作用するそれらの能力を減少させ、これは、後者が、酸素正常または低酸素IVTTとして、あるいはpVHLとエロンギンBおよびCとの細菌発現複合体として産生されるかどうかには無関係であった。
次に、pVHLとの相互作用の調節が、残基556-574を含む最小pVHL結合HIF-1α部分配列によっても支持されることを示すために、特定のHIF部分配列を有するGal4/VP16融合タンパク質の網状赤血球IVTTを使用した。HIF-1αのアミノ酸残基556-574、549-574、556-582または549-582を有する融合体を、添加したFe(II)の存在下または非存在下、網状赤血球溶解物中で発現させた。該融合タンパク質は、Gal4 DNA結合ドメインとVP16トランス活性化ドメインとの間のHIF-1α配列を含んでいた。対照として、HIF-1α配列を含有しない融合体も評価した。抗HA免疫共沈降によるpVHL.HAとの免疫共沈降に関してアリコートを評価した。試験したHIF-1α部分配列の最も短い領域を含む融合体（これは残基556-574を含む）を含め、HIF-1α部分配列を有する融合体のすべては、pVHLによる鉄依存性認識を示した。HIF-1α配列を欠く対照融合体は、鉄の存在下または非存在下のいずれにおいてもpVHLを認識しなかった。
これらの知見を更に理解するために、種々の原核性および真核性発現系（20）において産生された一連の組換えpVHLおよびHIF-1α産物が相互作用する能力を調べた。すべてのpVHL産物は、哺乳類発現系から誘導されたHIF-1αと相互作用することが可能であった。これに対して、HIF-1αは、in vivoで組織培養細胞内で又は網状赤血球IVTT内で産生された場合にのみ、相互作用することが可能であり、細菌、コムギ胚芽溶解物または昆虫細胞内で産生された場合には、相互作用することが不可能であった。総合すると、これらの結果は、哺乳類細胞抽出物中の或る因子が、特異的HIF-1α配列との相互作用を促進するのに必要であったこと、およびこの因子が、鉄および酸素に依存した様態で作用したことを示している。
1.2 HIFとVHLとの相互作用を促進する活性の修飾
これを更に分析するために、DFOの存在下で調製したIVTT反応物から、HIF-1αの残基549-582を発現するGal/HIF-1α/VP16融合タンパク質を、抗Gal抗体を使用して免疫精製した。非標識HIF-1α基質をビーズ上で免疫精製し、洗浄し、種々の試験条件下、バッファーまたは細胞抽出物中でアリコートをインキュベートした。更に洗浄した後、該ビーズを、35-S標識pVHL IVTT（21）と相互作用する能力に関してアッセイし、ついでそれをフルオログラフィーにより可視化した。該HIF融合タンパク質をFe(II)の存在下で細胞抽出物にさらした後では、pVHLを捕捉する能力の増強が認められたが、細胞抽出物を伴わずにFe(II)にさらした後では、そのような増強は認められなかった。細胞抽出物およびFe(II)にさらした後のpVHL捕捉能の増強は酸素依存的であることも判明した。同様の実験において、種々の哺乳類細胞（Hela、RCC、CHO-K1およびウサギ網状赤血球溶解物）から調製した抽出物中には該修飾活性が存在するが、昆虫細胞溶解物は哺乳類HIF融合タンパク質に対して実質的に不活性であることが判明した。該細胞抽出物のFe(II)依存的活性は冷却により減少し、60℃で10分間の予備加熱により妨げられた。該修飾活性は5kDa限外濾過膜を通過しなかった。Fe(II)添加の滴定は5μMで完全な活性化を示した。ATPを枯渇させるために該細胞抽出物をヘキソキナーゼ（50U/ml）およびグルコース（50mM）と共にプレインキュベーションしても、活性は変化しなかったが、この処理は、対照標的をリン酸化する該細胞抽出物の能力を妨げた。クロトリマゾール（10μM）、メチルビオローゲン（1mM）またはNADアーゼ（20mU/ml）による抽出物の前処理は活性に有意な影響を及ぼさなかった。
また、昆虫細胞内で発現されたPKエピトープ標識HIF-1α（PK.HIF）をHIF基質として使用して、実験を行った。RCC4細胞抽出物および網状赤血球溶解物は共に、Fe(II)の存在下、野生型pVHLを捕捉するHIFの能力は促進したが、突然変異(Pro86His)pVHLを捕捉するHIFの能力は促進しなかった。したがって、昆虫細胞内で産生されたヒトHIF-1αは、突然変異体pVHLとの相互作用を促進するためではなく野生型pVHLとの相互作用を促進するために、哺乳類抽出物での処理を要した（22）。RCC4細胞抽出物へのNaClの添加（最終濃度1Mまで）は該修飾活性を阻害したが、該細胞抽出物にさらした後のNaCl（1M）中のPK-HIFのインキュベーションは、後のそのpVHL捕捉能を変化させなかった。同様に、抽出物にさらすことにより修飾した後の該HIF融合タンパク質をホスファターゼまたはDFOで処理しても、pVHLの捕捉は妨げられなかった。総合すると、このことは、リン酸化ではないHIF-1αの酵素媒介修飾を示唆した。
1.3 HIF-1α認識の研究
図1Aは、HIF-αホモログ中の公知または推定pVHL結合ドメインのアラインメントを示す。pVHLと相互作用する能力に対するヒトHIF-1αにおける選択された点突然変異の効果も調べた。野生型（WT）および修飾完全長HIF-1α分子（D556N, D558N, D560Q, P564G, Y565A, P567G, M568R, D569NおよびD570Nを有するもの）を網状赤血球溶解物中で調製し、VHL.HAとの相互作用に関して抗HA免疫沈降により調べた。調べた置換のうち、保存されたプロリンの突然変異であるPro564Glyは相互作用を完全に阻止し、Tyr565Alaは該相互作用を減少させたが、他の突然変異は相互作用にほとんど影響を及ぼさないか又は相互作用を更に増強した。
HIF-1α/pVHL相互作用のインヒビターとして合成ポリペプチドを使用して、更なる研究を行った（23）。アミノ酸549-582を含む34残基の配列は、pVHL.HAとHIF-1α IVTTとの相互作用混合物に加えられた場合には、相互作用を遮断することができなかった。しかし、Fe(II)を添加した細胞抽出物にさらすと、遮断活性が顕著に誘導された（図1B）。遮断活性の誘導は、pVHLと組換えHIFタンパク質との相互作用の促進に関して確認されているのと全く同じ特徴を示した。このドメインから誘導された一連のポリペプチドに関する結果を図1Bに要約する。その結果は、同様の最小相互作用ドメインに関連している。Fe(II)を添加した細胞抽出物にさらした後に遮断活性を有することが示されたポリペプチドの1つは、19:WTであった。このポリペプチドはHIF-1αポリペプチドの残基556-574を含み、種々の直接酸化条件にさらした後に結合を遮断する能力を評価した。ポリペプチドを過酸化水素（1mM）と共にFe(II)（100μM）に、NADH（1mM）と共にNADHオキシダーゼ（1U/μl）に、NADH（1mM）と共にNADH-FMN酸化還元酵素（7mU/μl）に、またはメタクロロ安息香酸（1mM）にさらしても、該遮断活性は促進されなかったが、鉄を含有する細胞抽出物にさらすと、促進された。
要約すると、予め酵素的修飾を行わなければ、いずれのポリペプチドも該相互作用を遮断することが不可能であり、遮断活性は、種々の直接酸化系によっても誘導されることが不可能であり、Tyr565のリン酸化は、抽出物が遮断活性を促進する能力に影響を及ぼさず、突然変異配列Pro564Glyは、抽出物にさらされた後であっても、HIF-1α/pVHL相互作用を遮断しなかった。
抽出物で処理された合成ポリペプチドおよび組換えHIF（昆虫細胞内で発現させ、ついで、pVHL結合能を促進するために哺乳類抽出物で処理したもの）の質量分析（24）（MALDI-Tof）は、この配列に由来するイオンにおける+16Daの質量シフトにより示されるとおり、幾つかの酸化を示唆した。MS/MS（ESI-QTof）による更なる分析は、Pro564およびその近傍のメチオニン残基に影響を及ぼす酸化を示した。該メチオニン残基は保存されていないか、又は影響を及ぼすことなく突然変異しうること、およびメチオニンを効率的に酸化することが知られている直接酸化法は該酵素活性を効率的には模擬し得なかったことから、本発明者らは、このHIF-1α配列とpVHLとの相互作用を促進する酵素的酸化がPro564の酸化であると仮定した。
1.4 合成ポリペプチド中へのヒドロキシプロリンの組み込み
本発明者らは、564位にtrans-4-ヒドロキシ-S-プロリン残基を含有するポリペプチド（HIF-1α残基556-574）（19:Pro564Hyp）を合成した。なぜなら、trans-4-ヒドロキシル化は、最も一般的な酵素的プロリン酸化だからである（25）。19:Pro564Hyp修飾ポリペプチドを使用して、さらには、trans-4-ヒドロキシル化を含有しない未修飾ポリペプチド（19:WT）を対照として使用して、ポリペプチド遮断アッセイを行った。19:WTポリペプチドを、結合アッセイの前に細胞抽出物と共にインキュベートするか、または未処理のままとした。19:Pro564Hypポリペプチドを1、0.25、0.05または0.01μMの濃度でHIF-1αとpVHL-HA IVTTとの混合物に加え、細胞抽出物で処理された又は未処理の19:WTポリペプチドを0.5μMの濃度で該混合物に加えた。ついでHIF-1αとpVHLとの相互作用を抗HA免疫沈降によりアッセイした。該ヒドロキシプロリン置換ポリペプチド（19:Pro564Hyp）は、細胞抽出物による修飾を行わなくても、HIF-1α/pVHL相互作用の抑制において非常に有効であった。該19:WT対照非置換等価ポリペプチドは、予想どおり、相互作用の抑制には細胞抽出物を要することを示した。遮断ポリペプチドを使用しないで行った対照反応は、予想どおり、HIF-1αがpVHL-HAに結合することを示した。ついでビオチン化合成ポリペプチドを使用して、pVHL捕捉アッセイを行った。同じポリペプチド19:Pro564Hypおよび19:WTを、野生型または突然変異（Pro86His）pVHLを捕捉する能力に関して評価した。19:WT対照ポリペプチドは、細胞抽出物と共にインキュベートされた後においてのみ、pVHLを捕捉し、一方、19:Pro564Hypは、前処理なしで、野生型pVHLを捕捉した。どちらの場合も、捕捉は野生型pVHLには特異的であったが、突然変異pVHLには特異的ではなかった。
要約すると、既に試験されているポリペプチドとは著しく異なり、19:Pro564Hypは、細胞抽出物にさらさなくてもHIF-1α/pVHL相互作用を遮断した。さらに、19:Pro564Hypのビオチン化体は野生型pVHLを特異的に捕捉したが、突然変異pVHLを特異的に捕捉せず、pVHLを捕捉するその能力は、細胞抽出物と共にインキュベートしても、それ以上は増強されなかった（26）。これに対して、等価未修飾合成ポリペプチド19:WTは、細胞抽出物と共に予めインキュベートしなければ相互作用することができなかった。
これらの結果は、HIF-1αとpVHLとの相互作用を促進する酵素活性が、HIF-αプロリル-ヒドロキシラーゼ（HIF-PH）と称されるプロリル-4-ヒドロキシラーゼであることを示している。これまでに記載されている全てのプロリル-4-ヒドロキシラーゼは、2-オキソグルタル酸依存性および関連ジオキシゲナーゼのスーパーファミリーのメンバーである（27）。前記で示したデータに符合して、これらの酵素はいずれも、ATPまたはNAD(P)に対しては絶対的要求性を有さないが、それらは、補因子としてのFe(II)および補基質としてのジオキシジェンに対しては絶対的要求性を有する（27）。該クラス内の構造的研究は、HXD/E...Hモチーフにより配位される非ヘム鉄中心を明らかにした（28）。興味深いことに、また、本発明者らの知見と符合して、Fe(II)は強固に結合しているわけではなく、キレーターにより容易に除去することが可能であり、Fe(II)をCo(II)またはNi(II)で置換した後には酵素阻害が生じる（25）。
1.5 HIF-PH活性に対するアスコルビン酸添加および種々のインヒビターの効果
種々のHIF基質による標識pVHLの捕捉を、種々の試験条件への曝露の後にモニターした。
Gal/HIF-1α549-582/VP16融合タンパク質基質によるpVHL捕捉に対するアスコルビン酸の効果をモニターしたところ、アスコルビン酸（2mM）は細胞抽出物の修飾活性を増強するが細胞抽出物の非存在下では何ら効果を及ぼさないことが判明した。したがって、アスコルビン酸はHIF-PHの活性を増強する。
本発明者らは引き続き、このクラスの酵素の競合インヒビターとして作用する一連の2-オキソグルタル酸類似体（29）を、HIF-PHを抑制する能力［これは、細胞抽出物がHIFポリペプチド（19:WT）またはHIF融合タンパク質（Gal/HIF-1α549-582/VP16）を修飾してpVHLの捕捉を促進する能力により評価される］に関して試験した。両方のHIF配列源について、一致した結果が得られた。1つのそのような実験においては、基質としてのビオチン化HIFポリペプチドによるpVHL捕捉に対するN-オキサリルグリシンの効果をモニターした。前記のWT:19および19:Pro564Hypポリペプチドを基質として使用した。N-オキサリルグリシン（0.2〜1mM）は、19:WTに対する細胞抽出物の修飾活性を完全に抑制することが判明した。N-オキサリルグリシンによる抑制は5mM 2-オキソグルタル酸の添加により覆された。これまでと同様に、19:Pro564Hypは、細胞抽出物により修飾しなくてもpVHLを効率的に捕捉し、これはN-オキサリルグリシンへの曝露によっては影響されなかった。同様に2-オキソグルタル酸により競合される同様の抑制が、N-オキサリル-2S-アラニンでは観察されたが、そのエナンチオマーであるN-オキサリル-2R-アラニンでは観察されず、このことは、該効果が溶液中の単なるFe(II)キレート形成によるものではなかったことを示している。また、本発明者らは、クエン酸回路により生成された2-オキソグルタル酸を細胞抽出物から除去するために、2-オキソグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼであるフィタノイル-CoA α-ヒドロキシラーゼ（30）を、容易に入手可能な非天然基質（イソバレリルCoA）（31）と共に使用した。予想どおり、これは、HIFポリペプチドの後続の修飾を妨げた。HIF-1αの発現に対するジメチル-オキサリルグリシンの効果も調べた。ジメチル-オキサリルグリシン（0、0.1または1.0mM）に6時間さらしたHep3BおよびU2OS細胞の抽出物のHIF-1α免疫ブロット分析を行った。HIF-1αは酸素正常培養条件下で強力に誘導されることが認められた。
プロリル-4-ヒドロキシラーゼは多数の生物において同定されている。哺乳類細胞においては、これらはα2β2四量体を形成し、該四量体中のβサブユニットは多機能タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（27）と同一である。これらの酵素は小胞体におけるコラーゲン修飾において機能し、コラーゲンの反復配列、典型的には(Pro-Pro-Gly)n中のプロリル残基に対して厳格な基質特異性を有すると報告されている（27）。HIFポリペプチドは、組換え[α1またはα2]ヒトプロリル-4-ヒドロキシラーゼに対する基質として試験した場合には、全く活性を示さなかった（32）。総合すると、これらの知見から、HIF-PHは、pVHLユビキチンリガーゼ系によるHIF促進性認識を特徴づける新規プロリル-4-ヒドロキシラーゼであると仮定することができる。そのような酵素は補基質として分子状酸素を利用するため、これは酸素の直接的センシングのメカニズムを予想させるものである。これを確かめるために、他の補因子を添加した場合における、HIF-PH活性（これは、pVHL捕捉を促進するようGal/HIF-1α549-582/VP16融合タンパク質を修飾する能力により評価される）に対する低酸素の効果を調べた。外界条件下または低酸素実験室中、HIF基質を細胞抽出物（2mM アスコルビン酸および10μM Fe(II)を添加したもの）と共に1、2、5または10分間、30℃でインキュベートした。該反応をDFOでの洗浄により停止させ、該HIF基質を、pVHLと相互作用する能力に関してアッセイした。捕捉の時間依存的増加が酸素正常状態において認められ、低酸素状態による著しい活性抑制が認められた。
1.6 実施例1の総括
したがって、本発明者らの知見は、pVHLユビキチン化複合体との相互作用を調節するタンパク質修飾の新規方法を例示するものであり、酵素によるプロリルヒドロキシル化が分子状酸素のセンサーとして直接的に作用しうることを示している。2-オキソグルタル酸依存性オキシゲナーゼの公知特性は、鉄キレーターまたはコバルトイオンによる低酸素状態の模倣の古典的特徴を容易に説明するものである。これまでに、これらの知見に関して2通りの解釈が提示されている。第1に、酸素センシング鉄中心における第一鉄イオンが第一コバルトイオンで置換されうることが提示されている（15）。ほとんどの鉄中心（例えば、ヘム、および鉄硫黄クラスターの大部分）はこのようには置換されないため、そのようなタンパク質は迅速に代謝回転しているに違いないと提唱された。第2に、第一コバルトイオンおよび鉄キレーターは、フェントン化学を妨げ反応性酸素分子種を介してシグナル伝達することにより作用しうると仮定されている（17, 33）。例えば、局所的フェントン化学により特定のアミノ酸を酸化的に修飾する非酵素的「金属触媒酸化」系も鉄キレーターおよび非鉄遷移金属イオンにより抑制されるが（34）、このことは、該HIF系に対するこれらの物質の効果に関するもう1つの仮定を提供するものである。明らかに、プロリル-4-ヒドロキシラーゼと会合した不安定な鉄中心は、該センサーの迅速な代謝回転を提示するまでもなく、元の鉄中心置換の仮定を受け入れうるものである。これとは対照的に、本発明者らは、HIF-α配列とpVHLとの特異的相互作用を種々の非酵素的酸化系により促進することを何度も試みたが、それは達成されなかった。本発明者らのその証拠は、プロリンヒドロキシル化の酵素的メカニズムを明らかに示している。本発明者らの知見は直接酸化過程を排除するものではなく、また、HIFシグナル伝達に関与する他の分子上または実際には酵素的プロリルヒドロキシル化複合体の成分上の他の部位においてHIFに影響を及ぼす他の酸素センシング系を排除するものではない。本発明者らの証拠は、HIF-PHが、コラーゲン修飾に関連した[α1およびα2]プロリル-4-ヒドロキシラーゼとは異なることを示しているが、これらの酵素がβサブユニットとしてタンパク質ジスルフィドイソメラーゼを利用していてスルフヒドリル酸化還元化学に対する潜在的関連性を示していることは興味深い。同様に興味深いことに、最近、P4HA1がHIF応答性であることが示され（35）、このことは、持続的な低酸素状態においては、HIF-PH活性の同様の低酸素誘導がHIFをダウンレギュレーションし、HIF応答の受け入れに寄与しうることを示唆している。
pVHL多タンパク質複合体はユビキチンリガーゼのSCFクラスに属し、pVHLはFボックス様基質認識成分として作用する（36, 37）。現在のところ、Fボックスタンパク質による認識の、特徴づけられている具体例は、標的配列のリン酸化により調節されている。さらに、HIF-1αはリン酸化タンパク質であり、リン酸化はHIFの調節に関与している（38, 39）。本発明者らの知見は、HIF-αのリン酸化がpVHL認識に影響を及ぼしうるという可能性を排除するものではないが、該知見は、ここで調べられている最小相互作用ドメインの認識における鍵事象がPro564の酵素的ヒドロキシル化であることを示している。これは、Fボックスクラスのユビキチンリガーゼに対する基質認識を調節する新規メカニズムを定めるものである。さらに、進化的に保存されたプロリン残基がHIF-αサブユニット中の多数の他の部位において認められること、およびHIF-1αの他の内部領域が酸素依存性破壊を伝達しうること（6）は興味深い。他の研究において、本発明者らは、pVHL依存性ユビキチン化を支持し機能的に決定的に重要なプロリン残基を含有するHIF-1α酸素依存性分解ドメインのN末端部分内のもう1つのサブドメインを明らかにしている。さらに、本発明者らは、シー・エレガンス（C. elegans）において、機能的に保存されたpVHL/HIF系の存在を確認しており（後記を参照されたい）、ceVHL/ceHIF相互作用における、保存されたプロリン残基の決定的な重要性を示している（図1Aに示されている）。
総合すると、これは、同様の特徴的な修飾がHIF-1α分子中の他のどこかに生じる可能性があり他のドメインの酸素感受性特性に寄与しうることを示唆している。迅速な代謝回転を伴ういわゆる「PEST」ドメインの部分を形成する残基上で他の分子においてプロリンヒドロキシル化が生じるかどうかについても、現在関心が持たれている（40）。同様に、該プロリル修飾がpVHL媒介ユビキチン化に比較的特異的であれば、該新規知見は、pVHL腫瘍抑制機能において重要である他の基質を明らかにするのに役立つであろう。
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18. 低酸素状態（<0.1％酸素）は、O<SUB>2、CO2および温度が制御された実験室（Ruskinn Technologies, Leeds, UK）内で得た。低酸素状態で回収を行うためには、バッファーを該チェンバー内で一晩プレインキュベートした。RCC4-VHL.HA標識条件および免疫共沈降アッセイは既に記載されており（11）、本研究においては、プロテアソーム阻害のために12.5μM MG132を使用した。標準的な回収のために、該細胞を、低酸素状態にさらした後、細胞溶解の前に、該チェンバーから取り出した。すべての溶解物に関する免疫共沈降アッセイは、外界酸素条件下、4℃で行った。該細胞溶解および免疫沈降バッファーにデスフェリオキサミン（100μM）を加えても、pVHLと共に共沈するタンパク質種が変化しないことが、平行実験で確認された。
19. TNT網状赤血球溶解物（Promega）を調製するためにpcDNA3.VHL.HAおよびpcDNA3.HIF-1α.PKを使用した。低酸素状態での調製の場合には、反応混合物を該実験室内で10分間プレインキュベートした後、該DNA鋳型を加えた。外界酸素化における転写／翻訳のために、該実験室からアリコートを取り出した。相互作用アッセイは、既に記載されているとおり（11）に行った。
20. 使用したタンパク質発現系は、pcDNAに基づくベクターを使用して調製されたコムギ胚芽溶解物（Promega）、組換えバキュロウイルス（PK.HIF-1α(344-698)およびPK.HIF-1α(1-826)をコードするpFastBac1, (GibcoBRL)）を使用する昆虫細胞発現、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST-VBC複合体）およびマルトース結合タンパク質融合体（pMAL-HIF-1α(344-698)）としての細菌発現であった。昆虫細胞発現では、Sf9細胞（GibcoBRL）に、回収前に60時間感染させた。
21. 非標識メチオニンの存在下、網状赤血球溶解物を調製するために、pGal/HIF-1α549-582/VP16を使用した。該融合タンパク質産物を、抗Gal4抗体RK5C1で予めコーティングされたビーズ（Santa Cruz）で免疫精製した。NETNバッファーで洗浄した後、実験的曝露を低張抽出バッファー（HEB: 20 mM Tris pH7.5, 5mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 1mM DTT）、またはHEB中で調製した細胞溶解物に対して行った。インキュベーションは、特に示さない限り、22℃で60分間行い、ついで該ビーズを、DFOを含有するNETNで洗浄し、pcDNA3.VHL.HAを使用して調製された5μlのウサギ網状赤血球溶解物と共に、NETN+DFO中、4℃で2時間インキュベートした。
22. バキュロウイルスPK.HIF-1α（1-826）またはPK.HIF-1α（344-698）を抗PK抗体（Serotec）で免疫沈降させた。ビーズに結合した免疫沈降物を洗浄し、ついで試験細胞溶解物と共にインキュベートし、ついで該免疫沈降物をDFO含有NTENで再洗浄し、pVHLと共にインキュベートし、相互作用に関してアッセイした。
23. ポリペプチド抑制アッセイのために、ポリペプチドを、HIF-1αとpVHL.HAとの混合物を含有するNETNバッファーに加えた。ポリペプチドの最終濃度は、特に示さない限り、1μMとした。細胞抽出物または他の条件におけるポリペプチドのプレインキュベーションは30℃で60分間行った。
24. 質量分析用のサンプルは、ビオチン化合成ポリペプチド19:WT（残基
556-574）もしくは34:WT（残基549-582）、または昆虫細胞溶解物から回収されたPK標識HIF-1αであった。哺乳類細胞溶解物による修飾後、該物質をストレプトアビジン／ビオチン捕捉（合成ポリペプチド）または抗PK免疫沈降およびSDS-PAGEにより精製した。タンパク質分解消化は、ビーズ上またはゲル内で、トリプシンおよびV8プロテアーゼを用いて（pH7.8）、またはV8プロテアーゼ（pH4.5）を用いて行った。サンプルを凍結乾燥し、水性0.1％ TFAに溶解した。ポリペプチドを濃縮し、内径300μm/長さ5mmのC18 PepMapカラム（LC Packings, San Francisco, CA, USA）にて脱塩し、80％ アセトニトリルで溶出した。HPLC（CapLC, Waters, Milford, MA, USA）を、Nano-LC注入口を介して、ナノエレクトトスプレーZ−スプレー源を備えたQ-Tof質量分析計（Micromass, Manchester, UK）に接続した。溶出したポリペプチド混合物を、自動化MS-MS/MS切替プロトコールを用いるタンデム質量分光シークエンシングにより分析した。前駆体イオンの質量のオンライン測定を、30Vのコーン電圧の正電荷検出モードにおいて、300〜1200原子質量単位のm/z範囲にわたって行った。MS/MSによるポリペプチドシークエンシングのための衝突解離を、20〜40eVアルゴンガスおよび3Daの四重極分解で行った。
25. K. I. Kivirikko, R. Myllyla, in The Enzymology of Post-translational Modification of Proteins R. B. Freeman, H. C. Hawkins編, (Academic Press, London, 1980) pp. 53-104.
26. ビオチン化ポリペプチドを使用するpVHL捕捉アッセイでは、該ポリペプチドをVHL.HAと4℃で30分間相互作用させ、ストレプトアビジンビーズで沈降させた。該細胞抽出物またはバッファーの存在下の試験条件下でのプレインキュベーションは30℃で30分間であった。
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31. M.Mukherji, M.D.Lloydら 未公開の観察.
32. 昆虫細胞内で発現された組換えヒトI型およびII型プロリル 4-ヒドロキシラーゼを使用する2-オキソ[1-14C]グルタル酸のヒドロキシル化共役脱カルボキシル化に基づく方法（Kivirikko, K.I., Myllyla, R.: Posttranslational enzymes in the biosynthesis of collagen: intracellular enzymes. Methods Enzymol., 82, 245-304, 1982）により、プロリル 4-ヒドロキシラーゼ活性をアッセイした（26）。0.5または1.0mgのポリペプチドを各反応で使用した。該アッセイはthe Collagen Research Unit, Department of Medical Biochemistry, University of Oulu, FinlandのJohanna Myllyharju博士により行われた。
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シー・エレガンスにおける低酸素誘導因子およびフォン・ヒッペル-リンダウ腫瘍抑制ホモログの同定
本実施例においては、シー・エレガンス（C. elegans）におけるHIFホモログを同定し、低酸素状態に対する転写応答、およびフォン・ヒッペル-リンダウ腫瘍抑制物質との相互作用を介した調節の重要な様態の両方が保存されていることを示す。
2.1 ホモログの同定
本発明者らは、シー・エレガンス（C. elegans）ESTデータベースにおいて、該ヒト配列を用いたtBLASTn検索を使用して、HIF-αサブユニットのホモログを探索した。シー・エレガンス（C. elegans）配列決定計画の完了前に、基本ヘリックス-ループ-ヘリックス領域内にHIF-αに対して有意な相同性を有するESTが見出され、本発明者等は、該推定ホモログに及ぶESTのコンティグを合体させた。シー・エレガンス（C. elegans）配列の完全な決定は更なる6個の推定PASタンパク質を明らかにしたが、哺乳類HIF-αに対し、より類似したマッチは示されなかった。本発明者らが同定したESTコンティグは染色体V（F38A6.3）上の推定オープンリーディングフレーム（ORF）に対応し、これは、後者における104アミノ酸のアミノ末端伸長以外は同一である。該ESTデータベースの詳細な検索は、この推定5'伸長にマッピングされるcDNAを示さなかった。該伸長に対応するPCR産物を確認することはできなかった。RACE-PCR産物は推定トランススプライストリーダー配列を含有していた。これらの知見は推定N末端伸長とは矛盾し、9個のエキソンによりコードされる719アミノ酸のタンパク質の存在を支持している。図2は、ヒトおよびシー・エレガンス（C. elegans）配列のアラインメントを示す。
2.2 シー・エレガンスにおけるHIFの調節
推定シー・エレガンス（C. elegans）HIFホモログ（ceHIF）を特徴づけるために、推定オープンリーディングフレームのヌクレオチド1366-1496を含むリボプローブを構築し、該推定タンパク質のアミノ酸360-497を含有する細菌発現組換えタンパク質に対する抗血清を産生させた。該抗血清は、該完全長cDNAを発現する発現ベクターでトランスフェクトされたCos７細胞において、適切な移動度の単一種を認識した。窒素でバランス調整した特定の酸素含量の予混ガスを流したベルジャー内でのインキュベーションにより基準気圧低酸素状態にさらされた線虫の集団から、全RNAおよびタンパク質抽出物を調製した。線虫抽出物の免疫ブロット法は低酸素状態でのceHIFの顕著な誘導を示した。
低酸素状態および鉄キレート化による調節をモニターするために、シー・エレガンス（C. elegans）の抽出物中のceHIFレベルの免疫ブロットを行った。まず、タンパク質誘導の酸素依存性を分析した。18時間にわたり空気（N）または酸素／バランス窒素（5％、1％、0.5％または0.1％の酸素濃度を有する）を流したベルジャー内のプレート上で線虫を成長させた。酸素レベルが5％未満に減少するにつれて、タンパク質レベルの段階的増加が認められ、最高レベルの誘導は0.5％および0.1％酸素濃度で認められた。ついでタンパク質誘導の時間経過を調べた。抽出物の調製の前に0、4、8、16または24時間にわたり0.1％酸素／バランス窒素混合物を流したベルジャー内で線虫を成長させた。結果は、4時間以内に強力な誘導を示し、それは24時間にわたり持続した。ついで再酸素化の際のタンパク質崩壊の時間経過を評価した。空気（N）または0.1％／バランス窒素混合物を流したベルジャー内で線虫を成長させた。再酸素化の直後または4分後および8分後に抽出物を調製した。ceHIFタンパク質の崩壊は、再酸素化に際して非常に迅速であった。タンパク質レベルは該培養の再酸素化の4分後に明らかに減少し、8分後に検出不能となった。0、4、8、16および24時間にわたり0.1％酸素／バランス窒素にさらされた線虫におけるcehif mRNAレベルを示す時間経過RNアーゼプロテクションアッセイを行った。低酸素状態によるceHIF mRNAの誘導は全く認められなかった。したがって、ceHIF発現は、タンパク質レベルでは低酸素状態により強力に誘導されたが、mRNAレベルではそうではなく、これは、哺乳類HIF-αサブユニットに関して記載されているのと非常に類似している。哺乳類細胞においては、HIF-αタンパク質は、低酸素状態ならびに鉄キレート化剤によっても強力に誘導されたが、この特徴は、鉄および酸素の相互作用が酸素センシングの基本的メカニズムの中心をなすことを示唆している。シー・エレガンス（C. elegans）においても、鉄キレート化による誘導を調べた。浸透性二座鉄キレーターである2',2'ジピリジル（200μM）の存在下または非存在下、線虫を液体培地内で6または16時間培養した。6時間および16時間の両方の時点で鉄キレート化によるceHIFの顕著な誘導が観察され、その誘導レベルは、重度の低酸素状態で観察されたものと同等であった。ceHIFは鉄キレート化の非存在下では誘導されなかった。
2.3 VHLの保存された役割
哺乳類HIF-αサブユニットタンパク質レベルの調節は、1以上のユビキチン媒介酸素調節タンパク質分解系を介して生じる。現在のところ、これらのうちで最も明らかにされているものはフォン・ヒッペル-リンダウ腫瘍抑制タンパク質（pVHL）を含み、これは特定のHIF-1α残基と物理的に相互作用し、E3ユビキチンリガーゼの認識成分として作用する。VHL欠損腎癌細胞においては、HIF-αサブユニットは構成的に安定化され、酸素正常状態において、著しく高い定常レベルに至る。最近、データベース解析と、23％のアミノ酸同一性を示す配列アラインメントとに基づき、シー・エレガンス（C. elegans）における推定pVHLホモログが提示された。この場合に行われたシー・エレガンス（C. elegans）におけるHIF調節の解析は、pVHLの保存された役割を示している。
HIF調節におけるpVHLの機能も保存されている可能性があるかどうかを確認するために、本発明者らは、まず、相互作用に関して試験した。35-S標識ceHIFおよびHAタグ付きpVHLをウサギ網状赤血球溶解物中でIVTTにより合成し、ついで該ceHIFおよび／またはタグ付きpVHLを線虫抽出物の存在下または非存在下でEBCバッファーに加えた後、抗HA抗体での免疫沈降を行った。該組換えceHIF IVTTを線虫抽出物とプレインキュベートした場合にのみ、ceHIFとpVHLとの免疫共沈降が観察された。興味深いことに、網状赤血球溶解物中で産生された哺乳類HIF-αはpVHLと相互作用するだろうが、本発明者らは、これが、シー・エレガンス（C. elegans）抽出物によってではなく他の哺乳類細胞抽出物により置換されうる赤血球溶解物中の因子に依存していることを見出した。ヒト系とシー・エレガンス（C. elegans）系とは相同であるらしいが、このことは、HIF/pVHL相互作用を促進する種特異的修飾因子の存在を示唆している。ceHIFに対する短い保存領域を示す伝達可能な酸素依存性分解ドメイン（ODDD）内の部分配列を介して、哺乳類pVHLはHIF-αを認識する。この機能的重要性を調べるために、本発明者らは、哺乳類相互作用に決定的に重要な保存されたプロリン残基を突然変異させ、それをグリシンにより置換した。野生型ceHIFはタグ付きpVHLと相互作用することが可能であったが、該ceHIF Pro621→Gly突然変異型はpVHLと相互作用することはできず、このことは哺乳類HIFに関する知見を反映している。
つぎに、ceVHLとceHIFとの相互作用の機能的重要性を追跡するために、本発明者らは、ceVHLを欠く生存可能なホモ接合欠失突然変異体線虫を使用し、免疫ブロット法によりceHIFに関して線虫抽出物をアッセイした。酸素正常状態のceVHL線虫においては、ceHIFレベルは顕著にアップレギュレーションされ、酸素による調節は本質的に生じず、これは、高酸素状態（80％ O2）、空気および低酸素状態（0.1％ O2）において類似していた。したがって、酸素に対する応答におけるpVHLの決定的に重要な機能も保存されているらしい。驚くべきことに、ceVHL欠損線虫は表現型上は比較的正常であり、野生型と比較して成長速度が若干遅くおよび生殖能が軽度に低い。
HIF/pVHL系のこの厳密な保存は、シー・エレガンス（C. elegans）が、HIFを調節する酸素センシングおよびシグナル伝達経路の分析のための並びに遺伝子発現のパターンに対する下流効果の分析のための新規モデルとなることを示している。この可能性を探る第1段階として、本発明者らは、該センシング／シグナル伝達経路内の候補分子を試験するために選択された突然変異体線虫において、低酸素状態によるceHIFの誘導を評価した。HIF/pVHL複合体との相互作用の原因および様態は不明であるが、多数の研究が酸素ラジカルの関与を裏づけている。他の研究は、特定の増殖因子シグナル伝達経路がHIFの調節に関与していることを示唆しているが、該酸素感受性シグナルに対するこれらの知見の関連性は不明である。研究の1つの系統において、インスリンおよびインスリン様増殖因子が酸素正常状態の細胞においてHIFを活性化しうること、腫瘍抑制物質PTENがHIFの負の調節因子として作用すること、ならびにPTENの下流標的であるAktが酸素依存性リン酸化を示すことが判明しており、これらのことは、インスリン受容体/PI3-キナーゼ経路がHIFの調節に関与していることを示唆している。この経路はシー・エレガンス（C. elegans）において保存されており、興味深いことに、ROS代謝に関与している。したがって、本発明者らは、いくつかの突然変異体を、ceHIFとVHLとの相互作用に対するそれらの効果を確認するために試験した。
野生型および一連の突然変異体線虫におけるceHIFのレベルを免疫ブロット法により測定した。6時間にわたり酸素正常（21％酸素）または低酸素（0.1％酸素）ガス混合物を流したベルジャー内のプレート上で線虫を成長させた。予想どおり、vhl突然変異体線虫は酸素分圧には無関係に高レベルのceHIFタンパク質を有することが判明した。vhl突然変異体線虫とは対照的に、突然変異体daf-18（PTENホモログをコードしている）、daf-2（インスリン受容体ホモログをコードしている）およびage-1（PI3-キナーゼホモログをコードしている）はすべて、野生型と同様の酸素によるceHIFの調節を示した。ceHIFに対する効果に関してスクリーニングするその他の突然変異体は、ROS代謝に対する既知効果、またはオキシダントストレスに対する表現型感受性の変化に基づいて選択した。それらには以下のものが含まれた：ミトコンドリアタンパク質に影響を及ぼすいくつかの突然変異体（mev-1, clk-1, gas-1）、サイトゾルカタラーゼ活性に影響を及ぼすctl-1突然変異体、および他の突然変異体（mev-2, mev-3）(該産物は未だ特徴づけられおらず、この場合も、調節は野生型に類似しており、このことは、これが、シー・エレガンス（C. elegans）においてはオキシダント防御の一般的な系と密接には関連していない異なる酸素センシング系であることを示唆していた)。
哺乳類系においてHIFが酸素正常状態でpVHLにより認識され、ついでユビキチン化され、プロテアソームにより破壊される際のHIF中のプロリル残基の酵素的ヒドロキシル化の決定的な役割を示す本明細書に記載のデータを考慮して、本発明者らは、公知プロリルヒドロキシラーゼ（dpy-18およびphy-2）中の突然変異、およびプロリルヒドロキシラーゼとしての機能に適合した配列モチーフを含有する遺伝子（F22E12.4に位置するegl-9）を有する線虫をも試験した。HIF活性に対するプロリルヒドロキシラーゼ突然変異体の効果をブロッティングにより調べた。酸素正常状態（21％酸素）および低酸素状態（0.1％酸素）で成長させた野生型および突然変異体線虫から、抽出物を調製した。SDS/PAGE上での分離後、ceHIFに関する免疫ブロットを行った。CeHIFを表すバンドを同定した。酸素正常野生型線虫からの抽出物においては、検出可能なceHIFは全く認められなかった。これとは対照的に、egl-9欠損線虫からの酸素正常抽出物においては、低酸素状態で成長させたこれらの株からの抽出物で認められたのに匹敵するレベルでceHIFが容易に検出される（対立遺伝子MT 1201；対立遺伝子MT 1216（25℃で成長させたもの））。egl-9欠損線虫は高い酸素正常ceHIFレベルを有するため、このことは、この遺伝子産物がceHIFの正常な分解に関与していることを示唆している。dpy-18およびphy-12欠損線虫は正常なceHIFレベルを示した。
本発明者らはまた、ジメチルオキサリルグリシン（このジオキシゲナーゼファミリーを遮断することが知られている細胞透過性αケトグルタル酸類似体）を使用して、該インヒビターの存在下では酸素正常状態でのceHIFの存在量が増加することを示した。これらの実験においては、ジメチルオキサリルグリシン（1mM）の存在下および非存在下に酸素正常状態（21％酸素）で成長させた野生型線虫から抽出物を調製した。SDS/PAGE上での分離後、ceHIFに関する免疫ブロットを行った。ceHIFを表すバンドを同定した。インヒビターでの処理が、酸素正常状態において、免疫検出可能なceHIFの量における実質的な増加を明らかに引き起こすことが、明瞭に認めることができた。
2.4 HIF標的遺伝子の発現
本発明者らは、シー・エレガンス（C. elegans）における遺伝子発現パターンに対するHIF/pVHL系の効果に関して直接的に試験したいと考えた。まず、公知HIF標的である哺乳類遺伝子の1組のシー・エレガンス（C. elegans）ホモログにおける低酸素誘導発現に関して試験し、野生型線虫の低酸素曝露の際のmRNAのアップレギュレーションを、vhl突然変異体線虫で観察されたものと比較した。得られた結果を後記表AおよびBに示す。
表Aは、哺乳類HIF標的遺伝子に対する推定相同性に基づき分析用に選択され、シー・エレガンス（C. elegans）における低酸素およびVHLによる調節に関して試験された遺伝子のサブセットに関する結果を要約したものである。表Bは、野生型およびvhl突然変異体線虫の比較アレイスクリーニングでの同定後にRNアーゼプロテクションにより、vhlにより調節されると確認され、ついで低酸素による調節について試験された遺伝子のサブセットに関する結果を要約したものである。これらの遺伝子が同定された完全な遺伝子アレイデータセットは、http://genome-www4.stanford.edu/cgi-bin/SMD/login.plで入手可能である。
Figure 0004590157
乳酸脱水素酵素Aおよび炭酸脱水酵素のアイソフォームをコードするmRNAについて、低酸素による明らかな誘導が観察され、それぞれの場合で、該mRNAはvhl線虫において著しくアップレギュレーションされた。
第2に、本発明者らは、アレイスクリーニングにより定められたpVHL依存性示差的発現遺伝子のサブセットにおける低酸素による誘導に関して試験した。vhl線虫においてアップレギュレーションされることがRNアーゼにより示された8個の遺伝子のうち5個が、野生型線虫において、低酸素により強く誘導されることが可能であった。
酸素恒常性は、好気的環境中で生存しうる全ての生物における基本的な生理学的課題であり、細菌および酵母における遺伝的研究は、酸素利用能に応じて遺伝子発現を調節する特異的センシング系を規定している。しかし、現在のところ、これらの系を哺乳類細胞における応答に関連づけるための試みは失敗に終わっており、データベース解析は、エス・セレビシエ（S. cerevisiae）ゲノムにおけるHIFホモログを明らかにしていないし、原核生物ゲノムを配列決定していない。したがって、本研究は、遺伝子解析用に開発された原始的生物に対する現在までの最も明らかな相同性解析を提供するものである。シー・エレガンス（C. elegans）における遺伝子発現、遺伝子機能の大規模解析における最近の進歩を考慮すると、該知見は、酸素利用能に対する細胞応答を理解するための重要な新たな契機を提供するものである。
哺乳類細胞においては、HIFの転写活性化は、核移行、DNA結合およびコアクチベーターリクルートメントにおける別々の調節段階ならびにユビキチン媒介タンパク質分解の種々の系を含む多段階過程であると考えられている。多少驚いたことに、VHL欠損腎癌細胞系においては、HIF-αサブユニットが構成的に安定化され、低酸素誘導性mRNAが酸素正常細胞において構成的にアップレギュレーションされる。このことは、少なくともこの細胞バックグラウンドにおいて、pVHLが、HIF転写応答の調節における優性非重複（non-redundant）機能を有することを示している。また、ceHIFタンパク質およびその転写標的mRNAは共に、酸素正常vhl突然変異体線虫において顕著なアップレギュレーションを示した。重要なことに、これは、HIFの調節におけるVHLの決定的に重要な非重複機能が、VHL関連腫瘍の細胞バックグラウンド以外にも拡張され、十中八九は、概ね高等真核生物において機能していることを示している。
哺乳類系においては、HIF/pVHL系は、血管新生、血管運動制御および赤血球生成に対する効果を介した酸素運搬の調節において重要な機能を有する。シー・エレガンス（C. elegans）における保存は、酸素調節遺伝子発現のHIF/pVHL系がこれらの複雑な酸素運搬系の発生に先行すること、および該系が酸素利用能に対する他の応答において決定的に重要な機能を有するはずであることを示している。代謝酵素の発現に対する既に観察された効果はそのような機能の手がかりを提供するかもしれない。しかし、実験室におけるvhl突然変異体線虫およびhif突然変異体線虫の両方の生存能力は、この系の進化を導いた決定的に重要な機能が、他の恐らくはよりストレス性の条件下で観察されうることを示唆している。
2.5 方法
シー・エレガンスhif cDNAの同定
tBLASTnプログラムとプローブとしてのヒトHIF-1α配列とを使用して、シー・エレガンス（C. elegans）ESTデータベース検索を行った。標準的な方法を用いて、推定シー・エレガンス（C. elegans）hif cDNAを4個の重複cDNAクローンyk510h7、yk4a2、yk383g1およびyk272d11（National Institute of Genetics, Mishima, JapanのYuji Koharaから贈呈された）から構築し、pcDNA1AMP（invitrogen）のポリリンカー内に挿入してpcDNA1cehifを生成した。
抗体産生および免疫ブロット法
ceHIFのアミノ酸360-497をコードするDNAをpGEX-4t-1内に挿入し、対応するGST/ceHIF融合タンパク質を大腸菌（E. coli）内で発現させた。該タンパク質を、グルタチオンアガロースを使用して精製し、それを使用してウサギにおいて抗血清を産生させた。抗血清を、pcDNA1cehifでトランスフェクトされたCos7細胞の抽出物を使用して反応性に関して試験し、硫安沈殿により精製した。免疫ブロット法において使用する線虫抽出物は、Ultraturax T20ホモジナイザーを使用する4容量の抽出バッファー（150mM NaCl, 1mM EDTA, 50mM Tris pH 7.5, 1% NP-40 1% デオキシコール酸ナトリウム）中でのホモジナイゼーションにより、洗浄された線虫から調製した。
リボプローブおよびRNアーゼプロテクション
RT-PCRを用いて、リボプローブ鋳型を全シー・エレガンス（C. elegans）RNAから生成した。プライマーおよび配列の詳細は補足的情報として記載されている。RNアーゼプロテクションアッセイは、Tri-Reagent（Sigma）を使用して線虫の混合集団から調製された10〜50mgの全RNAを使用して、参考文献に記載のとおりに行った。
タンパク質発現および相互作用アッセイ
野生型ceHIF（pcDNA1cehif）、突然変異体ceHIF（pcDNA1cehif.P621G）またはc末端HAタグ付きceVHL（pcDNA3ceVHL-HA）をコードするプラスミドが組込まれた（programmed）網状赤血球溶解物（Promega）中で、35S標識タンパク質を生成した。pCDNA1cehif.PxxxGは、部位特異的突然変異誘発系（Stratagene）ならびに以下のフォワードおよびリバースプライマー：5'GATTTATCGTGCTTGGCAGGATTCGTTGACACTTATG（フォワード）；5'GTGTCAACGAATCCTGCCAAGCACGATAAATCAGGC（リバース）を使用して、pcDNA1cehifから生成した。pcDNA3ceVHL.HAは、シー・エレガンス（C. elegans）RNA由来の配列F08G12.4の推定ORFのヌクレオチド1-525のRT-PCR増幅により得た。該配列でpcDNA3-VHL.HA中のヒトVHL配列を置換した。相互作用アッセイのために、Cockmanらに記載のとおりに抗HA免疫沈降を行う前に1μlの各組込まれた溶解物をEBCバッファー中で4℃で1時間混合した。線虫抽出物でのceHIFの前処理は、20mM Tris pH7.5, 5mM KCl, 1.5 MgCl2, 1mM DTT中での線虫ホモジネートの低張性抽出により得られた10μl抽出物を用いて25℃で30分間行った。
線虫株および実験条件
シー・エレガンス（C. elegans）株を、Brenner[Brenner, 1974 #1]に記載のとおりに培養した。加湿空気または証明書付きの窒素／酸素混合物（British Oxygen Company）が供給されたベルジャー内で、低酸素状態への曝露を行った。鉄キレーターへの線虫の曝露は、既に記載されているとおりに[Lewis, 1997 #2]、200μM 2,2 ジピリジルの存在下または非存在下、液体培地内で線虫を成長させることにより行った。野生型線虫はBristol株（N2）であった。ok161は、紫外線およびプソラレンによる突然変異誘発を用いて、Oklahoma Medical FoundataionのRobert Barstead博士により作製された。該フランキングゲノム配列からのオリゴヌクレオチドを使用するPCRを用いて、FO8G12.4(vhl)遺伝子座に欠失を有する線虫を選択した。ok161中の誤った突然変異を、VHL遺伝子座（dpy-6 unc-9）に隣接する可視マーカーを使用する戻し交雑選択により除去した。
VHL E3リガーゼ複合体は2つの独立したHIF-1α領域と相互作用する
本実施例においては、HIF-1α ODDDの、2つの独立した領域が、プロリンヒドロキシル化依存的にVHL E3によるユビキチン化の標的となることを示す。しかし、これらの2つのVHL E3標的部位は、それらの全配列、VHLに直接的に結合するそれらの能力、および他の細胞因子に対するそれらの要求性において異なる。これらのデータは、HIF-α調節におけるpVHLの決定的に重要な役割を強化するものであるが、pVHL/HIF-α相互作用の、より複雑なモデルに関連づけられる。
免疫沈降およびバンドシフトアッセイは、VHLおよびHIF-αサブユニットが広範囲の細胞型において物理的に会合していることを示しており、これは、HIF-αサブユニットの酸素依存的調節におけるVHLの一般的役割と符合している。同時に、生化学的研究は、VHLがエロンガンBおよびC、CUL-2ならびにRBX1との多タンパク質複合体として存在することを示している。この複合体はSCF（Skp- 1-Cdc53/Cullin-F-ボックス）クラスのE3ユビキチンリガーゼと相同である。SCF E3と同様に、VHL複合体は固有のユビキチンリガーゼ活性を有する。VHL自体は、Fボックス基質認識成分と類似の役割を果たすと考えられる。したがって、HIF-αサブユニットは、VHL E3の、明らかな候補基質であり、in vitroでVHL依存的にユビキチン化されることが示されている。
前記実施例1は、VHL結合部位により媒介されるHIF-1αの分解が、プロリン564における酸素依存的ヒドロキシル化を介して生じることを示している。HIF-αサブユニットの酸素依存的分解が専らVHL依存的であるかどうかは、現在のところ不明である。腎細胞癌系およびCHO細胞においては、VHLは決定的に重要なメディエーターであるらしい。しかし、HIF-1αにおいては唯一のVHL結合部位が同定されているに過ぎず、この部位以外の領域がin vivoでの酸素依存的調節を引き起こしている可能性がある。このメカニズムを調べるために、このことを基礎として、本発明者らは、VHL E3リガーゼとの機能的相互作用の証拠を与えるin vitroユビキチン化アッセイを用いた。本発明者らは、HIF-1α ODDDの、2つの独立した領域が、プロリンヒドロキシル化依存的にVHL E3によるユビキチン化の標的となることを見出した。しかし、これらの2つのVHL E3標的部位は、それらの全配列、VHLに直接的に結合するそれらの能力、および他の細胞因子に対するそれらの要求性において異なる。これらのデータは、HIF-α調節におけるpVHLの決定的に重要な役割を強化するものであるが、pVHL/HIF-α相互作用の、より複雑なモデルに関連づけられる。
材料および方法
プラスミド構築物
pRSET中のHis6-E1タグ付きマウスE1 cDNAはT.Huntから贈呈されたものであった。pcDNA3-VHLHAはCockmanらにより既に記載されている。pGAL 344-417VP16は既に記載されている（O'Rourke）。部位特異的突然変異誘発キット（QuickChange; Stratagene）と該製造業者の推奨に従い設計された突然変異誘発性オリゴヌクレオチドとを使用して、突然変異を有するプラスミドを作製した。すべてのPCRは、pfu DNAポリメラーゼ（Stratagene）を使用して行った。
細胞培養および一過性トランスフェクション
7860、U2OSおよびRCC4細胞を、10％ ウシ胎児血清、グルタミン（2mM）、ペニシリン（50 IU/ml）および硫酸ストレプトマイシン（50μg/ml）で補足されたダルベッコ改変イーグル培地内で維持した。Ka13細胞（Woodら）を、同じ補足物を含有するHam's F12培地内で増殖させた。
細胞抽出物の調製およびウエスタンブロット法
ユビキチン化アッセイのための細胞質抽出物を、既に記載されているとおり（Cockmanら）に調製した。追加的な超遠心分離工程（100,000g、4℃で4時間）によりS100抽出物を得た。50μM フェニルメチルスルホニルフルオリドならびにロイペプチン、ペプスタインおよびアプロチニン（すべて0.1 μg/ml）を含有する7M 尿素、10％ グリセロール、1％ SDS、10mM Tris pH6.8に細胞ペレットを再懸濁させ、ついでハンドヘルド・ホモジナイザー（5G分散手段を備えたUltra-Turrax T8; Janke & Kunkel GmbH）を使用して破壊することにより、ウエスタンブロット法のための抽出物を調製した。SDS-PAGE後、タンパク質をImmobilon-P膜（Millipore）上に転写し、示されている抗体を使用するウエスタンブロット法のために処理した。
抗体
抗HA抗体（12CA5）はRoche Molecular Biochemicalsから、抗GAL4(DBD) (RK5C1)アガロースコンジュゲートはSanta Cruz Biotechnologyから、そして抗HIF-1αクローン54抗体はTransduction Laboratoriesから入手した。
ユビキチン化酵素およびアッセイ
ユビキチン化アッセイにおいて使用するE1活性化酵素は、Affiniti Research（Exeter, UK）から入手するか、またはHis6タグ付きマウスE1を発現するプラスミドでトランスフェクトされたBL21（DE3）大腸菌（E. coli）から精製した。His6-E1をNi2+-アガロースアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。リン酸緩衝生理食塩水に対する透析の後、グリセロールを10％（vol/vol）まで加え、25μg/μlのアリコートを-80℃で保存した。ヒトCDC34組換えE2酵素をAffiniti Research（Exeter, UK）から入手した。安定にトランスフェクトされた7860-VHLHA細胞溶解物からの抗HA免疫沈降により、VHL E3を得た（Iliopoulosら）。[35S]メチオニン標識TnTウサギ網状赤血球（Promega）翻訳物からの抗GAL免疫沈降により、GAL-HIF-1α基質を調製した。それぞれの40μlのユビキチン化反応は、4μlの5mg/ml ユビキチン、4μlの10×ATP再生系（20mM Tris pH7.5, 10mM ATP, 10mM 酢酸マグネシウム, 300mM クレアチンリン酸, 0.5mg/ml クレアチンホスホキナーゼ）、2μlのE1、3μlのE2、6μlのVHL E3（プロテインGセファロース上に免疫沈降したもの）、6μlのGAL-HIF-1α基質（アガロースビーズ上に免疫沈降したもの）よりなるものであった。反応を、時々混合しながら30℃で2時間インキュベートし、SDSサンプルバッファーの添加により停止させ、SDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーにより分析した。細胞質抽出物に基づくユビキチン化アッセイは既に記載されている（Cockman）。
in vitro相互作用アッセイ
TnTウサギ網状赤血球（Promega）翻訳物（4μlの[35S]メチオニン標識体）を70ulの低張抽出バッファー（20mM Tris ph7.5; 5mM KCl; 1.5mM MgCl2; 1mM DTT）またはRCC4細胞質抽出物中で30℃で1時間混合した。ついでサンプルを冷却し、pcDNA3 VHL.HAで安定にトランスフェクトされた786-0細胞からの400μlの抽出物と共に氷上で90分間インキュベートした後、過剰の抗HA抗体およびプロテインGビーズで免疫沈降させた。該GAL-HIF-1α融合タンパク質の投入サンプルおよび回収された免疫沈降物をSDS/PAGEおよびオートラジオグラフィーにより分析した。
ルシフェラーゼおよびβガラクトシダーゼアッセイ
市販のルシフェラーゼアッセイ系（Promega）およびTD-20eルミノメーター（Turner Designs）を使用して、細胞抽出物中のルシフェラーゼ活性を測定した。30℃で15〜45分間インキュベートされる10mM KCl、1mM MgSO4および30mM β-メルカプトエタノールを含有する0.1M リン酸バッファー（pH 7.0）中でo-ニトロフェニル-β-D-ガラクトピラノシド（0.67 mg/ml）を基質として使用して、抽出物中の相対βガラクトシダーゼ活性を測定した。0.4M 炭酸ナトリウム（最終濃度）の添加により反応を停止させた後、A420を測定した。
細胞抽出物の調製およびウエスタンブロット法
ユビキチン化アッセイのための細胞質抽出物を、既に記載されているとおり（Cockmanら）に調製した。追加的な超遠心分離工程（100,000g、4℃で4時間）によりS100抽出物を得た。50μM フェニルメチルスルホニルフルオリドならびにロイペプチン、ペプスタインおよびアプロチニン（すべて0.1 μg/ml）を含有する7M 尿素、10％ グリセロール、1％ SDS、10mM Tris pH6.8に細胞ペレットを再懸濁させ、ついでハンドヘルド・ホモジナイザー（5G分散手段を備えたUltra-Turrax T8; Janke & Kunkel GmbH）を使用して破壊することにより、ウエスタンブロット法のための抽出物を調製した。SDS-PAGE後、タンパク質をImmobilon-P膜（Millipore）上に転写し、示されている抗体を使用するウエスタンブロット法のために処理した。
3.1 VHL E3リガーゼはHIF-1α ODDDの2つの異なる領域とin vitroで機能的に相互作用しうる
HIF-1αとpVHLとの相互作用について更に理解するために、本発明者らは、ユビキチン化酵素源として細胞質抽出物を使用するin vitroアッセイにおいて、HIF-1α ODDDのVHL依存性ユビキチン化を分析した。HIF-1αのアミノ酸344-698、344-553、554-698または504-554を含有する35S-メチオニン標識GAL-HIF-1α融合タンパク質をIVTTにより産生させ、pVHLを欠くRCC4細胞（RCC4）またはpcDNA3 VHL.HAで安定にトランスフェクトされたRCC4細胞（RCC4/VHL）由来の細胞質抽出物中、外因性ユビキチンの存在下または非存在下でin vitroユビキチン化に供した。減少した移動度の強力なシグナルをレーンの最前部において与えるPVHL依存性ユビキチン化が、該基質がHIF-1αアミノ酸344-698、344-553および554-698を含有する場合には明らかに観察されたが、該基質がアミノ酸504-554を含有する場合には観察されなかった。HIF-α残基344-553および554-698は共に、in vivoでは酸素依存的調節を引き起こしうるが（O'Roukeら）、in vitroで分析した場合には、どちらの領域もVHL依存性ユビキチン化を示す。このことは、VHL E3リガーゼがHIF-1α中の少なくとも2つの部位と機能的に相互作用しうることを示している。
3.2 機能的相互作用のための要件
これを更に調べるためには、精製された成分を使用するユビキチン化アッセイを開発することが必要であった。35S-メチオニン標識GAL-HIF-1αアミノ酸344-698融合タンパク質をIVTTにより産生させ、抗Gal抗体コンジュゲートアガロースで免疫沈降させ、精製された成分でのin vitroユビキチン化に供した。これは、ユビキチンおよびATP依存的に高分子量のGAL344-698関連種を産生した。これらの高分子量種はGAL344-698のユビキチン化形態に対応する。なぜなら、それらの産生はE1、E2およびVHLE3依存的であったからである。
ついで種々のGAL-HIF-1α融合体上でin vitroユビキチン化を行った。HIF-1αのアミノ酸残基344-698、344-553、554-698または652-826を含む35S-メチオニン標識免疫精製GAL-HIF-1α融合体を基質として使用し、E1、E2、VHL E3リガーゼ、ユビキチンおよびATPを含有する反応混合物、または対照として作用するようユビキチンまたはVHL E3リガーゼを含有しない反応混合物を使用した。該基質がHIF-1αアミノ酸344-698、344-553または554-698を含有する場合には、VHL E3リガーゼ依存性ユビキチン化が明らかに観察されたが、HIF-1αの残基652-826を含有する基質では観察されなかった。対照として作用したHIF-1αの残基652-826を含有する融合体はin vivoにおいてタンパク質レベルで酸素依存的調節を示さず（O'Rouke）、in vitroでpVHLと相互作用しない（Cockmanら）。GAL 344-553およびGAL 554-698基質は共に、VHL E3の標的であることが判明したが、GAL 652-826はVHL E3の標的ではないため、該精製成分アッセイを用いて得られた結果は、in vitroにおける独立したVHL E3標的としてのHIF-1a残基344-553および554-698の同定における細胞質抽出物アッセイの場合と符合する。
3.3 細胞質抽出物はVHL E3リガーゼとHIF-1α中の5’標的部位との機能的相互作用を増強する
一方、GAL 344-553基質のVHL依存性ユビキチン化がそれらの2つのアッセイ間で著しく異なっていたことに注目した。該細胞質抽出物アッセイにおいては、GAL 344-553は、GAL 554-698よりも、VHL依存性ユビキチン化のはるかに良好な基質であるが、該精製成分アッセイにおいては、立場が逆転し、GAL 344-553は非常に弱い基質である。本発明者らは、細胞質抽出物はVHL E3による該344-553領域の認識に重要なのか否かに好奇心を持った。これを確かめるために、35S-メチオニン標識GAL 344-553基質をIVTTにより産生させ、バッファー、細胞質抽出物または核抽出物中でインキュベートし、ついでVHL E3リガーゼの存在下または非存在下、該精製成分アッセイにおいてin vitroユビキチン化に供した。細胞質抽出物での処理は該基質のVHL依存性ユビキチン化を劇的に増強した。したがって、バッファーで処理された基質はVHL E3に対する非常に弱い標的のままであるが、細胞質抽出物での前処理は劇的な効果を有し、GAL 344-553基質をVHL依存性ユビキチン化に対する強力な標的に変換する。細胞質抽出物においては、この効果と共に、リン酸化によるGAL 344-553基質の顕著な移動度シフトが認められた。
リン酸化はSCF E3リガーゼによる基質の認識調節において重要な役割を果たすことが知られている。酸素依存的リン酸化事象は確認されていないものの、HIF-1αはリンタンパク質であることが知られている。したがって、HIF-1αのリン酸化とユビキチン化との潜在的関連性に関心が持たれた。核抽出物を用いたGAL 344-553基質のプレインキュベーションもリン酸化誘発性移動度シフトを引き起こしたが、これはVHL依存性ユビキチン化の増強を伴わなかった。
細胞質抽出物の効果におけるリン酸化の役割を明らかにするために、ヘキソキナーゼ処理を用いた。35-Sメチオニン標識GAL-HIF-1αアミノ酸344-553融合タンパク質基質をIVTTにより産生させ、バッファー、細胞質抽出物、ヘキソキナーゼとのプレインキュベーションによりATPを枯渇させた細胞質抽出物、または熱変性させた細胞質抽出物中でインキュベートした。ATPの非存在下（したがってリン酸化の非存在下）ではVHL依存的基質ユビキチン化の増強が持続するが、熱変性後には持続しないことが判明した。したがって、ATP枯渇抽出物は、もはやGAL 344-553のリン酸化を支持し得ないが、VHL依存性ユビキチン化の増強を尚も支持しうるため、GAL 344-553のリン酸化は、VHL E3との相互作用を媒介する重要な事象ではない。熱処理された細胞質抽出物はVHL依存性ユビキチン化の増強を支持することができなかったため、このことは、GAL 344-553基質への結合または該基質の修飾において何らかのタンパク質因子が関与している可能性があることを示唆している。
VHLとHIF-1α中のVHL結合部位との相互作用が細胞質抽出物および鉄により促進されることが前記実施例1において証明されているため、本発明者らは、GAL 554-698基質のユビキチン化に対する細胞質抽出物の効果を調べ、また、GAL 344-417のユビキチン化に対する鉄の効果を調べることにした。HIF-1α基質のアミノ酸344-417または554-698を含む35S-メチオニン標識GAL-HIF-1α融合体をIVTTにより産生させ、バッファー、細胞質抽出物、100μM 塩化鉄(II)で補足された細胞質抽出物中でインキュベートした後、VHL E3リガーゼの存在下または非存在下、該精製成分アッセイにおいてin vitroユビキチン化に供した。鉄は細胞質抽出物の存在下でGal-HIF-1α 344-417融合体のユビキチン化を増強することが判明した。細胞質抽出物はGal-HIF-1α 554-698のユビキチン化を増強したが、その効果はGAL 344-417の場合ほど顕著ではなかった。これらのデータは、それらの2つの独立したVHL E3リガーゼ標的部位が、類似したメカニズムにより調節されうることを示唆した。
3.4 細胞質抽出物およびVHL E3が標的とする最小ドメインとしての380-417のマッピング
そのメカニズムを理解し始めるために、最小機能ドメインを規定することが必要であった。残基344-553はHIF-1αのエキソン9-11に対応するため、エキソンに基づく欠失ストラテジーを用いた。35S-メチオニン標識GAL-HIF-1αアミノ酸344-553融合タンパク質基質をIVTTにより産生させ、バッファーまたは細胞質抽出物中でインキュベートした後、VHL E3リガーゼの存在下または非存在下、該精製成分アッセイにおいてin vitroユビキチン化に供した。該GAL 344-503融合体（HIF-1αのエキソン9および10に対応する）は尚も、細胞質抽出物での前処理の後にVHL依存性ユビキチン化の増強を示した。ついでGAL-HIF-1αアミノ酸残基344-503、344-417または418-503を有する融合体を作製することにより、エキソン9および10を個々にアッセイした。ユビキチン化されなかった唯一の融合体は、残基418-503を有するものであった。したがって、ユビキチン化および細胞質抽出物効果は共に、GAL 344-417により表されるエキソン9に局在することが判明した。したがって、抽出物によるVHL依存性ユビキチン化の増強がHIF-1αアミノ酸344-417に依存していることは明らかである。
ついでHIF-2α中の対応エキソンをアッセイした。使用した基質は、アミノ酸344-417または345-416を含むGal-HIF-2α融合体であった。HIF-2αの残基345-416もVHL依存性ユビキチン化の標的であることが判明し、細胞質抽出物での前処理の後のユビキチン化の増強をも示した。したがって、この領域の機能はHIF-1αおよびHIF-2αの間において保存されており、決定的に重要な残基を同定するためには配列比較が役立つであろう。
欠失分析を更に拡張して、HIF-1α 344-417領域をスクリーニングした。HIF-1αのアミノ酸344-417、344-400、344-379、360-417または380-417を含むGal-HIF-1α融合体を、前記のとおりに個々に評価した。C末端に施した欠失はVHL依存性ユビキチン化を完全に消失させ（GAL 344-400およびGAL 344-379）、一方、N末端に施した欠失は活性を維持した。この分析により規定される最小機能ドメインはHIF-1α残基380-417であった。出力ユビキチン化シグナルは減少したものの、GAL 380-417は尚もVHL依存性ユビキチン化の標的であり、細胞質抽出物での前処理の後のユビキチン化の増強を尚も示した。
3.5 5'および3'VHL E3標的部位の間で保存された潜在的機能モチーフの同定
機能的効果に決定的に重要な残基を同定する試みにおいて、HIF-1α 380-417配列を分析した。HIF-1α配列をHIF-2αの対応領域およびVHL結合部位とアラインメントさせた。VHL結合部位内では、プロリン564位のヒドロキシル化が重要な調節事象として前記実施例1において同定されている。興味深いことに、このプロリンを含む潜在的保存モチーフは、2つのVHL E3リガーゼ標的部位の間で同定することが可能である（図3A）。この潜在的モチーフの突然変異をGAL 344-417の状況においてアッセイした。35S-メチオニン標識GAL-HIF-1αアミノ酸344-417の野生型および突然変異体基質（突然変異P402Aまたは二重突然変異LL397, 400Aを含む）をIVTTにより産生させ、バッファーまたは細胞質抽出物中でインキュベートした後、VHL E3リガーゼの存在下または非存在下、in vitroユビキチン化に供した。ロイシン397および400からアラニンへの二重突然変異（LL397, 400AA）はVHL依存性ユビキチン化を消失させることが判明した。プロリン402からアラニンへの点突然変異（P402A）もVHL依存性ユビキチン化を消失させた。
ついで344-417領域の突然変異を、in vivoにおける酸素依存的調節に対するその効果に関して試験した。HIF-1α 344-417領域はGAL-VP16融合体上で酸素依存的調節を与えることが知られている（O'Rouke）。C末端欠失（344-400）およびP402A突然変異をこの状況において試験したところ、どちらもin vivoで酸素依存的調節を消失させることが判明した（図3B）。
3.6 クリティカルな点突然変異の同定
クリティカル（critical）な点突然変異の同定は、これらの2つのVHL E3標的部位が完全長HIF-1α分子内でアッセイされるのを可能にする。5'VHL E3標的部位の活性を消失させるためにP402A突然変異を導入し、3'VHL E3標的部位の活性を消失させるためにP564G突然変異を導入した。35S-メチオニン標識完全長HIF-1αの野生型および突然変異体基質をIVTTにより産生させ、pVHLを欠くRCC細胞（RCC4）またはpcDNA3 VHL.HAで安定にトランスフェクトされたRCC4細胞（RCC4/VHL）に由来する細胞質抽出物中で外因性ユビキチンの存在下または非存在下でin vitroユビキチン化に供した。二重突然変異体P402A+P564GはVHL依存性ユビキチン化を示さないが、それぞれの個々のVHL E3標的部位におけるクリティカルプロリンの単独の突然変異はユビキチン化を消失させないことが判明した。したがって、これらの突然変異を個々に導入した場合には、該突然変異体HIF-1αタンパク質は尚もVHL依存性ユビキチン化の標的のままである（これはおそらく、それぞれが活性のあるVHL E3標的部位を保有しているからであろう）。したがって、HIF-1αは僅か2つのVHL依存性ユビキチン化標的部位を含有しているらしい。in vivoでの重要性をアッセイするために、単一および二重VHL E3標的部位突然変異体をHIF-1α欠損細胞系KA13（Woodら）内にトランスフェクトし、酸素依存的転写調節を媒介するそれらの能力を調べた（図4）。トランスフェクトされた野生型HIF-1αタンパク質は酸素依存的調節を示した。しかし、P402AおよびP564G点突然変異体は、酸素正常条件下では転写的に活性であり、低酸素状態では非常に低いアップレギュレーションを示した（図4）。P402A+P564G二重突然変異体は酸素正常条件下で本質的に構成的であった（図4）。
3.7 5'および3' VHL E3標的部位はそれらの機能的要件において相違する
pVHLが5'および3' E3標的部位の双方と直接的に相互作用する能力をin vitroで調べた。35S-メチオニン標識GAL-HIF-1α融合タンパク質GAL 344-553 P402A、GAL 344-553、GAL 652-826、GAL 554-698をIVTTにより産生させ、バッファー中、またはpVHLを欠くRCC4細胞に由来する細胞抽出物中、30℃で1時間インキュベートした。ついでサンプルを冷却し、pcDNA3 VHL.HAで安定にトランスフェクトされた786-0細胞に由来する抽出物と共に氷上で90分間インキュベートした後、抗HA抗体およびプロテインGビーズで免疫沈降させた。該GAL-HIF-1α融合タンパク質の投入サンプルおよび回収された免疫沈降物をSDS/PAGEおよびオートラジオグラフィーにより分析した。3' VHL E3標的部位はin vitro相互作用アッセイにおいてVHLに結合することが既に知られており（Cockmanら）、得られた結果はこれを裏付けた。これに対して、5' VHL E3標的部位（GAL 344-553により表される）はこのアッセイにおいてpVHLに結合しないらしい。pVHLと5' E3標的部位との相互作用が一過性であり余りにも弱くて検出できないのか、または該相互作用が直接的であるかのいずれかである。Gal-Hif-1α融合タンパク質を細胞質抽出物で処理した後、5'および3' VHL E3標的部位は共に、抗HA免疫沈降により捕捉されうる。該5' 部位の機能を妨げることが知られているP402A突然変異をGal-Hif-1α融合タンパク質が含有する場合には、相互作用は認められない。
HIF-1αのこれまでのドメイン分析においては、5' VHL E3標的部位は検出されなかった（Ohhら）。本発明者らは、これがS100抽出物の使用によるものなのか否かに好奇心を持った。標準的な細胞質抽出物またはS100を使用して、5'および3' E3標的部位の両方のVHL依存性ユビキチン化を比較した。35S-メチオニン標識GAL-HIF-1αアミノ酸344-553融合タンパク質およびGAL-HIF-1αアミノ酸554-698融合タンパク質基質をIVTTにより産生させた。新鮮な細胞質抽出物において、4℃で4時間放置された細胞質抽出物において、またはpVHLを欠くRCC4細胞もしくはpcDNA3 VHL.HAで安定にトランスフェクトされたRCC4細胞に由来する細胞質抽出物のS100上清において、ユビキチン化を行った。該S100抽出物は、明らかに、GAL-HIF-1αアミノ酸554-698融合タンパク質のVHL依存性ユビキチン化を可能としたが、GAL-HIF-1αアミノ酸344-553融合タンパク質のVHL依存性ユビキチン化を可能にしなかった。5' VHL E3標的部位の認識のために特異的に要求される因子がS100の調製中に失われたか又は不活性化されたかのいずれかである。
3.8 5' VHL E3標的部位もプロリンヒドロキシル化により調節される
3' VHL E3標的部位はプロリン残基564のヒドロキシル化を介して酸素レベルに応答することが前記で示されている。このプロリン残基は、5'および3' 標的部位の間で保存された潜在的モチーフの一部を形成する。5' 標的部位内の対応プロリン残基の突然変異（P402A）も機能的不活性化を引き起こす。したがって、プロリン残基402も調節性ヒドロキシル化の標的である可能性があった。これを調べるために、本発明者らは、3' VHL E3標的部位に対応するポリペプチドが5' VHL E3標的部位の細胞質抽出物依存的修飾を妨げうるかどうかを検討した。35S-メチオニン標識GAL-HIF-1αアミノ酸344-553融合タンパク質基質をIVTTにより産生させ、バッファー中またはRCC4細胞由来の細胞質抽出物中、HIF-1αアミノ酸556-574を表す野生型19merペプチド（12.5μM）、クリティカルプロリンがグリシンに突然変異（P564G）しているポリペプチド、または該プロリンがヒドロキシプロリン（P-OH）に修飾されたポリペプチドの存在下、in vitroでインキュベートした。ついでこの反応の産物を、VHL E3リガーゼの存在下または非存在下、in vitroユビキチン化アッセイにおいて基質として使用した。該19mer野生型ポリペプチド（P）は細胞質抽出物効果を完全に喪失させることが判明した。これに対して、該クリティカルプロリンがグリシンに突然変異（P-G）したポリペプチドは効果を全く有さないことが判明した。したがって、3' VHL E3標的部位ポリペプチドは、プロリン564の完全性に依存した様式で、5' 部位における細胞質抽出物依存的修飾と競合しうる。プロリン564が予めヒドロキシル化されると、該ポリペプチドは5' VHL E3標的部位における修飾に関して競合することができなかったが、これは恐らく、それが、もはや、5' VHL E3標的部位で生じる酵素修飾の基質ではないからであろう。したがって、プロリンのヒドロキシル化は5'および3' E3標的部位の両方におけるVHL依存性ユビキチン化の調節に関与しているらしい。
3.9 考察
in vitroユビキチン化アッセイを用いることにより、本発明者らは、VHL E3リガーゼにより標的化されるHIF-1αの2つの独立した領域を同定した。どちらの標的部位もODDD内に位置し、in vivoで機能的である。それらの2つのVHL E3標的部位の同定は、HIF-1α内の2以上の酸素依存性分解ドメインの存在を示唆する公開されているデータと符合する。3' VHL E3標的部位を包含するHIF-1αの残基532-585はVHL依存性ユビキチン化の標的であることが既に示されている。第2のVHL E3標的部位の同定は、HIF-1媒介性酸素センシングにおいてVHLが果たす決定的に重要な役割の更なる証拠を提供するものである。
HIF-1αはVHL E3に対する2つの標的部位を有するが、それらは機能的に異なるらしい。3' VHL E3標的部位は、既に同定されているVHL結合部位に対応する。HIF-1αのこの領域は、VHL E3リガーゼの認識成分として作用するVHLにより直接的に標的化されると考えられる。一方、5' VHL E3部位は完全なVHL E3リガーゼ複合体とは相互作用しうるものの、5' VHL E3部位がVHLに直接的に結合しうるという証拠はない。これは、VHLと5' 部位との相互作用が間接的であるか又は3' 部位と比較して弱く、用いたin vitro結合アッセイにより検出することが難しいからかもしれない。どちらの標的部位も、潜在的なコンセンサスモチーフ「LXXLAP」を含有するが、それらは、該モチーフを包囲する配列において異なる。該部位は機能的にも（すなわち、VHLと相互作用するそれらの能力、およびS100抽出物においてVHL E3によりユビキチン化されるそれらの能力においても）異なるため、これは、保存コア残基以外の決定因子が重要であることを示している。酸素依存性プロリンヒドロキシル化およびそれに続くVHL E3との相互作用の両方において重要な決定因子を理解することが重要である。特に、データベース検索により多種多様な細胞タンパク質において「LXXLAP」モチーフが同定されるためである。
それらの2つの部位は機能的に相違するが、それらは共に、同じ酵素修飾により調節されるらしい。プロリン564におけるヒドロキシル化は、3' VHL E3部位の活性を制御する重要な修飾である。5' VHL E3部位内の対応プロリンも機能に決定的に重要であり、ポリペプチド競合実験は調節性ヒドロキシル化に関連づけている。この直接的な証拠は質量分光分析から得られるであろう。両方の部位において同一酵素が酸素依存性プロリンヒドロキシル化に役割を果たすかどうかも興味深い。標的部位における配列の相違は、異なる酵素のリクルートメントを可能にし、次いでそれが、酸素応答における、選別された（graded）または細胞型特異的な差異を可能にするのかもしれない。S100抽出物は5'部位におけるVHL依存性ユビキチン化を支持し得ないことが判明した。これは、5'部位特異的酵素が除去されたことに起因するかもしれない。あるいは、それは、5' VHL E3標的部位とVHL E3との間で作用すると提示されている架橋タンパク質が除去されたことに起因するかもしれない。該架橋タンパク質は未知タンパク質であるかもしれない。あるいは、それは、VHL E3リガーゼの既に同定されている成分かもしれない。
参考文献
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8. Lewis, J.A.およびFleming J.T. Basic culture methods(基礎的な培養方法) (1995) In Methods in Cell Biology, Vol 48 (H.F. Epstein およびD.C. Shakes編) p.3 Academic Press, San Diego, California.
材料および方法
シー・エレガンスの培養、株および抽出物の調製
標準的な方法を用いて線虫を培養した。加湿空気または証明書付きの窒素／酸素混合物（British Oxygen Company）が供給されたベルジャー内で、低酸素状態への曝露を行った。2,2 ジピリジル（200μm）またはジメチル-オキサリルグリシン（1mM）への曝露は液体培地内での成長中に行った。野生型線虫はBristol株（N2）であった。突然変異体株はCaenorhabdltis Genetics Centreから入手し、表5に示されているとおりである。vhl-1遺伝子中の欠失突然変異体（ok1610）は、トリメチルプソラレンを使用して作製した。ok161を野生型（N2）と2回戻し交雑させ、ついでvhl-1の両側にマーカーを含有する三重突然変異体（遺伝子型：dpy-6 (e2062) vhl-1 (ok161) unc--9 (8101)）を構築し、ついでN2に対する更なる交雑によりこれらのマーカーを除去することにより、vhl-1株CB5603を構築した。免疫ブロット法用の4容量の抽出バッファー（100mM NaCl, 1mm EDTA, 50mM Tris pH 7.5, 1% NP-40, 1% デオキシコール酸ナトリウム）または修飾反応用の2容量の低張抽出バッファーHEB（20 mM Tris pH7.5, 5mM KCl, MgCl2, 1mM DTT）中でのホモジナイゼーション（Ultraturax T20, lKA Labortechnlk）により、線虫抽出物を調製した。
哺乳類細胞および抽出物の調製
HeLaおよびRCC4細胞をDMEM中で培養した。細胞抽出物をHEB中で調製した。
免疫ブロット法および免疫沈降法用の抗体
天然シー・エレガンス（C. elegans）HIF-1およびVHL-1タンパク質を検出するために、HIF-1のアミノ酸360-467を発現するグルタチオン-S-トランスフェラーゼ融合タンパク質、または完全長（1-174）VHL-1に連結されたマルトース結合タンパク質融合体で免疫したウサギにおいて抗血清を産生させた。組換えタンパク質を大腸菌（E. coli）内で発現させた。抗血清を、適切にトランスフェクトされたCos7細胞の抽出物を使用して反応性に関して試験し、硫安沈殿により精製した。マウス抗HA抗体は12CAS（Roche）であり、またマウス抗Gal4抗体はRK5C1（Santa Cruz）であった。
リボプローブおよびRNアーゼプロテクション
リボプローブ鋳型の詳細は表4に記載されている。RNアーゼプロテクションアッセイは、Tri-Reagent（Sigma）を使用して線虫の混合集団から調製された全RNA、またはRNAzolB（Biogenesis）を使用してHeLa細胞から調製された全RNAを使用して、記載（Wiesenerら, (1998) Blood 92 2260-2268）のとおりに行った。
プラスミドシー・エレガンスcDNA
hif-1 cDNAを4個の重複cDNAクローンyk510h7、yk4a2、yk383g1およびyk272d11（Yuji Kohara, National Institute of Genetics, Japan）から構築し、pcDNA1AMP（Invitrogen）内に挿入した。vhl-1 cDNA、およびT20B3.7の推定ORFをコードするcDNAを線虫RNAのRT-PCRにより得て、それぞれpcDNA3（N末端HAタグをコードするリンカーを含有する）およびpSP72（Promega）内に挿入した。egl-9 cDNAをyk130h5（Yuji Kohara）からpcDNA1内にサブクローニングした。Phy-1およびphy-2 cDNAをpCR-Script（WinterおよびPage, (2000) Mol. Cell. Biol. 20 4084-4093）内にサブクローングし、Ga14/HIF-1融合タンパク質をPCRにより作製し、pcDNA3Gal（O'Rourkeら, (1999) J. Biol. Chem. 274 2060-2071）内に挿入した。
昆虫細胞内の発現のために、GaI4/HIF-1（289-790）およびEGL-9（1-723）をコードする配列をpFastBac1（Gibco BRL）内にサブクローニングした。細菌内での発現のために、GaI4/HIF-1（590-790）およびEGL-9（359-723）をコードする配列をそれぞれpET-28a（Novagen）およびpMAL-p2X（NEB）内にサブクローニングした。
哺乳類cDNA
EGLN-2（PHD1）、EGLN1（PHD2）およびEGLN3（PHD3）と称されるヒトポリペプチドをコードするcDNAを、公的に入手可能なcDNAバンク（The I.M.A.G.E consortium, end NEDO human cDNA sequencing project）またはヒトクローンcDNAライブラリーから、PCR増幅および／または制限エンドヌクレアーゼ消化により得た。産物を、網状赤血球溶解物IVTT内での発現の場合にはpcDNA3内に、大腸菌（E. coli）内での発現の場合にはpMAL-c2X内にマルトース結合タンパク質融合体として連結した。網状赤血球溶解物IVTTのラットSM-20 の発現には、pPDS15（Lipscombら, (1999) J. Neurochem. 73 429-432）を使用し、大腸菌（E. coli）内での発現のために、アミノ酸60-355をコードする配列をpTYB11（NEB）内にサブクローニングした。
細菌内での発現のために、アミノ酸344-503または530-698をコードするヒトHIF-1α配列をpET28a内にサブクローニングした。
部位特異的突然変異誘発系（Stratagene）を使用して、突然変異を作製した。すべてのプラスミド配列をDNA配列決定により確認した。
タンパク質発現
35S標識または非標識タンパク質をTNT網状赤血球溶解物またはコムギ胚芽溶解物（Promega）中で産生させた。Bac-to-BacI/Sf9系（Gibco BRL）を使用して、昆虫細胞内でのタンパク質発現を行った。細菌発現タンパク質を大腸菌（E. coli）株BL21（DE3）内で産生させた。タンパク質は、溶解物中で使用するか、またはアミラーゼ樹脂、DEAE-セファロース、ニッケルアフィニティークロマトグラフィーまたは抗Gal抗体を適宜使用して精製した。
相互作用アッセイ
組換えVHLとHIFポリペプチドとの相互作用に関するアッセイは、以下の実験計画に従って行った。組換えVHLおよびHIFポリペプチドを別々にin vitroで産生させた。ついでHIFポリペプチドを、後記のとおりに抽出物または組換え酵素と共にプレインキュベートし、ついでVHLと混合し、EBCバッファー（50mM Tris pH 7.5, 150mM NaCI, 0.5% v/v Igepal, 0.5mM EDTA）中で4℃で1時間インキュベートした後、抗HA抗体（HAタグ付きVHLの場合）または抗Gal抗体（Gal4HIF融合体の場合）で免疫沈降させ、PAGE（Jaakkolaら, (2001) 前掲）で分析した。
ビーズ上（on bead）修飾アッセイの概要を図5に示す。
線虫抽出物または組換えEGL-9とのシー・エレガンス（C.elegans）HIF-1のプレインキュベーションを、25℃で30分間行った。細胞抽出物または組換え酵素との哺乳類HIF-αポリペプチドのプレインキュベーションを、特に示さない限り37℃で10〜30分間行った。組換え酵素のアッセイのためには、特に示さない限り、2-オキソグルタル酸（2mM）、鉄（100μM）およびアスコルベート（2mM）を反応バッファーに加えた。低酸素状態で行った反応は、制御された環境のInvivo2 400低酸素実験室（Ruskinn Technologies）および適当な大気で予め平衡化されたバッファーを使用して得られた一定の大気酸素濃度（バランス窒素）で行った。反応（50μl）は、開口したエッペンドルフチューブ中で、混合しながら行い、20容量のデスフェリオキサミン（100μM）の添加により停止させた。
ペプチド遮断実験では、ペプチド（最終濃度1μM）をVHL-1と共に15分間プレインキュベートした後、該相互作用に加えた。
合成ビオチン化HIF-1αペプチドを使用するVHL捕捉アッセイでは、示されているとおりにペプチドを37℃で30分間プレインキュベートし、ついでストレプトアビジンビーズに結合させ、洗浄し、組換えVHLまたは抽出物と共に混合し、ビーズを使用して再捕捉し、結合したVHLをPAGEにより分析した。
786-0/VHL細胞抽出物を使用するHIF-1α捕捉アッセイでは、HIF-1αポリペプチドをIVTTにより産生させ、酵素と共にプレインキュベートし、ついで、HIF1-αの修飾を許容しない条件下（10mM Tris pH7.5, 0.25M NaCI, 0.5% NP40, 4℃）（Massonら, (2001) EMBO）、細胞抽出物と相互作用させ、ついで抗HAで免疫沈降させ、PAGEにより分析した。
捕捉アッセイプロトコールの詳細は後記に示す。
HPLC分析
フェノメネックス・ハイペルシル（Phenomenex Hypersil）5μ C18（オクタデシルシラン）250×4.6mmカラムおよび移動相としての0.1％ TFA中の5％〜95％のアセトニトリル勾配（1ml/分）を使用する逆相HPLCにより、HIF-1αペプチドB19Pro（残基556-574）のヒドロキシル化を分析した。Gilson 715ソフトウェアにより制御される306ポンプおよび115 UV検出器を使用するGilson HPLC系を用いた。基準は、未修飾B19Pro、およびPro564にヒドロキシプロリン置換を有する合成ペプチド（B19Hyp）であった。
50mM Tris/HCl、1.5mM MgCl2、5mM KCl中で2.5mM アスコルベート、1.25mM DTT、50μM αKG、1.25mM Fe(II)、25μM ペプチド、0.66mg/ml カタラーゼ、1.75 mg/ml EGLN2pMALを使用して、アッセイを行った。すべての補因子を酵素の添加により同時に混合して滴（drops）を分離し、インキュベーションを37℃で30分間行った。アッセイをメタノール（70μl）で停止させ、ドライアイス上での凍結を行った後、遠心分離および注入を行った。
ヒドロキシプロリンの分析では、ペプチドまたはタンパク質を酸加水分解、フェニルイソチオシアネートでの誘導体化および標準的な方法を用いるHPLCに供した。
Mukherjiら, (2001) 前掲に記載のとおり、1-[14C]-2-オキソグルタル酸精製ポリペプチド基質（約25μM）および精製EGLN2（PHD1）融合体を使用して、脱炭酸アッセイを行った。
ビーズ上での修飾
20μlのPromega TnT Quick Coupled Retic溶解物（Promega, Madison, USA）、1μlのDNA（1μg/ul）、2μlの1mM デスフェリオキサミン（DFO）および2μlの冷メチオニン（IVTTキットと共に供給される）を使用して、Gal/549-582/VP16 In vitro転写翻訳（IVTT）を調製した。陽性対照として、該2μl DFOを2μl 1mM FeCl2（新鮮に調製されたもの）で置換した。IVTT反応を30℃で90分間インキュベートした。
ビーズを、20μlのgalビーズ（Santa Cruz no. sc-S10 AC）、5μlのIVTTおよび100μlのEBC + 100μM DFOを使用して調製し、End-Over-Endローテーター中で30〜60分間インキュベートした。該ビーズを2,000rpmで1分間遠心し、上清を除去し、該ビーズを1mlのEBC（EDTAもDFOも含有しない）中で洗浄した。これを3回繰返した。
ついで、各反応ごとに、該ビーズを1000μlのHEB（低張性抽出バッファー: 20mM Tris pH7.5, 5mM KCl, 1.5mM MgCl2, 1mM ジチオトレイトール）に再懸濁させた。100μlの該再懸濁ビーズを、500μlのHEB+DTTを含有する新鮮なミクロフュージチューブに移した。ついで該チューブを2000rpmで1分間遠心し、上清を除去した。ついでビーズを、後記の修飾条件下、エンド・オーバー・エンド・ローテーター中、溶解物サンプルと共に室温で10分間インキュベートし、ついで2000rpmで1分間遠心した。
上清を除去し、該ビーズを500μlのEBC（50mM Tris pH 7.5, 150mM NaCl, 0.5% v/v Igepal, 0.5mM EDTA）+DFO（原液の網状赤血球溶解物と共にインキュベートする場合には、1回目の遠心の前に500ulのEBC＋DFOを加えると上清の除去が容易となった）中で3回洗浄した。ついで上清を最終洗浄液から除去し、該ビーズをプルダウン（pull down）アッセイに使用した。
VHL捕捉アッセイ
前記のとおりに修飾されたGal/549-582/VP16ビーズ上のVHL捕捉または「プルダウン（pull down）」アッセイを氷上で行った。20μlのPromega TnT Quick Coupled Retic溶解物（Promega）を3μlのH2O、1μlのDNA（1μg/μl）および1μl（0.37MBq）の35S-メチオニン（Amersham Redivue no. AG1094）と混合し、30℃で90分間インキュベートすることにより、VHL-HA（T2.1）IVTTを行った。ついで、アッセイするビーズの組ごとに、VHL-HA IVTTを100μlのEBC + 100μM DFO中で希釈した。修飾され洗浄されたgal/ODD/PI6ビーズに、EBCバッファー+100μM DFO中の100μlの該VHL IVTT（T2.1）を加えた。
該反応物を低温室内のエンド・オーバー・エンド・ローテーター中で2時間インキュベートし、2,000rpmで1分間遠心し、上清を除去した（放射性液体廃棄物）。該ビーズを500μlのEBCバッファーおよび100μM DFOで洗浄し、再び2,000rpmで1分間遠心した。該洗浄工程を合計5回繰返した。上清を最終洗浄液から除去し、15μlの2×SDSサンプルバッファー中で溶出した。
サンプルを-20℃で保存し、SDS-PAGEにより試験した。
DNAおよびタンパク質の操作
DNAの操作およびクローニング、ならびにSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）によるタンパク質の発現および分析を、当業者によく知られておりMolecular Cloning: a Laboratory Manual: 第2版, Sambrookら, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory PressおよびCurrent Protocols in Molecular Biology, Ausubelら編, John Wiley & Sons, 1992に記載されている標準的な技術に従い行った。
4.1 シー・エレガンスにおけるHIF-1αホモログの同定および特徴づけ
シー・エレガンス（C. elegans）ESTデータベースにおいてHIF-1αサブユニットホモログを同定するために、HIF-αヒト配列によるtBLASTnでの問合せを用いた。オープンリーディングフレーム（ORF:F38A6.3）と同一であるESTコンティグが同定された。このORFは、シー・エレガンス（C. elegans）ゲノム配列の決定の後に推定した（ただし、後者の104アミノ酸のアミノ末端伸長以外）。該伸長に対応する更なるESTもPCR産物も同定されず、RACE-PCR産物は推定トランススプライシングされたリーダー配列を含有していた。これらの知見は、F38A8.3が、提示されているアミノ末端伸長を欠く119アミノ酸のポリペプチドをコードしていることを予想させる。
推定HIF-αホモログ（HIF-1）の調節を特徴づけるために、本発明者らは、組換えポリペプチドおよび免疫ブロットされた線虫抽出物に対する抗血清を産生させた。抽出物は、低酸素状態にさらされた線虫または細胞透過性鉄キレーター2,2' ジピリジルから調製した。
免疫ブロット法は両方の刺激による顕著なHIF-1誘導を示した。低酸素状態による誘導は5％酸素以下で進行し、最小試験濃度である0.5％および0.1％酸素で最大となった。0.1％酸素においては、HIF-1タンパク質レベルは4時間以内に強力に誘導され、24時間にわたり維持されたが、再酸素化の数分以内に消失した。これに対して、hif-1 mRNAレベルは低酸素状態により変化しなかった。したがって、これらの実験は低酸素状態によるHIF-1のアップレギュレーションを証明しており、哺乳類HIF-1αサブユニットに関して記載されているのに類似したタンパク質レベルでの調節様式を示唆した。
4.2 シー・エレガンスでのHIF-1の調節におけるpVHLホモログVHL-1の決定的に重要な機能
本発明者らは、野生型および一連の突然変異体線虫において、HIF-1の発現を比較した。それらの線虫を選択したのは、哺乳類HIF系における酸素センシングおよびシグナル伝達過程に関して既に提示されているモデル（Chandelら, (2000) J. Biol. Chem. (Aug) 1-37; Ehlebenら, (1997) Kidney Int. 51 483-491; Zundelら, (2000) Genes & Dev. 14 391-396; 総説としてはSemenza, (1999) Cell 98 281-284を参照されたい）に対する潜在的関連性を有するからである。これらは、PTEN/インスリン受容体/PI-3-キナーゼ経路における突然変異体（daf-18, daf-1, age-1）、VHLの推定ホモログにおける突然変異体（vh1-1）、ミトコンドリアタンパク質に影響を及ぼす突然変異体（mev-1, clk-1, gas-1）、サイトゾルカタラーゼ活性に影響を及ぼす突然変異体ctl-1、およびオキシダントストレスに対する耐性または感受性に関して選択されたが突然変異体遺伝子が未だ特徴づけられていない他の突然変異体（mev-2, mev-3）を含んでいた。
vhl-1以外の全ての突然変異体線虫は保存されたHIF-1タンパク質レベルの調節を示した。一方、vhl-1線虫は酸素正常状態において高レベルのHIF-1を示し、それは酸素により本質的に調節されなかった。これらの結果は、vhl-1に対する提示されている相同性（Woodwardら, (2000) Genomics 65 253-265）を証明するものであり、低酸素状態に対する応答におけるシー・エレガンス（C. elegans）VHL-1タンパク質の保存された役割を示した。
4.3 HIF-1とVHL-1との相互作用はプロリルヒドロキシル化により調節される
VHL-1によるHIF-1の調節のメカニズムを言及するために、それらの2つのタンパク質の間の相互作用を調べた。35S-メチオニン標識赤血球凝集素（HA）タグ付きVHL-1（HA.VHL-1）およびHIF-1を別々に、網状赤血球溶解物中の共役転写翻訳反応（IVTT）においてin vitroで産生させた。ついでIVTTを混合し、相互作用に関して抗HA免疫沈降によりアッセイした。このようにして産生させた場合には、それらのタンパク質は相互作用しなかった。しかし、組換えHIF-1を線虫抽出物と共にプレインキュベートすると、明らかな相互作用が観察された。
Gal4 DNA結合ドメインに連結されたHIF-1の一連のN末端切断体を構築した。該Gal/HIF-1融合タンパク質を網状赤血球溶解物中で発現させ、線虫抽出物と共にプレインキュベートし、ついでHA.VHL-1との相互作用に関して試験した。Gal4/HIF-1(590-719)までの及びそれを含むN末端切断体はHA.VHL-1により効率的に捕捉されるが、Gal4/HIF-1(641-719)は捕捉されないことが、これらの実験により示され、このことは、HIF-1アミノ酸590-641が該相互作用に関与していることを示していた。
プロリルヒドロキシル化の部位を含有することが最近示されたヒトHIF-1α中のpVHL結合ドメイン（Ivanら, (2001) Science 292 464-468; Jaakkolaら, Science (2001) 292 468- 472）に対する相同性が、この領域を詳細に調べることにより明らかとなった。したがって、本発明者らが、シー・エレガンス（C. elegans）HIF-1の相同プロリル残基を突然変異させたところ（P621からG）、この突然変異はHA.VHL-1との相互作用を消失させることが判明した。
シー・エレガンス（C. elegans）HIF-1における決定的に重要な保存されたプロリル残基とともに線虫抽出物の存在下のプレインキュベーションの必要性が示されたことにより、酵素的プロリルヒドロキシル化を介してHIF-1/VHL-1相互作用を調節するメカニズムもシー・エレガンス（C. elegans）において保存されている可能性があることが示された。これを証明するために、このクラスの酵素を抑制する2-オキソグルタル酸類似体であるN-オキサリル-2S-アラニン（Cunliffeら, (1992) 前掲）を、HIF-1とのプレインキュベーション中に該線虫抽出物に加えた。これは活性を強力に抑制した。この場合、抑制は5mM 2-OGにより拮抗されたため、その抑制は、過剰の2-オキソグルタル酸と競合する様式で生じた。
シー・エレガンス（C. elegans）HIF-1における決定的に重要なP621残基のヒドロキシル化が実際にVHl-1への結合を促進しうるかどうかを調べるために、本発明者らは、プロリン（B28Pro）または(2S.4R)-トランス-ヒドロキシプロリン残基（B28Hyp）を621位に含有するシー・エレガンス（C. elegans）HIF-1の残基607-634に対応するN末端ビオチン化ペプチドを合成した。本発明者らは、B28Hypが、相互作用混合物に加えた場合にHA.VHL-1による前処理済HIF-1の捕捉を遮断するが、B28Proは該捕捉を遮断しないことを見出した。
さらに、B28Hypは、野生型線虫に由来する抽出物と混合した場合には、免疫検出可能な天然VHL-1を捕捉したが、vhl-1突然変異体線虫に由来する抽出物と混合した場合には免疫検出可能な天然VHL-1を捕捉せず、また、B28Proは免疫検出可能な天然VHL-1を捕捉しなかった。最後に、in vivoでのシー・エレガンス（C. elegans）HIF-1の調節におけるプロリルヒドロキシル化の重要性を調べるために、本発明者らは、細胞透過性プロリルヒドロキシラーゼインヒビターであるジメチルオキサリルグリシンに線虫をさらした。これは、酸素正常状態の線虫においてHIF-1を強力に誘導した。これらの結果は、シー・エレガンス（C. elegans）におけるHIF/pVHL系の保存がプロリルヒドロキシル化による調節様式にも拡張されることを示した。
4.4 シー・エレガンスegl-9遺伝子産物は原型HIF-PHである
最もよく特徴づけられているプロリルヒドロキシラーゼはプロコラーゲン修飾酵素である（KivirikkoおよびMyllyharju, (1998) Matrix Biol. 16 357-368）。しかし、触媒サブユニットの2つのアイソフォーム、すなわち、dpy-1B（phy-1とも称される）およびphy-2（Friedmanら, 2000 前掲: WinterおよびPage, 2000 前掲）のそれぞれにおいて不活性化突然変異を含有する線虫は正常なHIF-1調節を示し、これは、該コラーゲン修飾酵素とは異なるHIF-PHの場合に符合する。
本発明者らは、シー・エレガンス（C. elegans）および哺乳類データベースを、これらの種間で良く保存されており共通のβバレルゼリーロール(jelly roll)モチーフを有する更なるHIF-PH候補遺伝子に関して検索した。
特に関心を持ったのは、産卵異常（egl）表現型に基づき最初に同定された以前は未知の機能の遺伝子であるシー・エレガンス（C. elegans）遺伝子egl-9（Trentら, (1983) Genetics 104 619-647）に関連した遺伝子のファミリーであった。
結晶学的データ（Valegardら, (1998) 前掲: Zhangら, (2000) Nature Structural Biology 7 127-133）を参考にした二次構造予測と組合せた配列解析から、これらの遺伝子は、シー・エレガンス（C. elegans）および哺乳類において保存された酵素のファミリーをコードしうると予想された。この予想は、該酵素が該ゼリーロールモチーフだけでなく、保存された鉄および2-オキソグルタル酸結合残基（例えば、該ゼリーロールモチーフの第2および第7鎖上のHXD...H鉄結合モチーフ）をも、結晶学的に特徴づけられた酵素においてそれらが存在するのと同じ関係で含有しうることを示唆した。
したがって、欠損egl-9対立遺伝子を含有する突然変異体線虫を、HIF-1の調節に関して免疫ブロット法により評価した。egl-9の不活性化突然変異体対立遺伝子を有する3つの株（sa307、sa330およびn571）（Darbyら, (1999) PNAS 96 15202-15207; Trentら, (1983) Genetics 104 619-647）はすべて、酸素正常状態におけるHIF-1の顕著な構成的アップレギュレーション、および低酸素状態による誘導の喪失を示した。さらに、更なる温度感受性egl-9突然変異体n586は、非許容温度で、酸素正常状態のHIF-1レベルの上昇を示した。
HIF-1転写応答に対するEGL-9の効果を測定するために、本発明者らは、ある範囲の低酸素誘導性転写産物のmRNAレベルを測定したところ、egl-9線虫において顕著なアップレギュレーションを見出した。未知機能の強力な誘導性mRNA（F22B6.4）も同定された。これらの知見は、HIF-1の調節におけるEGL-9の決定的に重要な機能を示し、さらには、HIF-1をVHL-1に標的化させるHIF.PHとしてEGL-9が機能することを示した。
本発明者らは、組換えEGL-9を産生させ、それがHIF-1の翻訳後修飾を触媒する能力を評価した。HIF-1は、EGL-9が組み込まれた網状赤血球またはコムギ胚芽溶解物と共にインキュベートした後では、HA.VHL-1により効率的に捕捉されたが、組み込まれていない溶解物とインキュベートした後では捕捉されなかった。
これとは対照的に、組換えシー・エレガンス（C. elegans）PHY-1、PHY-2および推定ORF T20B3.7（これも公知プロリルヒドロキシラーゼに対して有意な相同性を有する）の遺伝子産物を発現するIVTTは、これらのアッセイにおいて活性を全く示さなかった。
EGL-9がHIF-1と直接的に作用しうるのかどうかを調べるために、昆虫細胞内でのバキュロウイルス発現および大腸菌（E. coli）内でのマルトース結合タンパク質（Map）融合タンパク質としての発現により、更なる調製物を作製した。完全長MBP/EGL-9タンパク質は、大腸菌（E. coli）内で発現された場合には不溶性であったため、本発明者らは、IVTTとして発現された場合にHIF.1修飾活性を有し推定触媒ドメインを保存する残基359-723を含有するN末端切断体（MBP/ΔN.EGL-9）を調製した。シー・エレガンス（C. elegans）HIF-1基質を、昆虫細胞または大腸菌（E. coli）内でN末端Gal4融合タンパク質として産生させ、抗Gal免疫沈降により精製した。これらの基質を、完全長EGL-9を発現する昆虫細胞の溶解物または精製されたMBP/ΔN.EGL-9と共にインキュベートし、VHL-1を捕捉する能力に関して試験した。
どちらの形態の組換えEGL-9も、HA.VHL-1捕捉により示されるとおり、HIF.1の修飾を効率的に促進した。さらに、この活性の分析は、2-オキソグルタル酸、鉄および酸素依存性、ならびに第一コバルトイオンによる直接的な抑制を示した。
決定的に重要なHIF-1残基P621のヒドロキシル化に対応するHA.VHL-1捕捉アッセイにおける活性を証明するために、本発明者らは、HPLCにより4-ヒドロキシプロリン含量に関して修飾HIF-1ポリペプチドをアッセイした。大量のタンパク質をこの分析に供給するために、本発明者らは、His6/Gal4/HIF-1(590-719)(HGH)融合タンパク質の野生型またはP621からGへの突然変異型とMBP/ΔN.EGL-9またはMBPとで大腸菌（E. coli）を同時形質転換した。His6/Gal4/HIF-1基質をニッケルアフィニティークロマトグラフィーにより回収し、35S-メチオニン標識HA.VHL-1を捕捉する能力に関して抗Gal免疫沈降を用いてアリコートをアッセイし、あるいは酸加水分解に供し、フェニルイソチオシアネート誘導体化4-ヒドロキシプロリンの存在に関するHPLC分析に供した。
HA.VHL-1捕捉アッセイの結果と一致して、該野生型His6/Gal4/HIF-1基質においては、活性酵素に対する曝露の後に4-ヒドロキシプロリンが産生されたが、該突然変異体His6/Gal4/HIF-1基質においては産生されなかった（図12）。したがって、これらの結果は、シー・エレガンス（C. elegans）においてHIF-1をVHL-1に標的化させるプロリルヒドロキシラーゼとしてのEGL-9の活性を示した。
4.5 一連の哺乳類HIF-PHアイソフォームの同定
EGL-9とSM-20と称されるラット遺伝子産物（Waxら, (1994) J. Biol. Chem. 269 13041-13047）との間では、機能的関連性は認められていないが（Darbyら, (1999) 前掲）、配列類似性は既に認められている。本発明者らの配列-構造検索は、より広い一連の相同性を同定しており、egl-9（特にそのコア推定触媒ドメイン）に対して顕著な相同性を有するヒトおよびげっ歯類ゲノムのそれぞれにおける3つの密接に関連した遺伝子を推定した。
図9は、EGL-9（登録番号AAD56365）、SM.20（登録番号AAA 19321）、ならびに登録番号XP_040482、AAG33965およびNP_071356（EGLN1-3）（UnigeneクラスターHs.324277、Hs.6523およびHs. 18878に対応）で定められる推定ヒトタンパク質の配列アラインメントを示す。
該ヒトタンパク質産物は、EGLN1、2および3、またはそれぞれ「プロリルヒドロキシラーゼドメイン含有」（PHD）2、1および3と称される。EGLN3またはPHD3と称される遺伝子はラットSM-20のヒトホモログ（Dupuyら, (2000) Genomics 69 348-354）として既に同定されていることに注意すべきである。
ヒトHIFαサブユニットとVHL E3リガーゼ複合体との相互作用の調節におけるこれらの遺伝子産物の役割を調べるために、本発明者らは、まず、網状赤血球IVTTにより該タンパク質を産生させた。組み込まれていない溶解物は低レベルのHIF-PH活性を有するため（Jaakkolaら, 2001 前掲）、本発明者らは、組み込まれた溶解物がHIFα./VHL E3相互作用を促進する能力の増強に関して試験した。関連酵素と共にインキュベートした後、HIF-1α基質を、HAタグ付きヒトpVHLを安定に発現する786-0/VHL細胞に由来する抽出物と混合し、相互作用に関して抗HA免疫沈降により試験した。
完全長の野生型HIF-1αに対しては、ラットSM-20および全3個のヒト遺伝子産物においては顕著な活性が認められたが、推定触媒部位にH358A置換を有する突然変異体EGLN1、および陰性対照として試験した異なるヒト2-オキソグルタル酸依存性オキシゲナーゼ（フィタノイル補酵素Aヒドロキシラーゼ）（Mukherjiら, 2001）においては活性は認められなかった。
HIF-1α ODDD中の決定的に重要なプロリル残基にミスセンス置換を有するHIF.1α突然変異体（Massonら, 2001）の試験は、C末端（P564）およびN末端（P402）プロリルヒドロキシル化部位を介した相互作用の促進における効率が酵素によって様々であることを示した。C末端部位を介した相互作用は全ての酵素により促進されることが可能であったが、VHL E3捕捉は、N末端部位（P402）のみが無傷である場合にはそれほど効率的ではなく、EGLN2（PHD1）およびEGLN1（PHD2）によってのみ促進された。両方のヒドロキシル化部位が除去された二重HIF-1α突然変異体P402A P564Gでは、活性は全く認められなかった。
これらの結果に符合して、すべての酵素は、C末端部位からの単離されたHIF-1α配列（残基549-582）とpVHLとの相互作用を強力に促進した。さらなる分析は、この活性が鉄キレート化、第一コバルトイオンおよび2-オキソグルタル酸類似体N-オキサリルグリシンにより強力に抑制されることを示した。
HIF-α配列に対する直接的な作用を確認するために、本発明者らは、精製されたEGLN2をMBP融合タンパク質として大腸菌（E. coli）内で調製させ、N末端（344-503）もしくはC末端（530-698）ヒドロキシル化部位を含有する精製Hisタグ付きHIF-1αポリペプチド、または最小HIF-1α C末端基質（B19Pro、残基556-574）よりなる合成ペプチドを使用して活性をアッセイした。これらの実験は、pVHL捕捉アッセイによる活性、ヒドロキシル化ペプチド産物または誘導体化4-ヒドロキシプロリンのHPLC/MS検出、および2-オキソグルタル酸脱炭酸アッセイによる活性を示した。
全3個のアイソフォームの発現を確認するために、本発明者らは、各転写産物に特異的なリボプローブを使用するRNアーゼプロテクション分析を行った。最近公開された研究は、ある期間の低酸素状態に細胞を予めさらすことにより酸素正常状態におけるHIF分解の速度が増加することを示しているため（Berraら, (2001) FEBS Letters 491 85-90）、低酸素状態に対する転写的応答によりHIF-PH自体が誘導されると予想されている。
全3個のHIF-PH mRNAがHeLa細胞内で発現されること、およびこの細胞系においては、EGLN1（PHD2）およびEGLN3（PHD3）の転写産物は低酸素状態により誘導されるがEGLN2（PHD1）の転写産物は誘導されないことが、RNアーゼプロテクションにより示された。これに符合して、酸素正常状態で増殖させるか又は低酸素状態に16時間さらしたHeLa細胞から調製しin vitroでのHIF-PH活性に関してpVHL捕捉アッセイを用いてアッセイした溶解物の半定量分析は、アクチノマイシンDにより遮断される全HIF-PH活性の誘導を示した。
最後に、本発明者らは、制御された低酸素実験室内の段階的レベルの低酸素状態において、HIF-1α 549-582基質に対する組換えEGLN2のin vitro活性を測定するために、pVHL捕捉アッセイを用いた。まず、本発明者らは、比較的高いレベルの全HIF-PH活性を含有するvhl欠損RCC4細胞の抽出物のHIF修飾活性に対する段階的低酸素状態の効果を測定した。段階的低酸素状態で、活性の進行的減少が観察された。ついで、網状赤血球溶解物中でIVTTにより産生されたEGLN2、または大腸菌（E. coli）内での発現により得られた精製MBP/PHD-1を使用して、同様のアッセイを行った。段階的低酸素状態で、各調製物の活性の、酷似した進行的減少が観察された。したがって、いずれの起源由来の組換えPHD-1の酸素依存性活性も、粗細胞抽出物において観察されるものに匹敵し、培養における段階的低酸素状態に細胞をさらした場合に観察されるHIF-1αタンパク質およびDNA結合における進行的増加（Jiangら, (1996) Am. J. Physiol. 271 C1172-C1180）を反映している。
4.6 HIFプロリルヒドロキシラーゼ活性
完全長ラットSM20、アミノ末端の59アミノ酸を欠くラットSM20の末端切断形態およびヒトホモログEGLN-2は、VHLタンパク質との相互作用を促進するようHIFアミノ酸549-582を修飾することが示された。これはプロリン564のヒドロキシル化に依存的であることが公知である。
インサートを含有しないか、ラットSM20の完全なオープンリーディングフレーム、アミノ末端の59アミノ酸を欠くラットSM20の末端切断形態もしくはEGLN-2として公知のヒトホモログをコードするインサートを含有するpcDNA3に基づくプラスミドを、外因性鉄の非存在下、または100μM 塩化第一鉄を添加して、コムギ胚芽溶解物に組込んだ（programmed）。これらの推定タンパク質に対応するヌクレオチド配列をPCRにより作製し、それらの同一性を配列決定により確認した。生成されたタンパク質産物はそれらの推定分子量と合致した。
HIF-1配列（アミノ酸549-582）を含有するタンパク質を、100μM デスフェリオキサミンの存在下、網状赤血球in vitro転写翻訳反応において産生させ、回収し、ついで、前記の推定酵素を含有するコムギ胚芽翻訳産物にさらした。これらのタンパク質は、フォン・ヒッペル-リンダウ腫瘍抑制タンパク質（pVHL）による認識を可能にしヒドロキシル化により修飾されうる決定的に重要なプロリン（564）を含有する。
35S-メチオニンの存在下、ウサギ網状赤血球溶解物中でのヒト野生型pVHLオープンリーディングフレームを含有するpcDNA3ベクターのin vitro転写および翻訳により産生された放射能標識pVHLへのHIF-1の結合により、HIF-1配列の修飾をアッセイした。
SDS-PAGE分析は、遺伝子EGLN-2、完全長および末端切断型ラットSM20をコードするプラスミドが、Fe2+の存在下、標識pVHLの捕捉を可能にするHIF-1の明らかな修飾を引き起こすことを示した。
pVHL結合は、Fe2+の非存在下では、SM20においても、またはEGLN-2においても観察されず、末端切断型SM20において低レベルの結合が観察されたに過ぎなかった。
4.7 EGLN2の突然変異
修飾およびpVHL結合アッセイを前記のとおりに行った。インサートを含有しないか、EGLN-2として公知のヒトホモログの完全なオープンリーディングフレーム、ヒスチジンからアラニンへの置換をアミノ酸残基358に含有するEGLN-2の突然変異型もしくはアミノ酸369-389を欠く天然スプライス変異体をコードするインサートを含有するpcDNA3に基づくプラスミドを、ウサギ網状赤血球溶解物に組込んだ。
完全長野生型PHD-3ポリペプチドにおいてのみ、pVHL結合が観察された。該完全長野生型酵素はHIF-1配列を修飾することが可能であったが、該突然変異型も該欠失スプライス変異体もそれを行うことが不可能であった。このことは、His358および残基369と389との間の領域がHIFヒドロキシラーゼ活性に必要であることを示している。
4.8 HIFおよびpVHL突然変異の効果
修飾およびpVHL結合アッセイを前記のとおりに行った。インサートを含有しないか、EGLN-2として公知のヒトホモログの完全なオープンリーディングフレームをコードするインサートまたはPHD-3もしくはEGLN-3として公知のヒトホモログの完全なオープンリーディングフレームをコードするインサートを含有するpcDNA3に基づくプラスミドを、コムギ胚芽溶解物に組込んだ。
修飾のためのHIF基質は野生型であるか、またはプロリン564からグリシンへの突然変異を含有していた。捕捉のためのpVHL標的は野生型であるか、またはチロシン98からヒスチジンへの突然変異を含有していた。
野生型HIFおよびpVHLを使用するアッセイにおいて、標識pVHLの結合が観察された。突然変異体HIFまたはpVHLを使用するアッセイにおいては、結合は観察されなかった。
したがって、EGLN2およびEGLN3は共に、野生型pVHLの捕捉を可能にするが突然変異体pVHLの捕捉を可能にしない様式で、野生型HIFを修飾することは可能であったが、突然変異体HIFを修飾することは不可能であった。
4.9 組換え酵素によるHIFの修飾の酸素依存性
COS細胞またはウサギ網状赤血球溶解物中での発現により酵素を産生させた以外は前記のとおりに、修飾およびpVHL結合アッセイを行った。
酵素を産生させるのに使用したプラスミドは以下のとおりであった：pcDNA3（インサートを含有しない）、最初の59アミノ酸を欠くラットSM20をコードする配列を含有するpcDNA3、EGLN2（PHD1）をコードする配列を含有するpcDNA3。低酸素実験室を使用して、酵素によるHIF基質の修飾を酸素正常（21％ O2）または無酸素（2％ O2）条件で行った。
酸素によるHIF-1の調節と、酸素に対する2-オキソグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼの公知基質要求性とを考慮して、HIF修飾活性の酸素依存性を調べた。
EGLN2（PHD1）またはラットSM20（アミノ末端の59アミノ酸を欠く）は、無酸素状態では、pVHL結合に関してHIFを修飾することが不可能であったが、これに対して、21％ O2では、明らかに修飾した。これは、HIF-1の調節における酸素依存性および酸素センシングの手段を示している。
4.10 in vitroにおけるEGLN2およびEGLN3に対するオキサリルグリシンおよび2-オキソグルタル酸の効果
修飾およびpVHL結合アッセイを前記のとおりに行った。インサートを含有しないか又はEGLN-2として公知のシー・エレガンス（C. elegans）Egl-9のヒトホモログの完全なオープンリーディングフレームをコードするインサートもしくはEGLN-3として公知のヒトホモログの完全なオープンリーディングフレームをコードするインサートを含有するpcDNA3に基づくプラスミドを、ウサギ網状赤血球溶解物に組込んだ。添加物の非存在下、オキサリルグリシン、オキサリルグリシン + 2-オキソグルタル酸、200μM デスフェリオキサミンまたは200μM 塩化第一コバルトの存在下で修飾を行った。
酵素活性はオキサリルグリシン、デスフェリオキサミンおよび第一コバルトイオンにより減少することが観察された。オキサリルグリシンの抑制効果は、過剰の2-オキソグルタル酸の添加により部分的に競合された。2-オキソグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼのファミリーは酸素、鉄および2-オキソグルタル酸に対する要求性を示す。これらの遺伝子産物がHIF-1をVHL結合形態へと修飾する能力を、鉄利用能、2-オキソグルタル酸利用能の種々の条件において、および2-オキソグルタル酸インヒビターの存在下で検討した。これらの結果は、網状赤血球溶解物中の活性の、鉄および2-オキソグルタル酸依存性を示した。
4.11 in vivoでのHIF活性に対するジメチルオキサリルグリシンの効果
3つのプラスミド（GAL4応答性ルシフェラーゼ遺伝子をコードするpUAS.tk.luc、GAL4の147アミノ酸のDNA結合ドメインとヒトHIF-1αのカルボキシ末端トランスアクチベーターとの融合体の発現を導く哺乳類発現プラスミドであるpgal-hif775-826、およびトランスフェクション対照としての構成的に発現されるβガラクトシダーゼ遺伝子をコードするpCMV.β-gal）の混合物でHep3bおよびU20S細胞を同時トランスフェクトした。
トランスフェクションの48時間後、示されているとおりにジメチルオキサリルグリシンの存在下または非存在下、酸素正常状態または2％ 低酸素状態で細胞を一晩インキュベートした。細胞溶解物をルシフェラーゼおよびβガラクトシダーゼ活性に関してアッセイし、各サンプルの相対ルシフェラーゼ活性を測定した。
どちらの細胞系においても、該HIFプロリルヒドロキシラーゼインヒビターの存在は、未処理サンプルと比較して、酸素正常状態および低酸素状態のどちらにおいても該カルボキシ末端トランスアクチベーターの活性の増強を引き起こした（図6）。この結果は、活性がタンパク質分解性破壊に依存するとは通常はみなされないHIFのドメインに対するこのインヒビターの増強作用を示している。
該酸素依存性分解ドメインを介した破壊の抑制に共役したカルボキシ末端トランスアクチベーターの作用の増強は、インヒビターにより媒介される、HIF活性の全体的な増加を増強する。
また、組織培養内のHep3BおよびU20S細胞へのジメチルオキサリルグリシンの添加（0.1mM, 1mM）は、ウエスタンブロット実験におけるHIF-1の細胞内レベルを増加させることが観察された。
HIF活性に対するEGLN2（PHD1）の又はアミノ酸369-389を欠く天然スプライス変異体（PHD4）の強制発現の効果。
3つのプラスミド（HIF応答性ルシフェラーゼ遺伝子をコードするpHRE.luc、pcDNA3またはpcDNA3.HIF、産物の発現を導かないか又は完全長ヒトHIF-1αの発現を導く哺乳類発現プラスミド、およびトランスフェクション対照としての構成的に発現されるβガラクトシダーゼ遺伝子をコードするpCMV.β-gal）の混合物でHep3b細胞を同時トランスフェクトした。
トランスフェクションの48時間後、酸素正常状態または2％ 低酸素状態で細胞を一晩インキュベートした。細胞溶解物をルシフェラーゼおよびβガラクトシダーゼ活性に関してアッセイし、各サンプルの相対ルシフェラーゼ活性を測定した。
すべての場合において、相対ルシフェラーゼ活性は、同時発現が完全長EGLN2（PHD1）を含む場合には、該欠失非機能バージョン（PHD4）を含む場合より低かった（図7）。このことは、完全長EGLN2の発現が、急速に破壊されるヒドロキシル化HIFタンパク質の産生を増強することにより機能的HIFを減少させることを示している。
該効果は、HIF-1αのレベルがより高いと予想される場合（例えば、プラスミドから同時発現されるか又は適度の低酸素状態により部分的に安定化される場合）において、より一層顕著であった。これは、これらの遺伝子産物の発現がin vivoでHIF-1分解を増強しうることを示している。
4.12 HIFプロリルヒドロキシラーゼ活性のインヒビターの効果
細胞抽出物がGal-Hif549-582-VPI6を修飾して放射能標識組換えpVHLの捕捉を可能にする能力に対するインヒビターの効果を測定するために、修飾およびpVHL結合アッセイを前記のとおりに（および逆相HPLCにより）行った。
SDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーを用いて、pVHLの結合を測定した。
細胞抽出物での処理を行わなかった場合には、pVHLの結合は観察されなかったが、このことは、Gal-Hif549-582-VPI6が未修飾であったことを示している。
インヒビターの非存在下の細胞抽出物での処理は、pVHLの強力な結合を示した。オキサリルグリシン（NK87）の存在下の細胞抽出物での処理は、pVHLの結合の減少を示したが、このことは、オキサリルグリシンがHIFプロリルヒドロキシラーゼを抑制することを示している。追加的な2-オキソグルタル酸で補足された細胞抽出物での処理は強力なpVHL結合を生じた。NK87および追加的な2-オキソグルタル酸の存在下の細胞抽出物での処理も強力な結合を生じたが、このことは、HK87が該オキソグルタル酸補基質と競合することを示している。
1mM NMPGの存在下の細胞抽出物での処理はpVHLの強力な結合を生じる。しかし、5mM NMPGの存在下の処理はpVHL結合の量を減少させた。
陽性対照として、Gal-HIF-VP16基質を追加的な塩化第一鉄の存在下のウサギ網状赤血球溶解物中で合成させた場合には、pVHLは捕捉された。表3に示す他の潜在的インヒビターを、前記のとおりHIFヒドロキシラーゼ活性を抑制する能力に関してスクリーニングした。
このアッセイにおいてスクリーニングした化合物のうち、Is1、Is3、Is8、ベンゾヒドロキサム酸、エチル ジヒドロキシベンゾエートおよびNK45で、HIFヒドロキシル化の抑制を示すpVHL結合の減少が観察された。
本出願は、HIF-1/VHLプロリルヒドロキシラーゼ系の特徴づけ、およびHIFプロリルヒドロキシラーゼ（HIF-PH）として機能する2-オキソグルタル酸依存性オキシゲナーゼの新規官能基の同定に関する。HIFの調節におけるこれらの酵素の決定的に重要な役割は、vhl-1およびegl-9突然変異体線虫（これらは、酸素によるHIF-1の調節の本質的に完全な喪失を示す）の分析により強調される。組換えHIF-PHの入手可能性はHIF/VHL系の更なる研究を可能にし、生理的酸素恒常性の複雑な要求がこれらの酵素の生化学的特性により満たされる度合を測定することが重要な課題となろう。
拡散により直接的に酸素を得る線虫におけるHIF系の同定は、遺伝子調節のこの系が、おそらく、細胞レベルにおける酸素利用能に対する応答を調節するために、複雑な全身的酸素運搬系の発生の前に進化したに違いないことを示している。
哺乳類においては、HIF系は、酸素に対する細胞応答だけではなく、ある範囲の全身的機能（例えば、血管新生、血管運動制御および赤血球生成に対する作用を介した酸素運搬の制御）をも調節する。これらの複雑な要求性は、単一の酸素センサーの概念とは矛盾している。しかし、それぞれ2以上のプロリルヒドロキシル化部位（Massonら, 2001 前掲）を有するHIF.PHの（少なくとも）3つのアイソフォームおよびHIF-1αの（少なくとも）2つのアイソフォームの哺乳類細胞内での存在は、酸素利用能に対する種々の生理的応答がこれらの分子間の相互作用の組合せを介して生じるという可能性を示しているのかもしれない。本明細書に記載のHIF PH酵素の特徴づけは、特に、細胞内のHIF-αレベルをモジュレーションする薬理学的物質の開発における標的として種々の治療用途を有する。
本実施例においては、HIF-1αタンパク質、および炭酸脱水酵素9（CA-9）をコードする内因性HIF標的遺伝子が、PHDインヒビターであるジメチルオキサリルグリシンに細胞をさらすことにより誘導されることを示す。これまでの研究において、本発明者らは、N-オキサリルグリシンがin vitroでのPHD活性のインヒビターであるが無傷細胞内には進入し得ないらしいことを示している。したがって、該化合物を組織培養細胞に運搬するために、そのエステル化形態であるジメチルオキサリルグリシンを使用した。
Hep3BおよびU2OS細胞を0.1mMまたは1mM ジメチルオキサリルグリシンに6時間さらし、回収し、HIF-1αおよびCA-9発現のレベルの変化に関して免疫ブロット法（ウエスタンブロット法）によりアッセイした。インヒビターを加えない対照も行った。HIF-1αおよびHIF標的遺伝子産物CA9の両方の明らかなアップレギュレーションが、ジメチルオキサリルグリシンの存在下で観察される。HIF-1αのアップレギュレーションはジメチルオキサリルグリシンの濃度の増加と共に増加し、一方、0.1mMおよび1mMの両方のジメチルオキサリルグリシンにさらした後のCA-9発現のレベルは類似していた。
本実施例においては、HIFプロリルヒドロキシラーゼインヒビターであるジメチルオキサリルグリシンの注射により、マウス皮下スポンジ血管新生アッセイにおいて、新生血管の成長の促進が刺激されうることを示す。これまでの研究において、本発明者らは、N-オキサリルグリシンがin vitroでのPHD活性のインヒビターであるが無傷細胞内には進入し得ないらしいことを示している。エステル化形態であるジメチルオキサリルグリシンを組織培養細胞に適用することにより、HIFα鎖の安定化（実施例1）および内因性HIF標的遺伝子の転写の活性化（実施例5）がもたらされる。
マウスの皮下へのポリウレタンスポンジの移植は、血管新生に炎症性刺激を与え、化合物の血管新生促進(proangiogenic)効果および抗血管新生効果を評価するための十分に確立されたモデルである。in vivoでのジメチルオキサリルグリシンの効果を調べるために、第0日に、8mmの無菌スポンジディスクをC57 ブラック（Black）マウスの背部皮膚下に挿入した。第1、2、4および5日に、1日1回、試験溶液を皮膚を介してマウスのスポンジ内に注入した。個々のマウスに100μlのアリコートの無菌ジメチルオキサリルグリシン（0.1mM、1mMまたは10mM）または担体溶液を与えた。第7日に動物を犠死させ、該スポンジを取り出した。該スポンジを3.7％ ホルムアルデヒド中で固定し、パラフィン包埋し、フォンビルブランド(von Willebrand)因子に関して免疫組織化学的に染色して血管を同定した。
ジメチルオキサリルグリシン（1mM）を注入したスポンジにおいては、溶媒のみを与えたものより著しく多数の血管が観察された。
低酸素状態によるHIF-1αの誘導に対するPKタグ付きPHD1発現の効果
本実施例においては、組換えPHD（PHD1）が組織培養細胞系内で、HIFポリペプチドの代謝に影響を及ぼすよう過剰発現されうることを示す。
アクチベーターに融合したテトラサイクリンオペレーターをコードするバイナリー系、およびテトラサイクリン応答エレメントの制御下でC末端PKエピトープタグ付きPHD1をコードするプラスミドで、U2OS細胞を安定にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、21％、3％または0％ 酸素とともに、ドキシサイクリンの存在下または非存在下で16時間インキュベートした。ついで細胞溶解物上で免疫ブロットを行って、HIF-1αのレベルを定量し、また、PKタグによりPHDの発現を調べた。
細胞をドキシサイクリンに16時間さらすと、PKタグ付きPHD1の発現が誘導された。PHD1の誘導発現は、適度の低酸素状態（3％ 酸素）においては、HIF-1αの発現を実質的に減少させ、また、より低い程度であるものの、完全低酸素状態（0％ 酸素）下においても発現を減少させた。このように、内因性HIF-1の発現は、アッセイ条件下で特異的に誘導されるPHD1アイソフォームの活性に著しく依存することが、本実施例で示されている。
(S)-2-(メトキシオキサリル-アミノ)-ペンタン二酸ジエチルエステル（IS12）またはジエチル N-メトキシオキサリル-(L)-グルタメート（IS12）
Figure 0004590157
10 mlのトルエン中の10 mmol (2.40g)のジエチル (L)-グルタメート塩酸塩の撹拌溶液に、10 mmol (1.23 g, 0.93 ml)のメチルオキサリルクロリドを加え、HClガスが発生しなくなるまで（4〜6時間）加熱した。溶媒を蒸発させて2.86 g (9.9 mmol, 99%)のIS12を黄色っぽい油状物として得た。[α]25 D -28.3°(メタノール中、c 1); νmax (NaCl)/cm-1 1738, 1705 (C=O); δH(200 MHz; CDCl3) 1.22, 1.26 (6 H, 2 t, 3JHH 7.3, OCH2CH3), 1.95-2.47 (3 H, m, CHCH2CH2), 3.88 (3 H, s, OCH3), 4.10, 4.20 (4 H, 2 quart, 3JHH 7.3, OCH2CH3), 4.60 (1 H, ddd, 3JHH 8.1, 3JHH 8.1, 3JHH 4.8, CH), 7.76 (1 H, d, 3JHH 8.1, NH); δC(50 MHz; CDCl3) 14.1 (OCH2CH3), 27.0, 30.1 (CH2CH2), 52.1, 53.6 (CH, OCH3), 60.8, 62.0 (OCH2CH3), 156.1, 160.4, 170.5, 172.4 (C=O); m/z(AP+) 290 (MH+, 68%)。
(S)-2-(オキサリル-アミノ)ペンタン二酸（IS13）またはN-オキサリル-(L)-グルタメート（IS13）
Figure 0004590157
3 mmol (0.87 g)のIS12を、該化合物中のすべてのエステル官能基を切断するために1.1当量の水酸化ナトリウムが確保されるよう5.0 mlの2 N 水酸化ナトリウム水溶液と共に加熱した。該反応をAmberlite IR 120 Hイオン交換樹脂カラム（予め水で洗浄して約pH 4にしたもの）でパーコレーションし、再びpHが4に上昇するまで水で溶出した。水を真空中で蒸発させ、残渣を真空中で乾燥させた。これにより、0.65 g (2.9 mmol, 97%)のIS13が黄色っぽい吸湿性固体として得られた。mp 約 60℃; [α]25 D -2.2 (メタノール中、c 1); νmax (NaCl, MeOH)/cm-1 1697 (C=O); δH(200 MHz; D2O) 1.77-2.35 (3 H, m, CHCH2CH2), 4.30 (1 H, dd, 3JHH 9.1, 3JHH 5.0, CH); δC(50 MHz; D2O) 25.8, 30.3 (CH2CH2), 52.6, (CH), 161.4, 162.9, 174.5, 177.3 (C=O); m/z(AP-) 218 (M-H+, 5%), 168 (M-H+-オキサリル, 85%)。
(S)-2-(メトキシオキサリル-アミノ)-プロピオン酸（IS68）またはメチルオキサリル-L-アラニン（IS68）
Figure 0004590157
この化合物は、10 mmol (0.89 g) の(L)-アラニンおよび10 mmol (1.23 g, 0.93 ml)のメチルオキサリルクロリドを使用して実施例8のとおりに製造し、1.96 gの粗製黄色油状物を得た。該粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液 酢酸エチル）に供して1.42 gのIS68を黄色っぽい油状物として得た。これは尚も微量の不純物を含有していた。酢酸エチルとジエチルエーテル（0.39 g, 2.2 mmol, 22%）との混合物から再結晶することにより、純粋なサンプルを得た。mp 129-130 ℃; 1.1° (MeOH中、c 1); νmax (NaCl, MeOH)/cm-1 1744, 1693 (C=O); δH(200 MHz; DMSO-d6) 1.35 (3 H, d, 3JHH 7.3, CHCH3), 3.43 (1 H, br, COOH), 3.81 (3 H, s, OCH3), 4.28 (1 H, pseudo-quint, 3JHH 7.4, CH), 9.16 (1 H, d, 3JHH 7.5, NH); δC(50 MHz; DMSO-d6) 17.3 (CHCH3), 48.8 (CH), 53.7 (OCH3), 157.6, 161.8, 173.8 (C=O)。
(R)-2-(メトキシオキサリル-アミノ)-プロピオン酸（IS69）またはメチルオキサリル-D-アラニン（IS69）
Figure 0004590157
この化合物は、(L)-アラニンの代わりに(D)-アラニンを使用する以外はIS68と同様に製造して、0.36 g (2.1 mmol, 21%) のIS69を無色固体として得た。mp 131-132℃: [α]25 D +1.9° (MeOH中、c 1)。旋光度以外の分析データはIS68と一致した。
(S)-2-(3-メルカプト-プロピオニルアミノ)-プロピオン酸（IS37）またはN-(3-メルカプトプロパノイル)-(L)-アラニン（IS37）
Figure 0004590157
文献の手順（M. A. Ondetti, D. W. Cushman, 米国特許第4053651号, 1977, E. R. Squibb & Sons (Chem. Abstr., Volume 88, 136977)）に従い製造した。該文献の研究には、融点以外の分析の詳細が記載されていなかった。4 mmol (1.13 g)のIS20の水(2 ml)溶液を1.6 mlの濃アンモニア水溶液で室温で1時間処理し、その間に無色沈殿物が生成した。該混合物を水で希釈し、固体を濾去した。濾液を酢酸エチルで洗浄し、水相を濃塩酸で酸性にし、酢酸エチルで抽出した。合わせた有機物を水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、真空中で蒸発させて0.49 gの粗IS37を得た。酢酸エチルとn-ヘキサンとの混合物から再結晶して、0.32 g (1.8 mmol, 45%)のIS37を無色固体として得た。mp 78-79℃; [α]25 D -39.4 (メタノール中、c 1); νmax (NaCl, MeOH)/cm-1 1728, 1638 (C=O); δH(200 MHz; DMSO-d6) 1.28 (3 H, d, 3JHH 7.3, CH3), 2.31 (1 H, t, 3JHH 7.9, SH), 2.40-2.48, 2.60-2.73 (4 H, 2 m, CH2CH2), 4.22 (1 H, quint, 3JHH 7.3, CH), 8.26 (1 H, d, 3JHH 7.3, NH), 12.56 (1 H, br s, COOH); δC(50 MHz; DMSO-d6) 18.0 (CH3), 20.8 (CH2CH2, 第2シグナルはDMSOにより覆われた(covered), CDCl3中での測定はそれを40.0において示した), 48.3, (CH), 171.0, 175.1 (C=O); m/z(AP-) 176 (M - H+, 100%)。
(R)-2-(3-メルカプト-プロピオニルアミノ)-プロピオン酸（IS38）またはN-(3-メルカプトプロパノイル)-(D)-アラニン（IS38）
Figure 0004590157
表題化合物は、IS20の代わりにIS21を使用する以外はIS37と同様に製造して、0.18 g (1.0 mmol, 25%)のIS38を無色固体として得た。mp 64℃; [α]25 D +39.5 (メタノール中、c 1)。旋光度以外の分析データはIS37と一致する。
(S)-2-(3-ベンゾイルスルファニル-プロピオニルアミノ)-プロピオン酸（IS20）またはN-(3-ベンゾイルチオプロパノイル)-(L)-アラニン（IS20）
Figure 0004590157
文献の手順（M. A. Ondetti, D. W. Cushman, 米国特許第4053651号, 1977, E. R. Squibb & Sons (Chem. Abstr., Volume 88, 136977)）に従い製造した。該文献の研究には、融点以外の分析の詳細は記載されていなかった。
16.7 mlの1 N 水酸化ナトリウム溶液に、16.7 mmol (1.48 g)の(L)-アラニンを溶解した。更に9 mlの2 N 水酸化ナトリウム溶液を氷温で加えた後、16.7 mmol (2.85 g)の3-ブロモプロピオン酸を加え、該反応物を室温で3.5時間撹拌した。ついで18.1 mmol (2.50 g)のチオ安息香酸と11.6 mmol (1.6 g)の炭酸カリウムとの混合物（水16.7 mlおよびTHF 5ml中）を該反応物に加え、ついでこれを一晩撹拌した。得られた混合物を濃塩酸で酸性にし、30分間撹拌し、酢酸エチルで抽出した。合わせた有機物を乾燥させ、溶媒を真空中で蒸発させた。残留した濃厚な黄色油状物（5.15 g）をエーテルから再結晶して、1.83 g (6.5 mmol, 39%)のIS20を無色粉末として得た。mp 98-99℃; [α]25 D -19.1 (メタノール中、c 1); νmax (NaCl, MeOH)/cm-1 1730, 1660 (C=O); δH(200 MHz; CDCl3) 1.44 (3 H, d, 3JHH 7.1, CH3), 2.66, 3.32 (4 H, 2 d, 3JHH 7.1, CH2CH2), 4.61 (1 H, quint, 3JHH 7.1, CH), 6.77 (1 H, d, 3JHH 7.1, NH), 7.37-7.61, 7.89-7.96 (5 H, 2 m, ar), 10.08 (1 H, br s, COOH); δC(50 MHz; CDCl3) 18.0 (CH3), 24.6, 36.1 (CH2CH2), 48.3, (CH), 127.2, 128.7, 133.6, 136.7 (ar), 171.5, 176.0, 192.4 (C=O); m/z(AP-) 280 (M - H+, 10%)。
(R)-2-(3-ベンゾイルスルファニル-プロピオニルアミノ)-プロピオン酸（IS21）またはN-(3-ベンゾイルチオプロパノイル)-(D)-アラニン（IS21）
Figure 0004590157
この化合物は、(L)-アラニンの代わりに(D)-アラニンを使用する以外はIS20と同様に製造して、1.78 g (6.3 mmol, 38%)のIS20を無色粉末として得た。mp 98-99℃; [α]25 D +19.1 (メタノール中、c 1)。旋光度以外の分析データはIS20と一致した。
HIF-α分解のペプチド遮断は細胞代謝および血管新生をモジュレーションする
16.1 緒言
虚血は罹患率および死亡率の主要原因であり、有効な分子的療法が精力的に研究されている 1 2。転写因子である低酸素誘導因子1（HIF）は低酸素応答のマスター(master)調節因子であり、組織内の代謝の供給と需要とのバランスをとる多様な過程に関与する遺伝子を制御する 3 4 5。したがって、HIF活性のモジュレーションは虚血疾患の治療のための魅力的なアプローチを提供する。さらに、HIFにより駆動された血管新生は、個々の増殖因子により生成された血管より成熟した且つそれほど漏出性ではない血管を生成する 6 7 8。
HIFの調節は、そのα鎖を介して複数のレベルで媒介される 9 10 11 12 13。マクロファージ由来ペプチドであるPR39はHIFの蓄積および血管新生を引き起こすことが報告されている14。一過性トランスフェクション研究によるHIFα酸素依存性分解ドメイン（ODD）の分析 11 12 15 16 17 18は、HIFの安定化のための可能な具体的な代替的アプローチを示唆した。本発明者らは、前記実施例において、フォン・ヒッペル-リンダウE3（VHL E3）ユビキチンリガーゼ複合体により媒介される酸素存在下のプロテアソーム分解のために必要なものとして同定された、調節性プロリルヒドロキシル化部位を含有するペプチドを使用した 19 20 21 22。HIFの活性化には複数の段階が関与しているにもかかわらず、ODDの2つの領域に由来するペプチドがHIFαを安定化するのみならず、in vivoでの酸素正常条件下の血管新生および代謝をモジュレーションする転写応答をも引き起こすことを本発明者らは明らかに示しており、このことは、それらのペプチドが、すべての活性化段階に共通するメカニズムに影響を及ぼすことを示唆している。これらの結果は、これらのペプチドまたはそれらに基づく分子が虚血組織に対する可能な治療アプローチを提供することを示している。
16.2 CODDおよびNODDポリペプチドの過剰発現はHRE依存性レポーター遺伝子の発現を誘導しうる
酸素正常状態でのHIFα分解は飽和可能であり17、ODD内の亜領域に依存するため、本発明者らは、HIF-1αのアミノ末端ODD（NODD）およびカルボキシ末端ODD（CODD）21をコードするペプチドが、低酸素応答エレメント（HRE）依存性レポーター遺伝子発現により測定されるHIF活性に影響を及ぼしうるかどうかを検討した。NODDおよびCODDペプチドがHIF活性を抑制する提示されているモデルを図13に示す。簡潔に説明すると、プロリルヒドロキシル化および／またはVHL結合に関して競合して後続のユビキチン化を遮断するNODDおよびCODDポリペプチドにより、分解が妨げられる。本発明者らは、核移行配列とc-mycエピトープタグとに連結されたNODD（HIF-1-α aa 343-417）またはCODD（HIF-1-α aa 549-582）をコードするプラスミドを構築した。これらのプラスミドをHRE依存性ルシフェラーゼレポータープラスミドと共にU2OSおよびHep3B細胞内に一過性に同時トランスフェクトした。酸素正常条件下、いずれのODDに由来するポリペプチドの発現も、24時間後、ペプチドの非存在下で低酸素により誘導されるレベルに匹敵するレベルにまで相対ルシフェラーゼ活性を増加させた（結果を図13に示す）。該NODDおよびCODD発現プラスミドのトランスフェクションは、機能的HREを欠くレポータープラスミドに由来するルシフェラーゼ活性に何ら効果を及ぼさなかったが、このことは、この効果がHREにより媒介されたことを示していた（結果は表示していない）。ポリペプチドの作用が内在性HIF経路により媒介されたことを確認するために、本発明者らは、HIFα鎖を欠く突然変異体チャイニーズハムスター卵巣細胞系（Ka13）、およびHIF-1αで相補されたトランスフェクタント（KH-1）において、この実験を繰返した23。該NODDおよびCODDプラスミドのトランスフェクションは、KH-1細胞においてはルシフェラーゼ活性の増強を引き起こしたが、Ka13細胞においては引き起こさなかった（結果を図13に示す）。
本発明者らは、NODDおよびCODDペプチドのより短い断片を試験して、HRE依存性ルシフェラーゼ活性化を可能にする最小ドメインとしてアミノ酸390-417およびアミノ酸556-74を規定した（結果を図13に示す）。これらの最小ドメインとマウスHIF-1-α由来の同等領域との配列アラインメントを図13に示す。
HIFα鎖の分解は、402位および564位のプロリル残基の酸素依存性酵素的ヒドロキシル化の後のVHL E3ユビキチンリガーゼによる認識に依存している 19 20 21。本発明者らは、突然変異発現プラスミド（P402AまたはP564G）を使用して、ルシフェラーゼ活性のHRE依存性誘導の完全な消失を示したが（結果を図13に示す）、このことは、ポリペプチドの機能のためのこれらの残基の決定的な役割を示している。これは、NODDおよびCODD融合タンパク質の発現が、十中八九は酸素正常状態の細胞におけるVHL認識またはプロリルヒドロキシル化を妨げることにより、内因性HIFα鎖の分解を妨げ、したがって、HIF系の治療的操作のための可能な経路を提供することを示唆していた。
16.3 安定なNODDおよびCODDポリペプチドの発現は内因性HIF-1αの蓄積を引き起こす
内因性HIFを活性化するNODDおよびCODDポリペプチドの治療可能性を更に検討するために、本発明者らは、一過性トランスフェクションに使用したのと同じ配列をコードするドキシサイクリン誘導性NODD（doxNODD）およびCODD構築物（doxCODD）でU2OS細胞を安定にトランスフェクトした。
テトラサイクリン誘導系により制御されるNODDまたはCODDで安定にトランスフェクトされた細胞をドキシサイクリンにさらした。ドキシサイクリンにさらして0、16、24および48時間後に、細胞抽出物を調製した。ついでdoxNODD（HIF-1α aa 343-417）、doxCODD（HIF-1α aa 549-82）および対照細胞（空ベクター）の抽出物をHIF-1αタンパク質について免疫ブロットした。ドキシサイクリンの投与の16〜48時間後、doxNODDおよびdoxCODD細胞においてはHIF-1αシグナルの増加が検出されたが、空ベクター細胞においては検出されなかった。比較のために、低酸素により誘導されたHIF-1αのレベルも測定した。内因性HIF-1αの誘導はドキシサイクリンの用量（0.2〜3.2μg/ml）および時間に依存的であり、48時間後にピークに達した。最高レベルは、それぞれdoxNODDおよびdoxCODD細胞の低酸素またはDFO処理の後で認められるHIF-1αレベルの約20％および約70％であった。ドキシサイクリンは、鉄をキレート化する弱い能力を有するにもかかわらず、空ベクターでトランスフェクトされた細胞においてはHIF-1αタンパク質を誘導しなかった。
免疫蛍光顕微鏡法は、発現された融合タンパク質のc-mycタグおよび内因性HIF-αの両方の可視化を可能にした。ドキシサイクリン活性化doxCODD細胞においては、両者は核内に局在していた。HIF-1αの発現は細胞によって大きく異なっていた。ドキシサイクリンにさらされなかった細胞においては、内因性HIF-1-αからの強力な染色が認められたに過ぎなかった。
ドキシサイクリンと最適なDFO（75μm）または低酸素刺激（1％ O2）との組合せによるdoxCODD細胞の処理は、免疫ブロット上のHIF-1αシグナルの更なる増加を導かなかった。このことは、内因性HIFα鎖が生理的刺激により完全に誘導された場合には、それらのペプチドが更なる作用を有さないことを証明している。
それらのポリペプチドがVHL-ユビキチン-プロテアソーム系による細胞性HIF-1α標的化を妨げるかどうかを直接的に調べるために、本発明者らは、外因性35S-メチオニン標識HIF-1αのユビキチン化が、空ベクターでトランスフェクトされた該ペプチドを欠く対照細胞抽出物と比較してdoxCODD抽出物の存在下では著しく減少することを示した。
HIFおよびHIF依存性標的遺伝子の発現は多数の負のフィードバック制御を受けると示唆されている。該系の連続的活性化の結果を検討するために、本発明者らは、doxCODD細胞をドキシサイクリンに2、4、6または8日間さらした。HIF-1αタンパク質レベルは第2日および第4日に有意に上昇したが、それ以降は減少した。再びさらす前に48時間にわたりドキシサイクリンを培地から除去することにより該系のスイッチを切ると、上昇したHIF-1αタンパク質レベルの再誘導が生じた。このことは、該抑制効果が可逆的であることを示していた。例えば、間隔をあけて本発明のモジュレーターを投与することにより、あるいは間隔をあけて本発明の構築物を誘導することにより複雑な生理的下流効果をモジュレーションするためにHIF系を用いる際には、この現象を考慮する必要があるであろう。
16.4 NODDおよびCODD融合タンパク質は標的遺伝子のmRNAおよびタンパク質のレベルを誘導する
これまでに記載されている結果は、酸素正常条件下、NODDおよびCODDポリペプチドの発現が内因性HIF-1α鎖の安定化およびそれに伴う一過性トランスフェクト化人工HRE依存性プロモーターの活性化をもたらすことを示している。染色体DNA中の天然HIF標的遺伝子の発現は他の因子により抑制される可能性がある。したがって、本発明者らは、HIFの標的であることが知られている内因性遺伝子の、ペプチドによるモジュレーションを調べた。
炭酸脱水酵素IX（CAIX）は低酸素条件下で転写的にアップレギュレーションされる 24。本発明者らは、doxCODDおよび空ベクターでトランスフェクトされた細胞におけるドキシサイクリン処理の後、間隔をおいてCAIX mRNAを測定するために、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイを用いた。mRNAのレベルを、処理の0、24および48時間後に測定した。また、同等のローディングが保証されるよう、SnRNA（核内低分子RNA）をプローブした。24および48時間後、doxCODD細胞においては、ドキシサイクリンは、低酸素状態でのインキュベーションにより得られたのに類似したレベルにまでmRNAレベルを著しく誘導した。空ベクターでトランスフェクトされた細胞はCAIXの誘導を示さなかった。免疫ブロットは、c-mycタグを使用する免疫ブロット法により可視化される、CODDペプチドの検出に対応したCAIXタンパク質の付随的増加を示した。この効果の普遍性を調べるために、本発明者らは、グルコース輸送体1（Glut-1）mRNAの発現に関する比較可能な実験を行ったところ、類似した結果を得た。ドキシサイクリンを細胞培養培地に繰返し加え、Glut-1 mRNAをリボヌクレアーゼプロテクションにより検出し、0、2、4、6および8日後に測定したところ、Glut-1 mRNAレベルは最初の4日間は増加し、ついで、前記で観察されたHIF-1αタンパク質レベルと合致して減少した。最高Glut-1 mRNAレベルは、75μM デスフェリオキサミンにさらされた後に誘導されたレベルに匹敵した。
Glut-1発現の増強の生理的関連性を調べるために、本発明者らはグルコース取り込み実験を行った。3H-グルコースの取り込みを測定した。ドキシサイクリンで24時間誘導した後、doxCODD細胞においては、空ベクターでトランスフェクトされた細胞と比較して増加した3H-グルコースの取り込みが測定された。一方、ドキシサイクリンで処理されていない細胞における基礎レベル、および3H-グルコースの取り込みの低酸素誘導レベル（低酸素）は、細胞系間で匹敵した（*: P<0.01; 誤差線は3回の反復のSEMを表す）。
このように、対照細胞とは異なり、安定にトランスフェクトされた細胞においてはグルコースの取り込みを誘導することにより、CODDポリペプチドの発現は低酸素の効果を模倣したものとなった。
16.5 tat-NODDおよびtat-CODD融合タンパク質は培養細胞内に進入し酸素正常条件下でHIF-1αを誘導する
前記の実験は、酸素依存性遺伝子発現が、NODDおよびCODDポリペプチドの、プラスミドに基づく発現により、酸素正常状態でモジュレーションされうることを示している。このアプローチを拡張するために、本発明者らは、比較しうるペプチドを細胞内に形質導入する効果を調べることを選択した。HIV tat-タンパク質のトランスダクションドメインは、輸送体非依存的メカニズムにより、融合タンパク質を細胞膜越しにに運搬する 25 26。本発明者らは、検出およびニッケルアフィニティー精製を容易にするHAおよびHISタグと共にNODDおよびCODDペプチドをtat-配列に融合した。核内への進入にはtat配列のみで十分であるため 27、本発明者らは、外因性核移行配列は含有させなかった。
本発明者らは、tat-NODDおよびtat-CODDを使用して、VHLとの相互作用に必要な修飾をそれらが受ける能力を示すために、VHL E3相互作用アッセイを行った 21。tat-ODD発現ベクターの35S-メチオニン標識IVTT産物を、それがVHL E3リガーゼに結合する能力に関して調べた。前記のユビキチン化アッセイの場合と同様、細胞抽出物による修飾の後、NODD（HIF-1α 343-417）およびCODD（HIF-1α 549-582）ポリペプチドはVHL E3ユビキチンリガーゼに結合したが、それらに対応するプロリン突然変異体（HIF-1α 343-417/P402AおよびHIF-1α 549-582/P564G）は結合しなかった。したがって、該35S-メチオニン標識組換えポリペプチドはVHLと相互作用した。これは、前記のユビキチン化実験の結果を裏付けるものである。該相互作用は、402位および564位のプロリンのヒドロキシル化を促進する細胞抽出物の存在により増強された 19。一方、プロリンが突然変異したペプチドを使用した場合には、結合は生じなかった。
次に、これらのtat-融合タンパク質が細胞膜を通過しHIF-1αを誘導するかどうかを、本発明者らは免疫ブロット法により検討した。tat-NODDまたはtat-CODD融合タンパク質を細胞培養物に加えて2時間経過した後、全細胞タンパク質抽出物において、HAタグに関する免疫ブロット法により無傷ペプチドが検出可能であった。tat-NODD（tat-343-417）およびtat-CODD（tat-549-582）ポリペプチドのHAタグが、ポリペプチドを繰返し投与した後の細胞抽出物において検出され、このことは、該細胞によるそれらの取り込みを示している。HIF-1αタンパク質は、tat-NODDおよびtat-CODDポリペプチド（0.5μM）によっては誘導されたが、対応するプロリン突然変異体によっては誘導されなかった。最高レベルは、75μM デスフェリオキサミン（DFO）にさらした後に誘導されたレベルに匹敵した。ポリペプチドを繰返し投与する実験においては、該細胞を融合タンパク質に最初にさらして20時間経過した後、内因性HIF-1αが酸素正常状態で検出可能であった。これに対して、該プロリンを欠く対応突然変異体ペプチドを使用した場合には、本発明者らは、HIF-1αシグナルを検出しなかった。変性はtat-融合タンパク質の取り込みを増加させると報告されている 25。変性tat-NODDおよびtat-CODDペプチドは尚も細胞に進入することが可能であったが、HIF-1αのアップレギュレーションの媒介においては不活性であった。これは恐らく、それらが、もはやヒドロキシル化され得なかったからであろう。
16.6 内皮活性化およびin vivo血管新生アッセイ
本発明の方法を用いて、HIFシグナル伝達経路の人工的活性化は血管新生を誘導するはずであるため、虚血疾患の治療において潜在的に有用であろう。本発明者らは、空ベクターでトランスフェクトされた細胞またはdoxCODD細胞と共にヒト微小血管内皮細胞（HMEC-1）を共培養するin vitro血管新生アッセイにおいて、ポリペプチドにより誘導されるHIF安定化の効果を調べた。負のフィードバックループを誘導する持続的活性化の可能性を考慮して、本発明者らは、間欠誘導の効果を調べることを選択した。空ベクターでトランスフェクトされた細胞の場合ではなく、doxCODD細胞においては、5日間にわたるドキシサイクリンへの間欠的曝露は、フォンビルブランド因子に関する免疫染色により可視化される複合的管構造への共培養内皮細胞の集合を引き起こしたが、対照細胞においてはこれが認められなかった。陽性対照として、HMEC-1の増殖を誘導することが知られている表皮増殖因子（EGF; 5ng/ml）を使用した。これらの観察をin vivoモデルに拡張するために、本発明者らは、マウスの皮下に移植されたポリウレタンスポンジ内にtat-融合タンパク質を注入する効果をアッセイした。第1、2、4および5日における間欠的注入は、プロリン突然変異体融合タンパク質を注入したスポンジと比較して第7日にアッセイされた血管新生応答の著しい促進を招いたが、このことは、該tat成分からの寄与が無かったことを示している 28。フォンビルブランド因子に関する免疫組織化学は、tat-CODDでの処理の7日後に外植されたスポンジにおいては血管密度の増加を示したが、突然変異体ペプチド（tat-CODD/P564G）で処理されたスポンジにおいてはそのような増加を示さなかった。VEGFおよびGlut-1に対する染色は、tat-NODDまたはtat-CODDで処理された動物においては対照に比して増強された。該スポンジを包囲する細胞は特に強力な染色を示した。スポンジ内の血管内皮は、平滑筋アクチンを発現する細胞により包囲されていた。
16.7 総括
低酸素誘導因子-1（HIF）は、低酸素ストレスに応答して血管新生促進遺伝子を調節し、代謝をモジュレーションすることが知られている転写因子である。したがって、HIF活性のモジュレーションは、虚血疾患を改善するための魅力的な理論的経路を提供する。酸素正常条件下、HIFα鎖は、決定的に重要なプロリル残基の酵素的ヒドロキシル化の後、ユビキチン化され、プロテアソームにより破壊される。ここで、本発明者らは、内因性HIFを安定化してHIF標的遺伝子をアップレギュレーションするための、これらのプロリル残基を有するポリペプチドの使用を示す。細胞培養物内でのペプチドの発現は、グルコース輸送のような生理的に重要な機能に影響を及ぼし、共培養された内皮細胞による細管形成を引き起こす。ポリペプチドの皮下注射は、著しく促進された局所的血管新生応答およびグルコース輸送体-1遺伝子発現の誘導を引き起こす。これらの結果は、酸素正常状態のHIF活性を増強するためにこれらのポリペプチドを使用する実施可能性を示しており、虚血疾患の治療のための新たな道を開くものである。
本実施例においては、本発明者らは、低酸素調節性転写因子HIF-1αを安定化するポリペプチドの使用を記載した。本発明者らは、グルコースの取り込み及び血管新生のような複雑な生理的系が酸素正常条件下においても強力に誘導されうるという証拠を示した。
虚血疾患を治療するための関連した分子的アプローチには、単一の増殖因子の使用 2、または分解ドメインを欠くHIFに基づく配列による遺伝子治療の使用6 29が含まれる。本発明で用いるアプローチは、代謝適応および血管新生を引き起こす全体的な生理的応答を先取りする（co-opt）点、およびより容易に適用されるはずである、遺伝子治療の代替手段を提供する点など、前者に対する利点を有する。
癌の増殖およびアポトーシスにHIFが及ぼす影響 30 31は、長期的なHIFの活性化が新生物形成促進(pro-neoplastic)作用を含む有害な効果を及ぼしうるという懸念を抱かせる。しかし、これらの過程は恐らく、HIFの活性化以外の更なる事象を要し、治療のための血管新生に要するより遥かに長い時間経過を要すると考えられる。さらに、本発明で使用するペプチドは元来不安定であり局所的に作用するため、連続的かつ全身的な曝露を避ける厳しく限定された投与計画を可能にする。
NODDおよびCODDポリペプチドは単独使用および併用において有効であった。細胞内でのポリペプチドの作用メカニズムは、HIFプロリルヒドロキシラーゼ活性に関する競合またはVHL結合能に関する競合を含む。後者の可能性のほうが高いことを、3つの証拠が示唆している。第1に、本発明者らは、これらのNODDおよびCODD融合タンパク質が、おそらくそれら自身のヒドロキシル化の後にVHLに結合することを示している。第2に、いずれのペプチドの作用もHIFαを安定化するのに十分であり、それが、異なるヒドロキシラーゼアイソフォームにより標的化されうる両方のプロリル残基を含有している場合でさえそうである 22。第3に、細胞抽出物中のHIFプロリルヒドロキシラーゼ活性を消失させるのに必要な合成ペプチドの濃度が細胞内で産生されるとは考えにくい。
NODDおよびCODD配列の比較を、VHLおよび異なるプロリルヒドロキシラーゼアイソフォームとのそれらの相互作用の性質を明らかにする構造研究と組合せることにより、これらの物質の更なる精密化が可能となるだろう。他のタンパク質トランスダクションドメインおよび／または組織特異的標的化配列（肺に対するGFEまたは網膜に対するRDVのようなトリペプチドを含む）の使用は、副作用のリスクがより低い新規製剤につながるだろう 32 33。
本明細書に報告のポリペプチドは、制御されたHIF経路活性化を酸素正常状態で可能にする非常に興味深い試薬である。該ペプチドの正味の治療的利益を証明するためには、虚血の動物モデルを使用することが可能であり、ついで臨床試験を行うことが可能である。
16.8 方法
プラスミド、一過性および安定なトランスフェクション
プラスミド構築物：
レポーター遺伝子アッセイのために、HIF-1αアミノ酸343-417、380-417、390-417、390-410、343-400、530-95、530-82、549-82、556-74および530-62をコードするDNA断片を、5' SacIIまたは3' AscI部位を含有するオリゴヌクレオチドを使用するPCRにより作製し、これらの部位をNLSおよびエピトープタグに対してインフレームで含有するpCMV/myc/nuc（Invitrogen）誘導体内に挿入した。部位特異的突然変異誘発（QuikChange, Stratagene）を用いて、HIF-1α aa343-417またはaa549-82を含有する構築物をaa402 [ccaからgcaへ] またはaa564 [ccaからggcへ]において突然変異させて、それぞれプロリンからアラニンまたはグリシンへと変化させた。tet-オペレーター依存性プラスミドを作製するために、aa343-417およびaa549-82構築物からのオープンリーディングフレームをpUHD 10 34内にサブクローニングした。HIF-1α aa343-417およびaa530-82をコードする断片（P402AおよびP564G突然変異体を含有する及び含有しない）をptat-HA 25内にサブクローニングした。すべての構築物をDNA配列決定により確認した。
レポーター遺伝子アッセイ：
Fugene6（RocheMolecular） 35を使用して、HRE含有レポーター遺伝子、pCMV/myc/nuc構築物および構成的に発現されるβガラクトシダーゼ遺伝子で細胞を同時トランスフェクトした。トランスフェクタントを酸素正常状態で24時間または低酸素状態で最後の16時間維持した。市販のキット（Promega）およびTD-20eルミノメーター（Turner Designs）を使用して、細胞抽出物中のルシフェラーゼ活性を測定した。o-ニトロフェニル-β-D-ガラクトピラノシドを基質として使用して、βガラクトシダーゼ活性を分光光度的に測定した。
逆テトラサイクリン応答性トランスアクチベーター 34およびtetKRABサイレンサー構築物 36を含有するU2OS細胞をpUHD/HIFプラスミドでトランスフェクトすることにより、安定にトランスフェクトされた細胞系を作製した。G418（1mg/ml）での選択の後、個々のクローンを拾った。DoxNODD（F21）およびdoxCODD（myc19）クローンは、それぞれpUHD/HIF-1aa343-417/3NLS/c-mycおよびpUHD/HIF-1aa549-82/3NLS/c-mycを発現した。
mRNAおよびタンパク質の検出
RNA分析：
RNAzol B（Biotec Laboratories）を使用して抽出した全RNAを、既に記載されている鋳型 10 24を使用し32P-GTP標識Glut-1、CAIXおよびsnRNA（内部対照として）リボプローブを使用するリボヌクレアーゼプロテクションにより分析した。
免疫ブロット法：
細胞抽出物をバッファー（8M 尿素, 10％ グリセロール, 1％ SDS, 5 mM DTT, 10 mM Tris/pH 6.8）中で調製し、SDS-PAGEにより分離し、Immobilon-P膜（Millipore）に転写した。HIF-1α、c-mycタグおよびHAタグに対する一次抗体は、それぞれTransduction Laboratories、InnogenexおよびRoche Molecularから入手した。
ユビキチン化および相互作用アッセイ
コンフルエントになるまで増殖させた、空ベクターおよびdoxCODD細胞を、ドキシサイクリン（0.8μg/ml）で48時間誘導し、既に記載されている細胞質抽出物 37を使用してユビキチンアッセイを行った。
VHL E3相互作用アッセイのために、TnT7ウサギ網状赤血球溶解物（Promega）を使用する転写／翻訳により、35S-メチオニン標識HIF-1α基質を調製した。該網状赤血球溶解物のプロリルヒドロキシラーゼ活性を抑制するために、100μM DFOを該反応物に加えた。塩化第一鉄（100μM）の存在下、HIF-1α翻訳物をRCC4細胞溶解物と共にインキュベートすることにより、基質の修飾が達成された。既に記載されているとおりに 21、VHL E3との相互作用を分析した。
グルコースの取り込み
空ベクターおよびdoxCODD細胞をコンフルエントになるまで増殖させ、1％、21％ 酸素または0.8μg/ml ドキシサイクリンに16時間さらし、グルコースを含有しないDMEMで洗浄し、1μCi/ml 2-デオキシ-D 3H-グルコース（Amersham, UK）と共に10分間インキュベートした後、0.5％ NP-40、0.25M NaCl、10mM HEPES（pH 7.6）中で細胞溶解した。液体シンチレーション計数 35により、グルコースの取り込みを測定した。
tat-タンパク質の合成および精製
1mM IPTGで4時間誘導した後、形質転換BL21pLysS（Novagen）を細胞溶解バッファー（0.5％ Tween-20, 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 5 mM イミダゾール）中で音波処理することにより、HIF-1α-tet-融合タンパク質を精製した。溶解物を103 gで遠心沈殿させた後、Ni-NTAカラム（Qiagen）にローディングした。タンパク質を100mM イミダゾールで溶出し、10mM Tris/pH 7.0または10mM Tris/pH 8.0、30mM KCl中、PD10カラム（Amersham）25上で脱塩した。アリコートを液体窒素中でスナップ凍結（snap frozen）した。実験の開始時および開始の8時間後、DMEM/1％ FCS内での培養物にTat-タンパク質（最終濃度0.5μM）を加え、24時間後に細胞を回収した。
血管新生アッセイ
細管形成アッセイ：
DMEM 10％ ドキシサイクリン非含有FCS（Clontech）、2mM グルタミンおよび100 U/ml ペニシリン/100μg/ml ストレプトマイシン中、doxCODDまたは空ベクター細胞をヒト微小血管内皮細胞（HMEC-1）と2:1の比で共培養した。ドキシサイクリン（0.8μg/ml）または表皮増殖因子（5ng/ml）（Sigma）または対照培地での刺激を2日ごとに繰返した。第5日に、細胞を70％ エタノールで固定し、1％ BSA/PBSで予めブロッキングした。フォンビルブランド因子（vWF）（Dako）に対する抗体を使用して、内皮細胞を検出した。
マウススポンジモデル：
第0日に、無菌ポリウレタンスポンジ（直径8mm）を、麻酔されたブラック（黒色）C57雌マウスの背部皮膚下に皮下挿入した。第1、2、4および5日に、Trisバッファー（10mM, pH 7.0）中の100μlのtat-融合タンパク質（1μM）を該スポンジ内に注入した。第7日に動物を犠死させ、該スポンジを包囲組織と共に切り出し、3.5％ パラホルムアルデヒド中で固定した。
免疫組織化学：
パラフィン包埋スポンジを6μmの切片に切断し、キシレンでロウを取り、再水和させ、vWF（Dako）、Glut-1（Alpha Labs）、VEGF（Santa Cruz）および平滑筋細胞アクチン（DAKO）抗体で染色した。抗原の回収、切片のブロッキング、二次HRP標識抗体および発色反応は、製造業者の推奨（DAKO Envision System and Vector Labs ABC Vectastain）に従い行った。
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N-オキサリルグリシン抑制活性に対する鉄キレート化の効果、およびエナンチオマーのペアの抑制活性の直接比較
N-オキサリルグリシンが鉄キレート化を介してHIF-1αの修飾を抑制するのかどうかを判定するために、本発明者らは種々の濃度のインヒビターおよび鉄の存在下、HIF-1αの残基549-582を発現するGal/HIF-1α/VP16融合タンパク質を使用して、捕捉アッセイを行った。
未標識HIF-1α基質をビーズ上で免疫精製し、洗浄し、RCC4細胞抽出物の存在下、0、20、50、200、500または2000μM N-オキサリルグリシンおよび5または100μM FeCl2と共にアリコートをインキュベートした。洗浄後、該ビーズを、35-S標識pVHL IVTTと相互作用するそれらの能力に関してアッセイし、ついでそれをフルオログラフィーにより可視化した。得られた結果を図14Aに示す。捕捉されたpVHLの量が、バンド当たりの相対計数として表されている。N-オキサリルグリシンによるpVHL捕捉の抑制はインヒビターの濃度と共に増加し、鉄濃度には同様に無関係であった。鉄の補足は抑制にほとんど又は全く影響を及ぼさないため、これは、N-オキサリルグリシンによるHIF-1α修飾の抑制が鉄のキレート化により媒介されるのではなく、別のメカニズムにより媒介されることを示している。
HIF-1αの修飾に対するエナンチオマーのペア（すなわち、N-オキサリル-2S-アラニンおよびN-オキサリル-2R-アラニン）の抑制効果も調べた。これは、基質として同様にGal/549-582/VP16融合タンパク質を使用する前記と同じpVHL捕捉アッセイを用いて行った。ついでpVHLの捕捉に対する0、20、50、200、500および2000μMの濃度の各エナンチオマーの効果を評価した。得られた結果を図14Bに示す。この場合も、捕捉された標識pVHLの量が、バンド当たりの相対計数として表されている。結果は、HIF基質の修飾およびそれによるpVHLの捕捉を抑制するそれらのエナンチオマーの能力に約1 logの差があることを示している。それらの2つのエナンチオマーのうち、N-オキサリル-2S-アラニン エナンチオマーが、より高い抑制活性を有していた。
HIFの修飾の潜在的インヒビターのin vitroスクリーニングを、捕捉アッセイを用いて行った。HIF-1αの残基549-582を発現するGal/HIF-1α/VP16融合タンパク質をIVTTにより調製し、該アッセイにおける基質として使用した。該未標識基質をビーズ上で免疫精製し、洗浄し、RCC4細胞抽出物の存在下、100μM FeCl2および2mMの該潜在的インヒビターと共にアリコートをインキュベートした。該インヒビターを、示されているとおりにDMSOまたはTrisに溶解した。インヒビターを加えず同等量のDMSOまたはTrisを加えた対照も行った。洗浄後、該ビーズを、それらが35-S標識pVHL IVTTと相互作用する能力に関してアッセイした。該細胞抽出物中に存在するHIFヒドロキシラーゼによる該融合タンパク質のヒドロキシル化は、該標識pVHLを捕捉することを可能にする。ついで、該融合タンパク質に結合した標識タンパク質の量を測定して、相対HIFヒドロキシラーゼ活性を決定するために測定することが可能である。図15〜20は、特定のインヒビターの存在下のHIFヒドロキシラーゼ活性を、該インヒビターの非存在下（DMSO/Tris対照）で認められるものと比較して示している。
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HIF-1αの最小pVHL結合ドメインの分析。A．左パネル；HIF-1αおよびHIF-2αに由来する最小pVHL結合ドメインと、他の生物に由来するHIF-α遺伝子との配列アラインメント。B．Fe(III)を添加した網状赤血球溶解物への曝露の前および後のHIF-1α/pVHL相互作用を遮断する合成ポリペプチドの能力の概要。処理および未処理ポリペプチドをHIF-1αとpVHL.HA IVTTとの混合物に加え、ついでこれを、抗HA免疫沈降により、相互作用に関してアッセイした。置換残基は下線で示されている。Y*はホスホチロシンを示す。 ヒトHIF-1αおよびシー・エレガンス（C. elegans）HIFのアミノ酸配列。同一アミノ酸は、黒塗りの枠で囲まれている。PASドメインが示されている。ヒトHIF-1αの研究において定められたVHL最小結合領域が示されている。 示されているHIFα鎖の、示されているアミノ酸の整列。これは、VHL依存性ユビキチン化に関与することが示されている全3個のドメイン中のLxxLAPモチーフの保存を示している。 示されているGal-Hif-1α-VP16配列をコードするプラスミドとpUAS-tk-luc（Gal4上流活性化配列依存性ルシフェラーゼレポーター遺伝子プラスミド）との組合せでU20S細胞を一過性にコトランスフェクトした。全時間にわたり酸素正常状態で（白棒グラフ）または最後の16時間を低酸素刺激しながら（黒棒グラフ）48時間維持したトランスフェクト化細胞から調製した抽出物において、ルシフェラーゼ活性を測定した。Gal-Hif-VP16融合タンパク質が野生型Hif-1αアミノ酸344-417を含有する場合には、低い酸素正常状態活性（該融合タンパク質の急速な破壊により説明されうる）が認められるが、該配列がP402A突然変異を有するか又はアミノ酸400まで短小化されている場合には、それは認められない。 野生型完全長Hif-1α（HIF-1）、P402A突然変異（P402A）を有する完全長Hif-1α、P564G突然変異（P564G）を有する完全長Hif-1αまたは二重突然変異（P402A+P564G）を有する完全長Hif-1αをコードするpcDNA3発現プラスミドと低酸素応答要素依存性ルシフェラーゼレポーター遺伝子構築物との組合せで、CHO突然変異細胞系Kal3（Hifαサブユニット活性を欠く）をコトランスフェクトした。全時間にわたり酸素正常状態で（白棒グラフ）または最後の16時間を低酸素刺激しながら（黒棒グラフ）48時間維持したトランスフェクト化細胞から調製した抽出物において、ルシフェラーゼ活性を測定した。個々の突然変異は、野生型配列より若干高い酸素正常状態活性を示したが、該組合せ突然変異体は酸素正常状態において構成的活性を示し、低酸素による更なる誘導は全く認められなかった。 HIFプロリルヒドロキシラーゼ活性に関してアッセイするために用いた、ビーズ上の修飾アッセイ（on-bead modification assay）の概要を示す。 Hep3BおよびU2OS細胞系におけるHIF活性に対するジメチルオキサリルグリシンの効果を示す。 20％または2％酸素を含有する雰囲気中でインキュベートした細胞におけるHIFの作用に対するEGLN2（PHD1）の又はアミノ酸369-389を欠く天然スプライス変異体（PHD4）の強制発現の効果を示す。 クラバミン酸シンターゼおよびデアセトキシセファロスポリンCシンターゼの活性部位から導き出された概要図を示す。 HIF-PHの推定ゼリーロールコアの配列アラインメントを示す。示されている配列はシー・エレガンス（C. elegans）EGL-9（462-580）、ヒトEGLN1（288-403）、ヒトEGLN2（462-580）、ヒトEGLN3（111-225）、ラットSM20（226-341）である。また、ストレプトマイセス属種（Streptomyces sp.）プロリル-3-ヒドロキシラーゼ（P3OH）も示されている。2-オキソグルタル酸の5-カルボキシラートに結合すると提示されているアルギニン（Mukherjiら (2001) Chem. Comm. 11 972-973）、および2-His-1-Aspモチーフの残基が矢印で示されている。 2-オキソグルタル酸依存性の保存ゼリーロールコア（ストランド1〜8）のトポグラフィー図を示し、これは、候補HIF-OHを同定するために使用した保存2-ヒスチジン-1カルボキシラート鉄結合リガンドと2オキソグルタル酸結合塩基残基（Arg557）との大体の位置を示している。番号付けはEGL-9配列中の位置に基づいている。 精製されたPHD1による合成ペプチドのヒドロキシル化の、218nmにおける吸光度のHPLC溶出プロフィールを示す。記載されているとおり、合成HIF-1α（B19Pro）ペプチドを、2-オキソグルタル酸の存在下または非存在下、MBP/PHD1で処理し、産物をHPLCにより分析した。一番上の曲線は鉄（II）の非存在下でのインキュベーションの結果を示し、上から2番目の曲線はαKGの非存在下でのインキュベーションを示し、上から3番目の曲線は、存在するすべての補因子の存在下でのインキュベーションを示す。ヒドロキシル化および未ヒドロキシル化B19Pro標準体に対応するピークの位置が、一番下のパネルに示されている。ヒドロキシル化ペプチドの出現はpVHLとの相互作用能と合致する。 EGL-9によるHIF-1のプロリン621のヒドロキシル化のHPLC分析を示す。His6GalHIF-1（590-713）または突然変異体（P621G）誘導体のいずれかを発現するプラスミドと、MBP/Δ.EGL-9またはMBP単体を発現するプラスミドとで大腸菌（E. coli）を同時形質転換した。回収されたHis6GalHIF-1を、示されているとおりに4-ヒドロキシプロリンに関してHPLCにより分析した。 NODDおよびCODD発現プラスミドがHREレポーター遺伝子活性を増強することを示している。（A）HIFα-VHL相互作用に対するペプチドの効果に関して提示されているモデル。プロリルヒドロキシル化および／またはVHL結合に関して競合するNODDおよびCODDポリペプチドにより分解が妨げられ、それにより後続のユビキチン化が阻止される。（B）N末端またはC末端ODD（HIF-1α aa343-417またはaa549-82）のトランスフェクションは、低酸素レベルと比較して増加したHRE依存性ルシフェラーゼ活性を招いた。これに対して、P402AまたはP564G突然変異を有する対応配列でのトランスフェクションの後では誘導は全く見られなかった。RLU：相対光単位。 HIFα鎖を欠くCHO細胞系（KA-13）またはその安定なHIF-１αトランスフェクタント（KH-1）の使用は、観察されたHRE応答がHIF-1α発現に依存性であることを示している。 NODDに関してはアミノ酸390-410が、CODDに関してはアミノ酸556-72が、定められる最も短い活性ドメインであった。 ヒトおよびマウスHIF-1α NODDおよびCODDドメインの配列アラインメント。 オキサリルグリシン(A)ならびにオキサリルRおよびS-アラニン(B)に関する用量反応曲線を示す。 種々のインヒビターに関する相対HIP-PH活性を示す。 種々のインヒビターに関する相対HIP-PH活性を示す。 種々のインヒビターに関する相対HIP-PH活性を示す。 種々のインヒビターに関する相対HIP-PH活性を示す。 種々のインヒビターに関する相対HIP-PH活性を示す。 種々のインヒビターに関する相対HIP-PH活性を示す。
配列表
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Claims (7)

  1. 単離された低酸素誘導因子-α（HIF-α）プロリルヒドロキシラーゼによる低酸素誘導因子-α（HIF-α）ポリペプチドのヒドロキシル化をモジュレーションする物質を同定するためのアッセイ方法であって、該方法が
    ・該HIF-αプロリルヒドロキシラーゼが試験物質の非存在下で該HIF-αポリペプチドをヒドロキシル化するように設定した条件下、該HIF-αポリペプチドの存在下で該単離されたHIF-αプロリルヒドロキシラーゼと該試験物質とを接触させ、
    ・該HIF-αポリペプチドのヒドロキシル化を確認する、
    ことを含んでなり、ここで該HIF-αポリペプチドがHIF-1α、HIF-2α、もしくはHIF-3α、またはHIF-1αのPro 564および／もしくはPro 402と同等のプロリンを含むそれらの断片であり、
    また単離された該HIF-αプロリルヒドロキシラーゼが、以下：
    （a）配列番号2、4、6または8のアミノ酸配列、
    （b）配列番号2、4、6または8のアミノ酸配列に対して少なくとも90％の同一性を有し、かつHIF-αプロリルヒドロキシラーゼ活性を有する該アミノ酸配列(a)の変異体、または
    （c）配列モチーフHXD[X] 58 H（ここで、Xは任意のアミノ酸である）を含み、かつHIF-αプロリルヒドロキシラーゼ活性を有する、(a)の断片であって、ここで配列モチーフHXD[X] 58 Hが、配列番号2のアミノ酸配列中のアミノ酸残基His297からHis358まで、配列番号4のアミノ酸配列中のアミノ酸残基His313からHis374まで、配列番号6のアミノ酸配列中のアミノ酸残基His135からHis196まで、配列番号8のアミノ酸配列中のアミノ酸残基His487からHis548までの配列である、前記断片、
    である、アッセイ方法。
  2. 該HIF-αプロリルヒドロキシラーゼと試験物質とを2-オキソグルタル酸の存在下で接触させ、コハク酸およびCO2への2-オキソグルタル酸の代謝回転を測定することにより該HIF-αポリペプチドのヒドロキシル化を測定する、請求項1記載のアッセイ方法。
  3. HIF-αポリペプチドが、以下のヒトHIF-1αの残基：残基344-698、残基364-678、残基364-638、残基384-638、残基364-598、残基394-598、残基549-652、残基549-582、残基556-574、残基344-417、または残基380-417からなる群より選択されるいずれかのポリペプチド配列を含む、請求項1または2記載のアッセイ方法。
  4. HIF-αポリペプチドを発現する細胞を準備し、該細胞内でHIF-αプロリルヒドロキシラーゼを組換え的に発現させ、該細胞を試験物質と接触させ、該細胞におけるHIF-αポリペプチドの存在量もしくは安定性またはHIF-αポリペプチド関連活性をモニターして、HIF-αプロリルヒドロキシラーゼ活性に対する該試験物質の効果を判定することを含む、請求項1〜3のいずれか1項記載のアッセイ方法。
  5. HIF-αポリペプチド関連活性が、フォン・ヒッペル-リンダウタンパク質（VHL）との相互作用、HIF-αにより媒介される転写、およびHIF調節性プロモーターにより駆動されるレポーター遺伝子の発現から選ばれる、請求項4記載のアッセイ方法。
  6. (c)に記載の前記モチーフ中のHXD部分が、HIF-αプロリルヒドロキシラーゼのゼリーロールモチーフの第2ストランド上に位置し、前記モチーフ中のもう1つのHは該ゼリーロールモチーフの第2ストランドの近くに位置する、請求項1記載のアッセイ方法。
  7. (c)に記載の前記モチーフ中のHXD部分がHXEで置換されている、請求項1または6記載のアッセイ方法。
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